CN117916387A - 用于rna亲和纯化的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开文本提供用于RNA亲和纯化的方法和组合物。特别地，本公开文本涉及制备和使用mRNA的组合物和方法，所述mRNA包含一个或多个特异性结合亲和配体的适配体。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年9月2日提交的美国临时申请号63/240,027和2022年7月20日提交的EP优先申请号22315159.8的优先权权益，每项申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入。
背景技术
信使RNA(mRNA)治疗学正在变成越来越重要的用于治疗多种疾病的方法，并且是一种新出现的对蛋白质替代疗法、抗体疗法、常规疫苗疗法和/或基因疗法的备选方案。在mRNA治疗学中，将编码目的蛋白或肽的mRNA递送至患者或患者的靶细胞。在mRNA进入患者的靶细胞中之后，患者的翻译机构产生且随后表达所述目的蛋白或肽。因此，重要的是确保高纯度且安全的mRNA产物的产生。
用于治疗的mRNA通常使用体外转录系统用诸如RNA聚合酶的酶来合成，所述RNA聚合酶从模板质粒DNA转录mRNA，同时或随后进行5'-帽的添加和3'-多腺苷酸化。此类反应得到组合物，所述组合物包括全长mRNA和多种不期望的污染物，例如，蛋白质、非RNA核酸、不期望的RNA种类、亚精胺、DNA、焦磷酸盐、内毒素、洗涤剂和有机溶剂。这些污染物必须加以纯化以提供适合于治疗应用的清洁且均质的mRNA。
业内仍然需要更有效、更可靠且更安全的从大规模制造工艺纯化RNA的方法，用于潜在治疗应用。
发明内容
根据本文的描述将了解，本公开文本涵盖多个方面和实施方案，它们包括但不限于以下：
在一个方面，本公开文本提供一种信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列，其中所述mRNA包含至少一个RNA适配体。
在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌于RNA支架中。
在一些实施方案中，所述RNA支架包含至少一个二级结构基序。在一些实施方案中，所述二级结构基序是四环、假结或茎环。在一些实施方案中，所述RNA支架包含至少一个三级结构。在一些实施方案中，所述二级结构基序和/或所述三级结构具有核酸酶抗性。
在一些实施方案中，所述RNA支架是转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)或核酶。在一些实施方案中，所述核酶无催化活性。在一些实施方案中，所述RNA支架包含转移RNA(tRNA)。在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌于所述tRNA的tRNA发夹环中。在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌于所述tRNA的tRNA反密码子环中。在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌于所述tRNA的tRNA D环中。在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌于所述tRNA的tRNA T环中。
在一些实施方案中，所述RNA适配体定位于所述5'UTR中。在一些实施方案中，所述RNA适配体定位于所述ORF的3'端与所述3'UTR的5'端之间。在一些实施方案中，所述RNA适配体定位于所述3'UTR中。在一些实施方案中，所述RNA适配体定位于所述3'UTR的3'端与所述多A序列的5'端之间。在一些实施方案中，其中所述RNA适配体定位于所述多A序列的3'端。
在一些实施方案中，所述mRNA包含一个RNA适配体或由其组成。在一些实施方案中，所述mRNA包含一个与四个之间的RNA适配体。在一些实施方案中，所述RNA适配体是相同的。在一些实施方案中，所述RNA适配体是不同的。
在一些实施方案中，所述RNA适配体是合成来源的。在一些实施方案中，所述RNA适配体是裂开型适配体或X适配体。在一些实施方案中，所述RNA适配体是天然来源的。在一些实施方案中，所述RNA适配体源自发夹RNA、tRNA或核糖开关(riboswitch)。
在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌于生物正交支架中。
在一些实施方案中，所述生物正交支架是V5、F29、F30或其变体。
在一些实施方案中，所述生物正交支架包含SEQ ID NO:34的5'核苷酸序列和SEQID NO:35的3'核苷酸序列，其中适配体序列定位于SEQ ID NO:34与SEQ ID NO:35之间。
在一些实施方案中，所述生物正交支架包含SEQ ID NO:39的5'核苷酸序列、SEQID NO:40的内部核苷酸序列和SEQ ID NO:41的3'核苷酸序列，其中第一适配体序列定位于SEQ ID NO:39与SEQ ID NO:40之间并且第二适配体序列定位于SEQ ID NO:40与SEQ IDNO:41之间，任选地其中所述第一和所述第二适配体是相同的或不同的。
在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌入的生物正交支架包含SEQ ID NO:29或SEQID NO:31的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述RNA适配体与亲和配体结合。在一些实施方案中，所述亲和配体包括蛋白A、蛋白G、链霉抗生物素蛋白、谷胱甘肽、右旋糖酐或荧光分子。在一些实施方案中，所述亲和配体包括链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，所述亲和配体固定在色谱树脂上。
在一些实施方案中，所述RNA适配体是S1m或Sm。在一些实施方案中，所述mRNA包含一个与四个之间的S1m或sm RNA适配体。在一些实施方案中，所述S1m或sm RNA适配体定位于：1)所述ORF的3'端与所述3'UTR的5'端之间；2)所述3'UTR中；3)所述3'UTR的3'端与所述多A序列的5'端之间；和/或；4)所述多A序列的3'端。在一些实施方案中，所述RNA适配体包含SEQ ID NO:2或6的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌入的tRNA包含SEQID NO:7的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述mRNA编码至少一种多肽。在一些实施方案中，所述多肽是生物活性多肽、治疗性多肽或抗原性多肽。在一些实施方案中，所述抗原性多肽包括抗体或其片段、酶替代多肽或基因组编辑多肽。在一些实施方案中，所述治疗性多肽包括抗体重链、抗体轻链、酶或细胞因子。在一些实施方案中，所述生物活性多肽包括基因组编辑多肽。
在一些实施方案中，所述mRNA含有嵌合5'或3'UTR。
在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰是假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，所述化学修饰是假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷或其组合。在一些实施方案中，所述化学修饰是N1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，所述多A序列是至少10个连续腺苷残基。在一些实施方案中，所述多A序列是10个与500个之间的连续腺苷残基。在一些实施方案中，所述mRNA包含两个多A序列，每个多A序列包含10个与500个之间的连续腺苷残基，其中至少一个RNA适配体或RNA适配体嵌入的tRNA定位于所述两个多A序列之间。
在一些实施方案中，所述mRNA包含5'帽。
在一些实施方案中，所述mRNA的翻译效率与不含RNA适配体的mRNA相比基本上相同。
在一些实施方案中，所述mRNA是使用体外转录(IVT)合成的。
在一些实施方案中，所述mRNA是在体内或离体表达的。
在一个方面，本公开文本提供一种编码上述mRNA的载体。在一些实施方案中，所述载体从5'至3'包含至少元件a-e：a)RNA聚合酶启动子；b)编码5'UTR的多核苷酸序列；c)编码ORF的多核苷酸序列；d)编码3'UTR的多核苷酸序列；以及e)编码至少一个RNA适配体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述载体还包含编码多A序列和/或多腺苷酸化信号的多核苷酸序列。
在另一个方面，本公开文本提供一种包含上述载体的宿主细胞。
在另一个方面，本公开文本提供一种包含上述mRNA的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物在治疗或预防疾病或障碍的方法中被施用至有需要的受试者。
在另一个方面，本文公开一种用于纯化mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使包含所述mRNA的样品与固定在色谱树脂上的亲和配体接触，其中所述RNA适配体包含对所述亲和配体的结合亲和力；(b)从所述色谱树脂洗脱所述mRNA；以及(c)从所述样品纯化所述mRNA。在一些实施方案中，所述方法包括在所述接触步骤(a)与所述洗脱步骤(b)之间的一个或多个洗涤步骤。
在另一个方面，本文公开一种纯化RNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使包含所述RNA的样品与固定在色谱树脂上的亲和配体接触；(b)从所述色谱树脂洗脱所述RNA；以及(c)从所述样品分离所述RNA，其中所述RNA包含至少一个开放阅读框(ORF)和至少一个RNA适配体，其中所述RNA适配体包含对所述亲和配体的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述RNA还包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列。
在一些实施方案中，所述RNA具有至少约500个核苷酸的长度、至少约750个核苷酸的长度、至少约1,000个核苷酸的长度、至少约1,500个核苷酸的长度、至少约2,000个核苷酸的长度、至少约2,500个核苷酸的长度、至少约3,000个核苷酸的长度、至少约3,500个核苷酸的长度、至少约4,000个核苷酸的长度、至少约4,500个核苷酸的长度或至少约5,000个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述RNA包含5'帽。在一些实施方案中，所述RNA是mRNA。
在一些实施方案中，所述mRNA为大于或等于90％纯。
在另一个方面，本文公开一种用于纯化mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使包含所述mRNA的样品与固定在色谱树脂上的亲和配体接触；(b)从所述色谱树脂洗脱所述mRNA；以及(c)从所述样品分离所述mRNA，其中所述mRNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)、至少一个多腺苷酸化(多A)序列和至少一个RNA适配体，其中所述RNA适配体包含对所述亲和配体的结合亲和力。在一些实施方案中，所述mRNA为大于或等于90％纯。
在另一个方面，本文公开一种包含多个mRNA分子的药物组合物，其中至少约90％的mRNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)、至少一个多腺苷酸化(多A)序列和至少一个RNA适配体。
在另一个方面，本文公开一种信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列，其中所述mRNA包含至少一个tRNA。
在另一个方面，本文公开一种信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列，其中所述mRNA包含至少一个RNA适配体嵌入的tRNA。
在另一个方面，本文公开一种信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列，其中所述mRNA包含至少一个RNA适配体嵌入的生物正交支架。
附图说明
根据说明性实施方案的以下详细描述，结合附图，将更全面地理解本公开文本的前述和其他特征和优点。
图1用图示表示适配体标记的mRNA亲和纯化方法中的步骤。
图2显示在与链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠一起孵育之前(输入)或者在用随机适配体或S1m适配体进行链霉抗生物素蛋白亲和结合纯化和洗脱步骤之后(未结合的与洗脱的)，如在Nanodrop上测量的RNA浓度(ng)。在亲和纯化后回收的RNA百分比是相对于未经历亲和纯化的输入样品。
图3描绘携带用4xS1m适配体标记的ARE元件的pAM14(2,496bp)或携带未标记的ARE元件的pAM15质粒(2,168bp)的质粒图谱。
