CN117916272A - 多特异性抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了多特异性和多价的抗原结合蛋白。一方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合蛋白，其包括第一抗原结合位点，该第一抗原结合位点包含与第一表位特异性结合的第一VHH；以及与第二表位特异性结合的第二抗原结合位点。

Description

多特异性抗原结合蛋白
技术领域
本公开涉及多特异性和多价的抗原结合蛋白，以及其制备方法和用途。
背景技术
多特异性抗体在治疗性用途方面越来越受到人们的关注。天然抗体是单特异性的，而多特异性抗体(例如，双特异性抗体)识别相同或不同抗原上的两个或更多个不同表位。通过两个或更多个与靶细胞相互作用的位点，可以实现更多的靶向结合。更多的靶向结合可以引起新蛋白复合物的形成，并触发新的细胞接触。在许多情况下，可以通过重定向细胞毒性免疫效应细胞，诸如T细胞和自然杀伤(NK)细胞，来激活另外的免疫应答，从而产生显著更强的靶向细胞毒性效应。有时，该增强作用会比将两种分别的单克隆抗体作为联合疗法进行施用时要大得多。多特异性抗体的治疗性用途最初集中于癌症治疗的效应细胞重靶向。在过去的十年中，已经建立了许多其他基于多特异性抗体的治疗性策略。目前，多特异性抗体具有广泛的用途，包括例如诊断、成像、预防和治疗。
尽管多特异性抗体有许多优点，但开发和生产多特异性抗体仍然是一个挑战。这主要是因为常规方法在很大程度上依赖于单克隆抗体的抗原结合部分。在多特异性抗原结合构建体中，这些抗原结合部分可能会失去其所需的生物化学和/或生物物理学特性。此外，许多多特异性抗体形式存在错配问题，并且它们通常还与聚集和低表达水平有关。它们难以纯化和生产。仍然需要用于药物开发和生产的通用多特异性抗体平台。
发明内容
本公开涉及多特异性和多价抗原结合蛋白，以及其制备方法和用途。本文还提供了一种通用多特异性抗体平台。多特异性和多价抗原结合蛋白中的抗原结合部分可以正确折叠并保留与抗原的高结合亲和力。另外，这些多特异性和多价抗原结合蛋白可以易于以高水平表达，并且可以易于纯化和制备。这些多特异性抗原结合蛋白特别适用于药物开发和制备。
一方面，本公开涉及一种多特异性抗原结合蛋白，其包括(a)Fc；(b)第一抗原结合位点，包含与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH)；以及(c)与第二表位特异性结合的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点与Fc相连。
在一些实施方案中，第一VHH与Fc中的CH2结构域相连。
在一些实施方案中，第一VHH通过铰链区与Fc中的CH2结构域相连。
在一些实施方案中，第一VHH与Fc中CH3的C末端相连。
在一些实施方案中，第一VHH与CH1结构域相连。在一些实施方案中，CH1结构域与Fc中的CH2结构域相连。
在一些实施方案中，第一VHH与VH结构域和CH1结构域相连，并且CH1结构域与Fc中的CH2结构域相连。在一些实施方案中，抗原结合蛋白进一步包括VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域相互缔合，形成抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白进一步包括VHH。在一些实施方案中，VHH与VL结构域相连。
在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含VH结构域和VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域相互缔合，形成第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括两条重链和两条轻链。
在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含第二VHH。
在一些实施方案中，第二VHH与Fc中的CH2结构域相连。
在一些实施方案中，第二VHH通过铰链区与Fc中的CH2结构域相连。
在一些实施方案中，第二VHH与Fc中CH3的C末端相连。
在一些实施方案中，第二VHH与CH1结构域相连，并且CH1结构域与Fc中的CH2结构域相连。
在一些实施方案中，第二VHH与VH结构域和CH1结构域相连。在一些实施方案中，CH1结构域与Fc中的CH2结构域相连。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白进一步包括VH结构域和VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域相互缔合，形成抗原结合位点。
在一些实施方案中，第二VHH与VH结构域相连。在一些实施方案中，第二VHH与VL结构域相连。
在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自不同的抗原。在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自同一个抗原。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白进一步包括含有第三VHH的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，第三VHH与第一VHH相连。
在一些实施方案中，第三抗原结合位点与第三表位特异性结合。在一些实施方案中，第一表位和第三表位来自不同的抗原。
在一些实施方案中，第三抗原结合位点与第三表位特异性结合。在一些实施方案中，第一表位和第三表位来自同一个抗原。
在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点与选自由VEGF、Ang-2、MSLN、GITR和PD-1组成的组中的一种或多种抗原特异性结合。
在一些实施方案中，第一抗原结合位点、第二抗原结合位点和第三抗原结合位点与选自由VEGF、Ang-2、MSLN、GITR和PD-1组成的组中的一种或多种抗原特异性结合。
一方面，本公开涉及一种多特异性抗原结合蛋白，其包括(a)第一多肽，该第一多肽包含与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；和CH1结构域；(b)第二多肽，该第二多肽包含与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)和CL结构域。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽通过CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
在一些实施方案中，VH结构域位于VHH1和CH1结构域之间，并且VL结构域位于VHH2和CL结构域之间。在一些实施方案中，VH和VL相互缔合，形成抗原结合位点。
在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自不同的抗原。在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自相同的抗原。
在一些实施方案中，VHH1和VHH2与选自由VEGF、Ang-2、MSLN、GITR和PD-1组成的组中的一种或多种抗原特异性结合。
一方面，本公开涉及一种多特异性抗原结合蛋白，其包括(a)第一多肽，该第一多肽包含与第一表位特异性结合的第一VHH(VHH1)；和(b)第二多肽，该第二多肽包含与第二表位特异性结合的第二VHH(VHH2)。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽相互缔合以形成二聚体。
在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自相同的抗原。在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自不同的抗原。
在一些实施方案中，第一多肽进一步包含第一免疫球蛋白铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含第二免疫球蛋白铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域。
在一些实施方案中，VHH1与第一免疫球蛋白铰链区相连。
在一些实施方案中，VHH2与第二免疫球蛋白铰链区相连。
在一些实施方案中，第一多肽进一步包含第一CH1结构域。在一些实施方案中，VHH1与第一CH1结构域相连。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白进一步包括第三多肽。在一些实施方案中，第三多肽包含：(a)与第三表位特异性结合的第三单域抗体(VHH3)；和(b)第一CL结构域。在一些实施方案中，第一多肽和第三多肽通过第一CH1结构域和第一CL结构域之间的相互作用而相互缔合。
在一些实施方案中，第一表位和第三表位来自相同的抗原。在一些实施方案中，第一表位和第三表位来自不同的抗原。
在一些实施方案中，第二多肽进一步包含第二CH1结构域。
在一些实施方案中，VHH2与第二CH1结构域相连。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白进一步包括第四多肽，该第四多肽包含：(a)与第四表位特异性结合的第四VHH(VHH4)；和(b)第二CL结构域。在一些实施方案中，第二多肽和第四多肽通过第二CH1结构域和第二CL结构域之间的相互作用而相互缔合。
在一些实施方案中，第二表位和第四表位来自相同的抗原。在一些实施方案中，第二表位和第四表位来自不同的抗原。
在一些实施方案中，第一多肽进一步包含与第五表位特异性结合的第五VHH(VHH5)。在一些实施方案中，VHH5与第一多肽的N-末端相连。
在一些实施方案中，第一多肽进一步包含与第五表位特异性结合的第五VHH(VHH5)。在一些实施方案中，VHH5与第一多肽的C-末端相连。
