CN117916589A - 评估野靛碱纯度的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了在多个波长处使用梯度色谱法评估野靛碱的纯度的方法。

Description

评估野靛碱纯度的分析方法
优先权声明
本申请要求于2021年9月8日提交的美国临时专利申请第63/241,829号的优先权，所述美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文中。
背景技术
尼古丁是一种成瘾性物质，其会在香烟抽吸过程期间被快速吸收。所述药物分布快速，并且被视为与中枢神经系统(CNS)中的神经元烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)交互。尼古丁成瘾至少部分地是由这种交互引起的。尽管许多吸烟者试图停止抽吸，但在没有药物支持治疗的情况下很少有人成功。
烟草吸烟导致全世界每年约7百万人过早死亡。吸烟是高度成瘾性的，其中超过95％人在无辅助的情况下尝试戒除都无法持续6个月。据估计，一个人在他或她30岁左右每继续一年吸烟，其就会丧失3个月的预期寿命。世界卫生组织(The World HealthOrganization)的《烟草控制框架公约(Framework Convention on Tobacco Control)》鉴定了用于促进吸烟戒除的基于证据的方法，所述方法包含大众媒体运动、增加烟草税以及帮助想要戒烟的吸烟者。
(-)-野靛碱(cytisine)(金雀花碱(cytisinicline)；通常简称为野靛碱)是一种从金雀花金链花(Cytisus laburnum L.)(金链)和其它植物的种子中分离出的基于植物的生物碱。本文提及野靛碱是指(-)-野靛碱、金雀花碱。
野靛碱的作用机制帮助基础药理学家了解烟碱乙酰胆碱受体的各种亚型的复杂药理学。这些研究显示尼古丁和野靛碱两者都强烈且优先与alpha4、beta2(α4β2)受体结合，所述受体介导多巴胺在伏隔核(nucleus accumbens)的壳与其它地方释放。这种受体亚型与尼古丁依赖性的发展和维持有关，并且是如伐尼克兰(varenicline)等药物的初级靶标。
需要利用患者友好型方案进行尼古丁成瘾治疗，所述方案成本更低、更有效、安全概况得到提高和/或可以更成功地治疗使用已知治疗未能戒除尼古丁的个体。
发明内容
提供了用于评估野靛碱的纯度的方法。
在一些方面，本公开提供了一种评估野靛碱的纯度的色谱方法，所述方法包括：(a)将野靛碱样品引入到柱中，所述柱包括包含硬脂酸的固定相(C18)并且长度为150mm、内径为4.6mm并且粒度为2.5μm，其中所述野靛碱样品包括一种或多种杂质；(b)将pH为约10的第一流动相施加到所述柱，使得野靛碱和所述一种或多种杂质保留在所述柱上；(c)通过向所述柱施加pH为约10的第二流动相来洗脱野靛碱和所述一种或多种杂质；(d)检测野靛碱和所述一种或多种杂质。
在某些实施例中，将野靛碱和所述一种或多种杂质引导到质谱仪以进行步骤(d)中的检测。在一些实施例中，所述第一流动相和所述第二流动相相容以注入到质谱仪中。在某些实施例中，所述第一流动相和所述第二流动相包括挥发性组分。
在一些实施例中，所述第一流动相和所述第二流动相包括相容以注入到质谱仪中的缓冲液。在一些实施例中，第一流动相包括比率为约95:约5的10mM硼酸缓冲液和乙腈。在某些实施例中，第二流动相包括比率为约5:约95的10mM硼酸缓冲液和乙腈。
在一些实施例中，所述一种或多种杂质选自由以下组成的组：N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和鹰爪豆碱。在又另一实施例中，将野靛碱与N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱、鹰爪豆碱和沙豆树碱中的每一种分离。在一些实施例中，N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱、鹰爪豆碱和沙豆树碱中的每一种与野靛碱分离并且彼此分离。
在另一实施例中，将所述第一流动相施加到所述柱上，持续至少约2分钟。在一些实施例中，将所述第二流动相施加到所述柱上，持续约20分钟至约24.5分钟。
在一些实施例中，检测野靛碱和所述一种或多种杂质包括在一个或多个波长处的UV/Vis吸光度检测。在一些实施例中，所述一个或多个波长是200nm和308nm。在又另一实施例中，野靛碱是在约308nm的波长处检测到的。在某些实施例中，所述一种或多种杂质选自由以下组成的组：N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱和安那吉碱，并且所述一种或多种杂质是在约308nm的波长处检测到的。在另一实施例中，所述一种或多种杂质是狭叶碱、白羽扇豆碱或两者，并且所述一种或多种杂质是在200nm的波长处检测到的。
附图说明
图1是示出了根据本公开的实施例的用于评估野靛碱的纯度的示例过程100的流程图。
图2A-2B是根据本公开的实施例的未能分离野靛碱和一种或多种在200nm的波长处(图2A)和在310nm波长处(图2B)检测到的杂质的高效液相色谱法(HPLC)等度方法的示例性色谱图。
图3A-3G是根据本公开的实施例的野靛碱(图3A)和已知杂质的示例性吸收光谱，所述已知杂质包含N-甲酰基野靛碱(图3B)、N-甲基野靛碱(图3C)、白羽扇豆碱(图3D)、狭叶碱(图3E)、安那吉碱(图3F)和鹰爪豆碱(图3G)。
图4是示出了根据本公开的实施例的当流动相条件改变时野靛碱和已知杂质中的每种杂质的保留时间的示例性图(图例：(1)-水:TFA(100:0.05)/乙腈:TFA(100:0.05)；(2)-水:甲酸(100:0.1)/乙腈:甲酸(100:0.1)；(3)-20mM乙酸铵(pH 5.8)/乙腈；(4)10mM碳酸氢铵(pH 8.0)/乙腈；以及(5)-水:甲酸(100:0.1)/乙腈:甲酸(100:0.1)，等度保持)。
图5A-5C是根据本公开的实施例的使用包括2mM甲酸铵(pH 8)和乙腈的流动相的野靛碱和N-甲酰基野靛碱(图5A)、N-甲基野靛碱和安那吉碱(图5B)以及狭叶碱和白羽扇豆碱(图5C)的示例性色谱图。
图6A-6C是根据本公开的实施例的使用包括2mM甲酸铵(pH 8)和甲醇的流动相的野靛碱和N-甲酰基野靛碱(图6A)、N-甲基野靛碱和安那吉碱(图6B)以及狭叶碱和白羽扇豆碱(图6C)的示例性色谱图。
图7是示出了根据本公开的实施例的当流动相的pH改变时野靛碱和已知杂质中的每种杂质的保留时间的示例性图(图例：(1)-20mM甲酸铵(pH 8.0)/甲醇；(2)-10mM硼酸(pH8.5)/甲醇；(3)-10mM硼酸(pH 9.0)/甲醇；以及(4)-氨溶液(pH 9.2)/甲醇)。
