CN117916386A - 用于从解聚的聚羟基丁酸酯直接形成聚羟基丁酸酯的生物反应器和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于从解聚的聚羟基丁酸酯直接形成聚羟基丁酸酯的生物反应器和方法。在两个生物反应器容器中，微生物产物，诸如一种或多种酶，与所述含有聚羟基丁酸酯的消费后产品材料组合。所述微生物可以天然分泌所述一种或多种酶或者可以被遗传修饰为分泌所述酶。酶的组合被设计为促进代谢途径，所述代谢途径可以解聚PHB，将所得的羟基丁酸酯转化为羟基丁酰辅酶A，继而将羟基丁酰辅酶A聚合为PHB。即，用于将聚羟基丁酸酯回收为羟基丁酸酯并返回聚羟基丁酸酯的解决方案。

Description

用于从解聚的聚羟基丁酸酯直接形成聚羟基丁酸酯的生物反 应器和方法

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII拷贝创建于2022年5月18日，名称为KCX-2009-PCT_SequenceList.txt，大小为1,124字节。

背景技术

全球石油基塑料产量每年都在持续增加。例如，近年来，已经生产了超过300,000,000吨石油基聚合物。大部分上述生产的聚合物被用于生产一次性产品，诸如塑料饮料瓶、吸管、包装和吸收制品，包括可穿戴吸收制品。大多数这些塑料产品都被丢弃，没有进入回收流。

尤其是，吸收制品(包括个人护理和儿童护理服装)目前主要由石油基塑料(诸如由聚乙烯或聚丙烯形成的薄膜和非织造材料)制成。由于这些制品的性质和它们执行的功能，部分或完全回收使用过的聚丙烯或聚乙烯材料，即使不是不可能的，也是困难的。

长期以来，人们一直希望，由可再生资源生产的可生物降解的聚合物(以下简称“生物聚合物”)在减少全球石油基塑料在环境中的积聚方面能够大有前景。例如，已经对生物衍生的聚合物和可在合适环境中生物降解的聚合物进行了重要研究。一类这种生物聚合物是聚羟基链烷酸酯(PHA)。PHA家族已经完成了大量工作，最引人注目的是聚羟基丁酸酯(PHB)聚合物(包括聚3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚4-羟基丁酸酯(P4HB))、聚羟基戊酸酯(PHV)、聚羟基己酸酯(PHH)、聚羟基辛酸酯(PHO)及其共聚物。具体而言，PHB显示出是有前景的，因为该聚合物来源于天然来源，可以通过若干机制进行生物降解，并且与人体组织具有生物相容性。特别有利的是，PHA家族生物聚合物表现出与一些石油基聚合物非常相似的热塑性特性，因此代表了石油基聚合物(诸如聚丙烯和聚乙烯)的可行替代物。

聚羟基链烷酸酯是使用多个细菌属和古菌属合成的，这些细菌属和古菌属包括盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、盐杆菌属(Salinobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、盐单胞菌属(Halomonas)、海杆菌属(Marinobacter)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、盐球菌属(Halococcus)、盐棍菌属(Halorhabdus)、适盐菌属(Haladaptatus)、无色嗜盐菌属(Natrialba)、盐栖菌属(Haloterrigena)和盐红色菌属(Halorussus)。聚羟基链烷酸酯作为这些生物体的能量库。由上述微生物进行的聚羟基链烷酸酯聚合物的产生涉及三步酶促机制，该机制从乙酰辅酶A开始。在形成PHB时，第一步是通过PhaA(β-酮硫解酶)进行的乙酰辅酶A的催化形成β-酮酰辅酶A。转而，它在NADP依赖性反应中通过PhaB酶(β-酮脂酰辅酶A还原酶)转化为R-3-羟酰辅酶A。最后一步，通过PhaC(PHB合成酶)催化使R-3-羟酰辅酶A聚合成PHB。换句话说，该途径的最后一步涉及通过聚羟基链烷酸酯聚合酶将羟基链烷酸单体聚合成聚羟基链烷酸酯聚合物。生物合成的聚羟基链烷酸酯作为大分子量细粒在细菌细胞中积聚，可占细胞干物质的约60％至约90％。

这些相同的生物体表达胞外和/或胞内PHB解聚酶(基因phaZ)，该酶将聚合物降解回羟基丁酸酯(HB)和小PHB寡聚体。所得的HB被进一步降解，为微生物提供碳和能源。从工业的角度来看，HB是一个尽头，因为它不能通过任何已知的化学过程直接再聚合。虽然它可以在环境上完全降解，但是如果能够将HB转化为易于用于重新形成PHB的形式，那么在经济和环境上都是有利的。

在自然界中，为了回收聚合物中储存的能量，生物降解通过PHA解聚酶(PHAD酶)来完成。不幸的是，天然PHAD酶通常不利于工业过程，例如消费后回收过程，因为用于任何生物工业过程的酶必须具有若干典型的PHAD酶缺乏的特征。为了广泛使用，用于在工业过程中使用的酶应该是热力学和/或热稳定的，以在该过程中具有长寿命。酶还应该是在动力学上尽可能快的，使得在最少的时间内将最大量的底物转化为产物。酶还必须在工业过程的环境条件下具有完全活性。例如，在涉及处理污染的含有PHB的个人护理产品(例如尿布、女性护垫、失禁服装等)的过程中，酶必须能够在被粪便、尿、月经液等污染的环境中起作用。理想地，酶应该在设计用于中和用过的消费品中可能存在的污染物(例如嗜温细菌)的处理环境中起作用。

如果存在重新形成HB的过程，则将在废物处理过程方面取得重大进展。具体地说，即使与石油基聚合物相比，生物聚合物能够更快地生物降解，生物聚合物一旦被丢弃仍然可以在垃圾填埋场或土壤中保留很长一段时间。因此，需要一种用于在生物聚合物(诸如聚羟基链烷酸酯)进入固体废物流时对它们进行分解和回收，或者重新使用生物聚合物以将它们从废物流中完全除去的系统和方法。

需要可以回收生物塑料以回收PHA的方法，然后PHA可以在重新形成生物塑料和/或生物聚合物中被重新使用。如果回收和重新形成的生物聚合物适用于消费品和工业过程，则将是另一个有益效果。可以在处理来自消费后个人护理产品的生物聚合物中(例如在回收过程中)使用的工业处理材料和方法将在本领域中具有很大益处。具体而言，如果能够将HB转化为易于用于重新形成PHB的形式，那么在经济(和环境上)都是有利的。提供一种使用酶将消费后产品转化为回收的单体并且将回收的单体聚合成适用于工业过程的生物聚合物的方法，将是另一个有益效果。提供绕过任何涉及乙酰辅酶A的反应的用于重新形成生物聚合物的反应途径，从而允许聚羟基丁酸酯分解为羟基丁酸酯然后重新形成聚羟基丁酸酯的途径，将是另一个有益效果。

发明内容

一般而言，本公开涉及用于PHA聚合物的降解、脱污和回收的方法和系统。此类PHA聚合物可以是可能被污染的消费后产品，诸如消费后个人护理产品、食品行业产品和其他回收的含有PHA的制品的组分。目前，大部分消费后产品包括但不限于包装、吸管、杯子、瓶子、购物袋、餐具、盘子和个人护理产品(诸如个人护理服装(例如尿布、儿童训练裤、一次性泳裤、女性卫生用品、成人失禁用品)、卫生棉条分配器、医疗用品等)，是由石油基聚合物制成的。目前的重大工作是将生物聚合物(诸如PHA)纳入此类产品中，并且改善和促进生物聚合物的回收。本公开涉及可以用于在小型或大型环境中进行生物聚合物的同时脱污、生物降解和回收的改善的方法和系统。

在一个方面，公开了从含有聚羟基链烷酸酯的消费后产品中回收聚羟基链烷酸酯家族中的生物聚合物的方法。所述方法包括，在第一容器内，使消费后产品与嗜极端微生物悬浮液或嗜极端解聚酶接触，以提供羟基链烷酸酯单体，将含有所述单体的溶液通过过滤器泵送至第二生物反应器容器，以及在第二容器内，使所述单体与一种或多种酶接触，以产生回收的聚羟基链烷酸酯。在一个方面，聚羟基链烷酸酯可以是聚羟基丁酸酯。在一个方面，嗜极端细菌或嗜极端解聚酶可以是或得自以下属：盐单胞菌属(Halomonas)、徐丽华菌属(Lihuaxuella)、溶杆菌属(Lysobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、Empedobacter(稳杆菌属)、Desulfovibrio(脱硫弧菌属)、盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、Halobacteriovorax、Haloechinothrix、盐海洋菌属(Halomarina)、盐红色菌属(Halorussus)、盐栖菌属(Haloterrigena)、Isoptericola、海杆菌属(Marinobacter)、Methyloligella、小单孢菌属(Micromonospora)、嗜盐碱球菌属(Natronococcus)、Nocardiopsis(诺卡土壤菌属)、副球菌属(Paracoccus)、Roseivivax、Saccharomonospora(糖单孢菌属)、希瓦氏菌属(Shewanella)、酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、Natranaerobius、盐杆茵科(Halobacteriaceae)、生丝单胞菌属(Hyphomonas)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、乔治菌属(Georgenia)、热酸菌属(Acidothermus)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)或它们的组合。例如，在一个方面，嗜极端细菌或嗜极端解聚酶可以是或得自：嗜热徐丽华菌(Lihuaxuella thermophila)或海水盐单胞菌(Halomonas aquamarine)。在一个方面，嗜极端细菌可以具有约0.5摩尔/升至约5摩尔/升的耐盐性，或者约40℃至约120℃的耐温性，或者它们的组合。在一个方面，嗜极端解聚酶可以由经遗传修饰的微生物产生，所述微生物已经遗传修饰为分泌嗜极端解聚酶。例如，嗜极端解聚酶可以由至少一种类型的天然存在的微生物产生，所述天然存在的微生物天然编码嗜极端解聚酶。在一个方面，嗜极端微生物或嗜极端酶可以是以下生物体或从以下生物体纯化，所述生物体包括：河口溶杆菌(Lysobacter aestuarii)、抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)、布古尔溶杆菌(Lysobacter bugurensis)、辣椒溶杆菌(Lysobacter capsica)、产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)、Lysobacter lacus、Lysobacter lycopersici、马里溶杆菌(Lysobactermaris)、Lysobacter niastensis、深源溶杆菌(Lysobacter profundi)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.A03)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.cf310)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.H21R20)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.H21R4)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.H23M41)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.R19)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Root604)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Root690)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Root916)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Root983)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.TY2-98)、海绵溶杆菌(Lysobacter spongiae)、居海绵溶杆菌(Lysobacter spongiicola)、溶杆菌属、碱土溶杆菌(Lysobacter alkalisoli)、抗砷溶杆菌(Lysobacter arseniciresistens)、大田溶杆菌(Lysobacter daejeonensis)、Lysobacter dokdonensis、产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)、产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)、Lysobacter gilvus、胶状质溶杆菌(Lysobacter gummosus)、马里溶杆菌(Lysobacter maris)、Lysobacter oculi、Lysobacter panacisoli、Lysobacter penaei、Lysobacter prati、耐冷溶杆菌(Lysobacter psychrotolerans)、Lysobacter pythonis、瑞身溶杆菌(Lysobacter ruishenii)、Lysobacter segetis、Lysobacter silvestris、Lysobacter silvisoli、Lysobacter soli、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.17J7-1)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.Alg18-2.2)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Cm-3-T8)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.H23M47)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.HDW10)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.II4)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.N42)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.OAE881)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.Root494)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.URHA0019)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.WF-2)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.yr284)、Lysobacter tabacisoli、Lysobacter telluris、Lysobacter tolerans、Lysobacter tolerans、新疆溶杆菌(Lysobacter xinjiangensis)、未分类的溶杆菌、Aliivibrio finisterrensis、费氏别弧菌(Aliivibrio fischeri)、Aliivibrio sifiae、别弧菌属物种(Aliivibriosp.)、别弧菌属物种(Aliivibrio sp.1S128)、别弧菌属物种(Aliivibrio sp.EL58)、别弧菌属物种(Aliivibrio sp.SR45-2)、Caballeronia arvi、Caballeronia calidae、Caballeroniahypogeia、Caballeronia insecticola、Caballeronia pedi、Caballeronia terrestris、Dokdonella koreensis、

Dyella caseinilytica、Dyella choica、鼎湖山戴氏菌(Dyella dinghuensis)、Dyella flava、江宁戴氏菌(Dyella jiangningensis)、Dyella kyungheensis、Dyellamobilis、Dyella monticola、Dyella nitratireducens、Dyella psychrodurans、Dyellasoli、Dyella solisilvae、戴氏菌属物种(Dyella sp.7MK23)、戴氏菌属物种(Dyellasp.ASV21)、戴氏菌属物种(Dyella sp.ASV24)、戴氏菌属物种(Dyella sp.C11)、戴氏菌属物种(Dyella sp.C9)、戴氏菌属物种(Dyella sp.DHC06)、戴氏菌属物种(Dyellasp.EPa41)、戴氏菌属物种(Dyella sp.G9)、戴氏菌属物种(Dyella sp.M7H15-1)、戴氏菌属物种(Dyella sp.M7H15-1)、戴氏菌属物种(Dyella sp.OK004)、戴氏菌属物种(Dyellasp.S184)、戴氏菌属物种(Dyella sp.SG562)、戴氏菌属物种(Dyella sp.SG609)、戴氏菌属物种(Dyellasp.YR388)、Dyella tabacisoli、博兹曼荧光杆菌(Fluoribacterbozemanae)、杜氏荧光杆菌(Fluoribacter dumoffii)NY 23、戈氏荧光杆菌(Fluoribactergormanii)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、耐热假单胞菌(Pseudomonas thermotolerans)、地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)、冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.MB-3u-54)、冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.psych-6C06)、冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.RZ22)、冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.Urea-02u-13)、反硝化罗河杆菌(Rhodanobacter denitrificans)、黄褐色罗河杆菌(Rhodanobacterfulvus)、甘草罗河杆菌(Rhodanobacter glycinis)、Rhodanobacter lindaniclasticus、Rhodanobacter panaciterrae、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.7MK24)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.A1T4)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.B04)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.B05)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.C01)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.C03)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.C05)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.C06)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.DHB23)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.DHG33)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.L36)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.MP1X3)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.OK091)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.OR444)、罗河杆菌属物种(Rhodanobactersp.PCA2)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.Root480)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.Root627)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.Root627)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.SCN 67-45)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.SCN 68-63)、罗河杆菌属物种(Rhodanobactersp.Soil772)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.T12-5)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.TND4EH1)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.TND4FH1)、Rhodanobacter spathiphylli、Rhodanobacter thiooxydans、Stenotrophomonaschelatiphaga、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、Stenotrophomonas panacihumi、Stenotrophomonas pavanii、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)、寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonassp.DDT-1)、寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonas sp.RIT309)、寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonassp.SKA14)、河口弧菌(Vibrio aestuarianus)、Vibrio antiquaries、水弧菌(Vibrioaquaticus)、塔斯马尼斯弧菌(Vibrio tasmaniensis)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)细菌、白纹黄单胞菌属(Xanthomonas albilineans)、树生黄单胞菌(Xanthomonasarboricola)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、溴黄单胞菌(Xanthomonasbromi)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、大麻黄单胞菌(Xanthomonascannabis)、柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)、真泡黄单胞菌(Xanthomonaseuvesicatoria)、草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae)、天竺葵黄单胞菌(Xanthomonashortorum)、风信子黄单胞菌(Xanthomonas hyacinthi)、水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)、菜豆黄单胞菌(Xanthomonas phaseoli)、豌豆黄单胞菌(Xanthomonas pisi)、糖黄单胞菌(Xanthomonas sacchari)、黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp.Leaf131)、黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp.NCPPB 1128)、半透明黄单胞菌(Xanthomonas translucens)、Xanthomonas vasicola、Xanthomonas vesicatoria或它们的组合。例如，嗜极端酶或嗜极端微生物可以选自荧光假单胞菌或根癌农杆菌，或者从荧光假单胞菌或根癌农杆菌纯化。在一个方面，嗜极端酶可以包含约12个或更少的半胱氨酸残基。在一个方面，嗜极端解聚酶具有约3kDa或更小的分子量。在一个方面，过滤器可以是约3kDa至约30kDa的分子量筛截过滤器，任选地随后是离子交换床。在一个方面，当在600nm处测量的第一生物反应器容器内容物的光密度

约小于0.4或当消费后产品中至少40％的聚羟基链烷酸酯已经解聚为单体或它们的组合时，可以通过过滤器将羟基链烷酸酯单体泵送至第二生物反应器容器。在一个方面，消费后产品可以含有尿液、月经、粪便或它们的组合，包括失禁产品、婴儿和儿童护理产品、女性护理产品和家庭护理产品或它们的组合。