在一些实施方案中，第二多肽进一步包含与第六表位特异性结合的第六VHH(VHH6)。在一些实施方案中，VHH6与第二多肽的N-末端相连。
在一些实施方案中，第二多肽进一步包含与第六表位特异性结合的第六VHH(VHH6)。在一些实施方案中，VHH6与第二多肽的C-末端相连。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括第三多肽。在一些实施方案中，第三多肽进一步包含与第七表位特异性结合的第七VHH(VHH7)。在一些实施方案中，VHH7与第三多肽的N-末端相连。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括第三多肽。在一些实施方案中，第三多肽进一步包含与第七表位特异性结合的第七VHH(VHH7)。在一些实施方案中，VHH7与第三多肽的C-末端相连。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括第四多肽。在一些实施方案中，第四多肽进一步包含与第八表位特异性结合的第八VHH(VHH8)。在一些实施方案中，VHH8与第四多肽的N-末端相连。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括第四多肽。在一些实施方案中，第四多肽进一步包含与第八表位特异性结合的第八VHH(VHH8)。在一些实施方案中，VHH8与第四多肽的C-末端相连。
一方面，本公开涉及一种抗原结合蛋白，其包括(a)第一多肽，该第一多肽包含与第一表位特异性结合的第一VHH(VHH1)；和(b)第二多肽，该第二多肽包含第一Fab结构域的第一重链可变结构域(VH1)和第一CH1结构域。在一些实施方案中，第一Fab结构域与第二表位特异性结合。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽相互缔合以形成二聚体。
在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自相同的抗原。在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自不同的抗原。
在一些实施方案中，第一多肽从N-末端到C-末端进一步包含：第一免疫球蛋白铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域。在一些实施方案中，VHH1与第一免疫球蛋白铰链区相连。
在一些实施方案中，第一多肽从N-末端到C-末端进一步包含：第二Fab结构域的第二重链可变结构域VH(VH2)和第二CH1结构域、第一免疫球蛋白铰链区、第一CH2结构域以及第一CH3结构域。
在一些实施方案中，VHH1与VH2的N-末端相连。
在一些实施方案中，VHH1位于第二CH1结构域和第一免疫球蛋白铰链区之间。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白进一步包括第二VHH(VHH2)。在一些实施方案中，VHH2与第二Fab结构域的第二轻链可变结构域(VL2)相连。
在一些实施方案中，第二多肽从N-末端到C-末端进一步包含：第二免疫球蛋白铰链区；第二CH2结构域；和第二CH3结构域。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白进一步包括第三VHH(VHH3)。在一些实施方案中，VHH3与VH1的N-末端相连。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白进一步包括第三VHH(VHH3)。在一些实施方案中，VHH3位于第一CH1结构域和第二免疫球蛋白铰链区之间。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白进一步包括第四VHH(VHH4)。在一些实施方案中，VHH4与第一Fab结构域的第一轻链可变结构域(VL1)相连。
在一些实施方案中，第一多肽进一步包含与第五表位特异性结合的第五VHH(VHH5)。在一些实施方案中，VHH5与第一多肽的N-末端相连。
在一些实施方案中，第一多肽进一步包含与第五表位特异性结合的第五VHH(VHH5)。在一些实施方案中，VHH5与第一多肽的C-末端相连。
在一些实施方案中，第二多肽进一步包含与第六表位特异性结合的第六VHH(VHH6)。在一些实施方案中，VHH6与第二多肽的N-末端相连。
在一些实施方案中，第二多肽进一步包含与第六表位特异性结合的第六VHH(VHH6)。在一些实施方案中，VHH6与第二多肽的C-末端相连。
在一些实施方案中，VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5、VHH6、VHH7和/或VHH8与癌症相关抗原或癌症特异性抗原特异性结合。
在一些实施方案中，VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5、VHH6、VHH7和/或VHH8与抗原特异性结合。在一些实施方案中，抗原选自由VEGF、Ang2、间皮素(Mesothelin)、GITR、HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52组成的组。
在一些实施方案中，VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5、VHH6、VHH7和/或VHH8与VEGF、Ang2、间皮素或GITR特异性结合。
在一些实施方案中，VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5、VHH6、VHH7和/或VHH8与免疫检查点分子特异性结合。
在一些实施方案中，免疫检查点分子选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40组成的组。
在一些实施方案中，免疫检查点分子是PD-1。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白与至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种表位特异性结合。
一方面，本公开涉及一种抗原结合蛋白，其包括一个或多个以下抗原结合位点：
(a)靶向血管内皮生长因子(VEGF)的抗原结合位点；
(b)靶向血管生成素-2(Ang-2)的抗原结合位点；
(c)靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的抗原结合位点；和/或
(d)靶向间皮素(MSLN)的抗原结合位点；和/或
(e)靶向糖皮质激素诱导性TNFR相关蛋白(GITR)的抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白包括靶向VEGF的抗原结合位点和靶向Ang-2的抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白包括靶向VEGF的抗原结合位点和靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白包括靶向Ang-2的抗原结合位点和靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白包括靶向VEGF的抗原结合位点、靶向Ang-2的抗原结合位点和靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向VEGF的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向Ang-2的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向MSLN的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向GITR的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，一个或多个抗原结合位点包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
在一些实施方案中，一个或多个抗原结合位点包含VHH。
在一些实施方案中，可以以至少5mg/L、至少6mg/L、至少7mg/L、至少8mg/L、至少9mg/L、至少10mg/L、至少20mg/L、至少30mg/L、至少40mg/L、至少50mg/L、至少60mg/L、至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L或至少200mg/L的表达水平产生抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，可以以至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％的纯度(例如，通过蛋白A层析纯化后)产生抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有至少57℃、至少58℃、至少59℃、至少60℃、至少61℃、至少62℃、至少63℃、至少64℃或至少65℃的Tm。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白与VEGF、Ang-2、MSLN、PD-1或GITR结合的EC50值小于0.01μg/ml、小于0.02μg/ml、小于0.03μg/ml、小于0.04μg/ml、小于0.05μg/ml、小于0.06μg/ml、小于0.07μg/ml、小于0.08μg/ml、小于0.09μg/ml、小于0.10μg/ml、小于0.11μg/ml、小于0.12μg/ml、小于0.13μg/ml、小于0.14μg/ml、小于0.15μg/ml、小于0.16μg/ml、小于0.17μg/ml、小于0.18μg/ml、小于0.19μg/ml、小于0.20μg/ml、小于0.21μg/ml、小于0.22μg/ml、小于0.23μg/ml、小于0.24μg/ml、小于0.25μg/ml或小于0.30μg/ml。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白的结合亲和力为针对相同靶标的亲本抗体的结合亲和力的至少80％、85％、90％、95％或100％。