图8是示出了根据本公开的实施例的当固定相改变时野靛碱和已知杂质中的每种杂质的保留时间的示例性图(图例：(1)-C18；150x4.6mm，3.5μm粒度；(2)-苯基；150x4.6mm，3.5μm粒度；(3)-苯基-己基；150x4.6mm，3.5μm粒度；(4)-YMCC18；150x4.6mm，3.0μm粒度；(5)-苯基；150x4.6mm，3.0μm粒度；(6)-SynergiMAX-RP；150x4.6mm，4μm粒度；以及(7)-Gemini C6-苯基；150x4.6mm，5μm粒度)。
图9A-9C是根据本公开的实施例的使用包括10mM硼酸缓冲液(pH 8)和甲醇的流动相的野靛碱和N-甲酰基野靛碱(图9A)、N-甲基野靛碱和安那吉碱(图9B)以及狭叶碱和白羽扇豆碱(图9C)的示例性色谱图。
图10A-10C是根据本公开的实施例的使用固定相XBridge C18 3.5μm和甲醇的野靛碱和N-甲基野靛碱(图10A)、N-甲酰基野靛碱和安那吉碱(图10B)以及狭叶碱、白羽扇豆碱和鹰爪豆碱(图10C)的示例性色谱图。
图11是根据本公开的实施例的示出了流动相中包含甲醇引起色谱图中显著的梯度上升的示例性色谱图。
图12是示出了根据本公开的实施例的当流动相的梯度改变时野靛碱和一种或多种杂质的保留时间的示例性图(图例：(A)-梯度A；(D)-梯度D；(E)-梯度E；(F)-梯度F；以及(G)-梯度F、表22中提供的梯度A和表23中提供的梯度D-G)。
图13A-13F示出了根据本公开的实施例的示例性色谱图，所述示例性色谱图显示了在200nm的波长处(图13A)和308nm的波长处(图13B)处野靛碱和一种或多种杂质的重叠，在200nm的波长处(图13C)和308nm的波长处(图13D)处野靛碱和已知杂质的重叠，以及在200nm的波长处(图13E)和308nm的波长处(图13F)处野靛碱和已知杂质的重叠。
图14A-14F示出了根据本公开的实施例的示例性色谱图，所述示例性色谱图显示了在308nm处的野靛碱、N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、安那吉碱、狭叶碱和白羽扇豆碱的重叠以包含空白(图14A)、重叠(图14B)和重叠的放大图(图14C)以及在200nm处的重叠以包含空白(图14D)、重叠(图14E)和重叠的放大图(图14F)。
图15A-15B示出了根据本公开的实施例的使用HPLC方法在308nm(图15A)和200nm(图15B)处确认线性响应的示例性图。
具体实施方式
本公开涉及一种定量测定野靛碱的纯度的方法。所述方法特别涉及使用色谱法来解析野靛碱和已知杂质。野靛碱经常与以下杂质相关：N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和鹰爪豆碱，并且在色谱分离程序中这些杂质与野靛碱的共洗脱给野靛碱纯度的评估带来了挑战。本文提供了能够在多个波长处解析野靛碱和相关杂质的梯度HPLC方法。
本文所提供的方法允许通过利用碱性流动相(例如，pH 10)与固定相(例如，C18；150x4.6mm，2.5μm粒度)组合来分离野靛碱和已知杂质，其中流动相与如质谱法等分析技术相容，例如流动相适于注入到质谱仪中。本文所提供的方法对野靛碱和已知杂质具有选择性，与先前用于评估野靛碱的纯度的分析技术相比，提供了优异的分离。
虽然本公开能够以各种形式体现，但是以下对若干实施例的描述是在理解将本公开视为是本发明的例示并且不旨在将本发明限制于所展示的具体实施例的情况下做出的。提供标题仅仅是为了方便起见，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。在任何标题下所展示的实施例均可以与在任何其它标题下所展示的实施例组合。
定义
除非另外明确指出，否则在本申请中指定的各种定量值中使用的数值表示为近似值，就好像在所陈述范围内的最小值和最大值均以词语“约”开头。应理解的是，尽管并不总是明确地说明，但所有的数字标识的前面有术语“约”。应当理解的是，此类范围格式是为了方便和简洁而使用的，并且应该灵活地理解为包含明确指定为范围的界限的数值，而且还包含所述范围内涵盖的所有单独数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确指定一样。例如，约1到约200范围内的比率应该理解为包含约1和约200的明确列举的界限，但也包含如约2、约3和约4等单独比率以及如约10到约50、约20到约100等子范围。还应理解，尽管并不总是明确地说明，但本文所描述的试剂仅仅是示例性的，并且其等效物在本领域中是已知的。
如本文所用的术语“约”在提及如量或浓度等可测量值时，意在涵盖所指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
如本文所使用的，术语“质谱”和“MS”是指基于它们的质荷比或“m/z”的过滤、检测和测量离子的方法。通常，对一种或多种所关注分子进行电离，并且随后将离子引入到质谱仪器中，在所述质谱仪器中，由于磁场和电场的组合，离子在空间中遵循某个路径，所述路径取决于质量(“m”)和电荷(“z”)。
同样，范围的公开旨在作为连续范围，包含所叙述的最小值与最大值之间的每个值，以及可以由这些值形成的任何范围。本文还公开了可以通过将公开的数值除以任何其它公开的数值而形成的任何和所有比率(以及任何此类比率的范围)。因此，本领域的技术人员将认识到，许多此类比率、范围和比率的范围可以由本文呈现的数值明确地推导出来，并且在所有情况下，此类比率、范围和比率的范围表示本公开的各个实施例。
方法
本公开提供了用于评估野靛碱的纯度的方法。在一些方面，本公开提供了用于使用色谱法改进野靛碱和一种或多种杂质的解析的方法。通常与野靛碱相关的杂质包含N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和鹰爪豆碱。为了确定野靛碱的纯度，色谱方法需要实现野靛碱与已知杂质的最佳解析。
在一些实施例中，本文所公开的色谱方法包含高效液相色谱法(HPLC)。在一些实施例中，所述方法包含反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。
图1是展示了能够实现野靛碱和一种或多种杂质的最佳解析的示例过程100的流程图。在步骤101处，过程100开始于制备包括野靛碱样品的溶液，其中所述样品包含一种或多种与野靛碱相关的杂质。在一些实施例中，所述一种或多种杂质包含N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和/或鹰爪豆碱。