本公开还整体涉及由在多步酶促反应中通过聚羟基丁酸酯的解聚释放的羟基丁酸酯而产生的聚羟基丁酸酯。例如，聚羟基丁酸酯可以通过以下方式来产生：在第一生物反应器容器中，使聚羟基丁酸酯与解聚酶接触，以提供羟基丁酸酯单体，以及在第二生物反应器容器中，用羟基丁酸酯脱氢酶将羟基丁酸酯单体转化为乙酰乙酸酯，用乙酰乙酰辅酶A合成酶将乙酰乙酸酯转化为乙酰乙酸酯辅酶A，用乙酰乙酰辅酶A还原酶将乙酰鲸蜡基辅酶A还原为羟基丁酰辅酶A，以及用羟基丁酸酯聚合酶使羟基丁酰辅酶A聚合，以形成聚羟基丁酸酯。在一个方面，合成酶、还原酶和聚合酶可以从假单胞菌属或农杆菌属细菌纯化而来。在一个方面，假单胞菌属泽漆皂苷也可以包含在第二生物反应器容器中。

在一个方面，本公开还整体涉及一种用于从含有聚羟基丁酸酯的消费后产品回收聚羟基丁酸酯的方法。例如，所述方法可以包括在第一生物反应器容器内使消费后产品与嗜热或嗜盐细菌悬浮液或者嗜热或嗜盐解聚酶接触，以提供羟基丁酸酯单体，将羟基丁酸酯单体泵送通过分子量筛截过滤器，任选地随后通过离子交换床，然后泵送至第二生物反应器容器，所述分子量筛截过滤器任选地后接离子交换床，以及在第二生物反应器容器内，使羟基丁酸酯单体与酶和辅因子进料接触，从而产生回收的聚羟基丁酸酯。在一个方面，消费后产品还包含可以使用第一生物反应器容器中的高盐浓度或高温来控制的污染物。在一个方面，辅因子进料包括辅酶A、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、三磷酸腺苷、单磷酸腺苷、焦磷酸或它们的组合。

本公开的其他特征和方面在下文更详细地讨论。

附图说明

在说明书的其余部分中并参考附图更具体地提出了本公开全面并使之能够实施的公开内容，在附图中：

图1是根据本公开的生物反应器的一个方面的设计；

图2是根据本公开的所提出的PBH循环的一个方面的图示；

图3是根据实施例的PHB解聚酶酶活性随时间推移的图形表示；

图4是根据实施例的生物反应器的容器二中的HBD和ACS反应随时间推移的图形表示；

图5是根据实施例的PHB解聚酶对新形成的PHB的解聚随时间推移的图形表示；并且

图6是根据本公开的PHB/HB循环的完全解聚-再聚合中的五个酶促步骤的一个方面的图示。

在本说明书和附图中对附图标记的反复使用旨在表示本发明的相同或类似的特征或元件。

具体实施方式

定义

术语“约”、“大约”或“大致上”在本文中用于修饰值时表示所述值可以增加或减少10％(诸如7.5％、诸如5％、诸如4％、诸如3％、诸如2％或诸如1％)并且保持在所公开的方面内。

如本文所用，术语“可生物降解的”或“可生物降解的聚合物”通常是指可通过天然存在的微生物(诸如细菌、真菌、古菌和藻类)的作用；环境热量；水分；或其他环境因素而降解的材料。材料的生物降解性可以使用ASTM测试方法5338.92来确定。

如本文所用，术语“酶”通常是指包括但不限于以下各项的酶：天然酶、纯化的酶、野生型酶、经修饰的酶或它们的组合。

如本文所用，术语“微生物”包括野生型或经修饰的细菌、真菌、古菌和藻类，它们表达或产生本文讨论的一种或多种酶

如本文所用，术语“聚羟基链烷酸酯”或“羟基链烷酸酯”通常是指这样的生物聚合物的化学家族，该化学家族包括但不限于以下成员：聚羟基丁酸酯(PHB)聚合物，包括聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚羟基戊酸酯(PHV)、聚羟基己酸酯(PHH)、聚羟基辛酸酯(PHO)以及它们中的每个的单体和共聚物。

详细描述

本领域的普通技术人员应当理解，本讨论仅是对示例性方面的描述，而无意限制本公开的更广泛的方面。

一般而言，本公开涉及用于羟基丁酸酯(HB)的聚合的基于酶的循环，该循环允许回收的HB聚合为工业上可用的PHB。此外，本公开已经发现这种循环可以在两个容器工业样生物反应器100方法中完成(参见例如图1，该方法将在下文更详细地讨论)，该方法允许回收的PHB以高收率和高纯度方式形成。这种基于酶的方法使得在自然界中通常不能重新形成为PHB的HB能够聚合为PHB。由于HB不能通过任何已知的化学过程直接再聚合，因此从工业的角度来看，HB是一个尽头。然而，出乎意料的是，本公开提供了将HB转化为可以容易地用于重新形成PHB的形式的途径，所述重新形成PHB通过利用两种另外的酶在单个封闭的双容器生物反应器中进行：羟基丁酸酯脱氢酶(HBD)和乙酰乙酰辅酶A合成酶(ACS)。具体而言，本文公开的途径绕过了涉及乙酰辅酶A的任何反应，因此代表了从聚羟基丁酸酯至羟基丁酸酯以及至聚羟基丁酸酯的反应的新的非天然存在的途径。

具体而言，本文列出的酶促途径将从解聚的PHB释放的HB转化回PHB。这形成了生物塑料的完全回收利用，因为由PHB制成的消费品可以分解为HB，而HB又可以再聚合以产生新的(且完全回收的)PHB，这种新的PHB可以用于新的消费品。值得注意的是，下文描述的方法在本文中称为“PHB循环”，该循环绕过了天然存在的PHB生物合成中的第一步，并且以四个步骤将HB转化为PHB，这可以在封闭的双容器系统中进行，该系统将更详细地讨论。

因此，本公开已经发现，通过单独利用酶的独特组合或者将该独特组合与嗜极端细菌组合，消费后产品可以分解为HB单体单元，HB单体单元继而再聚合，从而允许从消费后产品形成新的PHB聚合物和/或产品。此外，本公开已经出乎意料地发现，与本领域的常规教导不同的是，可以利用本文讨论的PHB循环来使HB单体单元聚合为PHB。此外，本公开已经发现，所公开的PHB循环可以与一种或多种嗜极端细菌一起使用，这允许解聚步骤或容器与再聚合步骤或容器之间的直接连接，避免低效且高成本的清洁步骤。

所提出的PHB循环利用来自精心选择的微生物的酶，该酶克服了此前自然循环中缺乏从HB形成PHB的能力的缺陷。PHB循环是从PHB开始并且以新聚合的PHB结束的环状酶循环(参见例如图2)，并且包括来自多种微生物的精心选择的酶(102、116)。具体而言，基于包括但不限于以下的因素来选择微生物：容易且快速地以高密度生长、不需要特殊培养基、需氧、动力学快速、稳定、耐受高盐环境、耐受温度环境、能够产生容易纯化的酶、缺乏非常规等电点、不需要增强的生物安全措施、不包含过量的半胱氨酸残基、总体上非体内的、可商购获得或它们的组合，这将在下文中更详细地讨论。

然而，虽然迄今为止已经讨论了存在于溶液中的酶，但是应当理解，在一个方面，该方法可以利用天然表达所讨论的酶或者已经被修饰为表达所期望的酶的一种或多种微生物来进行。这种系统可以称为基于细菌的酶生物反应器，而不是上文讨论的基于酶的生物反应器。当然，如果利用基于细菌的生物反应器，可能需要另外的培养基，诸如生长培养基。然而，无论生物反应器是基于细菌的还是基于酶的，生物反应器都可以以分批、连续流或灌注模式运行。

图6更详细地提供了形成图2的PHB循环的五个酶促反应，包括：ACA：乙酰辅酶A乙酰转移酶，ACR：乙酰乙酰辅酶A还原酶，HBP：羟基丁酸酯聚合酶，PHD：聚羟基丁酸酯解聚酶、HBD羟基丁酸酯脱氢酶，ACS：乙酰乙酰辅酶A合成酶，辅酶A：辅酶A，NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADP：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，ATP：三磷酸腺苷，AMP：单磷酸腺苷，以及PPi：焦磷酸。

例如，可以从多种生物体获得的PHB解聚酶被用于第一反应(本文也称为“第一步”或图6中的反应1，并且该反应在第一容器中进行)。在第二反应(本文也称为“第二步”或图6中的反应2，该反应在第二容器中发生)中，使用3-羟基丁酸酯脱氢酶从羟基丁酸126形成乙酰乙酸酯128。乙酰乙酰辅酶A合成酶(ACS)进行PHB循环中的第三反应(本文也称为“第三步”或图6中的反应3，该反应在第二容器中发生)，并且提供将中间体提交给后续再聚合反应，将乙酰乙酸酯128转化为乙酰乙酰辅酶A 130的重要步骤。如图6所示，第三反应需要辅酶A和ATP作为辅助因子，并且在第二容器中发生。乙酰鲸蜡基辅酶A130在PHB循环的第四步(图6中的反应4，在第二容器中发生)中被乙酰乙酰辅酶A还原酶还原，形成可聚合分子羟基丁酰辅酶A 132。第五步也是最后一步(本文也称为“最终步骤”或图6中的反应5，该反应在第二容器中发生)是羟基丁酰辅酶A 132聚合为PHB 120的步骤，该步骤由HB聚合酶催化。

如上文所讨论，PBH循环反应的第二至五步在生物反应器系统100的第二容器118中进行，该生物反应器系统可以以自动或手动方式操作(图1)。生物反应器100由以封闭方式连接的两个或更多个容器(106/108、118)组成，该容器分隔整个反应的关键部分并且允许在整个反应的这些部分之间进行过滤(112、114)。

例如，如图1所示，在一个方面，含有一种或多种PHB聚合物的消费后制品或待回收的制品104可以被放置于第一容器106/108中。应当理解，消费后制品104可以处于其原始消费形式，或者可以在添加至第一容器106/108之前被切碎或压碎。然而，如上文所讨论，在一个方面，在将消费后制品104添加至第一容器106/108之前不进行预清洁或消毒步骤。

无论消费后/回收的制品104的形式如何，将含有PHA解聚酶的一种或多种酶进料102引入第一容器106/108中。然而，在一个方面，微生物来源的酶进料包含嗜极端微生物或微生物来源的嗜极端解聚酶。如本文所用，并且如下文更详细地讨论，嗜极端是指耐受一种或多种恶劣环境，诸如高盐、高温、高压、酸性、碱性等等的微生物或从嗜极端微生物获得的酶，下文将阐述其具体实例。

嗜极端微生物来源的酶或微生物本身102以及精心选择的第一生物反应器容器中的环境条件(106、108，例如能够对消费后产品进行消毒的条件，例如盐、热或压力)允许在单个容器中消除或减少消费后产品104中的任何粪便或其他污染物并且同时使PHB 124解聚。例如，来自嗜热、嗜盐、嗜压、嗜酸、嗜碱或抗辐射生物体的解聚酶或微生物本身(102)的选择提供了减少在工业过程期间粪便细菌污染物或其他污染物(例如，消费后尿布中存在的污染物)的潜在问题的若干方式。这是因为粪便细菌和其他污染物无法在高温、极高盐浓度或高压处存活。因此，本公开允许对消费后产品104进行灭菌并且同时使PHB 124解聚的独特和有效的途径。当然，应当理解的是，嗜盐容器(例如106)和嗜热容器(例如108)(或其他极端环境容器)可以同时进行，以增加对第二容器118的HB供应。然而，如上文所讨论，并且如下文更详细地讨论，第一容器106/108二者可以包含来自相同的或不同的嗜极端微生物(诸如嗜盐微生物、嗜热微生物、耐压微生物或它们的组合)的酶。

此外，如图1所示，第一容器106/108和/或第二容器118包括搅拌器110。搅拌器110可以在反应过程中连续运行，或者可以如本领域已知的那样间歇地启动和停止。

然而，允许PHB解聚酶反应继续进行直到含有PHB的消费后产品104中的PHB的所期望的部分被解聚。如将在以下实例中更详细地讨论，可以允许反应进行直到观察到PHB解聚酶减少、在600nm处的光密度降低、聚合物的目视观察减少或者已经过去一定时间段。

例如，在一个方面，PHB解聚酶的活性可以随着PHB存在量的减少而减少。如图3所示以及下文更详细地讨论，HB产生的速率是时间和酶活性的函数。因此，在一个方面，可以进行第一容器106/108中的反应直到出现酶活性的平台期(例如，图3中的约60分钟)。

或者，可以进行一次或多次光学或目视测量。例如，PHB不溶于大多数溶剂，在600nm处产生高光密度，而HB由于分子量较小，通常是可溶的。因此，在600nm处测量的光密度降低，诸如光密度为约0.9或更小，诸如约0.8或更小，诸如约0.7或更小，诸如约0.6或更小，诸如约0.5或更小，诸如约0.4或更小，诸如约0.3或更小，诸如约0.2或更小，诸如约0.1或更小，这表明PHB已经解聚为HB单体。

或者，随着PHB的解聚，PHB/消费后产品的可见碎片可以减少。在这个方面，完成时间可以基于第一容器106/108中的溶液的目视分析。然而，在另一个方面，完成时间基于引入第一容器106/106中的PHB和PHB解聚酶的量来确定(或者时间基于光密度或PHB解聚酶活性的样品来计算)，并且允许第一容器反应一段时间。

无论选择什么时间，在第一容器106/108中的反应完成之后，允许含有废物和解聚的HB的第一反应溶液109流向一个或多个过滤器112/114。在一个方面，过滤器112是尺寸排阻过滤器(诸如，分子量筛截过滤器)，该过滤器的尺寸为约5kD或更小，诸如约4.5kD或更小，诸如约4kD或更小，诸如约3.5kD或更小，诸如约3kD或更小，或者它们之间的任何范围或值。具体而言，可以使用任何尺寸的过滤器，该过滤器的尺寸适当地保持消费后产品104的任何剩余的碎片、任何剩余的PHB(未解聚)以及任何剩余的PHB解聚酶。最重要的是，应当选择过滤器以保持PHB解聚酶，因为允许PHB解聚酶通过至第二容器118将引发重新形成的PHB的解聚。然而，此时保持较大的废物颗粒以允许重新形成的PHB120容易地收集于第二容器118中也是有利的。

此外，在一个方面，除尺寸排阻过滤器之外，利用离子交换过滤器114(诸如Dowex离子交换床)可以是另一个有益效果，尤其是当使用嗜盐酶时(例如，当第一容器106/106利用高盐浓度来对消费后产品中的任何杂质进行破坏或中和或消毒时)。离子交换过滤器114可以从第一反应溶液109中除去盐，以使得中性的无废HB单体溶液111进入第二容器118，从而使得第二容器118中不需要嗜极端酶。

通过将辅因子进料116和已通过至少一个过滤器(112、114)的HB溶液111供应至第二容器118，在第二容器118中同时进行PHB循环的后续步骤。具体而言，如上文所讨论，允许图2和6的反应二至五在第二容器118中进行直到收集到新形成的PHB120的沉淀物。如下文更详细地讨论，HBD、ACS、ACR和HBP酶可以选自一种微生物或多种微生物。然而，为了使反应在单个容器中顺利进行，选择在相似的温度、pH、盐含量或它们的组合处优化的酶是有益的。因此，在一个方面，可以从单一生物体选择或纯化反应2至5的一种或多种酶，以增加所期望的环境中的相似性。然而，应当理解，在一个方面，每种酶选自不同的微生物。此外，如上文所讨论，在一个方面，可以在第二容器中使用微生物本身而不是由其产生的酶。

然而，辅因子进料116还提供如上文所讨论的图2和6的步骤2至5所需的辅因子，以及任何缓冲液、溶剂、其他添加剂或它们的组合。应当理解，辅因子和添加剂可以与HB单体溶液111同时添加，在整个过程中连续添加，或者可以在观察到滞后期或平台期反应时定期添加，或者它们的组合。

然而，本公开已经发现，基于消费后/回收的产品104中的PHB的重量计，至少约25％，诸如约27.5％或更多，诸如约30％或更多，诸如约32.5％或更多，诸如约35％或更多，诸如约37.5％或更多，诸如约40％或更多的消费后/回收的产品104中含有的PHB作为再聚合的PHB 120回收。

值得注意的是，消除或减少第一生物反应器容器中的污染物减少了过程操作员的风险，减少了过程设备污染的风险，并且可以在第二容器118中进行随后的反应，而无需预处理废物、生物反应器或最终后加工反应混合物的处理所需的附加灭菌程序。此外，这允许第二容器118中的过程步骤在中性环境(例如室温和中性盐)中进行，因为脱污在第一容器106/106和一个或多个过滤器112/114中受到控制。这可以简化整个处理过程并且可以降低成本，例如因为后加工混合物(在过滤步骤中与HB单体溶液111分离)可以安全地丢弃而无需附加加工。另外，本公开也可以在不需要包括附加抗病原体剂(例如，抗细菌加工助剂)的情况下使用，并且因此可以帮助防止此类试剂的过度使用以及病原体中的抗生素抗性的相关发展。