图4显示在与链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠一起孵育之前(输入)或者在用TNFα-53标记的4xS1m适配体mRNA或TNFα-53mRNA阴性对照进行链霉抗生物素蛋白亲和结合纯化和洗脱步骤之后(未结合的与洗脱的)，如在Nanodrop上测量的RNA浓度(ng)。纯化的RNA百分比是相对于未经历亲和纯化的输入样品。
图5描绘含有以下构建体的以下质粒图谱：(1)pAM22，2,173bp的对照质粒，携带热自养甲烷嗜热杆菌(M.thermautotrophicust)tRNAGLN2支架(pAM22(tRNA)；质粒图谱注释反密码子臂相对于Gln2反密码子环的位置)，(2)pAM20，2,134bp的对照质粒，携带Sm适配体(pAM20(Sm))，(3)pAM21，2,206bp的实验质粒，携带嵌于反密码子环tRNAGLN2序列的一部分中的Sm适配体序列，所述部分的两侧侧接tRNA反密码子臂序列(pAM21(tRNA Sm))，以及(4)pAM23，2,306bp的实验质粒，携带Sm-tRNAGLN2构建体的串联二重复序列配置(2x tRNA Sm)。每个标记由T7启动子驱动。
图6显示在与链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠一起孵育之前(输入)或者在用含有Sm、tRNA、tRNA-Sm和2x tRNA Sm适配体标记mRNA进行链霉抗生物素蛋白亲和结合纯化洗涤步骤之后(洗涤1-3)和洗脱步骤之后(洗脱的)，如在Nanodrop上测量的RNA浓度(ng)。在亲和纯化后回收的RNA百分比是相对于未经历亲和纯化的输入样品。
图7说明基于适配体-转录物位置、适配体拷贝数、嵌于tRNA支架中的适配体和嵌于tRNA支架中的适配体的串联重复序列拷贝，用于mRNA的优化的结合亲和力和翻译的适配体标记策略。
图8描绘携带人源化增强型绿色荧光蛋白(hEGFP)的pAM11(3,541bp)和携带用4xS1m适配体标记的hEGFP的pAM8质粒(3,213bp)的质粒图谱。
图9是对于hEGFP(泳道1，源自pAM11)和用4xS1m适配体标记的hEGFP(泳道2，源自pAM8)，含有从PCR产物模板的IVT反应生成的mRNA的琼脂糖凝胶的图像。
图10显示在与链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠一起孵育之前(输入)或者在用含有hEGFP或用4xS1m适配体标记的hEGFP的mRNA进行链霉抗生物素蛋白亲和结合纯化和洗脱步骤之后(洗脱的)，如在Nanodrop上测量的RNA浓度(ng)。纯化的RNA百分比是相对于未经历亲和纯化的输入样品。
图11是在24小时后获取的用hEGFP或hEGFP-4xS1m mRNA转染的HEK293FT细胞的代表性荧光显微术图像。
图12展示在24小时后获取的用以下转染的HEK293FT细胞的一组代表性荧光显微术图像：hEGFP(左列，上图)、hEGFP-4xS1m(左列，下图)、具有更长多A尾的hEGFP(右列，上图)或者具有更长多A尾的hEGFP-4xS1m(右列，下图)mRNA。
图13A-图13B测试S1m适配体的拓扑顺序是否会影响下游mRNA亲和纯化。图13A是设计用于测试mRNA转录物中的S1m适配体位置的实验构建体的示意图。将S1m适配体置于：(1)5'UTR的直接上游；(2)3'UTR的直接上游；(3)3'UTR中；(4)3'UTR的直接下游；或者(5)多A序列的3'端中。图13B显示在进行链霉抗生物素蛋白结合和洗脱步骤之后(未结合的与洗脱的)，相对于未经历亲和纯化的输入样品，在亲和纯化后回收的RNA百分比。
图14测试转录物中的适配体拷贝数(价态)是否会影响下游mRNA亲和纯化。图14显示在用含有一拷贝与六拷贝之间的S1m适配体的mRNA构建体进行链霉抗生物素蛋白结合和洗脱步骤之后(未结合的与洗脱的)，相对于未经历亲和纯化的输入样品，在亲和纯化后回收的RNA百分比。
图15显示在用含有不同蛋白质编码序列(新加坡'16血凝素)和不同UTR的经2xS1m、4xS1m或tRNA S1m适配体标记的mRNA进行链霉抗生物素蛋白结合和洗脱步骤之后(未结合的与洗脱的)，相对于未经历亲和纯化的输入样品，在mRNA亲和纯化后回收的RNA百分比。
图16A-图16C测试mRNA转录物中的适配体布局是否会影响HSKMc细胞中的翻译动力学。图16A是设计用于测试S1m适配体相对于mRNA的其他拓扑有序组分的位置的影响的实验构建体的示意图。图16B是对于用未标记的对照mRNA或图16A中所示的五种适配体标记的mRNA之一转染的HSKMc细胞，如通过流式细胞术分析所计算的GFP阳性细胞的总数(表示为百分比)的条形图。图16C是展示图16B中GFP阳性高细胞的数量(表示为百分比)的条形图。
图17A-图17C测试mRNA转录物中的适配体布局是否会影响Hela细胞中的翻译动力学。图17A是设计用于测试S1m适配体相对于mRNA的其他拓扑有序组分的位置的影响的实验构建体的示意图。图17B是对于用未标记的对照mRNA或图17A中所示的五种适配体标记的mRNA之一转染的Hela细胞，如通过流式细胞术分析所计算的GFP阳性细胞的总数(表示为百分比)的条形图。图17C是仅展示图17B中GFP阳性高细胞的数量(表示为百分比)的条形图。
图18描绘对于用对照或用多A尾长度增加的经适配体标记的mRNA(标记的，“适配体，多(A)2x60_6+A's”)转染的Hela细胞，如通过流式细胞术分析所计算的GFP阳性细胞的总数(表示为百分比)的条形图。
图19A-图19B检查用tRNA支架稳定S1m适配体是否会影响mRNA亲和纯化和随后的mRNA翻译效率。图19A是条形图，其显示在用未标记的mRNA对照、经2xS1m适配体、4xS1m适配体转录物或tRNA S1m适配体标记的mRNA进行链霉抗生物素蛋白结合和洗脱步骤之后(未结合的与洗脱的)，相对于输入样品，在mRNA亲和纯化后回收的RNA百分比。图19B是在用未标记的mRNA对照或tRNA S1m适配体标记的mRNA(标记的，“tRNA稳定的适配体”)转染后，如通过流式细胞术分析所计算的GFP阳性Hela细胞的总数(表示为百分比)的条形图。
图20A是由F30适配体形成的二级RNA结构。图20B是条形图，其显示在用未标记的mRNA对照、经4xS1m适配体、在F30支架中稳定的1xS1m适配体(F30-1xS1m)或在F30支架中稳定的2xS1m适配体(F30-2xS1m)标记的mRNA进行链霉抗生物素蛋白结合和洗脱步骤之后(未结合的与洗脱的)，相对于输入样品，在mRNA亲和纯化后回收的RNA百分比。图20C显示在与链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠一起孵育之前(输入)或者在用未标记的mRNA对照、经4xS1m适配体、F30-2xS1m适配体或F30-1xS1m标记的mRNA进行链霉抗生物素蛋白亲和结合纯化和洗脱步骤(洗脱的)之后，如在Nanodrop上测量的RNA浓度(ng)。
具体实施方式
本公开文本尤其涉及用于RNA亲和纯化的新型mRNA组合物和方法。特别地，本公开文本涉及包含至少一个RNA适配体的mRNA组合物。与所公开的mRNA组合物相关的RNA适配体使得能够使用有效亲和纯化方法，且对翻译效率和免疫原性的影响极小。本文还公开制备这些mRNA标记的适配体组合物的方法。
I.定义
除非本文另有定义，结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员一般所理解的含义。示例性方法和材料描述于下文中，但是在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的方法和材料。在矛盾的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、医学和药物化学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的术语以及这些领域的技术是本领域中熟知且常用的那些。酶反应和纯化技术根据制造商的说明书来进行，如本领域中通常所完成的或如本文所述。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在本说明书和实施方案通篇中，将理解词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或者变体如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”暗示包括所述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。本文提及的所有出版物和其他参考文献均通过引用以其整体并入。尽管本文引用了许多文件，但此引用并不意味着承认这些文件中的任一个构成本领域公知常识的一部分。
应注意，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”实体是指一个/一种或多个/多种所述实体：例如，“一个核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)、“一个/一种或多个/多种”以及“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。
此外，本文使用的“和/或”被视为两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一特征或组分一起的特定公开。因此，如在本文中的短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独的)以及“B”(单独的)。同样，如在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意图包括以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)；以及C(单独的)。
应理解，在本文中无论何处用语言“包含(comprising)”描述方面，也提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的措辞描述的其他类似的方面。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,学术出版社；以及Oxford Dictionary ofBiochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,牛津大学出版社，可能为本领域技术人员提供本公开文本中所使用的许多术语的一般解释。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)认可的形式表示。数值范围包括限定所述范围的数字。除非另有指示，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制。因此，通过从整体上参考说明书，可以更全面地定义下文紧接着定义的术语。
术语“大约”或“约”在本文中用于意指大约、大致、大概或在……左右。当术语“约”与数值范围一起使用时，它通过扩展所述数值的上下边界来修饰该范围。通常，术语“约”可以将数值修饰为高于和低于所述值某个差值(例如，10％)上或下(更高或更低)。在一些实施方案中，所述术语指示偏离所示数值±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％或±0.01％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±10％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±5％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±4％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±3％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±2％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±1％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.9％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.8％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.7％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.6％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.5％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.4％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.3％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.1％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.05％。在一些实施方案中，“约”指示偏离所示数值±0.01％。