一方面，本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的抗原结合蛋白的组合物。
在一些实施方案中，受试者患有表达VEGF、表达Ang-2和/或表达MSLN的癌症。
在一些实施方案中，癌症选自由乳腺癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤组成的组。
一方面，本公开涉及一种治疗患有自身免疫性疾病或炎症性疾病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的抗原结合蛋白的组合物。
一方面，本公开涉及一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的如本文所述的抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
一方面，本公开涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载剂。
一方面，本公开涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载剂。
一方面，本公开涉及一种编码如本文所述的抗原结合蛋白的核酸。
一方面，本公开涉及一种包含如本文所述的核酸的载体。
一方面，本公开涉及一种包含如本文所述的核酸或如本文所述的载体的宿主细胞。
一方面，本公开涉及一种用于产生抗原结合蛋白的方法，该方法包括在适于产生抗原结合蛋白的条件下培养如本文所述的宿主细胞。
如本文所用的，术语“抗原结合蛋白”或“抗原结合构建体”指的是一种含有至少一个能够与抗原特异性结合的抗原结合位点的蛋白质。抗原结合蛋白可以具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个多肽。它可以具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个抗原结合位点。在一些实施方案中，抗原结合蛋白可以是如本文所述的任何抗体。
如本文所用的，术语“抗体”指的是包含至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任何一个或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任何一个)并能够与抗原中的表位特异性结合的任何抗原结合分子。抗体的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、单可变结构域(VHH)抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可以包含人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如由这些抗体或抗体片段形成的多特异性抗体、双特异性抗体、单链抗体、双抗体和线性抗体。
如本文所用的，术语“抗原结合片段”指的是全长抗体的一部分，其中抗体的该部分能够与抗原特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合片段含有至少一个可变结构域(例如，重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或VHH)。抗体片段的非限制性实例包括，例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、ScFv以及VHH。
如本文所用的，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述根据本发明的方法向其提供治疗的动物、人类或非人类。在本公开中考虑了兽医和非兽医应用。人类患者可以是成年人或未成年人(例如，未满18岁的人)。除了人类之外，患者还包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类动物。例如，包括非人灵长类动物(如猴、黑猩猩、大猩猩以及诸如此类)、啮齿类动物(如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔形目动物、猪科动物(如猪、小型猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物以及其他家养动物、农场动物和动物园动物。
如本文所用的，当提及抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段时，短语“特异性结合”和“特异性结合地”意指抗体或抗原结合片段与其靶分子的相互作用优先于与其他分子相互作用，因为该相互作用依赖于该靶分子上特定结构(即，抗原决定簇或表位)的存在；换言之，该试剂识别并结合包括特定结构的分子，而不是一般而言的所有分子。与靶分子特异性结合的抗体可以称为靶标特异性抗体。例如，与PD-1特异性结合的抗体可以称为PD1特异性抗体或抗PD1抗体。
如本文所用的，术语“双特异性抗体”指的是与两种不同表位结合的抗体。表位可以位于相同抗原或位于不同抗原上。
如本文所用的，术语“三特异性抗体”指的是与三种不同表位结合的抗体。表位可以位于相同抗原或位于不同抗原上。
如本文所用的，术语“多特异性抗体”指的是与两种或更多种不同表位结合的抗体。表位可以位于相同抗原或位于不同抗原上。多特异性抗体可以是例如双特异性抗体或三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体与两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种不同的表位结合。
如本文所用的，“VHH”指的是一种能与抗原特异性结合的抗体可变结构域。它们是重链抗体的可变结构域或单域抗体(纳米抗体)。在一些实施方案中，VHH是人源化VHH。由于VHH本身可以与抗原结合，因此VHH亦称为单域抗体(sdAb)或纳米抗体。VHH可以获自例如对单峰骆驼、骆驼、美洲驼、羊驼或鲨鱼的免疫，获自噬菌体展示库或者获自抗体工程。
如本文所用的，术语“价”指的是抗原结合蛋白或抗体分子中结合位点的指定数量。例如，天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”表示在抗体或抗原结合蛋白中分别存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
如本文所用的，“Fc区”指的是抗体的可结晶区域片段。Fc区可以是天然序列Fc区或经改变的Fc区。Fc可以来源于多种免疫球蛋白，包括例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4以及其他类诸如IgA、IgD、IgE和IgM。总体来说，免疫球蛋白的Fc区包含CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。
如本文所用的，“连接”意指一个多肽通过一个或多个共价键与另一个多肽相连。在一些实施方案中，多肽通过肽键或二硫键与另一多肽相连。在一些实施方案中，多肽通过肽接头序列与另一多肽相连。肽接头序列可以具有一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，两个多肽可以通过肽键直接连接，而它们之间没有任何肽接头序列。在一些实施方案中，一个多肽可以通过融合与另一多肽相连，形成融合多肽。在许多情况下，融合多肽是通过连接两个或更多个编码这些多肽的核酸序列而创建的。在一些实施方案中，一个多肽直接与另一个多肽融合，而没有任何肽接头序列。在一些实施方案中，一个多肽通过肽接头序列与另一多肽融合。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；但也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而并非意在进行限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用方式整体并入。如果发生抵触，以本说明书(包括定义)为准。
根据以下详细描述和附图以及根据权利要求书，本发明的其他特征和优点会变得显而易见。
附图说明
图1A是示出了本公开中描述的多特异性抗原结合蛋白的结构元件的示意图的表格。
图1B是W366001-T1U1.F82-1.uIgG4V1(或“F82”)的结构示意图。
图1C是W366001-T1U1.F83-1.uIgG4V1(或“F83”)的结构示意图。
图1D是W366001-U1T1.F84-1.uIgG4V1(或“F84”)的结构示意图。
图1E是W366001-U1T1.G1-1.uIgG4V1(或“G1”)的结构示意图。
图1F是W366001-U1T1.G32-1.uIgG4V1(或“G32”)的结构示意图。
图1G是W366001-U1T1.G33-1.uIgG4V1(或“G33”)的结构示意图。
图1H是W366001-U1T1.H9-1.uIgG4V1(或“H9”)的结构示意图。
图2A示出了F82的凝胶电泳结果。
图2B示出了F82的SEC结果。
图2C示出了F82的熔解曲线。
图2D示出了F82、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图2E示出了F82、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图3A示出了F83的凝胶电泳结果。
图3B示出了F83的SEC结果。
图3C示出了F83的熔解曲线。
图3D示出了F83、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图3E示出了F83、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图4A示出了F84的凝胶电泳结果。