消费后/回收的产品104污染物包括但不限于嗜中温病原体，诸如但不限于病毒、细菌、真菌和原生动物，这些污染物可以通过所公开的方法来消除致病性。如本文所用，术语“嗜中温”(“mesophile”和“mesophilic”)是指自然存在于人类通常与生物体共存的环境条件下的生物体，所述环境条件包括接近人体温度(例如，约20℃至约45℃)、水中的盐含量为约千分之5至约千分之18份(也称为中盐)、约一个大气压(例如约20kPa至约110kPa)和接近中性pH(例如，约pH 5至约pH 8.5，也称为嗜中性(“neutrophile”或“neutrophilic”))。本文涵盖的典型细菌病原体可以包括人粪便中常见的那些，诸如但不限于链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterum)、乳杆菌属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或拟杆菌属(Bacteroides)。

然而，无论需要何种脱污，本公开整体涉及将消费后材料添加至嗜极端微生物群体或嗜极端解聚酶的溶液(例如第一容器106/108)，所述嗜极端微生物群体或嗜极端解聚酶的溶液被特别选择以分泌用于降解和回收生物聚合物的酶。在一个方面，微生物或由其产生的酶是包封的但保持有活力，并且一旦沉积于消费后材料储存库或第一容器中就从包封中释放。本公开的方法和系统特别涉及使用分泌适当的解聚酶的微生物(诸如细菌或古菌)或由其产生的酶来降解和回收用过的含有聚羟基链烷酸酯聚合物的产品。

根据本公开，任何合适的聚羟基链烷酸酯聚合物都可以被降解和回收。聚羟基链烷酸酯聚合物可以是均聚物或共聚物。聚羟基链烷酸酯，也称为“PHA”，是通过糖或脂质的细菌发酵在自然界中产生的直链聚酯。可以对该家族中超过100种不同的单体进行组合以产生材料。一种常见类型的聚羟基链烷酸酯聚合物是聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)。

可掺入聚羟基链烷酸酯聚合物中的单体单元的实例可以包括2-羟基丁酸酯、乙醇酸、3-羟基丁酸酯、3-羟基丙酸酯、3-羟基戊酸酯、3-羟基己酸酯、3-羟基庚酸酯、3-羟基辛酸酯、3-羟基壬酸酯、3-羟基癸酸酯、3-羟基十二酸酯、4-羟基丁酸酯、4-羟基戊酸酯、5-羟基戊酸酯和6-羟基己酸酯。

聚羟基链烷酸酯均聚物的实例包括聚3-羟基链烷酸酯(例如，聚3-羟基丙酸酯(PHP)、聚3-羟基丁酸酯(PHB)、聚3-羟基戊酸酯(PHV)、聚3-羟基己酸酯(PHH)、聚3-羟基辛酸酯(PHO)、聚3-羟基癸酸酯(PHD)和聚3-羟基-5-苯基戊酸酯(PHPV))、聚4-羟基链烷酸酯(例如，聚4-羟基丁酸酯(下文称为PHB)和聚4-羟基戊酸酯(下文称为PHB))或聚5-羟基链烷酸酯(例如，聚5-羟基戊酸酯(下文称为PHV))。

在某些方面，PHA可以是共聚物(含有两种或更多种不同的单体单元)，其中不同的单体随机分布在聚合物链中。PHA共聚物的实例包括聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基丙酸酯(下文称为PHB3HP)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-4-羟基丁酸酯(下文称为P3HB4HB)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-4-羟基戊酸酯(以下称为PHB4HV)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯(以下称为PHB3HV)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基己酸酯(以下称为PHB3HH)和聚3-羟基丁酸酯-共聚-5-羟基戊酸酯(以下称为PHB5HV)。

不仅可以根据PHB循环或PHA解聚酶对被选择用于本公开的微生物或微生物的集合(直接使用，或者产生上文讨论的一种或多种酶)进行选择以分泌特定的酶，而且可以基于消费后产品104废料储存库存在或生物反应器含有的环境条件来进行选择。例如，消费后材料储存库可以被包含在多种环境中的一种中，或者生物反应器可以含有多种环境中的一种，所述环境可以由土壤、垃圾填埋场或生物反应器中含有的特定温度范围、盐度量和氧量限定。根据本公开，特定环境变量可以与最适合特定环境的一种或多种微生物(诸如细菌和/或古菌)匹配。例如，微生物的选择可以基于所选的微生物的盐或温度耐受性，或者通过修饰具有所期望的盐或温度耐受性的微生物以表达适当的解聚酶来进行。例如，出乎意料地发现，当基于特定的耐盐性选择微生物时，适当的解聚酶的表达以及因此聚羟基链烷酸酯聚合物的降解可以基于所期望的降解速率而进一步增加和/或减慢。例如，所选的微生物可以是天然产生所期望的酶的微生物，或者可以是经遗传修饰或克隆以表达所期望的解聚酶基因的微生物。

在一个方面，当选择微生物以在一定的环境(所述环境杀死消费后产品104中存在的其他细菌或使这些细菌失活，所述消费后产品例如已经被粪便、月经、尿液等等污染的可穿戴制品)中发挥作用时，可以选择耐受以下盐浓度的微生物：约0.5M或更高，诸如约1M或更高，诸如约2M或更高，诸如约2.5M或更高，诸如约3M或更高，诸如约3.5M或更高，诸如约4M或更高，诸如约4.5M或更高，诸如约5M或更高，诸如约5.5M或更高，诸如约6M或更高，诸如约6.5M或更高，诸如约7M或更高，或者它们之间的任何范围或值。例如，在这个方面，消费后产品104可以被放置于高盐度液体，诸如含有具有根据上述范围的盐的体积摩尔浓度的盐水的容器、商业处理设施、生物反应器或具有高盐度的自然环境中。高盐度与对该浓度的盐具有耐受性的微生物一起可以导致消费后产品104的快速降解，并且还可以杀死制品中不耐受高盐度的其他细菌，诸如危险细菌。因此，在一个方面，任何一个或多个上述盐浓度都可以用于第一反应容器106/108中。

在另一个方面，当选择微生物以在一定的环境(所述环境杀死消费后产品104中存在的其他细菌或使这些细菌失活，所述消费后产品例如已经被粪便、月经、尿液等等污染的可穿戴制品)中发挥作用时，可以选择耐受以下温度的微生物：约40℃或更高，诸如约50℃或更高，诸如约60℃或更高，诸如约70℃或更高，诸如约80℃或更高，诸如约90℃或更高，诸如约100℃或更高，诸如约110℃或更高，诸如约120℃或更高，诸如约130℃或更高，诸如约150℃或更高，或者它们之间的任何范围或值。例如，在这个方面，消费后产品104可以被放置于高温，诸如含有具有根据上述范围的温度的水的容器、商业处理设施、生物反应器或具有高温的自然环境中。高温与对温度具有耐受性的微生物一起可以导致消费后产品104的快速降解，并且还可以杀死制品中不耐受高温的其他细菌，诸如危险细菌。因此，在一个方面，任何一个或多个上述温度可以单独或与任何一种或多种盐浓度组合用于第一反应容器106/108中。

在一个方面，当选择微生物以在一定的环境(所述环境杀死消费后产品104中存在的其他细菌或使这些细菌失活，所述消费后产品例如已经被粪便、月经、尿液等等污染的可穿戴制品)中发挥作用时，可以选择耐受以下高压的微生物：约0.5MPa或更高，诸如约1MPa或更高，诸如约5MPa或更高，诸如约10MPa或更高，诸如约15MPa或更高，诸如约20MPa或更高，诸如约30MPa或更高，诸如约40MPa或更高，诸如约50MPa或更高，诸如约60MPa或更高，诸如约70MPa或更高，诸如约80MPa或更高，诸如约90MPa或更高，诸如约100MPa或更高，诸如约150MPa或更高，诸如约200MPa或更高，诸如约250MPa或更高，诸如约300MPa或更高，诸如约350MPa或更高，诸如约400MPa或更高，诸如约450MPa或更高，诸如约500MPa或更高，诸如约550MPa或更高，诸如约600MPa或更低，或者它们之间的任何范围或值。例如，在这个方面，消费后产品104可以被放置于高压环境，诸如商业处理设施、生物反应器或具有根据上述范围的高压的自然环境中。高压与对高压具有耐受性的微生物一起可以导致消费后产品104的快速降解，并且还可以杀死制品中不耐受高压的其他细菌，诸如危险细菌。因此，在一个方面，任何一个或多个上述压力范围都可以用于第一反应容器106/108中。

在一个方面，酶可以包括由嗜热生物产生的PHB解聚酶(PHBD酶)。例如，该方法可以包括使消费后产品104与来自嗜热生物的天然PHBD酶接触和/或使消费后护理产品与可以产生PHBD酶的嗜热生物接触。在一个方面，该方法可以包括使消费后护理产品与包含修饰的PHBD酶的多肽接触，与由嗜热生物产生的野生型PHBD酶相比，该修饰的PHBD酶并入一个或多个单位点突变。

然而，应当理解，在一个方面，根据本公开的消费后产品104可以包含多于一种微生物，并且因此可以被构造为在如上文所讨论的任何盐浓度或温度处降解。在一个这种方面，消费后产品104可以在与低盐溶液(诸如在一个方面是体液)接触时开始降解，这可以开始降解过程，例如在添加至第一容器之前在储存库中开始该过程。然后将消费后产品104放置于高盐度环境中，所述环境活化耐高盐性微生物并且完成由耐低盐性微生物开始的降解过程，所述环境例如第一容器。在一个这种方面，消费后产品104可以在低温(诸如在一个方面是体液)处开始降解，这可以开始降解过程，例如在添加至第一容器之前在储存库中。然后将消费后产品104放置于高温环境中，所述环境活化耐高温性微生物并且完成由耐低温性微生物开始的降解过程，所述环境例如第一容器。

通常，可以选择任何合适的微生物以在本公开中使用酶或产生酶，所述微生物分泌能够降解和回收生物聚合物(尤其是聚羟基链烷酸酯聚合物)的代谢物或酶。例如，一种或多种微生物可以是一种或多种表达天然或外源性聚(羟基丁酸酯)解聚酶的细菌或古菌。在一个特定的方面，酶可以是聚[R-3-羟基丁酸酯]解聚酶。例如，以下反应展示了聚[R-3-羟基丁酸酯]解聚酶对聚羟基丁酸酯聚合物的酶促降解。

其中m<<<n，并且表示小寡聚体。

如上文所述，在一个方面，分解聚羟基链烷酸酯聚合物的酶或代谢物可以是天然表达所期望的酶的天然存在的细菌(或由其产生的酶)。例如，在一个方面，掺入本公开的产品的微生物或由其产生的酶选自多种细菌属，包括盐单胞菌属(Halomonas)、徐丽华菌属(Lihuaxuella)、溶杆菌属(Lysobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、稳杆菌属、脱硫弧菌属、盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、Halobacteriovorax、Haloechinothrix、盐海洋菌属(Halomarina)、盐红色菌属(Halorussus)、盐栖菌属(Haloterrigena)、Isoptericola、海杆菌属(Marinobacter)、Methyloligella、小单孢菌属(Micromonospora)、嗜盐碱球菌属(Natronococcus)、诺卡土壤菌属、副球菌属(Paracoccus)、Roseivivax、糖单孢菌属、希瓦氏菌属(Shewanella)、酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、Natranaerobius、盐杆茵科(Halobacteriaceae)、生丝单胞菌属(Hyphomonas)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、乔治菌属(Georgenia)、热酸菌属(Acidothermus)和喜热裂孢菌属(Thermobifida)。

在一个方面，用于所公开的方法和过程的嗜极端酶102可以是表现出在一些方面为约40℃或更高、约50℃或更高、约60℃或更高、约70℃或更高、约80℃或更高或者约90℃或更高的T_opt(在给定合适底物的情况下可以实现的最大反应速率的温度)的嗜热酶。本文涵盖的示例性嗜热菌(以及由此产生的嗜热菌酶)可以包括但不限于：苹果脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus pomorum)(WP-084453829)、热黄拟无枝酸菌(Amycolatopsisthermoflava)(WP-123687648)、热拟无枝酸菌属(Amycolatopsis thermalba)(WP-094002797)、鲁曼拟无枝酸菌(Amycolatopsis rumanii)(WP-116109633)、嗜热固氮螺菌(Azospirillum thermophilum)(WP-109324320)、放线硬化奇异球菌(Deinococcusactinosclerus)(WP-082689076)、冈瓦纳闪烁杆菌(Fervidobacterium gondwanense)(SHN54810)、嗜热甘贾里菌(Gandjariella thermophila)(WP-137812779)、萨提亚纳拉亚纳乔治菌(Georgenia satyanarayanai)(WP-146237554)、生丝单胞菌属物种(Hyphomanassp.)(HAO37884)、嗜热徐丽华菌(Lihuaxuella thermophila)(WP-089972404)、耐热微泡菌(Microbulbifer thermotolerans)(P-197462976)、耐热明武菌(Minwuiathermotolerans)(WP-206420073)、耐热红假单胞菌(Rhodopseudomonas thermotolerans)(WP-114356866)、戊酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas pentothenatexigens)(WP-114356866)、热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)(WP-067396676)、丰羽热厌氧单胞菌(Thermanaeromonas toyohensis)(WP-084666479)、热放线菌属物种(Thermoactinomyces sp.)CICC 10523(WP-198056464)、大曲热放线菌(Thermoactinomyces daqus)(WP-033100012)、嗜热放线菌属物种(Thermoactinosporasp.)(NUT44302)、红色嗜热放线菌(Thermoactinospora rubra)(WP-084965756)、耐盐嗜热裂孢菌(Thermobifida halotolerans)(WP-068692693)、褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)(WP-011290529)、双孢嗜热双孢菌(Thermobispora bispora)(WP-206206594)、腾冲热泉古菌(Thermocatellispora tengchongensis)(WP-185055796)、微温热着色菌(Thermochromatium tepidum)(WP-153975900)、市政热密卷菌(Thermocrispummunicipal)(WP-028851041)、二歧热黄微菌(Thermoflavimicrobium dichotomicum)(WP-093229000)、Thermogemmatispora carboxidivorans(WP-081839208)、Thermogemmatispora aurantia(WP-151728970)、Thermogemmatispora tikiterensis(WP-11243376)、Thermogemmatispora onikobensis(WP-084659191)、嗜热油菌纲(Thermoleophilaceae)细菌(MBA2429278)、棘孢嗜热单孢菌(Thermomonosporaechinospora)(WP-160147065)、解纤维素嗜热单孢菌(Thermomonosporacellulosilytica)(WP-182704610)、解淀粉嗜热单孢菌(Thermomonospora amylolytica)(WP-198679325)、Thermostaphylospora chromogena(WP-093263254)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(WP-197735236)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)(WP-053768217)、海岛栖热菌(Thermus islandicus)(HEO42284)。

本文涵盖的基于温度的酶不限于高温嗜热酶(及其来源的微生物)，并且在一个方面可以利用低温嗜冷酶(也称为嗜冷酶，及其来源的微生物)。例如，很多细菌菌株将无法繁殖，但是在暴露于约10℃的温度约6小时的时间后仍能存活。因此，在一些方面，可以利用能够在约10℃或更低，例如在一些方面7℃或更低或者约-15℃至约10℃的温度处具有活性的嗜冷酶(及其来源的微生物)。本文涵盖的示例性嗜冷菌(以及由此产生的嗜冷菌酶)可以包括但不限于：海洋交替单胞菌(Alteromonas oceani)(WP-123325050)、白色交替单胞菌(Alteromonas alba)(WP-105936495)、交替单胞菌属物种(Alteromonassp.)38(WP-201299304)、麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)(WP-156078157)、虾虎鱼交替单胞菌(Alteromonas ponticola)(WP-169211550)、解脂交替单胞菌(Alteromonaslipolytica)(WP-070178363)、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)(WP-005270754)、耐冷博斯氏菌(Bosea psychrotolerans)(WP-181011807)、解淀粉栖海冰菌(Glaciecola amylolytica)(WP-164472126)、生丝单胞菌属物种(Hyphomonas sp.)(HAO37884)、耐冷詹森菌(Janthinobacterium psychrotolerans)(WP-065307954)、嗜冷马西里亚菌(Massilia psychrophile)(WP-099914383)、嗜冷副冰栖菌(Paraglaciecolapsychrophile)(WP-007642709)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)SP1(WP-164483751)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)AER18D-145(WP-096697750)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)CF318(WP-007872516)、空泡极地单胞菌(Polaromonasvacuolate)(WP-168920719)、食萘极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)(WP-157040436)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)JS666(WP-011482994)、冰川极地单胞菌(Polaromonas glacialis)(WP-084181426)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)EUR31.2.1(WP-197028649)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)CG_9.2(WP-196864241)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)CG_9.11(WP-196869863)、Polaromonaseurypsychrophila(WP-188708524)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)(MBC7445758)、Polaromonas jejuensis(WP-068832216)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)AET17H-212(WP-096671180)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)YR568(WP-092127764)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)C04(WP-077562980)、耐冷假红杆菌(Pseudorhodobacterpsychrotolerans)(WP-08235149)、Psychrobacillus lasiicapitis(WP-142537823)、嗜冷芽孢杆菌属物种(Psychrobacillus sp.)OK032(WP-093265425)、嗜冷芽孢杆菌属物种(Psychrobacillus sp.)OK028(WP-093060398)、嗜冷芽孢杆菌属物种(Psychrobacillussp.)FJAT-21963(WP-056833301)、咸海鲜嗜冷杆菌(Psychrobacter jeotgali)(WP-201583776)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobactersp.)H8-1(WP-201574875)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)Cmf 22.2(WP-075103245)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)ENNN9_III(WP-058368887)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)P2G3(WP-068327306)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)P11G5(WP-068035467)、Psychrosphaera haliotis(WP-155693683)、嗜冷希瓦氏菌(Shewanella psychrophile)(WP-077755816)、Simplicispira psychrophile(WP-051603004)、Sphingobium psychrophilum(WP-169570392)、Sphingomonas psychrolutea(WP-188445826)、同型丙酸梭菌(Clostridiumhomopropionicum)(WP-074782965)、梭菌属物种(Clostridium sp.)DL-VIII(WP-009169886)、梭状梭菌(Clostridium clostridioforme)CAG:132(CDB63357)、大西洋王祖农菌(Zunongwangia atlantica)22II14-10F7(ORL47196)。