在一些实施例中，野靛碱样品是在具有与流动相A相同组成的溶液中制备的，其中流动相A是在步骤103a处添加到过程100的初始溶液。在一些实施例中，溶液包括水性组分和有机组分。在一些实施例中，溶液是包括挥发性组分的碱性溶液(例如，pH 10)。在一些实施例中，溶液是包括仅一种水性组分和仅一种有机组分的双组分系统。在一些实施例中，水性组分包括缓冲液，其中所述缓冲液与质谱分析相容。在一些实施例中，水性组分包括硼酸缓冲液并且有机组分包括乙腈，其中水性组分和有机组分以95:5、97:3或96:4的比率存在。在一些实施例中，将野靛碱样品添加到包括水性组分和有机组分的溶液中，其中水性组分是硼酸缓冲液并且有机组分是乙腈，并且其中水性组分与有机化合物的比率为95:5，并且溶液的pH为约10。在一些实施例中，溶液包括比率为约95:约5、pH为10的10mM硼酸缓冲液和乙腈。
在一些实施例中，溶液的pH为约8至约10。例如，在一些实施例中，溶液的pH为约8、约9或约10。在一些实施例中，溶液的pH为约10。在一些实施例中，通过添加氢氧化铵来调节硼酸缓冲液的pH。
在一些实施例中，溶液和/或溶液的水性组分中硼酸的浓度为约5mM至约30mM。例如，在一些实施例中，溶液和/或溶液的水性组分中硼酸的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM或约30mM。在一些实施例中，溶液和/或溶液的水性组分中硼酸的浓度为约10mM。
在一些实施例中，溶液的有机组分包括乙腈。在一些实施例中，溶液的有机组分包括乙腈和甲醇。在一些实施例中，溶液的有机组分包括溶液的有机组分总体积的95体积％的乙腈和5体积％的甲醇。在一些实施例中，溶液的有机组分除乙腈外不包括有机溶剂。在一些实施例中，溶液的有机组分不包括甲醇。
过程100可以继续到步骤102，其中将包括野靛碱样品的溶液引入到包括固定相的柱中。在一些实施例中，固定相容纳在分离柱中，用作分离通道或色谱柱。在一些实施例中，固定相是疏水性固定相。在一些实施例中，固定相是C18固定相。在一些实施例中，固定相是长度为150mm、内径为4.6mm的柱中的C18固定相，并且填充有平均大小为3.0μm的颗粒(C18，150x4.6mm，3.0μm)。在另一实施例中，固定相是长度为150mm、内径为4.6mm的柱中的C18固定相，并且填充有平均大小为2.7μm的颗粒(C18，150x4.6mm，2.7μm)。在又另一实施例中，固定相是长度为150mm、内径为4.6mm的柱中的C18固定相，并且填充有平均大小为3.5μm的颗粒(C18，150x4.6mm，3.5μm)。在一个实施例中，固定相是长度为150mm、内径为4.6mm的柱中的C18固定相，并且填充有平均大小为2.5μm的颗粒(C18，150x4.6mm，2.5μm)。
过程100可以继续到步骤103，其中流动相通过柱并且流动相在步骤103的过程中有意地改变(例如，梯度相色谱法)。在一些实施例中，流动相包括水性组分和有机组分以洗脱野靛碱和所述一种或多种杂质，其中水性组分与有机组分的比率改变以提供流动相梯度。在一些实施例中，在步骤103期间改变流动相以影响野靛碱和已知杂质的保留，从而提供野靛碱和已知杂质的最佳解析。
在某些实施例中，所述一种或多种流动相与如质谱法法等分析技术相容，例如所述一种或多种流动相适于注射到质谱仪中。因为流动相包括挥发性组分，所以流动相可以与如质谱法等分析技术相容。在一些实施例中，流动相基本上不含“非挥发性组分”。如本文所使用的术语“非挥发性组分”是指存在于所述一种或多种流动相中的组分，其在将液相色谱法系统与质谱仪介接时在用于去除流动相溶剂的条件下基本上不挥发。
在一些实施例中，步骤103包含第一步骤103a，其中第一流动相(“流动相A”)被引入到柱中。在一些实施例中，流动相A是包括水性组分和有机组分的溶液。在一些实施例中，溶液是包括挥发性组分的碱性溶液(例如，pH 10)。在一些实施例中，流动相A是包括仅一种水性组分和仅一种有机组分的双组分系统。在一些实施例中，水性组分包括缓冲液，其中所述缓冲液与质谱分析相容。在一些实施例中，水性组分包括硼酸缓冲液并且有机组分包括乙腈，其中水性组分和有机组分以95:5、97:3或96:4的比率存在。在一些实施例中，流动相A包括水性组分和有机组分，其中水性组分是硼酸缓冲液并且有机组分是乙腈，并且其中水性组分与有机化合物的比率为95:5，并且流动相A的pH为约10。在一些实施例中，流动相A包括比率为约95:约5、pH为10的10mM硼酸缓冲液和乙腈。
在一些实施例中，流动相A的pH为约8至约10。例如，在一些实施例中，流动相A的pH为约8、约9或约10。在一些实施例中，流动相A的pH为约10。在一些实施例中，通过添加氢氧化铵来调节硼酸缓冲液的pH。
在一些实施例中，流动相A和/或流动相A的水性组分中硼酸的浓度为约5mM至约30mM。例如，在一些实施例中，流动相A和/或流动相A的水性组分中硼酸的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM或约30mM。在一些实施例中，流动相A和/或流动相A的水性组分中硼酸的浓度为约10mM。
在一些实施例中，流动相A的有机组分包括乙腈。在一些实施例中，流动相A的有机组分包括乙腈和甲醇。在一些实施例中，流动相A的有机组分包括流动相A的有机组分总体积的95体积％的乙腈和5体积％的甲醇。在一些实施例中，流动相A的有机组分除乙腈外不包括有机溶剂。在一些实施例中，流动相A的有机组分包括甲醇。
在一些实施例中，在第一步骤103a处，流动相A通过柱，持续至少约2分钟。例如，在一些实施例中，动相A通过柱，持续至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟或更长时间。在一些实施例中，使流动相A通过柱，持续至少约2分钟可以增加野靛碱在固定相上的保留，从而允许野靛碱与所述一种或多种杂质的选择性分离并增加野靛碱和所述一种或多种杂质的总体解析度。在一些实施例中，使流动相A通过柱，持续至少约2分钟可以增加野靛碱、N-甲酰基野靛碱和/或N-甲基野靛碱在固定相上的保留，从而提供与其它杂质(例如，狭叶碱、白羽扇豆碱和安那吉碱)以及彼此之间的最佳解析度。
在一些实施例中，步骤103包含第二步骤103b，其中第二流动相(“流动相B”)被引入到柱中。在一些实施例中，流动相B是包括水性组分和有机组分的溶液。在一些实施例中，溶液是包括挥发性组分的碱性溶液(例如，pH 10)。在一些实施例中，流动相B是包括仅一种水性组分和仅一种有机组分的双组分系统。在一些实施例中，水性组分包括缓冲液，其中所述缓冲液与质谱分析相容。在一些实施例中，水性组分包括硼酸缓冲液并且有机组分包括乙腈，其中水性组分和有机组分以5:95、3:97或4:96的比率存在。在一些实施例中，流动相B包括水性组分和有机组分，其中水性组分是硼酸缓冲液并且有机组分是乙腈，并且其中水性组分与有机化合物的比率为5:95，并且流动相B的pH为约10。在一些实施例中，流动相B包括比率为约5:约95、pH为10的10mM硼酸缓冲液和乙腈。