根据上下文，术语“多核苷酸”或“核苷酸”可以包括单一核酸以及复数种核酸。在一些实施方案中，多核苷酸是一种分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。在一些实施方案中，多核苷酸包含常规磷酸二酯键。在一些实施方案中，多核苷酸包含非常规键(例如，酰胺键，如发现于肽核酸(PNA)中)。术语“核酸”可以是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如，DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意图是已经从其天然环境中取出的核酸分子(DNA或RNA)。例如，出于本公开文本的目的，载体中所含的编码因子VIII多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的其他例子包括在异源宿主细胞中维持或从溶液中的其他多核苷酸纯化(部分或基本)的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括本公开文本的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本公共文本的分离的多核苷酸或核酸进一步包括以合成方式产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可包括调节元件，如启动子、增强子、核糖体结合位点或转录终止信号。
如本文所用，术语“多肽”意图涵盖单数种“多肽”以及复数种“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语均包括在“多肽”的定义中，且术语“多肽”可以代替这些术语中的任一个使用，或与其可互换地使用。术语“多肽”还意图是指多肽的表达后修饰的产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成产生。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。不要求特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以仅仅从其天然或自然环境中除去。出于本公开文本的目的，宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被视为是分离的，已经通过任何合适的技术分开、分级分离或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被视为是分离的。
如本文所用的“施用(administer)”或“施用(administering)”是指向受试者递送本文所述的组合物，例如，嵌合蛋白。可以使用本领域中已知的方法将组合物(例如，嵌合蛋白)施用至受试者。特别地，可以以以下方式施用组合物：静脉内、皮下、肌内、皮内或经由任何黏膜表面(例如，口服、舌下、经颊、经鼻、直肠、阴道或经由肺途径)。在一些实施方案中，施用是静脉内的。在一些实施方案中，施用是皮下的。在一些实施方案中，施用是自我施用。在一些实施方案中，父母将嵌合蛋白施用至儿童。在一些实施方案中，由医疗保健从业者(如医生、医师或护士)将嵌合蛋白施用至受试者。
II.信使RNA(mRNA)
本文公开包含RNA适配体的mRNA组合物。mRNA通常被认为是将信息从DNA运载至核糖体的RNA类型。mRNA的存在通常非常短暂并且包括加工和翻译，之后被降解。通常，在真核生物中，mRNA加工包括在N末端(5')添加“帽”和在C末端(3')添加“尾”。
典型的帽是7-甲基鸟苷帽，其为经由5'-5'-三磷酸键与第一转录的核苷酸连接的鸟苷。所述帽的存在在提供对在大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性方面是重要的。5'帽通常如下来添加：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸去除末端磷酸基之一，留下两个末端磷酸；然后经由鸟苷酸转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)添加至所述末端磷酸，产生5'5'5三磷酸连接；然后通过甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。
尾通常是多腺苷酸化事件，借此将多腺苷酰基部分添加至mRNA分子的3'端。该“尾”的存在用于保护mRNA免受外切核酸酶降解。信使RNA由核糖体翻译为构成蛋白质的一系列氨基酸。
在一些实施方案中，mRNA包括5'和/或3'非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含5'UTR，所述5'UTR包括影响mRNA的稳定性或翻译的一个或多个元件。在一些实施方案中，5'UTR的长度可以在约50个与500个核苷酸之间。在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含3'UTR，所述3'UTR包含以下中的一个或多个：多腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的位置稳定性的蛋白质的结合位点、或者miRNA的一个或多个结合位点。在一些实施方案中，3'UTR的长度可以在50个与500个核苷酸之间或更长。在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含源自与mRNA转录物编码的基因不同的基因的5'或3'UTR。在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含嵌合的5'或3'UTR。
本文公开的mRNA可以根据多种已知方法中的任一种来合成。例如，根据本发明的mRNA可以通过体外转录(IVT)来合成。用于体外转录的方法是本领域中已知的。参见例如，Geall等人(2013)Semin.Immunol.25(2):152-159；Brunelle等人(2013)MethodsEnzymol.530:101-14。简言之，IVT通常用以下来进行：含有启动子的线性或环状DNA模板、核糖核苷三磷酸的库、可以包括DTT和镁离子的缓冲液系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切条件将根据具体应用而变化。这些试剂的存在在最终mRNA产物中是不期望的，并且被视为杂质或污染物，必须加以纯化以提供适合于治疗应用的清洁且均质的mRNA。尽管在一些实施方案中从体外转录反应提供的mRNA可能是期望的，但其他mRNA来源可以根据本公开文本来使用，包括从细菌、真菌、植物和/或动物产生的野生型mRNA。
本文公开的方法可以用于纯化多种核苷酸长度的mRNA。在一些实施方案中，所公开的方法可以用于纯化长度大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb或15kb的mRNA。本文公开的mRNA可以是修饰的或未修饰的。在一些实施方案中，本文公开的mRNA含有通常增强RNA稳定性的一个或多个修饰。示例性修饰包括主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，所公开的mRNA可以从天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(修饰的核苷酸)合成，所述天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及如嘌呤和嘧啶的修饰的核苷酸类似物或衍生物，如例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、5-甲基氨甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、辫苷、β-D-甘露糖基-辫苷、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-去氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。在一些实施方案中，所公开的mRNA包含至少一个化学修饰，所述化学修饰包括但不限于以下，由以下组成：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括N1-甲基假尿苷。此类类似物的制备是本领域技术人员已知的，例如来自美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和美国专利号5,700,642。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA含有源自单一基因或单一合成或表达构建体的mRNA。然而，在一些实施方案中，本文公开的mRNA组合物包含多种mRNA转录物，并且每一种可以编码或共同编码一种或多种蛋白质。
在一些实施方案中，包含如本文公开的RNA适配体的mRNA编码治疗性多肽。在一些实施方案中，所述治疗性多肽包括抗体重链、抗体轻链、酶或细胞因子。
在一些实施方案中，所述mRNA编码细胞因子。细胞因子的非限制性例子包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、INF-y、GM-CFS、M-CSF、LT-β、TNF-α、生长因子和hGH。
在一个实施方案中，包含RNA适配体的mRNA编码基因组编辑多肽。在一些实施方案中，所述基因组编辑多肽是CRISPR蛋白、限制性核酸酶、兆核酸酶、转录激活因子样效应蛋白(TALE，包括TALE核酸酶TALEN)或锌指蛋白(ZF，包括ZF核酸酶ZFN)。参见例如，国际公开号WO 2020139783。
在一些实施方案中，所述mRNA编码用于酶替代疗法中的酶。酶替代疗法的例子包括溶酶体病，如戈谢病、法布里病、MPS I、MPS II(亨特氏综合征)、MPS VI和糖原贮积症II型。
在一些实施方案中，包含RNA适配体的mRNA编码目的抗原。所述抗原可以是源自病毒的多肽，所述病毒例如流行性感冒病毒、冠状病毒(例如，SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或MERS相关病毒)、埃博拉病毒、登革病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、巨细胞病毒(CMV)、寨卡病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人变性肺病毒(hMPV)、人副流感病毒3型(PIV3)、EB病毒(EBV)或基孔肯亚病毒。
抗原可以源自细菌，例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、莫拉菌属(Moraxella)(例如，卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)；引起耳炎、呼吸道感染和/或鼻窦炎)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(引起衣原体)、疏螺旋体属(borrelia)(例如，伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，引起莱姆病)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)(引起炭疽)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(引起伤寒)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(引起结核病)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)(引起痤疮)或不可分型的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。
在期望的情况下，包含RNA适配体的mRNA可以编码超过一种抗原。在一些实施方案中，本文公开的mRNA编码两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种抗原。这些抗原可以来自相同或不同病原体。例如，多顺反子mRNA可以被翻译为超过一种抗原(例如，每个抗原编码序列由编码自切割肽(如2A肽)的核苷酸接头隔开)并且可以进一步与适配体融合。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA组合物用于疫苗中。mRNA疫苗提供传统亚单位疫苗(其含有源自病原体的抗原性蛋白)的有前景的备选方案。基于mRNA的疫苗允许在接种疫苗的受试者体内从头表达复杂抗原，这又允许所述抗原进行适当的翻译后修饰并以其天然构象来呈递。此外，一旦确立，mRNA疫苗的制造工艺可以用于多种抗原，从而使得mRNA疫苗能够进行快速开发和部署。对mRNA疫苗的详细讨论可以发现于Pardi,等人(2018)NatRev Drug Discov 17,261-279中。
III.适配体
RNA亲和纯化的广泛使用因为缺少有效的RNA融合标记而受限。除非要纯化的RNA天然含有对可以固定在固定相(即，色谱树脂)上的靶标具有强亲和力的序列，否则所述RNA可能需要具有这样的特定序列的标记，类似于蛋白质科学中使用的多组氨酸标记。