在一些方面，可以利用由嗜盐菌产生的嗜极端酶102。例如，在一些实施方面，可以利用在约1M或更高、约2M或更高的盐度处表现出活性的嗜盐菌酶。本文涵盖的示例性嗜盐菌(以及由此产生的嗜盐菌酶)可以包括但不限于：盐藻交替单胞菌(Alteromonashalophila)(WP-189403400)、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)(WP-005270754)、节杆菌属物种(Arthrobactersp.)NEB 688(WP-173027059)、高盐固氮螺菌(Azospirillum halopraeferens)(WP-029007775)、Empedobacter haloabium(TXE30443)、Desulfovibrio sulfodismutans(NDY59052)、湖南盐芽孢杆菌(Halobacillushunanensis)(WP-139377117)、衣氏盐芽孢杆菌(Halobacillus ihumii)(WP-16352794)、Halobacteriovorax marinus(WP-157868258)、Haloechinothrix halophila(WP-051400222)、东方盐海洋菌(Halomarina oriensis)(WP-158204529)、平静盐单胞菌(Halomonas cerina)(WP-183325502)、Halomonas korlensis(WP-089794761)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PR-M31(WP-048308188)、海水盐单胞菌(Halomonas aquamarine)(WP-089674669)、湛江盐单胞菌(Halomonas zhanjiangensis)(WP-040460201)、Halomonasaestuarii(WP-071946866)、内生盐单胞菌(Halomonas endophytica)(WP-102654199)、黑龙江盐单胞菌(Halomonas heilongjiangensis)(WP-102629242)、Halomonascampaniensis(WP-088701082)、嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphile)(WP-038486873)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)ALS9(WP-064233856)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)GFAJ-1(WP-009098816)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)KHS3(WP-041159480)、嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphile)(WP-162218603)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)ZH2S(WP-160419650)、Halomonas alkaliantarctica(WP-133732469)、Halomonas zincidurans(WP-031384106)、Halomonas chromatireducens(WP-083517585)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)KO116(WP-035563078)、盐单胞菌属物种(Halmonas sp.)A40-4(WP-199285424)、Halomonas ventosae(WP-035579360)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)HAL1(WP-008958555)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)MES3-P3E(WP-101146070)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)1513(WP-083700770)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)GT(WP-083007892)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PA5(QJQ97022)、Halomonas songnenensis(WP-106373458)、冰下盐单胞菌(Halomonas subglaciescola)(WP-079553041)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)HL-92(WP-074398447)、新疆盐单胞菌(Halomonasxinjiangensis)(WP-197053288)、Halomonas saliphila(WP-104202516)、盐单胞菌物种(Halomonas sp.)HL-48(WP-027336292)、Halomonas qijiaojingensis(WP-189471950)、乌鲁木齐盐单胞菌(Halomonas urumqiensis)(WP-102588859)、黄色盐单胞菌(Halomonaslutea)(WP-019020614)、Halomonas lutescens(WP-188638020)、Halomonas salicampi(WP-179930793)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)FME66(WP-193092800)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)156(CAD5269671)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)L5(WP-149329933)、南海盐单胞菌(Halomonas nanhaiensis)(WP-127060197)、泰坦尼克盐单胞菌(Halomonas titanicae)(WP-144810212)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)SH5A2(WP-186255949)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)TD01(WP-009722522)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PC(WP-127040515)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)RC(WP-126951333)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)DQ26W

(WP-114573011)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)TQ8S(WP-114486842)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PYC7W(WP-114478819)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)LBP4(WP-181421925)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QX-1(WP-176303735)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.QX-2(WP-180092182)、冰盐单胞菌(Halomonas glaciei)(WP-179915254)、肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)(WP-179927495)、仙河盐单胞菌(Halomonasxianhensis)(WP-092845804)、Halomonas gudaonensis(WP-089686750)、Halomonashumidisoli(WP-095603093)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)(WP-083825729)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QHL1(WP-083571058)、Halomonasilicicola(WP-072822829)、Halomonas saccharevitans(WP-089847692)、Halomonasmuralis(WP-089729617)、Halomonas arcis(WP-089706930)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)(WP-040480056)、Halomonas andesensis(WP-126944084)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)G5-11(WP-168017113)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)THAF5a(QFU03326)、Halomonas taeanensis(SDG32001)、盐单胞菌属物种(Halorussussp.)RC-68(WP-128475846)、Halorussus ruber(WP-135825713)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)ZS-3(WP-158056449)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)HD8-83(WP-135830119)、盐沼盐红色菌(Halorussus salinus)(WP-135854680)、解淀粉盐红色菌(Halorussus amylolyticus)(WP-132060623)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)MSC15.2(WP-163523881)、Haloterrigena limicola(WP-008010666)、西班牙盐栖菌(Haloterrigena hispanica)(WP-149782231)、盐栖菌属物种(Haloterrigena sp.)H1(WP-138782397)、Isoptericola halotolerans(WP-171781920)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)X15-166B(WP-198929205)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)LPB0319(WP-2066439888)、Marinobacter salaries(WP-126811858)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)PJ-16(WP-137435339)、Marinobacter nanhaiticus(WP-004579452)、Marinobacterbohaiensis(WP-111497193)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)ANT_B65(WP-202971753)、沉积海杆菌(Marinobacter sediminum)(WP-203299860)、居泉海杆菌(Marinobacterfonticola)(WP-148861082)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)JB02H27(WP-150989051)、Marinobacter maritimus(WP-144775354)、硝酸盐还原海杆菌(Marinobacternitratireducens)(WP-036130189)、Marinobacter aromaticivorans(WP-100686899)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)MCTG268(WP-081899301)、深源海杆菌(Marinobacterprofundi)(WP-099614009)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)R17(WP-123633665)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)F3R11(WP-113816648)、Marinobacter lipolyticus

(WP-012136507)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LV10MA510-1(WP-098421792)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LV10R520-4(WP-143751449)、南极海杆菌(Marinobacter antarcticus)(WP-072795398)、浙江海杆菌(Marinobacterzhejiangensis)(WP-092022278)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LZ-8(WP-138439039)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LZ-6(WP-138437074)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)DS40M8(WP-169052525)、胜利油田海杆菌(Marinobactershengliensis)(WP-106694886)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)(WP-007152654)、Marinobacter salicampi(WP-166253549)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)JSM1782161(WP-165857264)、Methyloligella halotolerans(WP-069095898)、嗜盐小单孢菌(Micromonospora halophytica)(WP-091291516)、嗜盐碱球菌属物种(Natronococcussp.)LS1_42(WP-148858780)、Nocardiopsis halotolerans(WP-017570132)、Paracoccushalophilus(WP-036743786)、Roseivivax halodurans(WP-037257008)、嗜盐糖单孢菌(Saccharomonospora halophila)(WP-157601674)、Shewanella vesiculosa(NCO72699)、Shewanella psychrophila(WP-077755816)、Shewanella frigidimarina(WP-123883413)、Shewanella khirikhana(WP-126168307)、Shewanella halifaxensis(WP-108946642)、Shewanella waksmanii(WP-028774143)、Shewanella saliphila(WP-188922486)、Shewanella ulleungensis(WP-188954542)、Shewanella litoralis(WP-160052797)。

在一些方面，可以利用由嗜酸菌产生的嗜极端酶102。例如，可以利用在约1至约5.5的pH处表现出活性的嗜酸菌酶。本文涵盖的示例性嗜酸菌(以及由此产生的嗜酸菌酶)可以包括但不限于：Acidibrevibacterium fodinaquatile(WP-162800754)、喜酸菌属物种(Acidicaldus sp)(HGC43174)、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)(WP-050751056)、生红酸球形菌(Acidisphaera rubrifaciens)(WP-084623200)、酸球形菌属物种(Acidisphaera sp.)S103(WP-158926549)、酸杆菌门(Acidobacteria)细菌(MBI4850940)、酸杆菌目(Acidobacteriales)细菌(MBA3914351)、酸杆菌科(Acidimicrobiaceae)细菌(TPW09344)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)(WP-011719018)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)(RZJ59385)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Leaf160(WP-156382378)、西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)(WP-116212334)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)ST3(WP-110960035)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)SD340(WP-055393692)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)JHL-9(WP-026434583)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)JHL-3(WP-024815995)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)59(WP-099731663)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)T1(WP-087747071)、Acidovorax radices(WP-145694120)、西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)(MVT28077)、Acidovorax konjaci(WP-184273732)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)YL-MeA13-2016(WP-179683865)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)JMULE5(WP-176888736)、Acidovorax carolinensis(WP-086926820)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root219(WP-057264729)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root217(WP-057200451)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root70

(WP-056639581)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root267(WP-057271450)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root275(WP-057228519)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root568(WP-056742554)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root402(WP-056056880)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Leaf78(WP-056167938)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)CF316(WP-007848954)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)NO-1(WP-008904688)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)KKS102(WP-015015374)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)BoFeN1(WP-114656624)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)MR-S7(WP-020227330)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)GW101-3H11(WP-063462297)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)100(WP-121942233)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)94(WP-121421729)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)93(WP-121508058)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)IB03(WP-198847087)、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(WP-182119389)、Acidovorax cattleya(WP-196290774)、Acidovorax soli(WP-184855240)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)TP4(BAA35137)、食酸菌属物种(Acidovoraxsp.)HMWF018(WP-199227795)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)107(WP-108624875)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)69(WP-100412617)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)RAC01(WP-069104250)、燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)(WP-107129247)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)ACV01(WP-192426852)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)ACV02

(WP-192419383)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)SRB_14(WP-173025722)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)99(WP-116748450)、Acidovorax delafieldii(WP-060985808)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)16-35-5(WP-175506463)、Acidovoraxvalerianellae(WP-092740663)、中等食酸菌(Acidovorax temperans)(WP-142084895)、水稻食酸菌(Acidovorax oryzae)(WP-026433360)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)SRB_24(WP-169168665)、Acidovorax cavernicola(WP-119555154)、中等食酸菌(Acidovoraxtemperans)(WP-044398345)、酸体菌属物种(Acidisoma sp.)S159(WP-159014448)、酸体菌属物种(Acidisoma sp.)L85(WP-158802619)、酸球形菌属物种(Acidisphaera sp.)L21(WP-158747166)、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5(ABQ28771)、Actinospicaacidiphila(WP-193455356)、苹果脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus pomorum)(WP-084453829)、Amycolatopsis acidiphila(WP-144638401)、Azospirillum baldaniorum(WP-014240680)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(WP-013057692)、嗜酸细小链孢菌(Catenulispora acidiphila)(WP-015793547)、代尔夫特菌属物种(Delftia sp.)UME58(WP-183018265)、Delftia acidovorans(WP-202760212)、Delftia lacustris

(WP-016453321)、Methylocapsa acidiphila(WP-026607232)、Paraburkholderiaacidophila(WP-084908171)、Paraburkholderia acidisoli(WP-158957882)、Paraburkholderia acidipaludis(WP-027796272)、Priestia megaterium(WP-016764703)、Rhizobium acidisoli(WP-054183259)、Rhodoblastus acidophilus(WP-088519736)、Stenotrophomonas acidaminiphila(WP-054666853)、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)(WP-078480871)、Streptomyces acidicola(WP-152864677)。

在一些方面，可以利用由嗜碱菌产生的嗜极端菌酶102。例如，可以利用在约7.5至约11.5的pH处表现出活性的嗜碱菌酶。本文涵盖的示例性嗜碱菌(以及由此产生的嗜碱菌酶)可以包括但不限于：Alkalilacustris brevis(WP-114966465)、Alkalihalobacillusmacyae(WP-152670966)、Alkalihalobacillus pseudofirmus(WP-012960136)、Alkalihalobacillus shacheensis(WP-082676287)、Alkalihalobacillus xiaoxiensis(WP-204463621)、碱湖生菌属物种(Alkalilimnicola sp.)S0819(WP-152144452)、解淀粉碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica)(WP-091344878)、耐碱拟无枝酸菌(Amycolatopsisalkalitolerans)(WP-139096058)、Cupriavidus alkaliphilus(WP-111516860)、Ensiferalkalisoli(WP-151613639)、Lacimicrobium alkaliphilum(WP-062478888)、Lysobacteralkalisoli(QDH70273)、Massilia alkalitolerans(WP-036214799)、甲基细菌属物种(Methylobacter sp.)B2(WP-174627553)、Neorhizobium alkalisoli(WP-105385441)、Nocardiopsis alkaliphile(WP-051045978)、Ramlibacter alkalitolerans(WP-201687394)、Spinactinospora alkalitolerans(WP-179641803)。

在一些方面，可以利用由嗜压菌产生的嗜极端菌酶102。例如，在一些方面，可以利用在约110kPa或更高、或者约50MPa或更高的压力处表现出活性的嗜压菌酶。本文涵盖的示例性嗜压菌(以及由此产生的嗜压菌酶)可以包括但不限于：Oceanobacilluspiezotolerans(WP-121525044)、Oceanobacillus profunda(WP-169713018)、Colwelliamarinimaniae(WP-082606415)、Salinimonas sediminis(WP-108566897)。

本文还涵盖抗辐射嗜极端菌102。例如，可以利用抗辐射生物体(诸如耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiotolerans))，它产生抗辐射酶(WP_189068351)。在一些方面，本文涵盖的抗辐射生物体和抗辐射酶通常可以在约1000Gy或更大、或者约2000Gy或更大的急性电离辐射(γ射线、高能UV射线、X射线等)水平处有活性。

例如，非常适合在本公开中使用的细菌以及合适的聚合酶和解聚酶的登录号列于下表1中。如上文所讨论，应当理解，本文的表中列出的微生物，可以用于第一容器和第二容器中的一个或多个，或者一种或多种由其产生的酶。可以用于第一容器和第二容器中的一个或多个。

表1.

在一个方面，如本文公开使用的PHBD酶/细菌/古菌可以包括存在于极端环境条件的组合下的多嗜极端菌。例如，嗜盐碱性嗜热菌，它理想地存在于高盐和碱性条件下，或者耐冷嗜盐菌，它理想地存在于低温和高盐条件下。大多数嗜压(喜压)嗜极端菌存在于海底，因此也是嗜盐(喜盐)和嗜冷(喜冷)的，所有这些都是可以在提供嗜中温病原体脱污的反应室内同时产生和维持的条件。在这个方面，可以通过多种机制结合由单一多嗜极端酶催化的解聚反应来解决嗜中温菌污染。

例如，在一个方面，掺入本公开的嗜极端微生物102选自多个细菌属，包括下表2中列出的那些。

表2.