图4B示出了F84的SEC结果。
图4C示出了F84的熔解曲线。
图4D示出了F84、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图4E示出了F84、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图5A示出了G1的凝胶电泳结果。
图5B示出了G1的SEC结果。
图5C示出了G1的熔解曲线。
图5D示出了G1、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图5E示出了G1、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图6A示出了G32的凝胶电泳结果。
图6B示出了G32的SEC结果。
图6C示出了G32的熔解曲线。
图6D示出了G32、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图6E示出了G32、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图7A示出了G33的凝胶电泳结果。
图7B示出了G33的SEC结果。
图7C示出了G33的熔解曲线。
图7D示出了G33、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图7E示出了G33、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图8A示出了H9的凝胶电泳结果。泳道1是纯化之前的上清液样品。
图8B示出了H9的SEC结果。
图8C示出了H9的熔解曲线。
图8D示出了H9、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图8E示出了H9、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图9A是W366001-T1U1.E32-1.uIgG4V1(或“E32”)的结构示意图。
图9B是W366001-U1T1.G44-1.uIgG4V1(或“G44”)的结构示意图。
图9C是W366001-U1T1.G45-1.uIgG4V1(或“G45”)的结构示意图。
图9D是W366001-U1T1.G46-1.uIgG4V1(或“G46”)的结构示意图。
图9E是W366001-U1T1.H14-1.uIgG4V1(或“H14”)的结构示意图。
图9F是W366001-U1T1.H6-1.uIgG4V1(或“H6”)的结构示意图。
图10A示出了E32的凝胶电泳结果。M是蛋白分子量标准。
图10B示出了E32的SEC结果。
图10C示出了E32的熔解曲线。
图10D示出了E32、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图10E示出了E32、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图11A示出了G44的凝胶电泳结果。
图11B示出了G44的SEC结果。
图11C示出了G44的熔解曲线。
图11D示出了G44、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图11E示出了G44、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图12A示出了G45的凝胶电泳结果。
图12B示出了G45的SEC结果。
图12C示出了G45的熔解曲线。
图12D示出了G45、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图12E示出了G45、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图13A示出了G46的凝胶电泳结果。
图13B示出了G46的SEC结果。
图13C示出了G46的熔解曲线。
图13D示出了G46、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图13E示出了G46、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图14A示出了H14的凝胶电泳结果。
图14B示出了H14的SEC结果。
图14C示出了H14的熔解曲线。
图14D示出了H14、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图14E示出了H14、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图15A示出了H6的凝胶电泳结果。标有M和N的两条泳道之间的泳道是纯化之前的上清液样品。
图15B示出了H6的SEC结果。
图15C示出了H6的熔解曲线。
图15D示出了H6、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图15E示出了H6、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图16A是W366002-U12T1.E28-1.uIgG4V1(或“E28”)的结构示意图。
图16B是W366002-T1U12.F43-1.uIgG4V1(或“F43”)的结构示意图。
图16C是W366002-U12T1.F85R-1.uIgG4V1(或F85R)的结构示意图。
图16D是W366002-U12T1.F45R-1.uIgG4V1(或“F45R”)的结构示意图。
图16E是W366002-U12T1.G58-1.uIgG4V1(或“G58”)的结构示意图。
图16F是W366002-T1U12.H27-1.uIgG4V1(或“H27”)的结构示意图。
图16G是W366002-T1U12.H22-1.uIgG4V1(或“H22”)的结构示意图。
图16H是W366002-T1U12.G47-1.uIgG4V1(或“G47”)的结构示意图。
图17A示出了E28的凝胶电泳结果。
图17B示出了E28的SEC结果。
图17C示出了E28的熔解曲线。
图17D示出了E28、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图17E示出了E28、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图18A示出了F43的凝胶电泳结果。
图18B示出了F43的SEC结果。
图18C示出了F43的熔解曲线。
图18D示出了F43、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图18E示出了F43、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图19A示出了F85R的凝胶电泳结果。
图19B示出了F85R的SEC结果。
图19C示出了F85R的熔解曲线。
图19D示出了F85R、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图19E示出了F85R、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图20A示出了F45R的凝胶电泳结果。
图20B示出了F45R的SEC结果。
图20C示出了F45R的熔解曲线。
图20D示出了F45R、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图20E示出了F45R、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图21A示出了G58的凝胶电泳结果。
图21B示出了G58的SEC结果。
图21C示出了G58的熔解曲线。
图21D示出了G58、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图21E示出了G58、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图22A示出了H27的凝胶电泳结果。
图22B示出了H27的SEC结果。
图22C示出了H27的熔解曲线。
图22D示出了H27、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图22E示出了H27、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图23A示出了H22的凝胶电泳结果。
图23B示出了H22的SEC结果。
图23C示出了H22的熔解曲线。
图23D示出了H22、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图23E示出了H22、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图24A示出了G47的凝胶电泳结果。
图24B示出了G47的SEC结果。
图24C示出了G47的熔解曲线。
图24D示出了G47、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图24E示出了G47、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图25A是W366003-T1U1W1.I23-1.uIgG4V1(或“I23”)的结构示意图。
图25B是W366003-T1U1W1.L52-1.uIgG4V1(或“L52”)的结构示意图。
图25C是W366003-T1U1W3.L1-1.uIgG4V1(或“L1”)的结构示意图。
图25D是W366003-T1W1U1.H27-1.uIgG4V1(或“H27-1”)的结构示意图。
图25E是W366003-T1U1W3.L54-1.uIgG4V1(或“L54”)的结构示意图。