在一些实施例中，流动相B的pH为约8至约10。例如，在一些实施例中，流动相B的pH为约8、约9或约10。在一些实施例中，流动相B的pH为约10。在一些实施例中，通过添加氢氧化铵来调节硼酸缓冲液的pH。
在一些实施例中，流动相B和/或流动相B的水性组分中硼酸的浓度为约5mM至约30mM。例如，在一些实施例中，流动相B和/或流动相B的水性组分中硼酸的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM或约30mM。在一些实施例中，流动相B和/或流动相B的水性组分中硼酸的浓度为约10mM。
在一些实施例中，流动相B的有机组分包括乙腈。在一些实施例中，流动相B的有机组分包括乙腈和甲醇。在一些实施例中，流动相B的有机组分包括流动相B的有机组分总体积的95体积％的乙腈和5体积％的甲醇。在一些实施例中，流动相B的有机组分除乙腈外不包括其它有机溶剂。在一些实施例中，流动相B的有机组分包括甲醇。
在一些实施例中，在第二步骤103b处，流动相B通过柱，持续至少约20分钟。在一些实施例中，流动相B通过柱，持续至少约20分钟至约24.5分钟。在一些实施例中，在使流动相B通过柱，持续至少约20分钟至约24.5分钟时，野靛碱和所述一种或多种杂质中的每一种杂质在不同时间从柱中洗脱。
在一些实施例中，步骤103包含第三步骤103c，其中将流动相A重新引入到柱中以确保野靛碱和所述一种或多种杂质中的每一种的杂质洗脱。在一些实施例中，将流动相A重新引入到柱中并且通过柱，持续至少约0.5分钟。
过程100可以继续到步骤104，其中野靛碱和所述一种或多种杂质中的每一种杂质从柱中洗脱，其中野靛碱和所述一种或多种杂质中的每一种杂质在不同时间从柱中洗脱，以便提供野靛碱和所述一种或多种杂质中的每一种杂质的完全分离。在一些实施例中，将野靛碱与所述一种或多种杂质中的每一种杂质分离。在一些实施例中，将野靛碱与N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和/或鹰爪豆碱中的一者或多者分离。在一些实施例中，将野靛碱与N-甲酰基野靛碱分离。在一些实施例中，将野靛碱与N-甲基野靛碱分离。在又另一实施例中，将野靛碱与狭叶碱分离。在一些实施例中，将野靛碱与白羽扇豆碱分离。在一些实施例中，将野靛碱与安那吉碱分离。在一些实施例中，将野靛碱与鹰爪豆碱分离。
在一些实施例中，所述一种或多种杂质中的每一种杂质不仅与野靛碱分离，而且还彼此分离。在一些实施例中，将N-甲酰基野靛碱与野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和/或鹰爪豆碱中的一者或多者分离。在一些实施例中，将N-甲基野靛碱与野靛碱、N-甲酰基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和/或鹰爪豆碱中的一者或多者分离。在一些实施例中，将狭叶碱与野靛碱、N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和/或鹰爪豆碱中的一者或多者分离。在一些实施例中，将白羽扇豆碱与野靛碱、N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、安那吉碱和/或鹰爪豆碱中的一者或多者分离。在一些实施例中，将安那吉碱与野靛碱、N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱和/或鹰爪豆碱中的一者或多者分离。在一些实施例中，将鹰爪豆碱与野靛碱、N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱和/或安那吉碱中的一者或多者分离。
过程100可以继续到步骤105，其中检测到野靛碱和所述一种或多种杂质。在一些实施例中，过程100包含当野靛碱和所述一种或多种杂质被检测器从柱中洗脱时，检测野靛碱和所述一种或多种杂质。
在一些实施例中，所述一种或多种流动相与如质谱分析等检测技术相容。在一些实施例中，所述一种或多种流动相与将样品注入到质谱仪的方法相容。在一些实施例中，所述一种或多种流动相的水相组分包括与质谱分析相容的缓冲液。在一些实施例中，所述一种或多种流动相与直接注射到质谱仪中相容，因为所述一种或多种流动相包括挥发性组分(例如，有机相和/或水相是挥发性的)。在一些实施例中，缓冲液(例如硼酸缓冲液)是与质谱分析相容的挥发性缓冲液。
在一些实施例中，所述方法包括将野靛碱和所述一种或多种杂质引导到质谱仪以进行检测。在一些实施例中，野靛碱和所述一种或多种杂质(包括在所述一种或多种流动相内)在从柱洗脱后被注射到质谱仪中。在一些实施例中，从柱洗脱后对野靛碱和所述一种或多种杂质的分析提供了分析野靛碱的纯度的“直接”方法。
在一些实施例中，检测技术是质谱分析。用于使用质谱法分析流出物的方法是本领域众所周知的。可以采用能够直接分析溶液中存在的组分的任何类型的质谱法，包含例如电喷雾质谱法(ES-MS)、大气压化学电离(APCI)、膜引入质谱法(MIMS)、连续流快原子轰击(cf-FAB)、热喷雾技术、粒子束、移动带接口等。
在一些实施例中，质谱分析可以包含“串联质谱法”或“MS/MS”，以增强检测解析度。在此技术中，可以在MS仪器中过滤从所关注的分子生成的第一离子或母体离子，并且随后可以将此母离子碎裂以产生一种或多种然后在第二MS程序中进行分析的第二离子或子离子。通过仔细选择母离子，仅通过某些分析物产生的离子才能进入碎片化室，在所述碎片化室中，与惰性气体的原子碰撞产生这些子离子。由于母离子和子离子两者都是在给定的电离/碎裂条件下以可重复的方式产生的，因此MS/MS技术可以提供极其强大的分析工具。例如，过滤/片段化的组合可以用于消除干扰物质，并且可以特别用于复杂样品，如生物样品。
在其它实施例中，多种标准HPLC检测器中的任何一种均可以用于从分析柱洗脱后检测分析物。在这种情况下，化合物从柱中的洗脱被检测为色谱图中的峰。峰的保留时间用于鉴定化合物，并且峰高(或面积)与样品中的化合物的量成正比。“保留时间”是分析物通过色谱系统所需的时间，并且是从注入时间到检测时间测量的。理想情况下，每种所关注的分析物都具有特有的保留时间。合适的检测器表现出良好的灵敏度、良好的稳定性、再现性、几个数量级的线性响应、短的响应时间并且易于操作。此类检测器包含但不限于UV/Vis吸光度检测器、光电二极管阵列检测器、荧光检测器、折射率检测器和电导率检测器。
在一些实施例中，可以使用包括具有光栅光学器件的扫描分光光度计的UV/Vis吸光度检测器。单独或组合使用氘源(UV范围，190-360nm)与钨源(可见光范围，360-800nm)提供了一种简单的方法来检测从柱中出现的吸收物种。