提及的许多嗜极端菌和嗜极端酶102是多嗜极端菌。本文涵盖的示例性多嗜极端菌(以及由此产生的多嗜极端菌酶)可以包括但不限于(其中一些也包括在此前提及的那些中)：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)(WP_011719018)、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)(WP_005270754)、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)NEB 688(WP_173027059)、Amycolatopsis decaplanina(WP_007028471)、Amycolatopsisazurea(WP_039919726)、Amycolatopsis orientalis(WP_044853678)、Amycolatopsisregifaucium(WP_061985795)、Amycolatopsis alba(WP_020632115)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CB00013(WP_073845662)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 04182(WP_125683401)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 04197(WP_125733174)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 01416(WP_125797595)、Amycolatopsis lurida(WP_034314791)、澳大利亚拟无枝酸菌(Amycolatopsisaustraliensis)(WP_072479564)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 01375(WP_125786221)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)YIM 10(WP_194239921)、澳大利亚拟无枝酸菌(Amycolatopsis australiensis)(WP_072480012)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 01376(WP_125797552)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)WAC 01376(WP_125791151)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)BJA-103(WP_168214428)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 04169(WP_125694889)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)YIM 10(WP_153034611)、Amycolatopsis xylanica(WP_091289432)、泰国拟无枝酸菌(Amycolatopsis thailandensis)(WP_093938547)、Amycolatopsis tolypomycina(WP_091314877)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)(WP_094002797)、Amycolatopsis mediterranei(WP_013227677)、Amycolatopsistolypomycina(WP_091316988)、Amycolatopsis mediterranei(WP_013225900)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)MJM2582(WP_037335097)、Amycolatopsis pretoriensis(WP_086680613)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)(WP_014467631)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)(WP_013227743)、莱克星敦拟无枝酸菌(Amycolatopsis lexingtonensis)(WP_086861387)、Amycolatopsis balhimycina(WP_026468360)、Amycolatopsis tolypomycina(WP_091309318)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)(WP_013225589)、莱克星敦拟无枝酸菌(Amycolatopsislexingtonensis)(WP_086864508)、Amycolatopsis balhimycina(WP_020640708)、Amycolatopsis balhimycina(WP_020639925)、Amycolatopsis japonica(WP_038521005)、Amycolatopsis vancoresmycina(WP_051767789)、Amycolatopsis vancoresmycina(WP_162146255)、Amycolatopsis vancoresmycina(WP_003055279)、Amycolatopsisvancoresmycina(WP_003059137)、Amycolatopsis arida(WP_177216885)、Amycolatopsisorientalis(WP_037305638)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32(ADJ49174)、Amycolatopsis balhimycina(WP_020640186)、Amycolatopsis balhimycina(WP_020646797)、Amycolatopsis regifaucium(WP_158070237)、Amycolatopsisumgeniensis(WP_184896802)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)(WP_176742238)、Amycolatopsis orientalis(WP_037318494)、Amycolatopsis taiwanensis(WP_027941815)、热黄拟无枝酸菌(Amycolatopsis thermoflava)(WP_037323546)、Amycolatopsis nigrescens(WP_157357235)、Amycolatopsis benzoatilytica(WP_020658806)、热黄拟无枝酸菌(Amycolatopsis thermoflava)(WP_123687648)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)MtRt-6(WP_206788940)、Amycolatopsis nigrescens(WP_020673950)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)MtRt-6(WP_206796628)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)MtRt-6(WP_206785025)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)195334CR(WP_206808196)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(WP_166641473)、Amycolatopsis vastitatis(WP_167441766)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)MtRt-6(WP_206794433)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)195334CR(WP_206804625)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(WP_160695402)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)195334CR(WP_206805671)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)S699(AEK42609)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(WP_160697844)、Amycolatopsis ruanii(WP_116109633)、Amycolatopsis vastitatis(WP_093953441)、Amycolatopsis antarctica(WP_094864937)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(WP_160697847)、Amycolatopsis vastitatis(WP_093953193)、Amycolatopsis rifamycinica(WP_043779284)、Amycolatopsis rifamycinica(WP_043787922)、Amycolatopsis orientalis(WP_044854926)、Amycolatopsis albispora(WP_113697064)、Amycolatopsis vastitatis(WP_093953762)、Amycolatopsis keratiniphila(WP_043848437)、Amycolatopsisrifamycinica(WP_043776526)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)ATCC 39116(WP_039791697)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-126428(WP_199191631)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-128772(WP_199199004)、Amycolatopsisrifamycinica(WP_043775110)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-128772(WP_103347542)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-126428(WP_103341161)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-126428(WP_103338297)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-128772(WP_103347494)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)CA-128772(WP_103351389)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-126428(WP_10334050)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-126428(WP_103337215)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)BJA-103(WP_101611121)、Amycolatopsis rifamycinica(WP_043775220)、Amycolatopsis bullii(WP_191309718)、耐碱拟无枝酸菌(Amycolatopsis alkalitolerans)(WP_139096058)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)CA-126428(WP_103340450)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)A23(WP_155542679)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)A23(WP_155546301)、Amycolatopsisbullii(WP_191313482)、Amycolatopsis oliviviridis(WP_191256639)、Amycolatopsisbullii(WP_191317041)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)A23(WP_155546374)、Amycolatopsis bullii(WP_191309628)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)H6(2020)(MBE8525409)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)H6(2020)(MBE8516875)、Amycolatopsis acidiphila(WP_144638401)、Amycolatopsis deserti(WP_191242759)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)H6(2020)(MBE8523464)、Amycolatopsisroodepoortensis(WP_192744003)、莱克星敦拟无枝酸菌(Amycolatopsislexingtonensis)(WP_086861614)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)H6(2020)(MBE8523449)、莱克星敦拟无枝酸菌(Amycolatopsis lexingtonensis)

(WP_086861672)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)H6(2020)(MBE8519699)、Amycolatopsis eburnean(WP_125314097)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)PIP199(WP_181777181)、Amycolatopsis eburnean(WP_125313793)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)YIM 10(WP_153034239)、Amycolatopsisrhizosphaerae(WP_144585784)、Amycolatopsis eburnea(WP_191984376)、澳大利亚拟无枝酸菌(Amycolatopsis australiensis)(WP_072479963)、Amycolatopsis eburnea(WP_125313723)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)Hca4(WP_176178332)、Amycolatopsis pretoriensis(WP_086674376)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)YIM 10(WP_153033440)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)Hca4(WP_176171164)、热拟无枝酸菌属(Amycolatopsis thermalba)(WP_115944128)、Amycolatopsistolypomycina(WP_091313624)、Amycolatopsis sacchari(WP_09150482)、Amycolatopsiskentuckyensis(WP_086849953)、Amycolatopsis pretoriensis(WP_086676731)、Amycolatopsis kentuckyensis(WP_086838850)、Amycolatopsis vancoresmycina(WP_033262149)、Amycolatopsis sacchari(WP_091509483)、Amycolatopsis eburnea(RSD12104)、Amycolatopsis vancoresmycina(WP_033262457)、Amycolatopsistolypomycina(WP_091314771)、Amycolatopsis kentuckyensis(WP_086842561)、Amycolatopsis tolypomycina(SED02538)、Amycolatopsis kentuckyensis(WP_086850817)、Amycolatopsis keratiniphila(SDU59319)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(NBH10816)、Amycolatopsis sacchari(SFI91313)、Amycolatopsis keratiniphila(AGM10176)、Amycolatopsis vancoresmycina DSM 44592(EOD69417)、Amycolatopsis vancoresmycina DSM44592(EOD63279)、Colwelliapsychrerythraea(WP_033095470)、Colwellia psychrerythraea(WP_033082346)、Colwellia chukchiensis(WP_085285385)、未分类的科维尔氏菌(Colwellia)(WP_182245161)、未分类的科维尔氏菌(Colwellia)(WP_108456828)、科维尔氏菌(Colwellia)(WP_082606415)、未分类的科维尔氏菌(Colwellia)(WP_182136131)、未分类的科维尔氏菌(Colwellia)(WP_182222214)、Colwellia psychrerythraea(WP_138140233)、未分类的科维尔氏菌(Colwellia)(WP_182213899)、未分类的科维尔氏菌(Colwellia)(WP_182191078)、Colwellia psychrerythraea(WP_033082290)、科维尔氏菌属物种(Colwelliasp.)Arc7-635(WP_126668020)、Colwellia aestuarii(WP_143323591)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)BRX8-4(WP_182258889)、科维尔氏菌属物种(Colwelliasp.)(MBL4900302)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)(MBL0710453)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)PAMC 21821(WP_081180401)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)(MBL4764635)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)12G3(WP_101233926)、Colwelliapolaris(WP_085306422)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)Bg11-28(WP_157825823)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)BRX10-3(WP_182133028)、科维尔氏菌属物种(Colwelliasp.)MB02u-6(WP_182233718)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)BRX8-2(WP_182231462)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)MB3u-4(WP_182185277)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)BRX9-1(WP_182230151)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)BRX8-7(WP_182242732)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)(NQZ90610)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)MB02u-10(WP_182238471)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)(NQZ28611)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)(QY47923)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)Bg11-12(WP_182229555)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)(NQY89088)、Colwellia beringensis(WP_081152231)、科维尔氏菌属(Colwellia sp.)(NQZ82584)、Colwellia demingiae(WP_146789187)、Candidatus Colwelliaaromaticivorans(WP_114327742)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)MB02u-9(WP_182197537)、Colwellia mytili(WP_085299583)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)(NQY47915)、科维尔氏菌属物种(Colwellia sp.)(NQZ28619)、嗜低盐适盐菌(Haladaptatus

paucihalophilus)(WP_007977720)、Haladaptatus litoreus(WP_076429835)、嗜低盐适盐菌(Haladaptatus paucihalophilus)(WP_007977722)、适盐菌属物种(Haladaptatus sp.)R4(WP_066143160)、Haladaptatus cibarius(WP_049970104)、适盐菌属物种(Haladaptatus sp.)(W1 WP_069450211)、Haladaptatus cibarius(WP_049971911)、嗜低盐适盐菌(Haladaptatus paucihalophilus)DX253(SHK49397)、衣氏盐芽孢杆菌(Halobacillus ihumii)(WP_163527944)、湖南盐芽孢杆菌(Halobacillushunanensis)(WP_139377117)、东方盐海洋菌(Halomarina oriensis)(WP_124957125)、东方盐海洋菌(Halomarina oriensis)(WP_158204529)、Halomonas(ventosae)(WP_035579360)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)156(CAD5269671)、未分类的盐单胞菌(Halomonas)(WP_008956714)、盐单胞菌(Halomonas)(WP_035577590)、Halomonaschromatireducens(WP_083517585)、Halomonas meridiana(WP_083602247)、未分类的盐单胞菌(Halomonas)(sp.HL-92)(WP_074398447)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)GFAJ-1(WP_009101808)、Halomonas chromatireducens(WP_066448186)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)KO116(WP_035563078)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)KO116(WP_035565981)、Halomonas arcis(WP_089708323)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)TD01(WP_009724586)、Halomonas arcis(WP_089706930)、Halomonas korlensis(WP_089792833)、Halomonas alkaliantarctica(WP_133732469)、Halomonas ilicicola(WP_072822829)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)(WP_007114283)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)HL-48(WP_027336292)、Halomonas alkaliphila(WP_038486873)、未分类的盐单胞菌(Halomonas)(WP_074394764)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)HAL1(WP_008958555)、冰下盐单胞菌(Halomonas subglaciescola)(WP_079553041)、Halomonaskorlensis(WP_089797758)、平静盐单胞菌(Halomonas cerina)(WP_183325502)、未分类的盐单胞菌(Halomonas)(sp.RC)(WP_126951333)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)TD01(WP_009722522)、泰坦尼克盐单胞菌(Halomonas titanicae)(WP_089691351)、海水盐单胞菌(Halomonas aquamarina)(WP_089674669)、Halomonas gudaonensis(WP_089686750)、Halomonas alkaliantarctica(WP_133731111)、Halomonas saccharevitans(WP_089847692)、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)(WP_092845804)、Halomonassongnenensis(WP_106373458)、Halomonas zincidurans(WP_031384106)、黄色盐单胞菌(Halomonas lutea)(WP_019020614)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)(WP_083825729)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)GFAJ-1(WP_009098816)、Halomonasmuralis(WP_089729617)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)(WP_040480056)、盐单胞菌属物种(Halomonassp.)(HAA45741)、湛江盐单胞菌(Halomonas zhanjiangensis)(WP_040460201)、Halomonas campaniensis(WP_088701082)、嗜碱盐单胞菌(Halomonasalkaliphile)(WP_162218603)、盐单胞菌属物种(Halomonassp.)ZH2S(WP_160419650)、内生盐单胞菌(Halomonas endophytica)(WP_102654199)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)ALS9(WP_064233856)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)KHS3(WP_041159480)、Halomonassalicampi(WP_179930793)、Halomonas salicampi(WP_179928774)、黑龙江盐单胞菌(Halomonas heilongjiangensis)(WP_102629242)、Halomonas campaniensis(WP_088701419)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)MES3-P3E(WP_101146070)、Halomonasalkaliantarctica(WP_030070137)、新疆盐单胞菌(Halomonas xinjiangensis)(WP_197053288)、Halomonas alkaliantarctica(WP_030072571)、盐单胞菌属物种(Halomonassp.)GT(WP_083002052)、盐单胞菌属物种(Halomonassp.)A40-4(WP_199285424)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)GT(WP_083007892)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)1513(WP_076746720)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)HL-48(WP_027335517)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)1513(WP_083700770)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)(MBL1266350)、乌鲁木齐盐单胞菌(Halomonas urumqiensis)(WP_102588859)、

Halomonas lutescens(WP_188638020)、Halomonas lutescens(WP_188638515)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)FME66(WP_193092800)、Halomonas saliphila(WP_104202516)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)(MBE0488383)、Halomonasqijiaojingensis(WP_189471950)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)3(2)(WP_151442249)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)FME20(WP_192536925)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)SH5A2(WP_186255949)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)TQ8S(WP_114486842)、泰坦尼克盐单胞菌(Halomonas titanicae)(WP_144812651)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PYC7W(WP_114478819)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PYC7W(WP_114478692)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)LBP4(WP_181421925)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)TQ8S(WP_114487405)、冰盐单胞菌(Halomonas glaciei)(WP_179915254)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QX-2 9(WP_180092182)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)SH5A2(WP_186253301)、肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)(WP_179927495)、泰坦尼克盐单胞菌(Halomonas titanicae)(WP_144810212)、南海盐单胞菌(Halomonas nanhaiensis)(WP_127060197)、Halomonas pantelleriensis(WP_089659512)、肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)(WP_179926908)、Halomonashumidisoli(WP_095603093)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QHL1(WP_083571058)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PC(WP_127040515)、盐单胞菌属(Halomonas sp.)DQ26W(WP_114573011)、胜利油田盐单胞菌(Halomonas shengliensis)(WP_089679049)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QX-1(WP_176303735)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QHL1(WP_071693265)、Halomonas korlensis(WP_089794761)、Halomonas aestuarii(WP_071946866)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PR-M31(WP_048308188)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PA5(QJQ97022)、Halomonas andesensis(WP_126944084)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PA5(QJQ94877)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)L5(WP_149329933)、Halomonas korlensis(SFU56513)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)G5-11(WP_168017113)、Halomonas subterranean(WP_092824778)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)(HDZ47214)、盐单胞菌属(Halomonas sp.)THAF5a(QFU03326)、盐单胞菌属物种(Halomonassp)(HDZ46744)、Halomonas chromatireducens(AMD02558)、Halomonas andesensis(WP_126948398)、Halomonas korlensis(SFU93166)、Halomonas taeanensis(SDG32001)、盐沼盐红色菌(Halorussus salinus)(WP_135854385)、盐红色菌属物种(Halorussussp.)MSC15.2(WP_163523881)、盐沼盐红色菌(Halorussus salinus)(WP_135854680)、解淀粉盐红色菌(Halorussus amylolyticus)(WP_132060623)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)ZS-3(WP_158056449)、解淀粉盐红色菌(Halorussus amylolyticus)(WP_132060625)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)ZS-3(WP_158056448)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)RC-68(WP_128475846)、Halorussus ruber(WP_135825713)、Halorussus ruber(WP_135825712)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)HD8-83(WP_135830119)、海杆菌属物种(MariInobacter sp.)LV10R520-4(WP_143751449)、浙江海杆菌(Marinobacterzhejiangensis)(WP_092022278)、未分类的海杆菌(Marinobacter)(WP_150989051)、硝酸盐还原海杆菌(Marinobacter nitratireducens)(WP_036130189)、Marinobactersalarius(WP_091640839)、未分类的海杆菌(Marinobacter)(WP_098419392)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)(WP_007152654)、南极海杆菌(Marinobacter antarcticus)(WP_072795398)、未分类的海杆菌(Marinobacter)(WP_152438805)、海杆菌属(Marinobacter)(WP_075197007)、深源海杆菌(Marinobacter profundi)(WP_099614009)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LPB0319(WP_206643988)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)DS40M8(WP_169052525)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)X15-166B(WP_198929205)、未分类的海杆菌(Marinobacter)(WP_081899301)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)PJ-16(WP_137435339)、Marinobacter bohaiensis(WP_111497193)、沉积海杆菌(Marinobacter sediminum)(WP_203299860)、Marinobacter lipolyticus(WP_012136507)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)ANT_B65(WP_202971753)、Marinobacternanhaiticus(WP_004579452)、Marinobacter salarius(WP_126811858)、Marinobactermaritimus(WP_144775354)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)F3R11(WP_113816648)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LZ-8(WP_138439039)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)LZ-6(WP_138437074)、胜利油田海杆菌(Marinobacter shengliensis)(WP_106694886)、居泉海杆菌(Marinobacter fonticola)(WP_148861082)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)JSM 1782161(WP_165857264)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)R17(WP_123633665)、Marinobacter salicampi(WP_166253549)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LV10MA510-1(WP_098421792)、褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(WP_016187994)、大西洋王祖农菌(Zunongwangia atlantica)22II14-10F7(ORL471960)。

例如，在一个方面，掺入本公开的产品的嗜极端微生物或由其产生的酶102选自多个细菌属和生物体，包括下表3中列出的那些。

表3.