图25F是W366003-T1U1W3.L55-1.uIgG4V1(或“L55”)的结构示意图。
图25G是W366003-T1U1W3.L56-1.uIgG4V1(或“L56”)的结构示意图。
图25H是W366003-T1U1W1.L51-1.uIgG4V1(或“L51”)的结构示意图。
图25I是W366003-T1U1W1.L57-1.uIgG4V1(或“L57”)的结构示意图。
图25J是W366003-T1U1W1.L58-1.uIgG4V1(或“L58”)的结构示意图。
图26A示出了I23的凝胶电泳结果。
图26B示出了I23的SEC结果。
图26C示出了I23的熔解曲线。
图26D示出了I23、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图26E示出了I23、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图26F示出了I23、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图27A示出了L52的凝胶电泳结果。
图27B示出了L52的SEC结果。
图27C示出了L52的熔解曲线。
图27D示出了L52、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图27E示出了L52、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图27F示出了L52、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图28A示出了L1的凝胶电泳结果。
图28B示出了L1的SEC结果。
图28C示出了L1的熔解曲线。
图28D示出了L1、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图28E示出了L1、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图28F示出了L1、W366001-cAb5和W366001-cAb6的MSLN结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb5(单价形式)和W366001-cAb6(二价形式)是靶向MSLN的亲本抗体。
图29A示出了H27-1的凝胶电泳结果。
图29B示出了H27-1的SEC结果。
图29C示出了H27-1的熔解曲线。
图29D示出了H27-1、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图29E示出了H27-1、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图29F示出了H27-1、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图30A示出了L54的凝胶电泳结果。
图30B示出了L54的SEC结果。
图30C示出了L54的熔解曲线。
图30D示出了L54、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图30E示出了L54、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图30F示出了L54、W366001-cAb5和W366001-cAb6的MSLN结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb5(单价形式)和W366001-cAb6(二价形式)是靶向MSLN的亲本抗体。
图31A示出了L55的凝胶电泳结果。
图31B示出了L55的SEC结果。
图31C示出了L55的熔解曲线。
图31D示出了L55、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图31E示出了L55、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图31F示出了L55、W366001-cAb5和W366001-cAb6的MSLN结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb5(单价形式)和W366001-cAb6(二价形式)是靶向MSLN的亲本抗体。
图32A示出了L56的凝胶电泳结果。
图32B示出了L56的SEC结果。
图32C示出了L56的熔解曲线。
图32D示出了L56、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图32E示出了L56、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图32F示出了L56、W366001-cAb5和W366001-cAb6的MSLN结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb5(单价形式)和W366001-cAb6(二价形式)是靶向MSLN的亲本抗体。
图33A示出了L51的凝胶电泳结果。
图33B示出了L51的SEC结果。
图33C示出了L51的熔解曲线。
图33D示出了L51、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图33E示出了L51、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图33F示出了L51、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图34A示出了L57的凝胶电泳结果。
图34B示出了L57的SEC结果。
图34C示出了L57的熔解曲线。
图34D示出了L57、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图34E示出了L57、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图34F示出了L57、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图35A示出了L58的凝胶电泳结果。
图35B示出了L58的SEC结果。
图35C示出了L58的熔解曲线。
图35D示出了L58、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图35E示出了L58、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图35F示出了L58、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图36A是W366004-T1U1W1X1.N1-1.uIgG4V1(或“N1”)的结构示意图。
图36B是W366004-T1U1W1X1.N2-1.uIgG4V1(或“N2”)的结构示意图。
图36C是W366004-T1U1W1X1.N3-1.uIgG4V1(或“N3”)的结构示意图。
图36D是W366004-T1U1W1X1.N4-1.uIgG4V1(或“N4”)的结构示意图。
图37A示出了N1的凝胶电泳结果。
图37B示出了N1的SEC结果。
图37C示出了N1的熔解曲线。
图37D示出了N1、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图37E示出了N1、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图37F示出了N1、W366001-cAb5和W366001-cAb6的MSLN结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb5(单价形式)和W366001-cAb6(二价形式)是靶向MSLN的亲本抗体。
图37G示出了N1、W366001-cAb7和W366001-cAb8的GITR结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb7(单价形式)和W366001-cAb8(二价形式)是靶向GITR的亲本抗体。
图38A示出了N2的凝胶电泳结果。
图38B示出了N2的SEC结果。
图38C示出了N2的熔解曲线。
图38D示出了N2、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图38E示出了N2、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图38F示出了N2、W366001-cAb5和W366001-cAb6的MSLN结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb5(单价形式)和W366001-cAb6(二价形式)是靶向MSLN的亲本抗体。
图38G示出了N2、W366001-cAb7和W366001-cAb8的GITR结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb7(单价形式)和W366001-cAb8(二价形式)是靶向GITR的亲本抗体。
图39A示出了N3的凝胶电泳结果。
图39B示出了N3的SEC结果。
图39C示出了N3的熔解曲线。
图39D示出了N3、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图39E示出了N3、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图39F示出了N3、W366001-cAb5和W366001-cAb6的MSLN结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb5(单价形式)和W366001-cAb6(二价形式)是靶向MSLN的亲本抗体。