在一些实施例中，检测器是可变波长检测器。通过UV/Vis检测，野靛碱和所述一种或多种杂质具有不同的最大吸光度，并且可变波长检测器可以通过使用多个波长在单个色谱图中捕获野靛碱和所述一种或多种杂质来最大化过程的灵敏度。在一些实施例中，野靛碱和所述一种或多种杂质是在约308nm和约200nm的波长下检测到的。
在一些实施例中，野靛碱是在约308nm的波长处检测到的。在一些实施例中，野靛碱是在约230nm的波长处检测到的。
在一些实施例中，N-甲酰基野靛碱是在约308nm的波长处检测到的。在一些实施例中，N-甲基野靛碱是在约308nm的波长处检测到的。在一些实施例中，安那吉碱是在约308nm的波长处检测到的。
在一些实施例中，狭叶碱是在约200nm的波长处检测到的。在一些实施例中，白羽扇豆碱是在约200nm的波长处检测到的。在一些实施例中，野靛碱是在约200nm的波长处检测到的。在一些实施例中，N-甲酰基野靛碱是在约200nm的波长处检测到的。在一些实施例中，N-甲基野靛碱是在约200nm的波长处检测到的。在一些实施例中，安那吉碱是在约200nm的波长处检测到的。
在一些实施例中，野靛碱和所述一种或多种杂质按以下顺序从柱中依次洗脱：N-甲酰基野靛碱、野靛碱、N-甲基野靛碱和安那吉碱，如在308nm的波长处检测到的。在又另一实施例中，野靛碱和所述一种或多种杂质按以下顺序从柱中依次洗脱：N-甲酰基野靛碱、野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱和安那吉碱，如在200nm的波长处检测到的。
在一些实施例中，野靛碱和所述一种或多种杂质的保留时间(溶质例如野靛碱通过柱所用的时间的量度)不同，以便提供野靛碱与所述一种或多种杂质的解析。在一些实施例中，所述一种或多种杂质彼此和野靛碱的保留时间不同，以便提供所述一种或多种杂质彼此与野靛碱的解析。
在一些实施例中，野靛碱的保留时间为约6.5分钟。在一些实施例中，N-甲酰基野靛碱的保留时间为约5.5分钟。在一些实施例中，N-甲基野靛碱的保留时间为约8.2分钟。在一些实施例中，安那吉碱的保留时间为约10.9分钟。在一些实施例中，狭叶碱的保留时间为约10分钟。在一些实施例中，白羽扇豆碱的保留时间为约10.2分钟。
在一些实施例中，野靛碱的相对保留时间为约1分钟。在一些实施例中，N-甲酰基野靛碱的相对保留时间为约0.8分钟。在一些实施例中，N-甲基野靛碱的相对保留时间为约1.3分钟。在一些实施例中，安那吉碱的相对保留时间为约1.7分钟。在一些实施例中，狭叶碱的相对保留时间为约1.53分钟。在一些实施例中，白羽扇豆碱的相对保留时间为约1.56分钟。
如从以上公开可以理解的，本发明具有各种应用。本发明通过以下实例进一步说明，这些实例仅是说明性的且并不旨在以任何方式限制本发明的定义和范围。
实例：用于评估野靛碱的纯度的分析方法
本研究的目的是开发一种用于评估野靛碱的纯度的分析HPLC方法。下文提供了筛选参数的汇总以及针对HPLC方法优化的最终系统参数的汇总。
与开发用于评估野靛碱的纯度的HPLC方法相关的挑战之一是能否从已知杂质中解析出野靛碱，所述杂质包含：N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱/野决明碱(对映体)和鹰爪豆碱(表1)。
表1.野靛碱和相关杂质的结构
先前用于分析野靛碱的方法使用等度HPLC方法，其中在整个分析过程中使用的流动相保持恒定。然而，等度方法存在局限性，因为所述方法无法从已知杂质中解析出野靛碱，如图2A(波长200nm)和图2B(波长310nm)所示出的。
进一步地，先前有关分析依赖于使用C18柱的反相色谱法的野靛碱的报告仅使用了310nm处的一个波长。这是有问题的，因为预期的杂质中的一些杂质，狭叶碱、白羽扇豆碱和鹰爪豆碱，在310nm的波长处没有任何吸光度(关于野靛碱和已知杂质的UV吸收光谱，参见图3A-3G)。这表明需要双波长方法来从已知杂质中实现野靛碱的最佳解析。
本研究被设计成旨在开发一种梯度HPLC方法(与等度方法相反)，能够在多个波长处解析野靛碱和预期的相关杂质。在开发过程中，将鹰爪豆碱和沙豆树碱从筛选过程中除去。这是由于无法获得沙豆树碱以及使用独立的HPLC方法分析鹰爪豆碱存在困难。另外，野决明碱也被从研究中除去，因为如果在样品中检测到与安那吉碱相对应的峰，也将开发一种手性方法。
1.样品制备
在开发过程中，试验了若干种稀释剂，目的是优化野靛碱的峰形和筛选的杂质。筛选的稀释剂列举于下表2中。
表2.筛选的稀释剂
乙腈(100％)
水:乙腈(1:1)
10mM硼酸盐缓冲液(pH 10.0):乙腈(95:5)(流动相A)
由于跨一系列流动相的峰分裂，乙腈(100％)被证明不适合。1:1乙腈:水的混合物产生单一宽峰。使用选定的稀释剂流动相A时观察到显著的改善，这产生表3中所示出的合适峰形。
表3.选定的稀释剂
流动相A
10mM硼酸盐缓冲液(pH 10.0):乙腈(95:5)(流动相A)
2.流动相筛选：阶段1
表4中列举的流动相在方法开发期间进行了筛选，并且涵盖了不同pH水平的选择。表4显示了筛选过程第一阶段筛选的流动相，其中每行详述了水相和其对应的有机相。2号流动相系统也使用不同的梯度(表5)来模拟等度方法。在流动相筛选的这个阶段，没有可用的鹰爪豆碱的参考材料，因此所述鹰爪豆碱不包含在数据中。
表4.筛选的流动相
编号 水相 有机相
1 水:TFA(100:0.05) 乙腈:TFA(100:0.05)
2 水:甲酸(100:0.1) 乙腈:甲酸(100:0.1)
3 20mM乙酸铵(pH 5.8) 乙腈
4 10mM氢碳酸铵(pH 8.0) 乙腈
5 水:甲酸(100:0.1) 乙腈:甲酸(100:0.1)
表5.用于复制等度方法的梯度
时间 A％ B％
0 95 5
25 95 5
45 5 95
49.5 5 95
50 95 5
通过在HPLC系统上以0.5mg/ml注入野靛碱和每种可用杂质的样品进行筛选，其中标准参数组如下表6和7所示出。
表6.HPLC参数
表7.HPLC梯度参数
对于每组注入，改变流动相以研究每种流动相系统对色谱法的影响。流动相筛选的主要目的是找到能够实现所有杂质(例如，N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、安那吉碱、狭叶碱、白羽扇豆碱)的充分保留以及良好的峰形的流动相。
图4和表8展示了每种可用杂质的保留时间如何随流动相条件改变。
表8.保留时间表
由于在用酸性梯度的情况下野靛碱缺乏保留，因此使用不同的缓冲系统进行进一步筛选。制备20mM甲酸铵(pH 8.0)并分别用乙腈和甲醇作为有机相进行筛选。甲酸铵优于碳酸氢铵，因为在200nm处发现的梯度杂质较少。甲醇被证明对野靛碱和筛选的杂质的保留有很大影响。每种杂质的保留增加至少2分钟。此筛选是在改变稀释剂之前进行的，并且因此，此时峰形仍然非常差；然而，在每个色谱图中仍然可以鉴定出可区分的峰。此筛选阶段的色谱图示出于图5A-5C(2mM甲酸铵(pH 8)和乙腈)和图6A-6C(2mM甲酸铵(pH 8)和甲醇)中。