本文公开mRNA组合物，所述mRNA组合物包含至少一种适配体。与这些mRNA组合物相关的适配体使得能够使用亲和纯化且对翻译效率和免疫原性的影响极小。本文还公开制备此类mRNA标记的适配体组合物的方法。
如本文所用术语“适配体”是指具有特定靶标的非共价结合位点的任何核酸序列。示例性适配体靶标包括核酸序列、蛋白质、肽、抗体、小分子、矿物、抗生素和其他。适配体结合位点可能源自所述适配体的二级、三级或四级构象结构。
如本文所用术语“RNA适配体”是指由RNA构成的适配体。在一些实施方案中，RNA适配体包括在mRNA转录物的核苷酸序列中。在其他实施方案中，RNA适配体与mRNA转录物的核苷酸序列分开。
适配体通常能够以高亲合力和特异性与特定靶标结合。适配体具有优于其他结合蛋白(例如抗体)的几项优点。例如，适配体可以在体外被完全工程化(例如，通过SELEX适配体选择方法)，可以通过化学合成来产生，具有期望的储存特性，并且在治疗性应用中激发极小的免疫原性或不激发免疫原性。总体上参见Proske等人,(2005)Appl.Microbiol.Biotechnol 69:367-374。
适配体在历史上用于通过与配体直接结合来调节基因表达。这些适配体的作用类似于调节蛋白，针对靶标形成高特异性结合袋，之后发生构象变化。
在一些实施方案中，RNA适配体是合成来源的。在一些实施方案中，RNA适配体天然地源自原核生物和/或真核生物。在一些实施方案中，RNA适配体源自发夹RNA、tRNA或核糖开关。
在一些实施方案中，RNA适配体源自核糖开关。核糖开关是调节性RNA元件，其作为小分子传感器作用于控制基因转录和翻译。几个核糖开关类别是本领域中已知的。示例性核糖开关包括B12核糖开关、TPP核糖开关、SAM核糖开关、鸟嘌呤核糖开关、FMN核糖开关、赖氨酸核糖开关和PreQ1核糖开关。
在一些实施方案中，RNA适配体是裂开型适配体。裂开型适配体是脱落蛋白质系统(例如β半乳糖苷酶)的类似物，并且依赖于两个或更多个短核酸链，所述短核酸链在特定靶标的存在下组装成更高阶的结构。Debais等人(2020)Nucleic Acids Res 48(7):3400-3422。示例性裂开型适配体是ATP-适配体。Sassanfar&Szostak(1993)Nature364(6437)-550-553。ATP适配体是RNA适配体，其通过去除闭合茎的环来分为两个RNA片段，并且通过用另外的核苷酸延长每个片段来补偿稳定性的损失。两个RNA片段都不单独结合ATP，但是在ATP的存在下结合能力被重新激活。Debiais等人(2020)Nucleic Acids Res 48(7):3400-3422。
在一些实施方案中，RNA适配体是X-适配体。X-适配体用天然核苷酸与化学修饰的核苷酸的组合进行工程化，以改善结合亲和力、特异性和通用性。X-适配体的示例性实施方案是PS2-适配体。PS2-适配体是一种RNA适配体，其含有在RNA适配体的单一核苷酸处的二硫代磷酸酯(即，PS2)取代，所述取代将所述适配体的结合亲和力从纳摩尔级增加至皮摩尔级。Abeydeera等人(2016)Nucleic Acids Res.44(17):8052-8064。
在一些实施方案中，RNA适配体与配体结合。在一些实施方案中，配体用于亲和纯化系统中。在一些实施方案中，亲和配体包括蛋白A、蛋白G、链霉抗生物素蛋白、谷胱甘肽(GSH)、右旋糖酐(sephadex)、纤维素(例如，二乙氨乙基纤维素)或荧光分子。在一些实施方案中，亲和配体固定在色谱树脂上。
在一些实施方案中，亲和配体包括蛋白A。先前已经显示DNA适配体可靶向蛋白A。参见例如，Stoltenburg等人(2016)Sci Rep.6:33812。
在一些实施方案中，所公开的RNA适配体结合链霉抗生物素蛋白。链霉抗生物素蛋白结合适配体描述于例如Srisawat&Engelke(2001)RNA 7(4):632-641中。
本文还公开与sephadex结合的RNA适配体。Sephadex结合适配体描述于例如Srisawat等人(2001)Nucleic Acid Res 29(2):e4中。
本文还公开与谷胱甘肽(GSH)结合的RNA适配体。谷胱甘肽结合适配体描述于例如Bala,等人(2011).RNA Biology 8(1):101-111中。在一些实施方案中，RNA适配体是GSHapt8.17或GSHapt 5.39。
本文还公开与荧光分子结合的RNA适配体。此类适配体的例子描述于例如Paige等人(2011)Science 333(6042):642-646中。
在一些实施方案中，RNA适配体包括S1m适配体。在一些实施方案中，根据本公开文本使用的S1m适配体是以下文献中所述的适配体：Bachler等人(1999)RNA 5(11):1509-1516；Srisawat&Engelke(2001)RNA 7(4):632-641；或Li&Altman.(2002)Nuc.AcidsRes.30(17):3706-3711。在一些实施方案中，RNA适配体包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA适配体包括Sm适配体。在一些实施方案中，RNA适配体包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
A.适配体位置
已报道将适配体引入mRNA中会影响翻译。适配体在mRNA上的位置可能部分决定了对翻译的影响的大小。例如，通常认为，在将结构化RNA插入转录物的5'-UTR中时，可能会降低蛋白质翻译水平。Babendure等人,(2006).RNA 12:851-861；Kotter等人(2009)NucAcids Res 37(18):e120。将适配体插入mRNA分子的5'UTR中可以形成发夹环，所述发夹环改变mRNA的结构并阻断到核糖体的通路，从而阻止翻译。参见例如，美国专利申请公开号2007/0136827。
本文公开RNA适配体，所述RNA适配体包括相对于mRNA的ORF在不同位置的适配体。RNA适配体在mRNA上的位置的选择可以关于调节翻译的幅度和基础表达水平二者来评价。例如，可以构建报告构建体，其含有在5'-UTR内不同位置(从帽或起始密码子起在0至100个碱基之间)的适配体。在一些实施方案中，可以保留在适配体之后的下游区域以保存肽前导序列，从而限制相对于适配体的上游序列的改变。
在一些实施方案中，RNA适配体定位于5'UTR中。在一些实施方案中，RNA适配体定位在5'UTR之后且紧接在蛋白质编码ORF之前。在一些实施方案中，RNA适配体定位在蛋白质编码开放阅读框(ORF)之后且紧接在3'UTR之前。在一些实施方案中，RNA适配体定位于ORF的3'端与3'UTR的5'端之间。在一些实施方案中，RNA适配体定位于3'UTR中。在一些实施方案中，RNA适配体定位于3'UTR的下游且紧接在多A尾之前。在一些实施方案中，RNA适配体定位于3'UTR的3'端与多A序列的5'端之间。在一些实施方案中，RNA适配体定位在紧接多A尾之后(即，在转录物的末端)。在一些实施方案中，RNA适配体定位于多A序列的3'端。
在一些实施方案中，RNA适配体不一定与mRNA直接结合。在一些实施方案中，RNA适配体与接头连接。参见例如，Elenko等人(2009)J Am Chem Soc.131(29):9866-9867。
在一些实施方案中，可以在亲和纯化后从mRNA去除RNA适配体。这可以例如使用与RNA适配体或RNA支架杂交的DNA寡核苷酸来实现。然后可以用酶(如RNA酶H)切割所得双链体。参见例如，Batey RT.(2014).Curr Opin Struct Biol.26:1-8。
B.适配体拷贝数
适配体拷贝数的增加可以允许适配体产生更大的三维结构(即，增加可用亲和配体结合位点的数量或产生独特的配体结合位点)。适配体拷贝的策略性安排可以允许增加与同源亲和配体的亲合力。
在一些实施方案中，所公开的方法和组合物中使用的mRNA包含多个拷贝的适配体。先前报道已经显示，在5'-UTR中使用单一小分子结合适配体允许在配体添加后对翻译的8倍阻遏，但是使用三种适配体引起37倍阻遏。Kotter等人,(2009).Nucleic AcidsRes.37(18):e120。在一些实施方案中，引入mRNA中的适配体的拷贝数是一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更大。
在一些实施方案中，RNA适配体包含多个拷贝的适配体序列。在一些实施方案中，RNA适配体包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
在一些实施方案中，适配体的拷贝呈重复序列串联构型。本文公开的4XS1m适配体是呈重复序列串联构型的多拷贝适配体的例子。
IV.RNA支架
在一些实施方案中，本文公开的mRNA组合物包含嵌于RNA支架中的RNA适配体。如本文所用，术语“RNA支架”是指可以组装以具有预定义结构的非编码RNA分子，所述结构产生空间架构以组织、保护或增强目的功能模块的特性。示例性功能模块可以是核酸(例如，适配体)或蛋白质。在一些实施方案中，适合于根据本公开文本使用的RNA支架可以在不破坏RNA结构的情况下与RNA缔合。此外，合适的RNA支架允许RNA适配体在不破坏RNA结构的情况下嵌入。在一些实施方案中，根据本公开文本使用的RNA支架可以是对RNA表达或翻译没有严重的负面影响的任何RNA支架。
RNA支架的预定义结构含有用于自组装的RNA特异性序列基序，如发夹茎(吻式环(kissing loop))之间的碱基配对和/或化学修饰，Myhrvold&Silver(2015)Nat StructMol Bio 22(1):8-10。RNA特异性序列基序可以形成二级(即，二维)和/或三级(即，三维)结构。在一些实施方案中，RNA支架包含至少一个二级结构基序。在一些实施方案中，RNA支架包含至少一个三级结构基序。常见的二级和/或三级RNA结构基序包括开放和堆叠的三路结(three-way junction)、四路结(four-way junction)、与Holliday结构类似的四路结、茎环(即，发夹环)、内部环(即，内环)、凸起、四环、多分支环、假结和结节、90°弯折(kink)和假扭转角(pseudo-torsional angle)。Shanna等人(2021)Molecules26(5):1422。
RNA支架可以源自自然(例如，弱化子、tRNA、核糖开关、终止子)或进行人为工程化以形成二级或三级RNA结构。Delebecque等人(2012)Nat Protoc 7(10):1797-1807。通常，为了保留RNA支架的预定义结构，RNA支架的一个或多个RNA环(例如，发夹环)是用于嵌入目的功能模块的目标区域。参见例如，US20050282190 A1。然而，RNA支架的预定义结构可以被修饰，以具有另外的期望特性。例如，预定义的RNA支架结构可以被修饰以变得抵抗外切核酸酶消化和内切核酸酶消化中的一者或两者。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA组合物包含嵌于转移RNA(tRNA)中的RNA适配体。转移RNA(tRNA)支架是亲和纯化系统中有吸引力的候选标记，因为tRNA折叠成典范的稳定的苜蓿叶(clover-leaf)式结构，所述结构抵抗解折叠并且可以保护RNA融合物免于核酸酶降解。已经证实，将适配体嵌入tRNA支架的反密码子环中促进正确折叠。总体上参见Ponchon和Dardel(2007)Nat.Methods 4(7):571-576；Ponchon等人(2013)Nucleic AcidsRes.41:e150。已经证实，使用嵌于tRNA支架中的RNA适配体成功地从细胞溶解物牵出(pull-down)转录物特异性RNA结合蛋白。Iioka H等人(2011)Nuc.Acids Res.39(8):e53。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA组合物包含嵌于tRNA中的RNA适配体，所述RNA适配体包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA适配体嵌于tRNA的tRNA发夹环中。在一些实施方案中，RNA适配体嵌于tRNA反密码子环中。在一些实施方案中，RNA适配体嵌于tRNA D环中。在一些实施方案中，RNA适配体嵌于tRNA T环中。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA组合物包含嵌于生物正交支架中的RNA适配体。生物正交支架的标志性特征在于，其不被细胞内核酸酶所识别和靶向而降解。Filonov等人(2015)Chem Biol.22(5):649-660。生物正交支架的例子包括V5、F29、F30或其变体。同上。F29和F30共有相同的三路结基序，所述基序见于天然存在的核糖开关和病毒RNA中。Shu等人(2014)Nucleic Acids Res.42,e10。F30是F29的工程化形式，其发生突变以去除内部终止子序列。Filonov等人(2015)Chem Biol.22(5):649-660。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA组合物包含嵌于生物正交支架中的RNA适配体。在一些实施方案中，所述生物正交支架是V5、F29、F30或其变体。
在一些实施方案中，所述生物正交支架包含SEQ ID NO:34的5'核苷酸序列和SEQID NO:35的3'核苷酸序列，其中适配体序列定位于SEQ ID NO:34与SEQ ID NO:35之间。