图39G示出了N3、W366001-cAb11和W366001-cAb12的PD-1结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb11(单价形式)和W366001-cAb12(二价形式)是靶向PD-1的亲本抗体。
图40A示出了N4的凝胶电泳结果。
图40B示出了N4的SEC结果。
图40C示出了N4的熔解曲线。
图40D示出了N4、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图40E示出了N4、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图40F示出了N4、W366001-cAb5和W366001-cAb6的MSLN结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb5(单价形式)和W366001-cAb6(二价形式)是靶向MSLN的亲本抗体。
图40G示出了N4、W366001-cAb7和W366001-cAb8的GITR结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb7(单价形式)和W366001-cAb8(二价形式)是靶向GITR的亲本抗体。
图41A是W366003-T1U1W1.D38-1.His(或“D38”)的结构示意图。
图41B示出了D38的凝胶电泳结果。
图41C示出了D38的SEC结果。
图41D示出了D38的熔解曲线。
图42示出了另外的多特异性抗原结合蛋白形式的结构示意图。
图43A是W366000-T1.V1-1.uIgG4V1(或“V1”)的结构示意图。
图43B是W366000-T1.V2-1.uIgG4V1(或“V2”)的结构示意图。
图44A示出了V1的凝胶电泳结果。
图44B示出了V1的SEC结果。
图44C示出了V1的熔解曲线。
图44D示出了V1、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图45A示出了V2的凝胶电泳结果。
图45B示出了V2的SEC结果。
图45C示出了V2的熔解曲线。
图45D示出了V2、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图46A是W366001-U1T1.H39-1.uIgG4V1(或“H39”)的结构示意图。
图46B是W366001-U1T1.H40-1.uIgG4V1(或“H40”)的结构示意图。
图46C是W366001-U1T1.V14-1.His(或“V14”)的结构示意图。
图46D是W366001-U1T1.V15-1.His(或“V15”)的结构示意图。
图46E是W366001-U1T1.V16-1.His(或“V16”)的结构示意图。
图46F是W366001-U1T1.V11-1.His(或“V11”)的结构示意图。
图47A示出了H39的凝胶电泳结果。
图47B示出了H39的SEC结果。
图47C示出了H39的熔解曲线。
图47D示出了H39、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图47E示出了H39、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图48A示出了H40的凝胶电泳结果。
图48B示出了H40的SEC结果。
图48C示出了H40的熔解曲线。
图48D示出了H40、W366001-cAb1和W366001-cAb2的VEGF结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb1(单价形式)和W366001-cAb2(二价形式)是靶向VEGF的亲本抗体。
图48E示出了H40、W366001-cAb3和W366001-cAb4的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。W366001-cAb3(单价形式)和W366001-cAb4(二价形式)是靶向Ang-2的亲本抗体。
图49A示出了V14的凝胶电泳结果。
图49B示出了V14的SEC结果。
图49C示出了V14的熔解曲线。
图49D示出了V14的VEGF结合结果。NC为阴性对照。
图49E示出了V14的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图50A示出了V15的凝胶电泳结果。
图50B示出了V15的SEC结果。
图50C示出了V15的熔解曲线。
图50D示出了V15的VEGF结合结果。NC为阴性对照。
图50E示出了V15的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图51A示出了V16的凝胶电泳结果。
图51B示出了V16的SEC结果。
图51C示出了V16的熔解曲线。
图51D示出了V16的VEGF结合结果。NC为阴性对照。
图51E示出了V16的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图52A示出了V11的凝胶电泳结果。
图52B示出了V11的SEC结果。
图52C示出了V11的熔解曲线。
图52D示出了V11的VEGF结合结果。NC为阴性对照。
图52E示出了V11的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图53A是W366003-U1W3X1.D1-1(或“D1”)的结构示意图。
图53B是W366003-U1W3X1.D2-1.His(或“D2”)的结构示意图。
图53C是W366003-U1W3X1.D3-1.His(或“D3”)的结构示意图。
图53D是W366003-U1W3X1.D43-1.His(或“D43”)的结构示意图。
图53E是W366003-U1W3X1.D44-1.His(或“D44”)的结构示意图。
图54A示出了D1的凝胶电泳结果。
图54B示出了D1的SEC结果。
图54C示出了D1的熔解曲线。
图54D示出了D1的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图54E示出了D1的MSLN结合结果。NC为阴性对照。
图54F示出了D1的GITR结合结果。NC为阴性对照。
图55A示出了D2的凝胶电泳结果。
图55B示出了D2的SEC结果。
图55C示出了D2的熔解曲线。
图55D示出了D2的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图55E示出了D2的MSLN结合结果。NC为阴性对照。
图55F示出了D2的GITR结合结果。NC为阴性对照。
图56A示出了D3的凝胶电泳结果。
图56B示出了D3的SEC结果。
图56C示出了D3的熔解曲线。
图56D示出了D3的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图56E示出了D3的MSLN结合结果。NC为阴性对照。
图56F示出了D3的GITR结合结果。NC为阴性对照。
图57A示出了D43的凝胶电泳结果。
图57B示出了D43的SEC结果。
图57C示出了D43的熔解曲线。
图57D示出了D43的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图57E示出了D43的MSLN结合结果。NC为阴性对照。
图57F示出了D43的GITR结合结果。NC为阴性对照。
图58A示出了D44的凝胶电泳结果。
图58B示出了D44的SEC结果。
图58C示出了D44的熔解曲线。
图58D示出了D44的Ang-2结合结果。NC为阴性对照。
图58E示出了D44的MSLN结合结果。NC为阴性对照。
图58F示出了D44的GITR结合结果。NC为阴性对照。
发明详述
虽然多特异性抗体具有广泛的用途，但是开发和制备多特异性抗体仍然是一个挑战。例如，由于抗原结合位点是由轻链和重链的可变结构域(VL、VH)构建的，因此生成双特异性IgG分子较为困难。双特异性IgG抗体需要两条不同的重链和两条不同的轻链，并且由于存在至少两个不同的抗原结合位点而表现出不对称性。在一个细胞中表达的两种抗体重链和轻链的混杂配对理论上可以产生16种不同的组合(10种不同的分子)，其中只有一种是双特异性的，而其余的配对则产生非功能性或单特异性分子。指导并强行正确组装正确的结合位点，例如重链和轻链之间以及两条不同的重链之间的结合位点，是生成多特异性抗体的挑战之一。
本公开提供了一种通用多特异性抗体平台。特别地，多特异性抗原结合蛋白中的抗原结合位点可以正确折叠并保留与抗原的高结合亲和力。另外，本文描述的方法可以显著减少错配的可能性。此外，本公开证明了这些多特异性和多价抗原结合蛋白可以轻易地以高水平表达，并且可以易于纯化和制备。
多特异性抗原结合蛋白
多特异性抗原结合蛋白是一种可以同时与两种或更多种不同类型表位结合的人工蛋白。表位可以位于相同抗原或位于不同抗原中。在一些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白可以具有两个、三个、四个、五个、六个或更多个抗原结合位点。在一些实施方案中，抗原结合位点包含或组成为一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，抗原结合位点包含或组成为一个VHH。在一些实施方案中，这些抗原结合蛋白包含或组成为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个VHH。
VHH是可以与抗原特异性结合的抗体可变结构域。它们是重链抗体或单域抗体的可变结构域。重链抗体只有两条重链，它们缺乏CH1区域，但在其N-末端仍带有抗原结合结构域。重链抗体通常从骆驼科动物中获得。像所有哺乳动物一样，骆驼科动物(例如，美洲驼)可以产生常规抗体，由两条重链和两条轻链通过二硫键结合在一起组成，呈Y型(例如，IgG1)。然而，它们还产生两种独特的IgG亚类：IgG2和IgG3，也称为重链抗体。常规的Ig需要重链和轻链两者的可变区缔合以使抗原-抗体相互作用具有高度多样性。尽管分离的重链和轻链仍显示出这种能力，但与成对的重链和轻链相比，它们表现出极低亲和力。重链抗体的独特之处在于其单体抗原结合区与抗原结合的能力，其特异性、亲和力特别是多样性都可以与常规抗体相媲美，而无需与另一区域配对。这一特征主要是由于两条重链的可变区氨基酸序列内发生了一些重大变异，与常规Ig相比，这些变异会引起深层次构象变化。