3.流动相筛选：阶段2
使用甲醇作为有机相观察到的保留增加意指甲醇被带入流动相筛选的下一阶段。在不同的pH水平下筛选另外的缓冲液。图7以及表9和10展示了保留时间如何随pH改变。将结果相对于20mM甲酸铵(pH 8.0)和甲醇绘制，示出了保留时间比较(图7)。
表9.图7的参数图例
图例 筛选的参数
1 20mM甲酸铵(pH 8)/甲醇
2 10mM硼酸(pH 8.5)/甲醇
3 10mM硼酸(pH 9.0)/甲醇
4 氨溶液(pH 9.2)/甲醇
表10.保留时间表
峰名称 1 2 3 4
野靛碱 6.74 7.46 7.632 7.59
N-甲酰基野靛碱 5.93 5.84 5.882 5.87
N-甲基野靛碱 9.70 9.85 9.916 9.90
安那吉碱 8.52 11.75 12.664 11.90
狭叶碱 7.68 11.59 12.669 11.89
白羽扇豆碱 13.44 13.76 13.815 13.80
此流动相筛选阶段的结果用于章节5中详述的进一步的流动相优化。
4.固定相筛选
固定相筛选与流动相筛选的第二阶段并行开始。此筛选以与流动相筛选类似的方式进行；然而，改变了柱而不是流动相。温度从30℃升至40℃，以解决用较小粒度的柱观察到的背压问题。用于筛选的参数列举在表11和12中。
表11.用于固定相筛选的HPLC参数
表12.用于固定相筛选的HPLC梯度参数
筛选的固定相范围并入不同的反相化学以及不同的粒度和柱尺寸。最佳固定相的选择基于所有杂质的良好解析度和可比较的峰形。还需要野靛碱峰周围有一个良好的窗口，以便在必要时允许高样品装载。筛选的柱列于下表13中。展示杂质分离的报告示出于图8中。
表13.筛选的固定相
本报告中省略了Synergi极性-RP结果，因为使用此柱仅洗脱了两种化合物。Synergi MAX-RP显示野靛碱的峰形非常差。苯基和苯基-己基固定相都难以充分分离野靛碱和N-甲酰基野靛碱。C18固定相在野靛碱峰周围提供了最佳分离，表现出良好的峰形，并且解析了所有杂质。对下表14中列举的另外的C18固定相进行了筛选，以研究更多的粒度。
表14.筛选的C18固定相
编号 筛选的C18固定相
1 C18；150x4.6mm，3.5μm粒度
2 YMC C18；150x4.6mm，3.0μm粒度
3 ACE C18；150x4.6mm，3.0μm粒度
4 C18；150x4.6mm，2.7μm粒度
5 C18；150x4.6mm，2.5μm粒度
YMC 3.0μm和2.7μm C18固定相导致N-甲基野靛碱、狭叶碱和白羽扇豆碱的分离较差。YMC 3.0μm柱还给出了N-甲酰基野靛碱的分裂峰。2.7μm C18柱对于野靛碱也表现出非常差的峰形。2.5μm C18、ACE 3.0μm C18和3.5μm C18固定相可以很好地分离野靛碱和预期杂质。这些柱被带到下一阶段并且针对另外的流动相进行筛选。
5.进一步的流动相和固定相筛选
最有前途的柱和流动相组合，用于另一个更有针对性的开发阶段。使用10mM硼酸缓冲液(pH 8.0)，而不是20mM甲酸铵(pH 8.0)，因为硼酸缓冲液流动相增加了野靛碱峰周围的分离，如图9A-9C(20mM甲酸铵(pH 8.0)和甲醇)和10A-10C(XBridge C18 3.5μm和甲醇)所示出的。
此阶段筛选的流动相和固定相分别列于下表15和16中，其中系统参数列于表17和18中。由于柱上压力高，10mM硼酸缓冲液(pH 8.0)和甲醇组合无法一起以最小粒度筛选。表19示出了流动相和固定相的组合以及野靛碱峰的峰高、峰宽和USP拖尾。
表15.筛选的流动相
编号 水相 有机相
1 10mM硼酸缓冲液(pH 8.0) 乙腈
2 10mM硼酸缓冲液(pH 8.0) 甲醇
表16.筛选的固定相
A C18；150x4.6mm，3.5μm粒度
B ACE C18；150x4.6mm，3.0μm粒度
C C18；150x4.6mm，2.5μm粒度
表17.HPLC参数
系统 Agilent 1100/1200系列液相色谱图或等同物
柱 各种固定相
流动相A 10mM硼酸盐缓冲液(pH 8.0)
流动相B 甲醇/乙腈
流速 1.0毫升/分钟
停止时间 25分钟
注入体积 5μl
柱温度 40℃
波长 200nm
运行后时间 5分钟
表18.HPLC梯度参数
时间 A％ B％
0 95 5
20 5 95
24.5 5 95
25 95 5
表19.流动相和固定相的组合以及野靛碱峰的峰高、峰宽和USP拖尾
筛选的参数 野靛碱保留时间(分钟) 峰高(mAu) 峰宽＊(分钟) USP拖尾
1A 5.16 1348.19 0.1157 1.72
1B 5.97 1382.95 0.1028 1.81
1C 4.76 1769.75 0.0682 2.25
2A 7.22 981.67 0.1633 2.07
2B 8.07 1072.83 0.1333 2.68
*在半高度处测量的峰宽。
甲醇的吸光度引起野靛碱的峰高小得多，因此方法灵敏度较低。在用乙腈作为有机相的情况下野靛碱的峰宽也更窄。较小的粒度与峰高增加/峰宽减少之间也存在相关性。然而，观察到USP拖尾的增加。使用2.5μm C18柱将硼酸缓冲液调节到pH 10.0进行进一步运行。流动相中还包含5％v/v甲醇。此实验的结果示出于下表20中。此测试是在具有不同检测器的不同仪器上进行的。因此，峰高与上述结果不可直接比较。
表20.在用硼酸缓冲液的情况下筛选的pH参数
筛选的参数 野靛碱保留时间(分钟) 峰高(mAu) 峰宽＊(分钟) USP拖尾
pH 8.0 4.49 1305.12 0.08 2.43
pH 10.0 4.61 1023.32 0.06 1.01
*在半高度处测量的峰宽。
另一项测试是在将缓冲液浓度增加到25mM硼酸的情况下进行的；这也是使用2.5μm C18柱进行的。野靛碱峰的此运行的结果包含在下表21中。
表21.在用硼酸缓冲液的情况下筛选的浓度参数
筛选的参数 野靛碱保留时间(分钟) 峰高(mAu) 峰宽＊(分钟) USP拖尾
10mM硼酸缓冲液 5.10 1696.08 0.05 1.20
25mM硼酸缓冲液 5.21 1632.44 0.06 1.30
*在半高度处测量的峰宽。
这些结果示出在缓冲液浓度的增加的情况下峰形没有显著影响。根据这些结果，10mM硼酸(pH 10.0)被认为适合水性流动相。还注意到，将硼酸的pH调节剂改为氨(而不是氢氧化钠)，提高了与液相色谱质谱法(LC-MS)的相容性。
6.梯度筛选
甲醇对野靛碱峰的保留有明显影响。因此，使用甲醇和乙腈的组合作为有机相进行了简短的梯度试验。对表22中列举的以下条件(A＝10mM硼酸缓冲液(pH 8.0)、B＝甲醇和C＝乙腈)进行筛选，目的是优化杂质之间的分离并减少梯度的吸收。
表22.使用甲醇和乙腈的筛选的有机相