嗜盐和耐盐生物体：

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嗜酸或耐酸生物体：

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嗜碱或耐碱生物体：

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嗜冷或耐冷生物体：

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嗜压或耐压生物体：

例如，嗜热徐丽华菌可以在相对较高的温度范围内存活；例如，海水盐单胞菌可以在相对较高的盐度范围内存活，并且每者都可以产生大量用于分解聚羟基链烷酸酯聚合物的酶。例如，PHB解聚酶的一些特征列于下表4中。

表4.

*在移除22个aa信号序列后

在移除24个aa信号序列后

在其他方面，例如，第二容器118酶选自荧光假单胞菌或根癌农杆菌属。此外，例如，鉴定出适当细粒形成所需的辅助蛋白，即假单胞菌属泽漆皂苷。在一个方面，例如，酶、物种和登录号列于下表5中。

表5.

例如，假单胞菌属PHB循环酶和泽漆皂苷的一些特征列于下表6中。

表6.

当然，在所公开的方法和系统中可以利用嗜极端菌或由其产生的酶的任何组合102，并且同样可以利用对应于酶的活性条件的环境条件的任何组合来提供同时进行消费后产品104的脱污和消费后产品104中含有的一种或多种生物聚合物的降解和回收的多维方法。

可以选择来自特定环境的极端酶和/或微生物来匹配解聚过程的需要。例如，如果需要/期望在高温处运行过程，则酶和/或微生物可以从嗜热菌中选择。类似地，如果需要或期望在高盐存在下运行反应，则所使用的酶和/或微生物可以从嗜盐菌中选择。类似地，如果脱污和解聚过程需要不太极端的条件，例如由于已知的污染物，则可以选择在那些不太极端的条件下表现出高活性的嗜极端酶和/或微生物102。在这一方面，脱污过程可能不需要对病原体是致命的，但是可以提供不太极端的方法来从污染物中除去致病性特征。

除天然表达解聚酶基因的微生物之外，还可以选择一种或多种经遗传修饰的细菌，所述细菌表达能够进行本发明的特定反应的外源性酶。例如，根据本公开，任何细菌属或古菌属都可以与任何聚羟基链烷酸酯解聚酶匹配，所述聚羟基链烷酸酯解聚酶从与正确的信号序列偶联的组成型载体表达。在这个方面，任何合适的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌均可用于产生和分泌解聚酶，所述酶可以是革兰氏阳性聚羟基链烷酸酯解聚酶。通过这种方式，本公开的微生物产品可以基于环境变量、储存库中的消费后材料的类型和量或者它们的组合来定制。此外，通过在已知的(例如NCBI数据库)或具有完全或部分工程化的变体的大约6,400个解聚酶序列中选择一个，可以使酶的序列与环境匹配。在一个方面，可以用质粒载体转化所选择的细菌或古菌，所述质粒载体具有编码聚[R-3-羟基丁酸酯]解聚酶(含有适当的N-末端信号序列)的组成型表达的基因。或者，所选择的细菌和/或古菌可以通过转导、线性重组或任何其他合适的方法而不是使用额外的染色体载体来将解聚酶基因插入细菌染色体中，从而消除对外源性载体的需要。

酶可以通过转化合适的宿主生物体来表达，例如通过使用原核或真核宿主细胞。宿主细胞类型的实例包括但不限于细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞(例如，毕赤酵母、酿酒酵母(S.cerevisiae))、培养的昆虫细胞系(例如，果蝇(Drosophila))、植物细胞系(例如，玉米、烟草、水稻、甘蔗、马铃薯块茎)、哺乳动物细胞系(例如，中国仓鼠卵巢(CHO))。在一个方面，可选择重组宿主细胞系统，该系统以产生最终催化酶所需的方式对新生多肽进行加工和翻译后修饰。

编码酶的核酸序列可以放置于表达载体中用于在选定宿主中表达。此类表达载体通常可以包含与编码酶的核酸序列连接的转录起始区。表达载体还可以包含多个限制性位点，用于插入核酸以处于各种控制元件的转录调节下。表达载体可以另外地含有选择性标志物基因。合适的控制元件(诸如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等)可以置于紧邻编码区，以允许正确的转录起始和/或初级转录物(即，酶的编码区)的正确加工。可替代地，表达载体中采用的编码区可以含有内源性增强子/启动子、剪接点、插入序列、多腺苷酸化信号等或者内源性和外源性控制元件的组合。

表达载体通常在转录的5'-3'方向上包括启动子、转录和翻译起始区、编码酶的DNA序列以及在宿主细胞中发挥功能的转录和翻译终止区。在一个方面，可以使用基于T7的载体，其可以包含至少以下组成：复制起点、选择性抗生素抗性基因(例如，amp^r、tetr、chlrr)、多克隆位点、T7起始子和终止子序列、核糖体结合位点和T7启动子。

一般而言，可以使用能够与异源性DNA可操作地连接的任何合适的启动子，以使得可以通过RNA聚合酶从启动子启动DNA的转录，该RNA聚合酶可以特异性地识别、结合至并转录开放阅读框中的DNA。一些有用的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、调控的启动子、细胞特异性启动子、病毒启动子和合成启动子。此外，虽然启动子可以包含RNA聚合酶结合的序列，但是这不是要求。启动子可以从多种不同来源获得。例如，启动子可以完全衍生自宿主细胞的天然基因，由衍生自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或由完全合成的核酸序列组成。启动子可以衍生自许多不同类型的生物体并经过定制以用于在给定细胞内使用。例如，除了参与控制蛋白质翻译的区域(包括编码序列)之外，启动子还可以包括其他调节蛋白质可以结合的区域。

翻译起始序列可以来源于任何来源，例如，任何表达的大肠杆菌基因。通常，该基因是高表达基因。翻译起始序列可以通过标准重组方法、合成技术、纯化技术或它们的组合来获得，这些都是熟知的。或者，翻译起始序列可以从许多商业供应商获得。(OperonTechnologies；Life Technologies Inc.)。

终止区可以是转录起始区天然的，可以是编码区天然的，或者可以来源于另一个来源。通过转化细胞识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3'的调控区，因此与启动子一起位于编码序列的侧翼。实例包括来源于具有强启动子的基因的转录终止序列，诸如大肠杆菌中的trp基因以及其他生物合成基因。

可以使用的载体包括但不限于能够在原核生物和真核生物中复制的那些载体。例如，可以使用在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中复制的载体。载体的实例包括质粒、噬菌粒、噬菌体、病毒(例如，杆状病毒)、粘粒和F-因子。特定载体可以用于特定细胞类型。另外，穿梭载体可以用于在超过一种细胞类型中克隆和复制。此类穿梭载体是本领域已知的。如果需要，载体可以是可在多个宿主中发挥作用的双功能表达载体。

根据需要，编码嗜极端菌酶102的表达载体可以通过本领域的技术人员已知的任何方法引入宿主细胞中，并且核酸构建体可以在宿主细胞内染色体外携带或可以整合进宿主细胞染色体中。用于原核生物宿主(诸如细菌细胞)的载体包括复制系统，使其能够维持在宿主中用于进行表达或用于进行克隆和扩增。载体可以以高拷贝数或低拷贝数存在于细胞中。通常，宿主细胞内存在约5至约200个、并且通常约10至约150个拷贝的高拷贝数载体。含有高拷贝数载体的宿主细胞优选地含有至少约10个、并且更优选地至少约20个质粒载体。通常，宿主细胞中存在约1至10个、并且通常约1至4个拷贝的低拷贝数载体。

在多个方面，细菌被用作宿主细胞。细菌的实例包括但不限于革兰氏阴性生物体和革兰氏阳性生物体。在一个方面，可以使用适合T7蛋白表达的大肠杆菌表达系统。T7表达株的实例可以包括但不限于BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BLR(DE3)pLysS、Tuner(DE3)pLysS、Tuner(DE3)、Lemo21(DE3)、NiCO2(DE3)、Oragami2(DE3)、Origami B(DE3)、ShuffleT7Express、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、DH5aplhaE、Rosetta2(DE3)、Rosetta2(DE3)pLysS、NovaBlue(DE3)、Rosetta-gami B、Rosetta-gami B(DE3)、Rosetta-gami B(DE3)pLysS、Rosetta Blue(DE3)、Novagen(DE3)、Novagen(DE3)pLysS。

可以通过常用的转化/感染程序来将表达载体引入细菌细胞中。含有表达盒的核酸构建体可以通过使用整合载体整合到细菌宿主细胞的基因组中。整合载体通常含有至少一个与允许载体整合的细菌染色体同源的序列。整合载体还可以含有噬菌体或转座子序列。染色体外载体和整合载体可以含有选择性标志物，以允许选择已转化的细菌菌株。

有用的大肠杆菌表达系统载体可以含有组成型或诱导型启动子，以指导融合或非融合蛋白的表达。对于融合载体，通常将许多氨基酸添加到表达的靶基因序列中。另外，可以在靶重组蛋白与融合序列之间的位点处引入蛋白水解切割位点。一旦融合蛋白已被纯化，切割位点就使靶重组蛋白能够与融合序列分离。适用于切割蛋白水解切割位点的酶包括TEV、因子Xa和凝血酶。可用于本发明的融合表达载体可以包括表达例如但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(THX)、几丁质结合结构域(CBD)、六组氨酸标签(His-标签)(SEQ ID NO:3)、谷胱甘肽-S-转移酶蛋白(GST)、FLAG肽、N-利用物质(NusA)或与靶标重组酶融合的小泛素修饰(SUMO)的那些。

将外源性DNA引入宿主细胞的方法是本领域可获得的，并且可以包括用CaCl₂或其他试剂(诸如二价阳离子和DMSO)处理的细菌的转化。还可以通过以下方法将DNA引入宿主细胞中：电穿孔、使用噬菌体、弹道转化(ballistic transformation)、磷酸钙共沉淀、原生质体融合、电穿孔、用乙酸锂或通过电穿孔处理宿主细胞。转化程序通常根据要转化的细菌种类而不同。

在将核酸转化或转染至细胞后，可以通过使用选择性标记来选择存在核酸的细胞。选择性标志物通常编码在被引入受体细胞中的核酸上。然而，在将核酸引入宿主细胞中期间，还可以使用选择性标志物的共转染。可以在受体宿主细胞中表达的选择性标志物可以包括但不限于使受体宿主细胞对药物(诸如放线菌素Cl、放线菌素D、两性霉素、氨苄青霉素、博来霉素、羧苄青霉素、氯霉素、遗传霉素、庆大霉素、潮霉素B、硫酸卡那霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、硫酸新霉素B、新生霉素钠、青霉素G钠、盐酸嘌呤霉素、利福平、硫酸链霉素、盐酸四环素和红霉素)具有抗性的基因。选择性标志物还可以包括生物合成基因，诸如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些基因。在转染或转化宿主细胞后，将细胞置于与适当的选择剂接触。

当修饰微生物时，可以使用任何合适的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。例如，在一个方面，经修饰的细菌可以从链霉菌属获得。来自上述属的微生物的具体实例包括热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)、热橄榄链霉菌(Streptomycesthermoolivaceus)、热吸水链霉菌(Streptomyces thermohygroscopicus)、热食碳酸链霉菌(Streptomyces thermocarboxydovorans)或它们的混合物。

还可以根据本公开选择以下属来表达本发明的酶：

厚壁菌门(Firmicutes)：芽孢杆菌属、徐丽华菌属和梭菌属；

变形菌门(Proteobacteria)：慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、硝化菌属(Nitrobacter)、溶杆菌属(Lysobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、硫杆状菌属(Thiobacillus)、施莱格尔氏菌属(Schlegelella)、詹森菌属(Janthinobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)和埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)；

放线菌门(Actinobacteria)：红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Arthobacter)、链霉菌(Streptomyces)、康奈斯氏杆菌属(Conexibacter)、红球菌属(Rhodococcus)、土壤红杆菌属(Solirubrobacter)、微球菌属(Micrococcus)、红色杆菌属(Rubrobacter)和放线菌属(Actinomyces)；

拟杆菌门(Bacteroidetes)：黄杆菌属(Flavobacterium)和土地杆菌属(Pedobacter)；

奇异球菌-栖热菌(Deinococcus-thermus)：奇异球菌属(Deinococcus)和栖热菌属(Thermus)；

芽单胞菌门：芽单胞菌属(Gemmatimonas)和Gemmatirosa；

螺旋体门(Spirochaetes)：Tumeriella和钩端螺旋体属(Leptospira)；

疣微菌门(Verrucomicrobia)：Pedosphaera、Chthoniobacter和疣微菌门(Verrucomicrobia)；

绿弯菌门(Chloroflexi)：Thermogemmatispora和Dictyobacter；以及

装甲菌门(Armatimonadetes)：菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)

应当理解，以下列表仅仅是示例性的。可以基于温度、氧气可用性、盐度、其他环境特征等等来选择特定属。

还可以根据本公开选择以下生物体来表达本公开的酶(无论是微生物本身还是纯化的酶)：河口溶杆菌(Lysobacter aestuarii)、抗生素溶杆菌(Lysobacterantibioticus)、布古尔溶杆菌(Lysobacter bugurensis)、辣椒溶杆菌(Lysobactercapsica)、产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)、Lysobacter lacus、Lysobacterlycopersici、马里溶杆菌(Lysobacter maris)、Lysobacter niastensis、深源溶杆菌(Lysobacter profundi)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.A03)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.cf310)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.H21R20)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.H21R4)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.H23M41)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.R19)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Root604)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Root690)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Root916)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Root983)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.TY2-98)、海绵溶杆菌(Lysobacter spongiae)、居海绵溶杆菌(Lysobacter spongiicola)、溶杆菌属、碱土溶杆菌(Lysobacter alkalisoli)、抗砷溶杆菌(Lysobacter arseniciresistens)、大田溶杆菌(Lysobacter daejeonensis)、Lysobacter dokdonensis、产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)、产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)、Lysobacter gilvus、胶状质溶杆菌(Lysobacter gummosus)、马里溶杆菌(Lysobacter maris)、Lysobacter oculi、Lysobacter panacisoli、Lysobacter penaei、Lysobacter prati、耐冷溶杆菌(Lysobacter psychrotolerans)、Lysobacter pythonis、瑞身溶杆菌(Lysobacterruishenii)、Lysobacter segetis、Lysobacter silvestris、Lysobacter silvisoli、Lysobacter soli、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.17J7-1)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Alg18-2.2)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.Cm-3-T8)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.H23M47)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.HDW10)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.II4)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.N42)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.OAE881)、溶杆菌属物种(Lysobactersp.Root494)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.URHA0019)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.WF-2)、溶杆菌属物种(Lysobacter sp.yr284)、Lysobacter tabacisoli、Lysobacter telluris、Lysobactertolerans、Lysobacter tolerans、新疆溶杆菌(Lysobacter xinjiangensis)、未分类的溶杆菌、Aliivibrio finisterrensis、费氏别弧菌(Aliivibrio fischeri)、Aliivibriosifiae、别弧菌属物种(Aliivibriosp.)、别弧菌属物种(Aliivibrio sp.1S128)、别弧菌属物种(Aliivibrio sp.EL58)、别弧菌属物种(Aliivibrio sp.SR45-2)、Caballeroniaarvi、Caballeronia calidae、Caballeronia hypogeia、Caballeronia insecticola、Caballeronia pedi、Caballeronia terrestris、Dokdonella koreensis、Dyellacaseinilytica、Dyella choica、鼎湖山戴氏菌(Dyella dinghuensis)、Dyella flava、江宁戴氏菌(Dyella jiangningensis)、Dyella kyungheensis、Dyella mobilis、Dyellamonticola、Dyella nitratireducens、Dyella psychrodurans、Dyella soli、Dyellasolisilvae、戴氏菌属物种(Dyella sp.7MK23)、戴氏菌属物种(Dyella sp.ASV21)、戴氏菌属物种(Dyella sp.ASV24)、戴氏菌属物种(Dyella sp.C11)、戴氏菌属物种(Dyellasp.C9)、戴氏菌属物种(Dyella sp.DHC06)、戴氏菌属物种(Dyella sp.EPa41)、戴氏菌属物种(Dyella sp.G9)、戴氏菌属物种(Dyella sp.M7H15-1)、戴氏菌属物种(Dyellasp.M7H15-1)、戴氏菌属物种(Dyella sp.OK004)、戴氏菌属物种(Dyella sp.S184)、戴氏菌属物种(Dyella sp.SG562)、戴氏菌属物种(Dyella sp.SG609)、戴氏菌属物种(Dyellasp.YR388)、Dyella tabacisoli、博兹曼荧光杆菌(Fluoribacter bozemanae)、杜氏荧光杆菌(Fluoribacter dumoffii)NY 23、戈氏荧光杆菌(Fluoribacter gormanii)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、耐热假单胞菌(Pseudomonas thermotolerans)、地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)、冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.MB-3u-54)、冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.psych-6C06)、冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.RZ22)、冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.Urea-02u-13)、反硝化罗河杆菌(Rhodanobacterdenitrificans)、黄褐色罗河杆菌(Rhodanobacter fulvus)、甘草罗河杆菌(Rhodanobacter glycinis)、Rhodanobacter lindaniclasticus、Rhodanobacterpanaciterrae、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.7MK24)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.A1T4)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.B04)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.B05)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.C01)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.C03)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.C05)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.C06)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.DHB23)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.DHG33)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.L36)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.MP1X3)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.OK091)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.OR444)、罗河杆菌属物种(Rhodanobactersp.PCA2)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.Root480)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.Root627)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.Root627)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.SCN 67-45)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.SCN 68-63)、罗河杆菌属物种(Rhodanobactersp.Soil772)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.T12-5)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.TND4EH1)、罗河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.TND4FH1)、Rhodanobacter spathiphylli、Rhodanobacter thiooxydans、Stenotrophomonaschelatiphaga、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、Stenotrophomonas panacihumi、Stenotrophomonas pavanii、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)、寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonassp.DDT-1)、寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonas sp.RIT309)、寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonassp.SKA14)、河口弧菌(Vibrio aestuarianus)、Vibrio antiquaries、水弧菌(Vibrioaquaticus)、塔斯马尼斯弧菌(Vibrio tasmaniensis)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)细菌、白纹黄单胞菌属(Xanthomonas albilineans)、树生黄单胞菌(Xanthomonasarboricola)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、溴黄单胞菌(Xanthomonasbromi)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、大麻黄单胞菌(Xanthomonascannabis)、柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)、真泡黄单胞菌(Xanthomonaseuvesicatoria)、草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae)、天竺葵黄单胞菌(Xanthomonashortorum)、风信子黄单胞菌(Xanthomonas hyacinthi)、水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)、菜豆黄单胞菌(Xanthomonas phaseoli)、豌豆黄单胞菌(Xanthomonas pisi)、糖黄单胞菌(Xanthomonas sacchari)、黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp.Leaf131)、黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp.NCPPB 1128)、半透明黄单胞菌(Xanthomonas translucens)、Xanthomonas vasicola、Xanthomonas vesicatoria或它们的组合。应当理解，以下列表仅仅是示例性的。可以基于温度、氧气可用性、盐度、其他环境特征等等来选择特定微生物。