这些抗体的单可变结构域(称为VHH、sdAb、纳米抗体或重链抗体可变结构域)是由适应性免疫系统生成的最小抗原结合结构域。通常发现，这些抗体可变区的第三互补决定区(CDR3)的长度是常规CDR3的两倍。这引起与抗原的相互作用表面增加以及抗原-抗体相互作用的多样性增加，从而补偿了轻链的缺失。凭借长互补决定区3(CDR3)，VHH可以延伸到常规抗体无法接近的蛋白质上的裂隙中，包括功能上感兴趣的位点，诸如酶的活性位点或病毒表面上的受体结合峡部(canyon)。此外，额外的半胱氨酸残基使结构更加稳定，从而提高了相互作用的强度。
与携带常规抗体可变结构域(VH和VL)的常规抗体相比，VHH提供了许多其他优势，包括更高的稳定性、溶解性、表达产量和重折叠能力，以及更好的体内组织穿透性。此外，与常规抗体的VH结构域相反，VHH不显示与轻链结合的内在倾向。这有利于在功能性轻链基因座存在的情况下诱导重链抗体。而且，由于VHH不与VL结构域结合，因此将VHH重构为多特异性抗体构建体比含有常规VH-VL对或基于VH结构域的单一结构域的构建体要容易得多。
本公开为包括一个或多个VHH的多特异性抗原结合蛋白提供了多种形式。其中许多形式在图1B-1H、图9A-9F、图16A-16H、图25A-25J、图36A-36D和图41A中示出。结构元件的示意图如图1A所示。其他形式如图42所示。
在一些实施方案中，此处提供的抗原结合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个VHH。在一些实施方案中，此处提供的抗原结合蛋白进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个抗原结合位点，其中这些抗原结合位点由一对VH和VL形成。
在一些实施方案中，这些抗原结合位点融合在一起。在一些实施方案中，这些抗原结合位点附着在支架(例如，多肽、全长抗体、Fc)上。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含Fc。在一些实施方案中，一个或多个VHH和/或一个或多个VH/VL对与Fc相连。在一些实施方案中，一个或多个VHH和/或一个或多个VH/VL对通过接头序列，即至少一个氨基酸的氨基酸序列，与Fc相连。在一些实施方案中，接头序列是铰链区序列、CH1或CL。在一些实施方案中，Fc是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含Fc结构域，该Fc结构域可以来源于各种类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一些实施方案中，Fc结构域来源于IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，Fc结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个重链恒定区。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含全长抗体(例如，IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含由两条重链和两条轻链组成的全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链组成的全长单克隆抗体。在一些实施方案中，一个或多个VHH和/或一个或多个VH/VL对与重链的C末端相连。在一些实施方案中，一个或多个VHH和/或一个或多个VH/VL对与重链的N末端相连。在一些实施方案中，一个或多个VHH和/或一个或多个VH/VL对与轻链的C末端相连。在一些实施方案中，一个或多个VHH和/或一个或多个VH/VL对与轻链的N末端相连。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白可以来源于各种抗体变体(包括衍生物和缀合物)或抗体片段以及多特异性(例如，双特异性)抗体或抗体片段。本文提供的这些抗体包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体(多聚抗体，例如双特异性抗体)、人抗体、嵌合抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、单链抗体、细胞内产生的抗体(即，内抗体)及其抗原结合片段。
本文为多特异性抗原结合蛋白提供了许多形式。一方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合蛋白。该抗原结合蛋白包含或组成为1、2、3、4、5、6个或多于6个Fc。Fc可以作为蛋白支架，其中一个或多个VHH可以直接或间接连接、附着或融合到该蛋白支架上。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白中VHH与Fc的比率为至少或约8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个VH-VL对或者由其组成，其中该VH和VL相互缔合，形成抗原结合位点。在一些实施方案中，抗原结合蛋白中VHH与VH-VL对的比率为至少或约8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3或1:4。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白不具有Fc。抗原结合蛋白中VHH与VH-VL对的比率为至少或约8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3或1:4。
在一些实施方案中，一个或多个VHH连接、融合或附着到VH、CH1、CH2、CH3、CH4上，例如直接或通过接头序列间接完成。在一些实施方案中，一个或多个VHH连接、融合或附着到VL或CL上，例如直接或通过接头序列间接完成。在一些实施方案中，一个或多个VHH直接或通过接头序列间接与另一个VHH相连。
VHH可以与多肽的N末端或C末端相连。在一些实施方案中，VHH通过如本文所述的接头序列与多肽相连。在一些实施方案中，一个或多个VHH与CH3的C末端相连。在一些实施方案中，一个或多个VHH与CH1或CL的C末端相连。在一些实施方案中，一个或多个VHH与CH2的N末端相连。在一些实施方案中，一个或多个VHH与VH或VL的N末端相连。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为1、2、3、4、5、6、7、8个或多于8个多肽。这些多肽可以具有CH2结构域和/或CH3结构域。在一些实施方案中，它们可以具有CH1结构域。在一些实施方案中，它们可以具有CL结构域。在一些实施方案中，它们可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个VHH。在一些实施方案中，它们可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个VH或VL。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含Fab样结构域或由其组成。如本文所用的，“Fab样”结构域指的是一种包含CH1和CL的结构，其中该CH1和CL相互缔合并形成二聚体。在一些实施方案中，一个VHH与CH1相连，并且一个VHH与CL相连。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，该第一抗原结合位点包含VH和VL或由VH和VL组成，该第二抗原结合位点包含VHH或由VHH组成，其中该第一抗原结合位点和该第二抗原结合位点相互连接、融合或附着。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图1B所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向VEGF；并且第二多肽中的两个VHH靶向Ang-2。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图1C所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向VEGF；并且第二和第三多肽中的VHH靶向Ang-2。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。在一些实施方案中，第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第三VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图1D所示的结构。在一些实施方案中，第一VHH和第三VHH靶向Ang-2；并且第二VHH靶向VEGF。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图1E所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的第一VHH靶向Ang-2；第一多肽和第二多肽中的第二VHH靶向VEGF。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图1F所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的第一VHH靶向Ang-2；第一多肽和第二多肽中的第二VHH靶向VEGF。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图1G所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的VHH靶向VEGF；第三多肽和第四多肽中的VHH靶向Ang-2。