在一些实施方案中，所述生物正交支架包含SEQ ID NO:39的5'核苷酸序列、SEQID NO:40的内部核苷酸序列和SEQ ID NO:41的3'核苷酸序列，其中第一适配体序列定位于SEQ ID NO:39与SEQ ID NO:40之间并且第二适配体序列定位于SEQ ID NO:40与SEQ IDNO:41之间，任选地其中所述第一和所述第二适配体是相同的或不同的。
在一些实施方案中，所述RNA适配体嵌入的生物正交支架包含SEQ ID NO:29或SEQID NO:31的核苷酸序列。
其他示例性RNA支架包括核糖体RNA(rRNA)和核酶。在一些实施方案中，RNA适配体嵌于核糖体RNA中。在一些实施方案中，核糖体RNA是5S rRNA或其衍生物。示例性5S rRNA支架及其衍生物更详细地描述于Stepanov等人(Methods Mol Biol.2323:75-97.2021)中，所述文献的内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，RNA适配体嵌于核酶中。在一些实施方案中，核酶无催化活性。
在一些实施方案中，RNA适配体嵌于T-盒中。在一些实施方案中，T-盒RNA支架包含以下序列
43，其中加粗加下划线的文本对应于适配体插入位点)。适配体可以在1个、2个或所有3个适配体插入位点处插入。在一些实施方案中，T-盒RNA支架嵌入有1个、2个或3个适配体。在一些实施方案中，所述适配体是相同的。在其他实施方案中，所述适配体是不同的。在又其他实施方案中，3个适配体中的2个是不同的。在又其他实施方案中，2个或3个适配体是相同的。
在一些实施方案中，T-盒RNA支架由如下多核苷酸序列编码
GAACGAAACTCTGGGAGCTGCGATTGGCAGAATTCCGTTAGCAAGGCCGCAGGACTTGCATGCTTATCCTGCGGCGCGGGCGCGTTTCCCGGGTTACGCGCCCGCCTTAAGTGTTTCTCGAGTTGGCACTTAAGCTTGCTAACGGAATTCCCCCATATCCAACTTCCAATTTAATCTTTCTTTTTTAATTTTCACTTATTTGCG(SEQ ID NO:44)。
T-盒支架更详细地描述于Wurster等人(Nucleic Acids Research.37(18):6214-6224.2009)中，所述文献的内容通过引用并入本文。
V.RNA的亲和纯化
在一个方面，本文公开用于纯化mRNA样品的方法。在一些实施方案中，根据所公开的方法纯化的mRNA基本上不含来自mRNA合成的杂质。这些杂质包括例如体外合成中使用的过早流产的RNA序列、DNA模板和/或酶试剂。
在一些实施方案中，所公开的用于纯化mRNA的方法包括以下步骤：(a)使包含含有至少一种适配体的mRNA的样品与固定在色谱树脂上的亲和配体接触，其中所述RNA适配体包含对所述亲和配体的结合亲和力；(b)从所述色谱树脂洗脱所述mRNA；以及(c)从所述样品纯化所述mRNA。
亲和色谱是一种可以与本文公开的mRNA组合物和方法一起使用的纯化方法。本文公开的RNA适配体包含对所选亲和配体的结合亲和力。所选亲和配体被固定(例如交联)在色谱树脂上。包含所述RNA适配体的mRNA由此与含有所述亲和配体的树脂结合。色谱树脂材料优选地存在于柱中，其中将含有RNA的样品加载于柱的顶部上，并且在柱的底部收集洗脱液。本文公开的亲和纯化方法的总体说明参见例如图1。
色谱树脂可以是已知用作色谱方法中的固定相的任何材料。用作与本文公开的RNA适配体相互作用的亲和配体的分子的类型可以是多种类型。亲和配体的非详尽例子是抗体、蛋白质、寡核苷酸、染料、硼酸根基团或螯合的金属离子。固定相可以由有机和/或无机材料构成。
使用最广泛的固定相材料是亲水性碳水化合物，如交联琼脂糖和合成共聚物材料。这些材料可以包括纤维素的衍生物、聚苯乙烯、合成聚氨基酸、合成聚丙烯酰胺凝胶或玻璃表面。可以用作色谱树脂的材料的其他例子是聚苯乙烯二乙烯苯、硅胶、用非极性残基修饰的硅胶、或者适合于凝胶色谱或其他色谱方法的其他材料，如右旋糖酐、sephadex、琼脂糖、右旋糖酐/琼脂糖混合物和本领域中已知的其他材料。
色谱树脂可以用对RNA适配体具有结合亲和力的亲和配体进行官能化。在一些实施方案中，树脂可以是用苯基官能化的琼脂糖介质或膜(例如，来自GE Healthcare的Phenyl SepharoseTM或来自Sartorius的苯基膜(Phenyl Membrane))、Tosoh Hexyl、CaptoPhenyl、具有低或高取代的Phenyl SepharoseTM6快流(Fast Flow)、PhenylSepharoseTM高效、Octyl SepharoseTM高效(GE Healthcare)；FractogelTMEMD丙基或FractogelTMEMD苯基(E.Merck，德国)；Macro-PrepTM甲基或Macro-PrepTM叔丁基柱(Bio-Rad，加利福尼亚州)；WP HI-Propyl(C3)TM(J.T.Baker，新泽西州)或ToyopearlTM醚、苯基或丁基(TosoHaas，宾夕法尼亚州)。ToyoScreen PPG、ToyoScreen Phenyl、ToyoScreen Butyl和ToyoScreen Hexyl是基于刚性甲基丙烯酸聚合物珠。GE HiScreen Butyl FF和HiScreenOctyl FF是基于高流量琼脂糖基珠。优选的是Toyopearl Ether-650M、Toyopearl Phenyl-650M、Toyopearl Butyl-650M、Toyopearl Hexyl-650C(TosoHaas，宾夕法尼亚州)、POROS-OH(ThermoFisher)或基于甲基丙烯酸酯的整体柱(如CIM-OH、CIM-SO3、CIM-C4 A和CIM C4HDL，它们分别包含OH、硫酸根或丁基配体)(BIA Separations)。
在一些实施方案中，色谱树脂包含蛋白A作为亲和配体。示例性蛋白A树脂包括Byzen Pro蛋白A树脂(MilliporeSigma；18887)、Dynabeads蛋白A磁珠(ThermoFisher；10001D)、Pierce蛋白A琼脂糖(ThermoFisher；20334)、Pierce蛋白A/G加琼脂糖(ThermoFisher；20423)、Pierce蛋白A加UltraLink(ThermoFisher；53142)、Pierce重组蛋白A琼脂糖(ThermoFisher)、POROS MabCapture A Select(ThermoFisher)。
在一些实施方案中，色谱树脂包含链霉抗生物素蛋白作为亲和配体。示例性链霉抗生物素蛋白树脂包括来自阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖(MilliporeSigma；S1638)、Pierce链霉抗生物素蛋白加UltaLink树脂(ThermoFisher；53117)、Pierce高容量链霉抗生物素蛋白琼脂糖(ThermoFisher；20357)、链霉抗生物素蛋白6HC琼脂糖树脂(ABT；STV6HC-5)、链霉抗生物素蛋白树脂-Amintra(Abcam；ab270530)。
在一些实施方案中，色谱树脂包含谷胱甘肽(GSH)作为亲和配体。示例性GSH树脂包括谷胱甘肽树脂(GenScript；L00206)、Pierce谷胱甘肽琼脂糖(ThermoFisher；16102BID)、谷胱甘肽琼脂糖4B GST标记的蛋白质树脂(Cytiva；17075605)；谷胱甘肽亲和树脂-Amintra(Abcam；ab270237)。
在某些实施方案中，本文公开的纯化方法可以在mRNA合成期间或之后进行。例如，mRNA可以在将帽和/或尾添加至mRNA之前如本文所述进行纯化。在一些实施方案中，mRNA是在将帽和/或尾添加至mRNA之后进行纯化。在一些实施方案中，mRNA是在添加帽之后进行纯化。在一些实施方案中，mRNA在将帽和/或尾添加至mRNA之前和之后均进行纯化。通常，如本文所述的纯化步骤可以在mRNA合成的每个步骤之后进行，任选地与其他纯化方法(如透析和/或过滤)一起进行。例如，mRNA可以在初始合成之后(例如，具有或没有尾)经历透析以去除短聚体(shortmer)，然后经历如本文所述的纯化。可以将本文公开的纯化方法多次应用于mRNA样品。
VI.载体
在一个方面，本文公开包含本文公开的mRNA组合物的载体。可以将编码目的蛋白的核酸序列(例如，编码治疗性多肽的mRNA)克隆至多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆至载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬粒、噬菌体衍生物、动物病毒和黏粒。特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体、测序载体和针对体外转录优化的载体。
在一个实施方案中，使用载体在宿主细胞中表达mRNA。在另一个实施方案中，使用载体作为IVT的模板。适合于治疗应用的最佳翻译的IVT mRNA的构建详细披露于以下文献中：Sahin,等人(2014).Nat.Rev.Drug Discov.13,759-780；Weissman(2015).ExpertRev.Vaccines 14,265-281。
在一些实施方案中，本文公开的载体从5'至3'包含至少以下：RNA聚合酶启动子；编码5'UTR的多核苷酸序列；编码ORF的多核苷酸序列；编码3'UTR的多核苷酸序列；以及编码至少一个RNA适配体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本文公开的载体还包含编码多A序列和/或多腺苷酸化信号的多核苷酸序列。
多种RNA聚合酶启动子是本领域中已知的。在一个实施方案中，启动子是T7 RNA聚合酶启动子。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域中已知的。
本文还公开包含本文公开的载体或RNA组合物的宿主细胞(例如，哺乳动物细胞，例如，人细胞)。
可以使用多种不同方法中的任一种将多核苷酸引入靶细胞中，所述方法例如市售方法，包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，科隆，德国)、ECM830(BTX)(Harvard Instruments，波士顿，马萨诸塞州)或Gene Pulser II(BioRad，丹佛，科罗拉多州)、Multiporator(Eppendort，汉堡，德国))、阳离子脂质体介导的使用脂质体转染进行的转染、聚合物包封、肽介导的转染、生物弹道学颗粒递送系统(如“基因枪”)(参见例如，Nishikawa,等人(2001).Hum Gene Ther.12(8):861-70)或者TransIT-RNA转染试剂盒(Mirus，麦迪逊，威斯康辛州)。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶态分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶态系统是脂质体(例如，人工膜囊)。
不管使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞中或以其他方式使细胞暴露于本发明的抑制剂，为了确认mRNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定是本领域技术人员熟知的。
VII.药物组合物
根据本发明纯化的RNA可用作药物组合物(例如用作疫苗)中的组分。这些组合物通常将包括RNA和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物还可以包括一种或多种另外的组分，如小分子免疫增强剂(例如TLR激动剂)。本发明的药物组合物还可以包括用于RNA的递送系统，如脂质体、水包油乳液或微粒。在一些实施方案中，药物组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)。在一个实施方案中，组合物包含包封于LNP内的抗原编码核酸分子。在一些实施方案中，LNP包含至少一种阳离子脂质。在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质、聚乙二醇(PEG)缀合的(聚乙二醇化的)脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质。
为了可以更好地理解本发明，列出了以下实施例。这些实施例仅用于说明目的，并不被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
具体实施方案的前述描述将充分揭示本公开文本的总体性质，使得其他人可以通过应用本领域技术内的知识，在无需过度实验并且不偏离本公开文本总体概念的情况下容易地修改和/或改编此类具体实施方案的各种应用。因此，基于本文给出的传授内容和指导，此类调整和修改意图包含在所公开的实施方案的等效方案的含义和范围内。应理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据传授内容和指导来解释。
实施例1：适配体合成