例如，在一个方面，掺入本公开的产品的嗜极端微生物102，以及它们的用于产生PHB的酶选自多个溶杆菌属(Lysobacter)物种，包括下表7中列出的那些。

表7.

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例如，在一个方面，掺入本公开的产品的嗜极端微生物或由其产生的酶102，以及它们的用于代谢HB和产生PHB的酶选自多个细菌物种，包括下表8中列出的那些。

表8.

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在一个方面，本公开的微生物或由其产生的酶可以包括不同的微生物(诸如细菌)的组合。例如，在一个方面，产品可以含有一种或多种天然分泌解聚酶的微生物与一种或多种已经遗传修饰为分泌解聚酶的微生物的组合。例如，经遗传修饰的微生物可以用于根据环境条件和进料供应来微调系统。当然，在一个方面，微生物是细菌。

具体而言，在一个方面，可以基于以下因素中的一种或多种来选择一种或多种上述微生物和/或它们各自的酶：容易且快速地以高密度生长、不需要特殊培养基、需氧、动力学快速、稳定、耐受高盐温度环境、能够产生易于纯化的酶、缺乏非常规等电点、不需要增强的生物安全措施、不包含过量的半胱氨酸残基、总体上非体内的以及可商购获得。例如，本公开已经发现，通过在一个方面限制半胱氨酸残基的量，可以实现改善的折叠，从而允许更好且更快地掺入宿主(诸如大肠杆菌)中，以改善经修饰的酶的产生。这种特征可以反映在上表中的一个或多个的#Cys栏下，是指各自的酶或其编码中的半胱氨酸的数量。具体而言，基于一种或多种上述因素的选择可以进一步改善反应的速度和效率，从而允许改善工业过程的通量。

然而，在一个方面，微生物可以在添加至第一容器之前直接添加至消费后/回收的材料储存库中，与运载体组合或以悬浮液形式悬浮液第一容器中，或者放置于如上文讨论的生物反应器中。运载体可以是食物源，或者可以是任何合适的运载体、缓冲液等等。

在一个方面，诸如当使用微生物时，可以将微生物包封于运载体，诸如聚合物运载体中。聚合物运载体可以是高吸水性而不溶于水的材料。例如，在一个方面，聚合物运载体在与水组合时呈凝胶形式，可以脱水和转化为固体形式，然后在与水分接触时能够再水合。以这种方式，一种或多种微生物可以与凝胶形式的聚合物运载体组合。一旦共混在一起，即可除去水以形成固体。固体可以形成任何合适的形状并且与消费后产品104废料接触。为了降解废料中所含的聚合物，使固体材料与水分接触，从而导致运载体聚合物再水合。一旦再水合，微生物即可从聚合物凝胶中释放或可分泌从聚合物凝胶中释放的酶。

当然，如上文所讨论，在一个方面，酶可以单独、与运载体组合、与辅因子进料组合或者这些方式的组合直接掺入第一和/或第二容器中。

然而，在一个方面，例如，酶或微生物群体可以与消费后产品104组合，所述消费后产品含有丢弃的失禁产品或由聚羟基链烷酸酯聚合物制成的其他基于聚合物的消费品。失禁产品包括例如尿布、训练裤、泳裤、成人失禁产品、女性卫生产品等等。这些产品通常包括可透水衬里、外覆层和定位于液体可渗透的衬里和外覆层之间的吸收结构。失禁产品可以含有大于约5重量％的量，诸如大于约10重量％的量，诸如大于约20重量％的量，诸如大于约30重量％的量，诸如大于约40重量％的量，诸如大于约50重量％的量，诸如大于约60重量％的量，诸如大于约70重量％的量的生物聚合物。

添加至消费后产品104废料储存库或生物反应器中的微生物产品的量可以基于储存库或生物反应器中的消费后产品104废料的量、基于废料储存库或生物反应器中存在的聚羟基链烷酸酯的量、或者基于包封的微生物产品与存在的土壤或生物反应器的量之间的比率。当基于每个失禁产品的包封的微生物产品的量时，范围可以为约0.000001g至约10.0g，诸如约0.001g至约5.0g，诸如约0.1g至约1g。

通过参照以下实施例可以更好地理解本公开。

实施例

以下实施例展示了本公开的一些益处和优点。

在一个具体实施例中，选择两种PHB解聚酶。第一种是嗜热细菌嗜热徐丽华菌。该生物似乎缺乏可鉴定的乙酰乙酰辅酶A还原酶和合成酶以及HB聚合酶同源物。第二种HB聚合酶是嗜盐细菌海水盐单胞菌。其中任一种生物体的选择都提供了两种减少在工业过程期间粪便细菌污染物(例如，用过的尿布)的潜在问题的方式。这是因为粪便细菌无法在高温(例如，50℃)或极高的盐浓度(例如，1.0M)处存活。两种聚合酶的序列特征如表4中所示。

其余四种酶选自荧光假单胞菌或根癌农杆菌。此外，还鉴定出适当细粒形成所需的辅助蛋白，即假单胞菌属泽漆皂苷。被选为纳入的物种和酶的登录号如表5所示。其余的酶的序列特征如表6所示。

值得注意的是，只有合成酶和聚合酶含有多个具有二硫键的半胱氨酸残基，这对于在表达过程中在大肠杆菌细胞质中正确折叠可能是有问题的。虽然半胱氨酸残基的分布和数量对于这些酶在更广泛的系统发生空间中是典型的。此前的工作已经表明，在商业化大肠杆菌Oragami2菌株中的表达允许在表达过程中发生成功折叠。

假单胞菌属被选为表达PHB循环所需的所有酶(除脱氢酶之外)的单一物种。由于单一细菌不会根据PHB循环代谢HB、PHB或中间体(图2)，因此有必要走出单个属(或更广泛的分类学)才能鉴定所有所需的酶。包括尽可能少的属(或种)，可以通过利用有利于所有酶的培养基和条件(温度、盐、pH等)来优化过程条件，诸如速度。本实施例中使用的所有生物体的完整分类学提供于下表7中。

表7.

除使用二硫键耐受性表达菌株之外，还通过使用针对大肠杆菌优化的密码子回译所选的酶的氨基酸序列来优化蛋白质表达。这确保了最有效的翻译，避免了暂停，并且增加了异源性蛋白质的收率。在除去任何鉴定的N-末端信号序列之后，将每个蛋白质序列与His6 N-末端融合序列和TEV蛋白酶切割位点MHHHHHHLEVLFQGP(SEQ ID NO:2)组合。该序列由ATUM,Inc.针对大肠杆菌密码子使用进行了优化，并且克隆至IPTG诱导型载体pD454中，该载体具有中等强度的核糖体结合位点序列并且编码氨苄青霉素抗性。通过TEV蛋白酶可有效地除去蛋白质中的His6融合体。该TL中的工作通过纯化的和切割的酶进行。例如，His-6标签的使用大大简化了裂解的细菌粗提物形成后的纯化过程，将该过程简化为两个步骤。蛋白质在25℃和35℃之间表达，诱导后生长期为12小时，每一升起始培养物产生10–20mg纯化的/切割的酶。

生物反应器100原型由两个不同的容器组成。第一容器(106、108)容纳输入PHB样品，其中发生嗜热或嗜盐解聚酶反应。在反应完成后，反应完成通过600nm处的光密度降低来测量，目测观察当PHB膜消失时，或当HB测定法达到平台期时(图5)，使反应体积泵送通过分子量筛截过滤器(“MWCO”)112(MWCO；3kDa)，以进行嗜热反应，或者泵送通过MWCO过滤器112，然后通过Dowex离子交换床114，以进行嗜盐反应。MWCO过滤器112防止酶和未反应的大物质传递至第二容器118。Dowex离子交换介质从嗜盐解聚酶反应中除去NaCl。然后使反应进入第二容器118，第二容器含有溶于缓冲液的其他四种PHB循环酶。进行第二反应直到在600nm处的光密度达到最大。生物反应器100的示意图如图1所示。

第一容器(106、108)中的反应在50℃(对于嗜热反应)或30℃(对于嗜盐反应)处有效地进行。在两个反应中，输入PHB 124材料在大约一小时内转化为HB 126。在开放容器中进行与第一容器(106、108)相同的反应，以便可以定时取出等分试样，从而测定HB 126的存在。该数据如图3所示，其中在荧光HB测定法中PHB解聚酶(图6中的反应1)的酶活性随时间而变化。嗜热反应的反应条件：10mM乙酸钠pH 6.0、5mM KCl、5mM MgCl2、50℃。嗜盐反应的反应条件：10mM乙酸钠pH 6.0、5mM KCl、5mM MgCl2、1.0MNaCl、37℃，实心圆形：嗜热PHD；空心圆形：嗜盐PHD。

嗜热反应在10分钟内达到线性期，而嗜盐反应的特征在于在进入反应的线性部分之前有明显的(约20分钟)滞后期。两个反应的特征还在于在反应过程中溶液澄清，这表明不溶性PHB正在转化为可溶性HB。

第二容器118反应(图6，反应2-5)在第二容器118缓冲液中进行：10mM Tris-HCl(pH 7.0)、10mM MgCl2、1mM KCl、2mM COA、5mM ATP、2mM NAD+、5mM NADPH。反应在37℃处进行总共五小时。每五分钟，从反应中取出100mL等份样品，并将等分试样分为四个子样品。分别对这些样品进行构成第二容器118的4种酶活性的测定。设想了本实施例中的单个反应的优化。

图4显示了从第一容器(106、108)反应中产生的HB形成PHB。最初，HB 126通过脱氢酶转化为乙酰乙酸酯128(图4，实心圆形)。然后，乙酰乙酸酯128通过利用ATP和辅酶A辅因子转化(当浓度接近ACS酶的Km时)为乙酰乙酰辅酶A 130(图4，空心圆形)。然后，在整个反应的NADPH依赖性部分中，乙酰乙酰辅酶A 130通过还原酶反应(图6，实心正方形)被还原为羟基丁酰辅酶A 132。最后，不溶性PHB 120通过聚合酶来形成(图4，空心正方形)。PHB形成伴随着溶液的混浊，表示第一容器(106、108)中的起始反应。对第一容器(106、108)中的单个酶促反应的测量表明PHB循环实际上按设计运行。整个反应在第一容器(106、108)反应开始时以细粒PHB开始。随着解聚酶反应的进行(在本实施例中为嗜热反应)，在600nm处的光密度随着可溶性HB的形成而降低。当在600nm处的OD接近零时，使反应物通过MWCO过滤器112并且与第二容器118缓冲液混合。溶液再次变混浊，如通过光密度(600nm)的增加所测量。通过以4,000rpm离心10分钟来收集在第二容器118反应结束时沉淀的材料。除去上清液，将沉淀重悬于PBS中并重新离心。重复该步骤两次。将最终沉淀物重悬于第一缓冲液中，并且如所描述进行嗜热解聚酶反应。以10分钟间隔，从反应中取出等分试样并测量样品的光密度。结果如图5所示。

该结果表明，PHB循环反应中形成的物质确实是PHB，因为它可以作为PHB解聚酶的底物。

在该实施例中，测试来自各种细菌的不同的酶在本公开中的适用性。测试在本公开中天然产生酶的细菌以及经遗传修饰为产生此类酶的细菌。假单胞菌属HB聚合酶的序列如下：

假单胞菌属3-羟基丁酸酯脱氢酶的序列如下：

假单胞菌属乙酰乙酰辅酶A合成酶的序列如下：

假单胞菌属乙酰乙酰辅酶A还原酶的序列如下：

假单胞菌属泽漆皂苷-A的序列如下：

嗜热徐丽华菌PHB解聚酶的序列如下：

海水盐单胞菌PHB解聚酶的序列如下：

表达载体的产生如下所述。

PHB解聚酶：采用嗜热徐丽华菌和海水盐单胞菌PHD酶的氨基酸序列来构建重组DNA表达系统。首先，从酶序列中除去所鉴定的信号序列(嗜热徐丽华菌同源物的前22个氨基酸和盐海洋菌同源物的前24个氨基酸)。将组氨酸表达序列和TEV蛋白酶切割信号序列：MHHHHHHGSENLYFQG(SEQ ID NO:1)添加至酶序列的氨基末端部分。在切割后，重组蛋白将具有以甘氨酸残基开始的N-末端序列。使用ATUM,Inc.的Gene Designer程序将这个新氨基酸序列反向翻译为DNA，并且针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化。基因使用ATUM,Inc.的标准PCR技术来组装，并克隆至表达载体p454-MR(ampr，中等强度核糖体结合位点)中。在构建后通过DNA测序来验证插入片段。来自农杆菌属和假单胞菌属的第二容器118酶的表达质粒以类似的方式构建。

酶的表达和纯化：将每个表达质粒用于转化化学感受态Oragami2-(DE3)细菌。从LB-Amp平板中选择单菌落并将单菌落用于表达筛选。使菌落在补充有氨苄青霉素的LB培养基中在37℃处生长12小时。该培养物用于以1:100的接种量接种新鲜的LB-AMP烧瓶。这些培养物在37℃下生长直到OD595＝0.4(通常4小时)，此时添加IPTG达到1mM的终浓度。生长持续12小时。细胞通过以10,000xg离心15分钟来收获，并冷冻于-80℃下直到使用(最短冷冻时间为24小时)。细胞在冰上解冻并重悬于缓冲液A(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、5mM咪唑，pH 7.9)(通常每克细胞1mL)中。使细胞通过弗氏(French)压碎器两次来破碎细胞，然后以30,000x g离心30分钟。将粗提物与等体积的带电His-Bind树脂浆液混合，并将混合物倾倒入5cm x 4.9cc色谱柱中。用10倍柱体积的缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、60mM咪唑，pH 7.9)以0.2mL/min的流速洗涤色谱柱。通过添加3个柱体积的0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、1.0M

咪唑，pH 7.9从色谱柱洗脱酶。收集馏分(1.0mL)。在通过SDS PAGE分析后合并含有酶的级分。将合并级分施加于70cm x 4.9cc Sephadex G-

75色谱柱(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)。合并含有均质蛋白质的级分(通过SDS PAGE检查后)，通过Centricon过滤器将该级分浓缩至5mg/mL。将酶冷冻储存于-20℃直到使用。使用TEV蛋白酶从酶中除去组氨酸标签区域。将蛋白质以1.0mg/mL稀释至10mMTris-HCl pH 7.5、25mM NaCl中。每毫克酶添加100U TEV蛋白酶(大约1:100(w/w)的比率)。使反应在4℃处进行16小时。使混合物通过带电镍色谱柱。收集一个柱体积的洗脱液代表纯化的无标签的酶。