A＝10mM硼酸缓冲液(pH 8.0)、B＝甲醇和C＝乙腈
甲醇已被证明会影响所有筛选的杂质的分离，其中5％v/v(梯度A)甲醇足以影响分离。然而，包含甲醇确实会导致另外的复杂性，并且可能对方法稳健性有影响。图11中的色谱图还显示了在包含甲醇的情况下观察到的显著梯度上升。
开发继续进行进一步的研究，以使用100％乙腈作为有机相发现改进的梯度，因此消除了添加甲醇的复杂性。筛选了较长的梯度以及在开始时保持2分钟等度的梯度，如表23中所列举的。此梯度筛选是在流动相微调后进行的，这意味着硼酸缓冲液的pH为10，而先前的梯度是在pH 8下筛选的。流动相筛选示出，从pH 8改为pH 10改善了峰形，并且对保留时间的影响可忽略不计。因此，先前的梯度筛选和本次进一步筛选的结果仍然被认为是可比较的。将梯度筛选的结果制成表格以示出每种筛选的杂质的保留时间。将梯度与梯度A(表22)进行比较，所述梯度A是仅使用甲醇且梯度上升可接受的梯度(图12)。
表23.使用乙腈的筛选的有机相
流动相A＝10mM硼酸缓冲液pH 10.0:乙腈(95:5)
流动相B＝10mM硼酸缓冲液pH 10.0:乙腈(5:95)
选定的梯度为野靛碱和相关工艺杂质提供了最佳分离和峰形。通过引入2分钟的保持，野靛碱、N-甲酰基野靛碱和N-甲基野靛碱的保留充分增加，表明无需使用甲醇即可获得足够的色谱法。这使得双组分流动相系统具有较低的吸光度，这也不易受到过压柱的影响。最终的方法参数已列举在下表24-26中。
表24.HPLC参数
表25.HPLC梯度参数
/>
表26.杂质和中间体
7.方法性能
野靛碱和开发中筛选的所有杂质在不同响应水平下的λmax为约200nm。野靛碱、N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱和安那吉碱在308nm处具有另一个λmax。由于显著较低的梯度吸收，在308nm处所述方法的信噪比被证明高出约十倍。因此，开发转向一种以下方法：主要在308nm处分析样品，但也收集200nm的数据，以仍然检测白羽扇豆碱、狭叶碱和任何其它吸收200nm处但不吸收308nm处UV的杂质。已包含相关杂质的200nm和308nm的示例叠加，如图13A-13F所示出的。具体地，图13A和13B分别示出了在200nm和308nm处筛选的所有杂质，其中图13C和13D分别示出了在200nm和308nm处用高浓度样品收集的样品的典型色谱图。并且最后，图13E和13F分别示出了在200nm和308nm处用低浓度样品收集的样品的典型色谱图。
8.实验验证测试
野靛碱工作浓度(200μg/mL)下的系统合适性、特异性、检测限、定量限、线性度、精确度和准确度已进行了初步验证。
特异性
来自特异性测试的色谱图示出于图14A-14F中，所述图包含稀释剂的色谱图以及野靛碱、N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、安那吉碱、狭叶碱(仅200nm)和白羽扇豆碱(仅200nm)在308nm(图14A-14C)和200nm(图14D-14F)处的重叠色谱图。没有检测到野靛碱的干扰。在杂质之前注入的稀释剂空白注入示出，在所有杂质的保留时间下，没有大于定量限(LOQ)的峰。
系统合适性测试
通过注入工作浓度(200μg/mL)的野靛碱六次来进行系统合适性测试。系统合适性结果示出于表27中。
表27.系统合适性测试
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线性度
通过稀释标准储备溶液来制备线性度溶液，使稀释剂中野靛碱的浓度范围介于20与300μg/ml之间。浓度为20至300μg/ml的线性度溶液的峰面积结果以图形方式呈现在图15A-15B中。峰面积响应在测试的浓度范围内呈线性。峰面积与标称浓度的线性回归线斜率的相关系数在308nm处为0.9997并且在200nm处为0.9962。
灵敏度
进行野靛碱和所有筛选的杂质的重复注入以获得如下表28和29中所列举的理论检测限和定量限(工作浓度为0.2mg/ml)。
表28.野靛碱和相关杂质灵敏度
表29.野靛碱和相关杂质响应因子
灵敏度在308nm处大幅提高；然而，检测限(LOD)和LOQ仍然高于典型的验收标准(分别为LT0.02％、LT0.05％)。为了解决灵敏度问题，需要用10mg/mL高浓度的高/低分析方法。
测定可重复性
分别制备高浓度10mg/ml的六个野靛碱标准品，然后稀释到0.2mg/ml的工作浓度，并且一式三份注入，并根据系统合适性标准进行测定。每个标准品中掺有大约0.15％ N-甲酰基野靛碱和N-甲基野靛碱。测定结果和杂质特性结果示出于表30中。
表30.样品溶液的可重复性
测定可重复性溶液的结果给出了99.59％的平均测定，其中准确度范围为99.37％至99.90％，并且精确度为0.23％ RSD。杂质高达0.15％，并且N-甲酰基野靛碱和N-甲基野靛碱的平均值分别为0.16％和0.14％。N-甲酰基野靛碱的准确度范围为0.15％至0.16％，并且N-甲基野靛碱的准确度范围为0.137％至0.138％。杂质准确度恰好在±20.0％内。
9.野靛碱分析程序的汇总
基于上文所描述的发现，已开发出如下文所描述的分析程序。
流动相制备
将0.62g硼酸溶解于去离子水中。通过向溶液中添加氢氧化铵(35％w/w)将pH调节到10.0。通过0.22微米过滤器过滤此缓冲液。将50ml缓冲液添加到950ml乙腈中以制成流动相B。将50ml乙腈添加到剩余的950ml缓冲液中以制成流动相A。
空白/稀释剂制备
空白/稀释剂由流动相A(10mM硼酸缓冲液pH 10.0:乙腈(95:5))组成。
RT-ID标准品制备
准确称取20mg野靛碱和10mg所关注的相关物质中的每一种物质至100ml容量瓶中。在稀释剂中溶解并定容至体积。
储备样品溶液制备
准确称取100mg样品至合适的容器中。如果需要，使用超声处理溶解于10ml稀释剂中。将溶液标记为储备样品溶液。
稀释的样品溶液制备
准确吸取1ml储备样品溶液至50ml容量瓶中，并且用稀释剂稀释至体积。标记为稀释的样品溶液。
HPLC参数
下表31和32中列举了用于分析野靛碱的纯度的HPLC参数。
表31.HPLC参数
表32.HPLC梯度参数
色谱图积分以及杂质％和纯度％的计算
在储备样品色谱图中，不应对可归因于空白溶液的所有峰进行积分。在308nm处，在储备样品溶液中，应对所有峰进行积分。在200nm处对对应于白羽扇豆碱和狭叶碱的峰进行积分。另外，对200nm处储备样品中在308nm储备样品色谱图中没有对应杂质的任何峰进行积分。
PA杂质(储备溶液)在200nm或308nm处注入储备样品溶液所得的杂质峰面积。
PA野靛碱308nm(稀释剂溶液)在308nm处注入稀释的样品溶液所得的野靛碱的峰面积。