化学合成两个RNA适配体序列。第一RNA适配体核苷酸序列是用作阴性对照的随机序列适配体(SEQ ID NO:1)。第二序列是S1m适配体(SEQ ID NO:2)，先前报道其与链霉抗生物素蛋白结合。Bachler等人,(1999),RNA 5(11):1509-1516；Srisawat,C.和Engelke,D.R.,(2001)RNA 7(4):632-641；Li,Y.和Altman,S.,Nucleic Acids Res.(2002),30(17):3706-3711。随机适配体(SEQ ID NO:1)和S1m适配体(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列示于下文中。
| SEQ ID NO:1_随机适配体标记(58bp) |
| AUACCAGCUUAUUCAAUUAGCAACAUGAGGGGGAUAGAGGGGGUGGGUUCUCUCGGCU |
| SEQ ID NO:2_S1m适配体标记(60bp) |
| AUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCCGCAU |
实施例2：链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠亲和纯化和RNA定量
使用琼脂糖珠亲和纯化策略和之后对RNA回收产率的定量来分析适配体的结合。
用于制备RNA适配体和用于结合的链霉抗生物素蛋白珠的方法包括以下步骤：(1)链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠的制备.为了去除珠储存溶液，将20μL链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠(/样品)在4℃下以600xg旋转1分钟，并在结合缓冲液(500μL/样品)中洗涤两次。随后，将珠重悬于20μL具有RNasin核糖核酸酶抑制剂(3μL/100单位)的结合缓冲液中，然后在冰上孵育15分钟。(2)RNA适配体的制备.将2.5μg RNA适配体重悬于10μL结合缓冲液中。通过在56℃下加热5 min，在37℃下加热10 min，之后在室温下孵育5分钟进行RNA适配体的再折叠，以再折叠适配体结构。在RNA适配体制备程序结束时，以与结合缓冲液的1:2混合物收集2μL随机适配体和S1m适配体作为总RNA适配体产率的对照(输入对照)。(3)孵育条件.将10μL含有再折叠适配体的mRNA(2.5μg)适配体添加至珠并在4℃下在旋转器上孵育2小时。随后，将珠用100μL结合缓冲液洗涤3次并在程序的剩余时间中保持在冰上，以维持适配体二级结构。(4)从珠洗脱RNA适配体.在如下步骤中用250μL基于苯酚的试剂进行洗脱。将50μL冷氯仿添加至珠并剧烈振动10秒，之后以12,000xg旋转15分钟(在4℃下)。将每个样品含有RNA的顶部水相(大约125μL/样品)直接添加至Monarch净化柱并遵循制造商的说明书(Monarch RNA净化试剂盒；NEB)。从每个Monarch柱在50μL DEPC处理的水中洗脱RNA。在Nanodrop上使用按制造商的说明书设定的参数对链霉抗生物素蛋白亲和纯化后的RNA浓度进行定量。
使用上述方法用链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠对实施例1中制备的适配体进行亲和纯化，洗脱，并对洗脱液中RNA回收的量进行定量。随机适配体序列样品未产生任何RNA回收(Nanodrop检测下限为2.5ng/μL)。相比之下，相对于在与链霉抗生物素蛋白珠一起孵育之前收集的S1m适配体RNA样品(大约9,600ng/μL)，S1m适配体样品具有大约13％RNA回收(1,250ng/μL)(图2)。该结果显示，实施例1中设计的S1m适配体可以用链霉抗生物素蛋白进行亲和纯化，因此可能适合作为基于链霉抗生物素蛋白亲和力的纯化系统中的功能标记。
实施例3：用多拷贝(4X)适配体标记的mRNA的合成和亲和纯化
为了分析适配体拷贝数对结合亲和力的影响，将多拷贝适配体引入mRNA中，并与不包括适配体的mRNA进行比较。
先前显示S1m适配体在串联四重复序列构型中的排列(4xS1m；SEQ ID NO:5)对琼脂糖珠具有更高亲和力。Leppek&Stoecklin.(2014)Nuc.Acids Res.42(2):e13。为了研究RNA适配体拷贝数对结合亲和力的作用，构建DNA质粒以生成用于体外转录(IVT)的cDNA模板，以产生标记到mRNA的4xS1m适配体。同上。
如先前所述修饰DNA质粒pAM14和pAM15，以包括编码由T7启动子驱动的来自小鼠TNFα的3'UTR的富AU元件(ARE)RNA的53bp核苷酸序列。Stoeklin G等人,(2004),EMBO J23(6):1212-1324；Leppek&Stoecklin.(2014)Nuc.Acids Res.42(2):e13。pAM14(2,496bp)与pAM15(2,168bp)源自相同的载体主链，但是含有在5'至3'方向上侧接30-mer多A尾的4xS1m适配体。
为了获得用于IVT的cDNA模板(SEQ ID NO:5)，用来自pAM14质粒的AM5/6引物对扩增TNFα-53-4xS1m核苷酸序列。使用来自质粒pAM15的相同AM5/6引物对扩增阴性对照cDNA模板，产生含有5'UTR和3'UTR侧翼(分别为SEQ ID NO:3和4)的序列。AM5/6引物结合位点的位置注释于pAM14和pAM15质粒图谱中，如图3中所示。
随后，使用市售RNA试剂和程序对实验组、TNFα-53-4xS1m mRNA和对照组进行IVT反应。(HiScribe T7 ARCA mRNA合成试剂盒(带尾)，NEB)。在帽和尾反应后，将过滤的mRNA储存在-20℃下直至使用。
5'UTR、3'UTR和4xS1m适配体的核苷酸序列示于下文中。
为了分析TNFα-53-4xS1m适配体mRNA的亲和结合，使用上述方法用链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠对适配体mRNA进行亲和纯化，洗脱，并对洗脱液中RNA回收的量进行定量。评价并比较链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠与TNFα-53标记的4xS1m mRNA或TNFα-53mRNA阴性对照样品的结合亲和力。相对于在与链霉抗生物素蛋白珠一起孵育之前收集的4xS1m mRNA样品(大约2,800ng/μL)，亲和纯化的TNFα-53标记的4xS1m mRNA产生54％RNA回收产率(1,500ng/μl)(图4)。相比之下，亲和纯化的TNFα-53阴性对照仅产生2％RNA回收产率。该结果显示，引入多个适配体拷贝(例如，4xS1m)可以潜在地用于改善mRNA的亲和纯化效率。
实施例4：用嵌于RNA支架中的适配体标记的不同mRNA的合成和亲和纯化
为了测试嵌于tRNA支架中的RNA适配体在下游mRNA亲和纯化方法中的效率，构建四种载体。
选择Sm适配体用于分析。Sm适配体(SEQ ID NO:6)和tRNA-Sm适配体(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列示于下文中。
目的质粒的图谱描绘于图5中。简言之，这些质粒是：(1)pAM22，对照构建体，携带热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicust)tRNAGLN2支架(pAM22(tRNA)；质粒图谱注释反密码子臂相对于Gln2反密码子环的位置)，(2)pAM20，对照构建体，携带Sm适配体(pAM20(Sm))，(3)pAM21，实验构建体，携带嵌于反密码子环tRNAGLN2序列的一部分中的Sm适配体序列，所述部分的两侧侧接tRNA反密码子臂序列(pAM21(tRNA Sm))，以及(4)pAM23，实验构建体，携带Sm-tRNAGLN2构建体的串联二重复序列配置(2x tRNA Sm)。每个标记由T7启动子驱动。
为了获得用于IVT的cDNA模板，用侧接引物扩增适配体标记核苷酸序列，如实施例3中所述。[随后，使用市售RNA试剂和程序对实验组、tRNA Sm和2x tRNA Sm mRNA以及对照组进行IVT反应。(HiScribe T7 ARCA mRNA试剂盒(带尾)，NEB)。在帽和尾反应后，将过滤的mRNA储存在-20℃下直至使用。
分析Sm、tRNA、tRNA-Sm和2x tRNA Sm适配体标记的亲和结合。应用实施例2的相同结合和洗脱方法。
如图6中所示，使用tRNA(pAM22)或Sm适配体(pAM20)标记导致相似水平的RNA回收，指示在所测试的实验条件下非特异性的结合。相比之下，显示以一个(pAM21)或两个拷贝(pAM23)使用嵌于tRNA支架中的Sm适配体显著改善纯化效率，导致相对于输入RNA的60％RNA回收。该结果证实，RNA支架结构(如tRNA)的使用可以改善适配体标记的结合效率。
实施例5：编码用多拷贝适配体标记的hEGFP(eHGFP-4xS1m)的mRNA的合成和亲和
纯化
此实施例研究包括RNA适配体标记对mRNA表达和蛋白质翻译的作用。因为适配体被设计为mRNA的一部分，存在适配体标记可能对翻译产生负面影响的可能性。
为了测试RNA适配体对翻译效率的潜在影响，构建质粒，所述质粒包括人源化增强型绿色荧光蛋白(hEGFP；如下所示的SEQ ID NO:8)的ORF，其侧接5'和3'UTR序列，由T7启动子驱动，并且在5'至3'方向上以30-mer多A尾结束(pAM11)。通过在3'UTR下游且紧接在多A尾之前引入4xS1m适配体序列(SEQ ID NO:5)来产生实验质粒pAM8。图8描绘pAM11和pAM8的质粒图谱。
为了获得IVT cDNA模板，用AM5/6引物对扩增hEGFP或hEGFP-4xS1m适配体标记的核苷酸序列。引物对的设计和方向与实施例3中公开的策略是类似的。根据制造商的说明书用HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒进行IVT反应。为了避免另外的多腺苷酸化步骤，用IVT的模板DNA产生30-mer腺苷尾的伸长。
如图9的琼脂糖凝胶中所示，所得mRNA具有良好质量和预期大小(泳道1为hEGFP且泳道2为hEGFP-4xS1m)。
为了测试4xS1m适配体对亲和结合的作用，用链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠对含有hEGFP或hEGFP-4xS1m的mRNA各自进行亲和纯化。应用如实施例2中所概述的相同的结合和洗脱方法。
4xS1m适配体标记的hEGFP导致相对于输入对照样品的63％RNA回收，这显著高于无适配体的hEGFP的RNA回收(图10)。
实施例6：对用多拷贝适配体(eHGFP-4xS1m)标记的mRNA的蛋白质翻译和功能的分
析
通过细胞中GFP表达的直接可视化来评估RNA适配体标记对蛋白质翻译和功能的作用。为了测试该作用，在亲和纯化后分离从pAM8和pAM11产生的hEGFP mRNA，并将其转染至HEK293FT细胞中。根据制造商的说明书在24孔板中将0.5μg RNA用Mirus TransIT转染试剂转染至HEK293FT细胞中。在24小时后，使用荧光显微术检查细胞。
如图11中所示，相对于无适配体的mRNA(左图)，含有4xS1m适配体的mRNA产生更低强度信号(右图)。因此，似乎引入4拷贝的链霉抗生物素蛋白适配体标记(4xS1m)可以导致hEGFP表达的翻译效率降低。该结果证实，将某些适配体引入mRNA中可能对蛋白质翻译造成负面影响。
实施例7：对用多拷贝适配体标记且包括延长的多A尾的mRNA的蛋白质翻译和功能
的分析
假设短多A尾(30-mer腺苷)可能由于适配体序列而影响翻译效率。为了研究多A尾对翻译效率的影响，使用多(A)聚合酶(NEB，M0276S)使hEGFP-4xS1m适配体标记的mRNA经历另外的多腺苷酸化反应。
通过mRNA产物在琼脂糖凝胶上的迁移确认多腺苷酸化(数据未显示)。如上所述对mRNA进行亲和纯化，并且将具有更长多A的mRNA转染至HEK293细胞中。如图12中所示，具有更长多A尾的经hEGFP-4xS1m适配体标记的mRNA显示比具有更短(30-mer)多A尾的mRNA显著更高的EGFP表达。该结果表明，多A尾的长度可能影响含有某些适配体序列的mRNA的翻译效率。
实施例8：关于RNA回收对适配体位置的分析
适配体序列被设计为mRNA的一部分，并且存在潜在适配体结构或其构型可能负面影响表达的可能性。为了理解这种影响，设计适配体标记的mRNA构建体以测试：(1)适配体相对于其他拓扑有序mRNA组分的位置，(2)适配体拷贝数(即，适配体价态)，(3)周围支架(即，稳定性tRNA-支架)，或者如图7中图式的构型的组合。
具体而言，此实施例探询改变4xS1m适配体序列相对于mRNA中的其他拓扑有序部分的位置是否会影响mRNA亲和纯化后的RNA回收。设计的mRNA构建体组示于图13A中。
4xS1m适配体尤其定位于(1)5'UTR的直接上游，(2)3'UTR的直接上游，(3)3'UTR中，(4)3'UTR的直接下游，或者(5)嵌于多A序列的3'端中。
生成cDNA模板并且使用IVT来产生具有特定适配体构型的mRNA。如实施例2中所述使用链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠对mRNA进行亲和纯化并进行定量。