酶促反应条件如下所述。

PHB解聚酶：采用比浊测定法来测量各种条件下的PHBD酶活性。标准反应(最终体积＝1.0mL)含有200mg/L PHB细粒(此前通过超声处理稳定悬浮)、10mM KCl、10mM MgCl₂、25mM不同pH值的缓冲液。在添加酶后开始反应，并在Applied Photophysics光谱偏振计中以吸光度模式在650nm处监测。用搅拌器110将反应轻轻搅拌并保持在恒定温度下。将OD测量值(通常开始于2-3的范围内)转换为随时间变化的剩余OD百分比。或者，直接使用Sigma-Aldrich羟基丁酸酯测定试剂盒MAK272利用第二测定法来测量β-羟基丁酸酯。HB通过荧光测定法测量(λex＝535nm，λem＝587nm)。在各种时间点从PHB解聚酶反应中取出等分试样(10μL)，与50μL提供的HB测定缓冲液混合，并移液到黑色平底96孔板的孔中。将板在黑暗中在室温下孵育30分钟。使用

Molecular Dynamics SpectraMax M5来测量荧光发射强度。通过与由已知浓度的纯羟基丁酸酯构建的标准曲线进行比较，将荧光读数转换为HB浓度。所有动力学参数均根据Segel(1993)计算。

羟基丁酸酯脱氢酶：3-羟基丁酸酯至乙酰乙酸酯128的转化

通过乙酰乙酸酯比色测定法(Sigma-Aldrich试剂盒MAK199)来监测。在酶促反应期间的不同

时间点，从反应中取出10μL等分试样并

在冰上冷却5分钟。然后将等分试样转移至含有90μL测定缓冲液的透明96孔板的孔中。将平板在室温处避光温育30分钟

。使用Molecular Dynamics SpectraMax M5光谱仪来测量在550nm处的

光密度。通过与由已知浓度的纯乙酰乙酸酯构建的标准曲线进行比较，将光密度读数转换为乙酰乙酸酯128浓度。或者，可以简单地测量在340nm处的光密度增加，因为NAD+在反应过程中转化为NADH。在酶促反应期间的不同时间点，从反应中取出10μL等分试样并在冰上冷却5分钟。然后将等分试样转移至透明96孔板的孔中，并使用Molecular DynamicsSpectraMax M5光谱仪来测量在340nm处的光密度。由于反应化学计量为1:1，因此每单位时间转化的NAD+的量等于所形成的乙酰乙酸酯128的量。

乙酰乙酰辅酶A合成酶：该测定法测量乙酰乙酸酯128转化为乙酰乙酰辅酶A 130期间ATP的水解释放的焦磷酸(PPi)。采用来自Sigma-Aldrich的高灵敏度

焦磷酸盐测定试剂盒(MAK169)。焦磷酸通过荧光测定法测量(λex＝370nm，λem＝470nm)。在不同时间点从反应中取出等分试样(10μL)，与40μL提供的测定缓冲液混合，并移入黑色平底96孔板的孔中。将板在黑暗中在室温下孵育30分钟。使用Molecular DynamicsSpectraMax M5来测量荧光发射强度。通过与由已知浓度的纯焦磷酸钠构建的标准曲线进行比较，将荧光读数转换为PPi浓度。

乙酰乙酰辅酶A还原酶：该测定法测量NADPH转化为NADP+时在340nm处的光密度损失。在酶促反应期间的不同时间点，从反应中取出10μL等分试样并在冰上冷却5分钟。然后将等分试样转移至透明96孔板的孔中，并使用Molecular Dynamics SpectraMax M5光谱仪来测量在340nm处的光密度。由于反应化学计量为1:1，因此每单位时间转化的NADPH的量等于所形成的羟基丁酰辅酶A 132的量。

羟基丁酸酯聚合酶：采用比浊测定法来测量PHB聚合酶活性。在测定法的不同点，从反应中取出10μL等分试样并转移至透明96孔板的孔中。在Molecular DynamicsSpectraMax M5光谱仪中测量650nm处的光密度。

本领域的普通技术人员将理解，搅拌器110可用于搅拌或混合生物反应器100的第一容器(106、108)和/或第二容器118中的任何此类反应，并且过滤器、阀或任何此类其他沉淀物收集相关装置(122)可用于收集新形成的PHB 120。

生物反应器：采用20mL注射器、色谱柱和管道来构建原型生物反应器100。所有部件都用鲁尔(Luer)锁连接。注射器代替泵用于使反应流体从第一容器(106、108)移动通过螯合树脂并进入第二反应容器。第一注射器含有200mg PHB薄膜或200mg/mL细粒PHB。在反应持续时间(通常2小时)中将注射器浸入反应温度的水浴中。移动两个注射器的柱塞，以使反应从注射器1，通过中心柱(包括MWCO过滤器112(3kDa)和/或Dowex离子交换树脂)114，转移至预先装载有溶于反应缓冲液的第二容器118酶的注射器2中，反应缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.0)、10mM MgCl2、2.0mM ATP、2.0mM辅酶-A、2mM NAD+、2.0mM NADPH。所有酶均以2.0mM终浓度添加。第二容器118反应在40℃处运行5分钟。在整个反应期间的不同时间点，取出100mL等分试样，分成25mL样品并分别测定构成整个第二容器118反应的四种酶活性。

这是代谢途径的示例，该代谢途径可以解聚PHB薄膜或细粒，以三步将所得的羟基丁酸酯126转化为羟基丁酰辅酶A 132，继而将羟基丁酰辅酶A聚合为PHB。因此，这项工作代表了PHB可以替代聚丙烯作为真正循环解决方案的首次发现的可能性。

在不脱离在所附权利要求中更具体地描述的本发明的精神和范围的情况下，本发明的这些和其他修改和变型可由本领域的普通技术人员实践。另外，应理解，各方面中的小方面可整体或部分互换。此外，本领域的普通技术人员将了解，前述描述仅仅是举例，并且无意限制这类所附权利要求中进一步描述的本发明。

序列表

<110> 金伯利-克拉克环球有限公司

<120> 用于从解聚的聚羟基丁酸酯直接形成聚羟基丁酸酯的生物反应器和方法

<130> KCX-2009-PCT (65093187PCT02)

<140> 尚未分配

<141> 随附

<150> 63/194,445

<151> 2021-05-28

<160> 3

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 1

Met His His His His His His Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 2

Met His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro

1 5 10 15

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

6xHis标签

<400> 3

His His His His His His

1 5

Claims (20)

1.一种用于从含有聚羟基链烷酸酯的消费后产品中回收聚羟基链烷酸酯家族中的生物聚合物的方法，所述方法包括：

在第一容器内，使消费后产品与嗜极端微生物悬浮液或嗜极端解聚酶接触，以提供羟基链烷酸酯单体；

将所述单体通过过滤器泵送至第二生物反应器容器，以及

在所述第二容器内，使所述单体与酶接触，以产生回收的聚羟基链烷酸酯。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚羟基链烷酸酯是聚羟基丁酸酯。

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜极端微生物或嗜极端解聚酶是以下属的细菌：盐单胞菌属、徐丽华菌属、溶杆菌属、交替单胞菌属、节杆菌属、固氮螺菌属、稳杆菌属、脱硫弧菌属、盐芽孢杆菌属、Halobacteriovorax、Haloechinothrix、盐海洋菌属、盐红色菌属、盐栖菌属、Isoptericola、海杆菌属、Methyloligella、小单孢菌属、嗜盐碱球菌属、诺卡土壤菌属、副球菌属、Roseivivax、糖单孢菌属、希瓦氏菌属、酸芽孢杆菌属、Natranaerobius、盐杆茵科、生丝单胞菌属、拟无枝酸菌属、乔治菌属、热酸菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合，或者由它们纯化而来。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜极端微生物嗜极端解聚酶是嗜热徐丽华菌或海水盐单胞菌或者由它们纯化而来。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜极端微生物或嗜极端解聚酶具有约0.5摩尔/升至约5摩尔/升的耐盐性，或者约40℃至约120℃的温度的耐温性，或者它们的组合。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜极端解聚酶由经遗传修饰的微生物产生，所述微生物已经遗传修饰为分泌所述嗜极端解聚酶。

7.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述嗜极端解聚酶由至少一种类型的天然存在的微生物产生，所述微生物天然编码所述嗜极端解聚酶。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜极端解聚酶纯化自：河口溶杆菌、抗生素溶杆菌、布古尔溶杆菌、辣椒溶杆菌、产酶溶杆菌、Lysobacter lacus、Lysobacterlycopersici、马里溶杆菌、Lysobacter niastensis、深源溶杆菌、溶杆菌属物种、溶杆菌属物种A03、溶杆菌属物种cf310、溶杆菌属物种H21R20、溶杆菌属物种H21R4、溶杆菌属物种H23M41、溶杆菌属物种R19、溶杆菌属物种Root604、溶杆菌属物种Root690、溶杆菌属物种Root916、溶杆菌属物种Root983、溶杆菌属物种TY2-98、海绵溶杆菌、居海绵溶杆菌、溶杆菌属、碱土溶杆菌、抗砷溶杆菌、大田溶杆菌、Lysobacter dokdonensis、产酶溶杆菌、产酶溶杆菌、Lysobacter gilvus、胶状质溶杆菌、马里溶杆菌、Lysobacter oculi、Lysobacterpanacisoli、Lysobacter penaei、Lysobacter prati、耐冷溶杆菌、Lysobacter pythonis、瑞身溶杆菌、Lysobacter segetis、Lysobacter silvestris、Lysobacter silvisoli、Lysobacter soli、溶杆菌属物种、溶杆菌属物种17J7-1、溶杆菌属物种Alg18-2.2、溶杆菌属物种Cm-3-T8、溶杆菌属物种H23M47、溶杆菌属物种HDW10、溶杆菌属物种II4、溶杆菌属物种N42、溶杆菌属物种OAE881、溶杆菌属物种Root494、溶杆菌属物种URHA0019、溶杆菌属物种WF-2、溶杆菌属物种yr284、Lysobacter tabacisoli、Lysobacter telluris、Lysobactertolerans、Lysobacter tolerans、新疆溶杆菌、未分类的溶杆菌、Aliivibriofinisterrensis、费氏别弧菌、Aliivibrio sifiae、别弧菌属物种、别弧菌属物种1S128、别弧菌属物种EL58、别弧菌属物种SR45-2、Caballeronia arvi、Caballeronia calidae、Caballeronia hypogeia、Caballeronia insecticola、Caballeronia pedi、Caballeroniaterrestris、Dokdonella koreensis、Dyella caseinilytica、Dyella choica、鼎湖山戴氏菌、Dyella flava、江宁戴氏菌、Dyella kyungheensis、Dyella mobilis、Dyellamonticola、Dyella nitratireducens、Dyella psychrodurans、Dyella soli、Dyellasolisilvae、戴氏菌属物种7MK23、戴氏菌属物种ASV21、戴氏菌属物种ASV24、戴氏菌属物种C11、戴氏菌属物种C9、戴氏菌属物种DHC06、戴氏菌属物种EPa41、戴氏菌属物种G9、戴氏菌属物种M7H15-1、戴氏菌属物种M7H15-1、戴氏菌属物种OK004、戴氏菌属物种S184、戴氏菌属物种SG562、戴氏菌属物种SG609、戴氏菌属物种YR388、Dyella tabacisoli、博兹曼荧光杆菌、杜氏荧光杆菌NY 23、戈氏荧光杆菌、海洋微颤菌、铜绿假单胞菌、耐热假单胞菌、地中海假单胞菌、嗜冷杆菌属物种、冷单胞菌属物种MB-3u-54、冷单胞菌属物种psych-6C06、冷单胞菌属物种RZ22、冷单胞菌属物种Urea-02u-13、反硝化罗河杆菌、黄褐色罗河杆菌、甘草罗河杆菌、Rhodanobacter lindaniclasticus、Rhodanobacter panaciterrae、罗河杆菌属物种7MK24、罗河杆菌属物种A1T4、罗河杆菌属物种B04、罗河杆菌属物种B05、罗河杆菌属物种C01、罗河杆菌属物种C03、罗河杆菌属物种C05、罗河杆菌属物种C06、罗河杆菌属物种DHB23、罗河杆菌属物种DHG33、罗河杆菌属物种L36、罗河杆菌属物种MP1X3、罗河杆菌属物种OK091、罗河杆菌属物种OR444、罗河杆菌属物种PCA2、罗河杆菌属物种Root480、罗河杆菌属物种Root627、罗河杆菌属物种Root627、罗河杆菌属物种SCN 67-45、罗河杆菌属物种SCN68-63、罗河杆菌属物种Soil772、罗河杆菌属物种T12-5、罗河杆菌属物种TND4EH1、罗河杆菌属物种TND4FH1、Rhodanobacter spathiphylli、Rhodanobacter thiooxydans、Stenotrophomonas chelatiphaga、嗜麦芽糖寡养单胞菌、Stenotrophomonas panacihumi、Stenotrophomonas pavanii、嗜根寡养单胞菌、寡养单胞菌属物种DDT-1、寡养单胞菌属物种RIT309、寡养单胞菌属物种SKA14、河口弧菌、Vibrio antiquaries、水弧菌、塔斯马尼斯弧菌、黄单胞菌目细菌、白纹黄单胞菌属、树生黄单胞菌、地毯草黄单胞菌、溴黄单胞菌、野油菜黄单胞菌、大麻黄单胞菌、柑橘黄单胞菌、真泡黄单胞菌、草莓黄单胞菌、天竺葵黄单胞菌、风信子黄单胞菌、水稻黄单胞菌、菜豆黄单胞菌、豌豆黄单胞菌、糖黄单胞菌、黄单胞菌属物种Leaf131、黄单胞菌属物种NCPPB 1128、半透明黄单胞菌、Xanthomonas vasicola、Xanthomonas vesicatoria或它们的组合。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜极端解聚酶纯化自荧光假单胞菌或根癌农杆菌。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜极端解聚酶或所述酶包含约12个或更少的半胱氨酸残基。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜极端解聚酶具有约3kDa或更小的分子量。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器是约3kDa至约30kDa的分子量筛截过滤器，任选地随后是离子交换床。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中当在600nm处测量的所述第一生物反应器容器内容物的光密度约小于0.4或当所述消费后产品中至少40％的聚羟基链烷酸酯已经解聚为所述单体或它们的组合时，通过所述过滤器将所述羟基链烷酸酯单体泵送至所述第二生物反应器容器。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述消费后产品可以含有尿液、月经、粪便或它们的组合，或者选自由以下各项组成的组：失禁产品、婴儿和儿童护理产品、女性护理产品和家庭护理产品或它们的组合。

15.一种聚羟基丁酸酯，其由通过在多步酶促反应中解聚聚羟基丁酸酯而释放的羟基丁酸酯产生，所述多步酶促反应包括：

在第一生物反应器容器中，使聚羟基丁酸酯与解聚酶或产生微生物的解聚酶接触，以提供羟基丁酸酯单体，以及

在第二生物反应器容器中，用羟基丁酸酯脱氢酶将所述羟基丁酸酯单体转化为乙酰乙酸酯，用乙酰乙酰辅酶A合成酶将乙酰乙酸酯转化为乙酰乙酸酯辅酶A，用乙酰乙酰辅酶A还原酶将乙酰鲸蜡基辅酶A还原为羟基丁酰辅酶A，以及用羟基丁酸酯聚合酶使羟基丁酰辅酶A聚合，以形成聚羟基丁酸酯。

16.如权利要求15所述的聚羟基丁酸酯，其中所述合成酶、所述还原酶和所述聚合酶从假单胞菌属或农杆菌属细菌纯化而来。

17.如权利要求15至16中的任一项所述的聚羟基丁酸酯，其中假单胞菌属泽漆皂苷也包含在所述第二生物反应器容器中。

18.一种用于从含有聚羟基丁酸酯的消费后产品中回收聚羟基丁酸酯的方法，所述方法包括：

在第一生物反应器容器内，使消费后产品与嗜热或嗜盐细菌悬浮液或者嗜热或嗜盐解聚酶接触，以提供羟基丁酸酯单体；

将所述羟基丁酸酯单体泵送通过分子量筛截过滤器，任选地随后通过离子交换床，然后泵送至第二生物反应器容器；以及

在所述第二生物反应器容器内，使所述羟基丁酸酯单体与一种或多种酶和辅因子进料接触，从而产生回收的聚羟基丁酸酯。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述消费后产品还包含可以使用所述第一生物反应器容器中的高盐浓度或高温来控制的污染物。

20.如权利要求18至19中的任一项所述的方法，其中所述辅因子进料包括辅酶A、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、三磷酸腺苷、单磷酸腺苷、焦磷酸或它们的组合。