相对响应因子是在308nm处关于野靛碱计算的。然后将下表33中包含的归一化因子应用于从储备样品溶液获得的峰面积。这些归一化面积将用于杂质％计算。
表33.野靛碱纯度计算中使用的归一化面积
10.结论
总之，以下实例提供了允许对野靛碱和相关物质/杂质进行定量的方法。所述研究特别提供了能够在多个波长处解析野靛碱和预期相关杂质的梯度HPLC方法。
除非上下文另外指示，否则明确意图是可以以任何组合使用本文描述的本发明的各种特征。此外，本公开还设想，在一些实施例中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。为了说明，如果说明书指出复合物包括组分A、B和C，那么尤其期望A、B或C中的任一个或其组合可以单独地或以任何组合形式省略和否认。
段落A.一种评估野靛碱的纯度的色谱方法，所述方法包括：(a)将野靛碱样品引入到柱中，所述柱包括包含硬脂酸的固定相(C18)并且长度为150mm、内径为4.6mm并且粒度为2.5μm，其中所述野靛碱样品包括一种或多种杂质；(b)将pH为约10的第一流动相施加到所述柱，使得野靛碱和所述一种或多种杂质保留在所述柱上；(c)通过向所述柱施加pH为约10的第二流动相来洗脱野靛碱和所述一种或多种杂质；(d)检测野靛碱和所述一种或多种杂质。
段落B.根据段落A所述的色谱方法，其中将野靛碱和所述一种或多种杂质引导到质谱仪以进行步骤(d)中的检测。
段落C.根据段落A或B所述的色谱方法，其中所述第一流动相和所述第二流动相相容以注入到质谱仪中。
段落D.根据段落A至C中任一项所述的色谱方法，其中所述第一流动相和所述第二流动相包括挥发性组分。
段落E.根据段落A至D中任一项所述的色谱方法，其中所述第一流动相和所述第二流动相包括相容以注入到质谱仪中的缓冲液。
段落F.根据段落A至E中任一项所述的色谱方法，其中所述第一流动相包括比率为约95:约5的10mM硼酸缓冲液和乙腈。
段落G.根据段落A至F中任一项所述的色谱方法，其中所述第二流动相包括比率为约5:约95的10mM硼酸缓冲液和乙腈。
段落H.根据段落A至G中任一项所述的色谱方法，其中所述一种或多种杂质选自由以下组成的组：N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱、鹰爪豆碱和沙豆树碱。
段落I.根据段落H所述的色谱方法，其中将野靛碱与N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱、鹰爪豆碱和沙豆树碱中的每一种分离。
段落J.根据段落H所述的色谱方法，其中N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱、鹰爪豆碱和沙豆树碱中的每一种与野靛碱分离并且彼此分离。
段落K.根据段落A至J中任一项所述的色谱方法，其中将所述第一流动相施加到所述柱上，持续至少约2分钟。
段落L.根据段落A至K中任一项所述的色谱方法，其中将所述第二流动相施加到所述柱上，持续约20分钟至约24.5分钟。
段落M.根据段落A至L中任一项所述的色谱方法，其中检测野靛碱和所述一种或多种杂质包括在一个或多个波长处的UV/Vis吸光度检测。
段落N.根据段落M所述的色谱方法，其中所述一个或多个波长是200nm和308nm。
段落O.根据段落M所述的色谱方法，其中野靛碱是在约308nm的波长处检测到的。
段落P.根据段落M所述的色谱方法，其中所述一种或多种杂质选自由以下组成的组：N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱和安那吉碱，并且所述一种或多种杂质是在约308nm的波长处检测到的。
段落Q.根据段落M所述的色谱方法，其中所述一种或多种杂质是狭叶碱、白羽扇豆碱或两者，并且所述一种或多种杂质是在200nm的波长处检测到的。

Claims (17)

1.一种评估野靛碱的纯度的色谱方法，所述方法包括
(a)将野靛碱样品引入到柱中，所述柱包括包含硬脂酸的固定相(C18)并且长度为150mm、内径为4.6mm并且粒度为2.5μm，其中所述野靛碱样品包括一种或多种杂质；
(b)将pH为约10的第一流动相施加到所述柱，使得野靛碱和所述一种或多种杂质保留在所述柱上；
(c)通过向所述柱施加pH为约10的第二流动相来洗脱野靛碱和所述一种或多种杂质；
(d)检测野靛碱和所述一种或多种杂质。
2.根据权利要求1所述的色谱方法，其中将野靛碱和所述一种或多种杂质引导到质谱仪以进行步骤(d)中的检测。
3.根据权利要求1所述的色谱方法，其中所述第一流动相和所述第二流动相相容以注入到质谱仪中。
4.根据权利要求3所述的色谱方法，其中所述第一流动相和所述第二流动相包括挥发性组分。
5.根据权利要求3所述的色谱方法，其中所述第一流动相和所述第二流动相包括相容以注入到质谱仪中的缓冲液。
6.根据权利要求1所述的色谱方法，其中所述第一流动相包括比率为约95:约5的10mM硼酸缓冲液和乙腈。
7.根据权利要求1所述的色谱方法，其中所述第二流动相包括比率为约5:约95的10mM硼酸缓冲液和乙腈。
8.根据权利要求1所述的色谱方法，其中所述一种或多种杂质选自由以下组成的组：N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱、鹰爪豆碱和沙豆树碱。
9.根据权利要求8所述的色谱方法，其中野靛碱与N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱和鹰爪豆碱中的每一种分离。
10.根据权利要求8所述的色谱方法，其中N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱、狭叶碱、白羽扇豆碱、安那吉碱、鹰爪豆碱和沙豆树碱中的每一种与野靛碱分离并且彼此分离。
11.根据权利要求1所述的色谱方法，其中将所述第一流动相施加到所述柱上，持续至少约2分钟。
12.根据权利要求1所述的色谱方法，其中将所述第二流动相施加到所述柱上，持续约20分钟至约24.5分钟。
13.根据权利要求1所述的色谱方法，其中检测野靛碱和所述一种或多种杂质包括在一个或多个波长处的UV/Vis吸光度检测。
14.根据权利要求13所述的色谱方法，其中所述一个或多个波长是200nm和308nm。
15.根据权利要求13所述的色谱方法，其中野靛碱是在约308nm的波长处检测到的。
16.根据权利要求13所述的色谱方法，其中所述一种或多种杂质选自由以下组成的组：N-甲酰基野靛碱、N-甲基野靛碱和安那吉碱，并且所述一种或多种杂质是在约308nm的波长处检测到的。
17.根据权利要求13所述的色谱方法，其中所述一种或多种杂质是狭叶碱、白羽扇豆碱或两者，并且所述一种或多种杂质是在200nm的波长处检测到的。
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