所测试的每种适配体标记的mRNA的亲和纯化RNA产率(相对于在进行链霉抗生物素蛋白结合和洗脱步骤之后未经历亲和纯化的输入样品来表示)(未结合的与洗脱的)示于图13B中，并且每个样品(未结合和洗脱)的平均值和标准差值示于下文表1中。
表1-图13B的数据的未结合的mRNA的百分比和洗脱的mRNA的百分比
如图13B和表1中所示，不管适配体位置在哪里，相对于缺乏适配体的对照mRNA，含有4xS1m适配体的mRNA产生特异性结合。该结果证实，将4xS1m适配体引入mRNA中的多个位置之一中对亲和纯化产率没有影响。
实施例9：关于RNA回收对适配体价态的分析
与mRNA转录物内的适配体位置一样，适配体价态(即，适配体拷贝数)是可能影响RNA回收的另一个变量。为了扩展实施例3中进行的分析，设计一组适配体标记的mRNA构建体以含有一个至六个之间的串联重复序列拷贝(标为1xS1m至6xS1m)的S1m适配体。对于此研究，将适配体标记置于3'UTR之后。
生成cDNA模板并使用IVT来产生具有特定适配体价态的mRNA。如实施例2中所述使用链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠对mRNA进行亲和纯化并进行定量。
所测试的每种适配体价态mRNA构建体的亲和纯化RNA产率(未结合的与洗脱的)示于图14中，并且每个样品(未结合和洗脱)的平均值和标准差值示于下文表2中。
表2-图14的数据的未结合的mRNA的百分比和洗脱的mRNA的百分比
如图14中所示，对于最多三拷贝的适配体(3xS1m)，纯化效率增加，其后在添加后续拷贝(4xS1m-6xS1m)时未观察到RNA亲和纯化产率的改善。该结果证实，增加的适配体价态改善结合亲和力。
实施例10：关于RNA回收在替代性mRNA情况下对适配体结合的分析
为了证实在亲和纯化中提供有效结合的适配体在替代性RNA情况下具有功能，设计一组mRNA以编码与实施例3中所呈现不同的蛋白质编码区(新加坡'16血凝素)和不同的UTR。
所测试的每种构建体(未结合的与洗脱的)在链霉抗生物素蛋白亲和结合纯化过程之后的RNA产率示于图15中。每个样品(未结合和洗脱)的平均值和标准差值示于下文表3中。
表3-图15的数据的未结合的mRNA的百分比和洗脱的mRNA的百分比
如图15中所示，尽管相邻序列改变，适配体提供与链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠的特异性结合。该结果证实，本文公开的链霉抗生物素蛋白适配体mRNA设计在替代性RNA情况下是稳健的。
实施例11：关于蛋白质翻译对适配体位置的分析
为了理解mRNA翻译动力学是否受到mRNA转录物内的适配体布局的影响，在mRNA翻译效率测定中评估来自实施例8中设计的构建体组的mRNA以检测GFP表达。
简言之，通过体外转录(IVT)产生编码人源化EGFP(hEGFP)的mRNA，随后将其与转染试剂混合。然后将混合物应用于Hela或人骨骼肌(HSKMc)细胞。在孵育24小时后，经由流式细胞术分析针对GFP荧光对转染的细胞进行定量。细胞GFP荧光强度与编码hEGFP的mRNA转录物的翻译效率成正比。
以下步骤描述用于mRNA翻译效率测定的转染程序：
(1)细胞系的制备.将Hela或HSKMc细胞系接种于12孔板中的完全生长培养基中，并生长至80-90％汇合度。Hela 229细胞培养基条件是DMEM和10％FBS，并且HSK Mc细胞培养基条件是199培养基、20％FBS和1％PenStrep。
(2a)对于HskMc细胞系用Mirus TransIT转染试剂制备mRNA.在使用前将TransIT-mRNA转染试剂和mRNA加强试剂升温至室温并温和地涡旋。遵循制造商用于mRNA转染的方案，所测试每种mRNA的管含有5μg mRNA(10μL 500ng/μL mRNA)至400μL Opti-MEM。对于阴性对照，添加培养基代替mRNA。随后，添加8μL mRNA加强试剂并通过吸液将管充分混合。接下来，添加8μL Transit mRNA试剂，充分混合，并在室温下孵育2-5分钟以允许有足够的时间来形成复合物。
(3a)HskMc细胞系的转染.将106.5μL mRNA混合物逐滴添加至12孔板的每个孔(大约1.25μg mRNA/孔；每种构建体设置一式三份孔)，并温和摇动以使TransIT-mRNA试剂:mRNA加强:RNA复合物均匀分布。随后，将板孵育24小时。
(2b)对于Hela细胞系用Lipofectamine MessengerMax转染试剂制备mRNA.遵循制造商用于mRNA转染管的方案，通过将4μg mRNA(8μL 500ng/μL mRNA)添加至312μL Opti-MEM并充分混合来制备所测试的每种mRNA。对于阴性对照，添加培养基代替mRNA。在单独管中，将8μL MessengerMax转染试剂添加至312μL Opti-MEM并充分混合。随后，将mRNA管的容积添加至转染混合物管并在室温下孵育15分钟，以允许有足够的时间来形成复合物。
(3b)Hela细胞系的转染.将160μL/孔如2b中所述的mRNA混合物逐滴添加至12孔板中的每个孔(大约1μg mRNA/孔；每种构建体设置一式三份孔)。随后，将板孵育24小时。
以下步骤描述在mRNA翻译效率测定中使用的用于流式细胞术分析的细胞染色和分选程序：
(1)收获细胞.从细胞单层吸出培养基，用1ml PBS洗涤，并用250μL 1x Accutase/孔解离，并在室温下孵育5min。将250μL PBS添加至每孔，并将细胞收获至1.5ml微量离心管中。
(2)细胞染色.根据制造商的说明书对所有样品进行Live/Dead染色(Live/Dead可固定远红死细胞染色试剂盒)。细胞固定是可选步骤，不是必要步骤。随后，通过在1ml PBS中洗涤细胞来去除过量染色，在20℃下进行300rcf持续5分钟以使细胞沉淀，去除旧上清液，并将样品重悬于400μL染色缓冲液(BD Biosciences)中。
(3)补偿珠.通过根据制造商的说明书制备live/dead反应性ArC补偿珠或使用GFPBrightComp eBeads来制备补偿对照样品。(4)FACS分析.对于HskMc和Hela细胞系，使用130μm分选芯片。首先运行未染色的珠和染色的补偿珠以调整FSC/SSC电压设定和设置门控窗。
如图16A-图16C以及图17A-图17B中所示，分别在HskMc和Hela细胞系中评估适配体标记的mRNA(其中适配体在mRNA内的布局变化)的mRNA翻译效率。将表达定量为GFP信号高于背景的细胞总数(GFP+细胞％)，以及高于某一信号强度阈值的细胞数(高GFP+细胞％)。
适配体标记在全长mRNA序列内的位置对翻译效率有显著影响。适配体在mRNA的5'端的布局消除翻译，而其他所有位置均允许不同翻译水平。将适配体定位于3'UTR之后得到最高翻译效率，如通过增加的GFP强度所证实。这种趋势在HskMc和Hela细胞系二者中是可复现的。
实施例12：关于翻译效率对延长的多A尾长度的分析
实施例7证实，更长的多A尾长度增加适配体标记的mRNA的翻译效率。
为了对翻译增强的量进行定量，将延长的多A尾添加至S1m适配体标记的mRNA并且在实施例11中描述的mRNA翻译效率测定中加以测试。用于IVT的载体包括编码的多A尾，具体而言分段多A尾，其具有60个A、NsiI限制性酶切割位点、然后另外60个A。
从上述载体产生的所有mRNA均含有分段多A尾并且具有ARCA帽。图18右侧的两种条件包括另外的多腺苷酸化步骤，其中将1μl大肠杆菌(E.coli)多(A)聚合酶(NEB，M0276)与缓冲液和另外的ATP一起孵育45分钟，这通常将约200个A添加至图18中所示的每个RNA的末端，相对于对照，对于具有延长的多A尾的经适配体标记的mRNA，GFP阳性Hela细胞的总数(表示为百分比)显著更高。该结果确认，延长适配体标记的mRNA中的多A尾长度可以改善细胞中的下游mRNA翻译动力学。
实施例13：关于RNA回收和翻译效率对用嵌于RNA支架中的适配体标记的mRNA的分
析
为了确认并扩展实施例5的发现，关于链霉抗生物素蛋白亲和纯化后的RNA回收和mRNA翻译效率，将嵌于tRNA支架中的S1m适配体标记(参见实施例5)与2xS1m和4xS1m适配体标记的mRNA进行比较。
如图19A中所示，在S1m适配体周围添加稳定性序列得到的RNA纯化产率等于4xS1m适配体标记的mRNA的结合效率，从而证实RNA支架显著增加亲和纯化产率。用tRNA支架稳定S1m适配体对mRNA翻译效率没有影响，如图19B中所示。结果归纳于下文表4中。
表4-图19A的数据的未结合的mRNA的百分比和洗脱的mRNA的百分比
实施例14：用在生物正交RNA支架中稳定的适配体标记的mRNA的合成和亲和纯化
在细菌和哺乳动物细胞中，有tRNA支架的适配体通常由于核酸内切溶解切割(endonucleolytic cleavage)而具有降低的RNA稳定性。Filonov等人(2015)Chem Biol.22(5):649-660。tRNA支架的备选方案是生物正交支架。生物正交支架不易被细胞内核酸酶识别和靶向而降解，如V5、F29或F30支架。同上。
为了测试生物正交支架是否可以稳定S1m适配体并改善下游mRNA亲和纯化方法的效率，构建两种载体，所述载体含有稳定1xS1m适配体的F30支架(F30-1xS1m适配体)或稳定2xS1m适配体的F30支架(F30-2xS1m适配体)。F30-1xS1m适配体和F30-2xS1m适配体序列提供于下文中。
编码F30-1xS1m适配体的DNA序列(F30区段加下划线并加粗)：
F30-1xS1m适配体(F30区段加下划线并加粗)：
编码F30-2xS1m适配体的DNA序列(F30区段加下划线并加粗)：
F30-2xS1m适配体(F30区段加下划线并加粗)：
可以将其他目的适配体容易地插入F30支架中。在1x适配体构型中，左侧F30序列和“1x右侧”F30序列位于一个适配体的侧翼。在2x适配体构型中，左侧F30序列和中间F30序列位于第一适配体的侧翼，并且中间F30序列和“2x右侧”F30序列位于第二适配体的侧翼。F30-1x适配体和F30-2x适配体序列提供于下文中。
编码F30-1x适配体的DNA序列：
TTGCCATGTGTATGTGGG(左侧F30序列，SEQ ID NO:32)-适配体序列-
CCCACATACTCTGATGATCCTTCGGGATCATTCATGGCAA(“1x右侧”F30序列，SEQ ID NO:33)
F30-1x适配体：
UUGCCAUGUGUAUGUGGG(左侧F30序列，SEQ ID NO:34)-适配体序列-
CCCACAUACUCUGAUGAUCCUUCGGGAUCAUUCAUGGCAA(“1x右侧”F30序列，SEQ ID NO:35)
编码F30-2x适配体的DNA序列：
TTGCCATGTGTATGTGGG(左侧F30序列，SEQ ID NO:36)-适配体序列-
CCCACATACTCTGATGATCC(中间F30序列，SEQ ID NO:37)-适配体序列-
GGATCATTCATGGCAA(“2x右侧”F30序列，SEQ ID NO:38)
F30-2xS1m适配体(F30区段加下划线并加粗)：
UUGCCAUGUGUAUGUGGG(左侧F30序列，SEQ ID NO:39)-适配体序列-
CCCACAUACUCUGAUGAUCC(中间F30序列，SEQ ID NO:40)-适配体序列-
GGAUCAUUCAUGGCAA(“2x右侧”F30序列，SEQ ID NO:41)
为了分析F30-1xS1m和F30-2xS1m适配体mRNA的亲和结合，使用上述方法用链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠对适配体mRNA进行亲和纯化，洗脱，并对洗脱液中RNA回收的量进行定量。评价并比较链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠与未标记的mRNA(无适配体对照)、经4xS1m适配体、F30-1xS1m适配体或F30-2xS1m适配体标记的mRNA的结合亲和力。
相对于在与链霉抗生物素蛋白珠一起孵育之前收集的输入样品，亲和纯化的F30-1xS1m和F30-2xS1m mRNA产生约30-40％RNA回收产率(图20B)，也示于下文表5中。
表5-图20B的数据的未结合的mRNA的百分比和洗脱的mRNA的百分比
来自洗脱的F30-2xS1m和F30-1xS1m标记的mRNA的总RNA回收分别为大约900ng/μL和800ng/μL(图20C)。相比之下，亲和纯化的洗脱的阴性对照仅产生200ng/μL RNA回收产率。
该结果显示，引入生物正交支架(即，F30)以稳定适配体(例如，S1m适配体)可以潜在地用于改善mRNA的亲和纯化效率。
考虑到本文公开的公开文本的说明书和实践，本公开文本的其他实施方案对于本领域技术人员而言是清楚的。说明书和实施例意图被视为仅是示例性的，本公开文本的真实范围和精神是通过以下权利要求来指示。
本文引用的所有专利和出版物都是通过引用以其整体并入本文。
序列
表6：编码mRNA转录物的核苷酸序列
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Claims (77)
1.一种信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列，其中所述mRNA包含至少一个RNA适配体。
2.根据权利要求1所述的mRNA，其中所述RNA适配体嵌于RNA支架中。
3.根据权利要求2所述的mRNA，其中所述RNA支架包含至少一个二级结构基序。
4.根据权利要求3所述的mRNA，其中所述二级结构基序是四环、假结或茎环。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的mRNA，其中所述RNA支架包含至少一个三级结构。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的mRNA，其中所述二级结构基序和/或所述三级结构具有核酸酶抗性。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的mRNA，其中所述RNA支架是转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)或核酶。
8.根据权利要求7所述的mRNA，其中所述核酶无催化活性。
9.根据权利要求2-7中任一项所述的mRNA，其中所述RNA支架包含转移RNA(tRNA)。
10.根据权利要求9所述的mRNA，其中所述RNA适配体嵌于tRNA的tRNA发夹环中。
11.根据权利要求9所述的mRNA，其中所述RNA适配体嵌于所述tRNA的tRNA反密码子环中。
12.根据权利要求9所述的mRNA，其中所述RNA适配体嵌于所述tRNA的tRNA D环中。
13.根据权利要求9所述的mRNA，其中所述RNA适配体嵌于所述tRNA的tRNA T环中。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体定位于所述5'UTR中。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体定位于所述ORF的3'端与所述3'UTR的5'端之间。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体定位于所述3'UTR中。
17.根据权利要求1-13中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体定位于所述3'UTR的3'端与所述多A序列的5'端之间。
18.根据权利要求1-13中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体定位于所述多A序列的3'端。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含一个RNA适配体或由其组成。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含一个与四个之间的RNA适配体。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体是相同的。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体是不同的。
23.根据权利要求1-23中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体是合成来源的。
24.根据权利要求23所述的mRNA，其中所述RNA适配体是裂开型适配体或X适配体。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体是天然来源的。
26.根据权利要求25所述的mRNA，其中所述RNA适配体源自发夹RNA、tRNA或核糖开关。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体嵌于生物正交支架中。
28.根据权利要求27所述的mRNA，其中所述生物正交支架是V5、F29、F30或其变体。
29.根据权利要求28所述的mRNA，其中所述生物正交支架包含SEQ ID NO:34的5'核苷酸序列和SEQ ID NO:35的3'核苷酸序列，其中适配体序列定位于SEQ ID NO:34与SEQ IDNO:35之间。
30.根据权利要求28所述的mRNA，其中所述生物正交支架包含SEQ ID NO:39的5'核苷酸序列、SEQ ID NO:40的内部核苷酸序列和SEQ ID NO:41的3'核苷酸序列，其中第一适配体序列定位于SEQ ID NO:39与SEQ ID NO:40之间并且第二适配体序列定位于SEQ ID NO:40与SEQ ID NO:41之间，任选地其中所述第一适配体和所述第二适配体是相同的或不同的。
31.根据权利要求28所述的mRNA，其中所述RNA适配体嵌入的生物正交支架包含SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:31的核苷酸序列。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体与亲和配体结合。
33.根据权利要求32所述的mRNA，其中所述亲和配体包括蛋白A、蛋白G、链霉抗生物素蛋白、谷胱甘肽、右旋糖酐或荧光分子。
34.根据权利要求32或33所述的mRNA，其中所述亲和配体包括链霉抗生物素蛋白。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的mRNA，其中所述亲和配体固定在色谱树脂上。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体是S1m或Sm。
37.根据权利要求36所述的mRNA，所述mRNA包含一个与四个之间的S1m或sm RNA适配体。
38.根据权利要求36或37所述的mRNA，其中所述S1m或sm RNA适配体定位于：
1)所述ORF的3'端与所述3'UTR的5'端之间；
2)所述3'UTR中；
3)所述3'UTR的3'端与所述多A序列的5'端之间；和/或
4)所述多A序列的3'端。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
40.根据权利要求36-38中任一项所述的mRNA，其中所述RNA适配体嵌入的tRNA包含SEQID NO:7的核苷酸序列。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA编码至少一种多肽。
42.根据权利要求41所述的mRNA，其中所述多肽是生物活性多肽、治疗性多肽或抗原性多肽。
43.根据权利要求42所述的mRNA，其中所述抗原性多肽包括抗体或其片段、酶替代多肽或基因组编辑多肽。
44.根据权利要求42所述的mRNA，其中所述治疗性多肽包括抗体重链、抗体轻链、酶或细胞因子。
45.根据权利要求42所述的mRNA，其中所述生物活性多肽包括基因组编辑多肽。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA含有嵌合5'或3'UTR。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含至少一个化学修饰。
48.根据权利要求47所述的mRNA，其中所述化学修饰是假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。
49.根据权利要求47所述的mRNA，其中所述化学修饰是假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷或其组合。
50.根据权利要求47所述的mRNA，其中所述化学修饰是N1-甲基假尿苷。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的mRNA，其中所述多A序列是至少10个连续腺苷残基。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的mRNA，其中所述多A序列是10个与500个之间的连续腺苷残基。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的mRNA，所述mRNA包含两个多A序列，每个多A序列包含10个与500个之间的连续腺苷残基，其中至少一个RNA适配体或RNA适配体嵌入的tRNA定位于所述两个多A序列之间。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含5'帽。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA的翻译效率与不含RNA适配体的mRNA相比基本上相同。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA是使用体外转录(IVT)合成的。
57.根据权利要求1-55中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA是在体内或离体表达的。
58.一种载体，所述载体编码根据权利要求1-57中任一项所述的mRNA。
59.根据权利要求58所述的载体，其中所述载体从5'至3'至少包含元件a-e：
a.RNA聚合酶启动子；
b.编码5'UTR的多核苷酸序列；
c.编码ORF的多核苷酸序列；
d.编码3'UTR的多核苷酸序列；以及
e.编码至少一个RNA适配体的多核苷酸序列。
60.根据权利要求59所述的载体，所述载体进一步包含：
f.编码多A序列和/或多腺苷酸化信号的多核苷酸序列。
61.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求58-60所述的载体。
62.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-57中任一项所述的mRNA。
63.一种用于纯化mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含根据权利要求1-57所述的mRNA的样品与固定在色谱树脂上的亲和配体接触，其中所述RNA适配体包含对所述亲和配体的结合亲和力；
(b)从所述色谱树脂洗脱所述mRNA；以及
(c)从所述样品纯化所述mRNA。
64.根据权利要求63所述的方法，所述方法包括在所述接触步骤(a)与所述洗脱步骤(b)之间的一个或多个洗涤步骤。
65.一种纯化RNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含所述RNA的样品与固定在色谱树脂上的亲和配体接触；
(b)从所述色谱树脂洗脱所述RNA；以及
(c)从所述样品分离所述RNA，
其中所述RNA包含至少一个开放阅读框(ORF)和至少一个RNA适配体，其中所述RNA适配体包含对所述亲和配体的结合亲和力。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述RNA还包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述RNA具有至少约500个核苷酸的长度、至少约750个核苷酸的长度、至少约1,000个核苷酸的长度、至少约1,500个核苷酸的长度、至少约2,000个核苷酸的长度、至少约2,500个核苷酸的长度、至少约3,000个核苷酸的长度、至少约3,500个核苷酸的长度、至少约4,000个核苷酸的长度、至少约4,500个核苷酸的长度或至少约5,000个核苷酸的长度。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述RNA包含5'帽。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中所述mRNA为大于或等于90％纯。
71.一种纯化mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含所述mRNA的样品与固定在色谱树脂上的亲和配体接触；
(b)从所述色谱树脂洗脱所述mRNA；以及
(c)从所述样品分离所述mRNA，
其中所述mRNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)、至少一个多腺苷酸化(多A)序列和至少一个RNA适配体，
其中所述RNA适配体包含对所述亲和配体的结合亲和力。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述mRNA为大于或等于90％纯。
73.一种治疗或预防疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求62所述的药物组合物。
74.一种包含多个mRNA分子的药物组合物，其中至少约90％的mRNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)、至少一个多腺苷酸化(多A)序列和至少一个RNA适配体。
75.一种信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列，其中所述mRNA包含至少一个tRNA。
76.一种信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列，其中所述mRNA包含至少一个RNA适配体嵌入的tRNA。
77.一种信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个开放阅读框(ORF)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(多A)序列，其中所述mRNA包含至少一个RNA适配体嵌入的生物正交支架。
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