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个第二VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个第二VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图1H所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的两个第一VHH靶向Ang-2；第一多肽和第二多肽中的两个第二VHH靶向VEGF。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图9A所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向VEGF，并且第二多肽中的VHH靶向Ang-2。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图9B所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第二VHH靶向VEGF；第一多肽中的第一VHH、第二多肽和第三多肽中的VHH靶向Ang-2。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图9C所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向VEGF；第二多肽、第三多肽和第四多肽中的VHH靶向Ang-2。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图9D所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第一VHH、第二多肽中的第一VHH和第二VHH靶向Ang-2；并且第一多肽中的第二VHH靶向VEGF。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图9E所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的第一VHH、第三多肽和第四多肽中的VHH靶向Ang-2；第一多肽和第二多肽中的第二VHH靶向VEGF。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图9F所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的两个第一VHH靶向Ang-2；第一多肽和第二多肽中的第二VHH靶向VEGF。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VL和CL结构域。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图16A所示的结构。在一些实施方案中，第二多肽中的VHH靶向VEGF；第一多肽中的VH和第三多肽中的VL相互缔合，形成靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第一VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图16B所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向VEGF；第一VH和第一VL相互缔合，形成靶向PD-1的第一抗原结合位点；第二VH和第二VL相互缔合，形成靶向PD-1的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VL和CL结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第一多肽中的CH1结构域和第二多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图16C所示的结构。在一些实施方案中，第三多肽中的两个VHH靶向VEGF；第一多肽中的VH和第二多肽中的VL相互缔合，形成靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、VL和CL结构域。第二多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图16D所示的结构。在一些实施方案中，第一和第三多肽中的VHH靶向VEGF；第二多肽中的VH和第三多肽中的VL相互缔合，形成靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VH、第一CH1结构域、VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和第一CL结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VH、第二CH1结构域、VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和第二CL结构域。第一CH1结构域和第一CL结构域可以相互缔合。第二CH1结构域和第二CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图16E所示的结构。在一些实施方案中，第一和第三多肽中的VHH靶向VEGF；第一VH和第一VL相互缔合，形成靶向PD-1的第一抗原结合位点；第二VH和第二VL相互缔合，形成靶向PD-1的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第一VH、第一CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和第一CL结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第三VHH、第二VH、第二CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第四VHH。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和第二CL结构域。第一CH1结构域和第一CL结构域可以相互缔合。第二CH1结构域和第二CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图16F所示的结构。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH、第三VHH和第四VHH靶向VEGF；第一VH和第一VL相互缔合，形成靶向PD-1的第一抗原结合位点；第二VH和第二VL相互缔合，形成靶向PD-1的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第一VH、第一CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第一VL和第一CL结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第二VH、第二CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第二VL和第二CL结构域。第一CH1结构域和第一CL结构域可以相互缔合。第二CH1结构域和第二CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图16G所示的结构。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四多肽中的VHH靶向VEGF；第一VH和第一VL相互缔合，形成靶向PD-1的第一抗原结合位点；第二VH和第二VL相互缔合，形成靶向PD-1的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、VL和CL结构域。第二多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图16H所示的结构。在一些实施方案中，第一和第三多肽中的VHH靶向VEGF；VH和VL相互缔合，形成靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VL和CL结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第一多肽中的CH1结构域和第二多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25A所示的结构。在一些实施方案中，第三多肽中的第一VHH靶向VEGF；第三多肽中的第二VHH靶向Ang-2；VH和VL相互缔合，形成靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第一VHH。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25B所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第一VHH靶向VEGF；第二多肽中的第二VHH靶向Ang-2；第一VH和第一VL相互缔合，形成靶向PD-1的第一抗原结合位点；第二VH和第二VL相互缔合，形成靶向PD-1的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第三VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第三VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25C所示的结构。在一些实施方案中，第一和第二多肽中的第一VHH靶向VEGF；第一和第二多肽中的第二VHH靶向Ang-2；第一和第二多肽中的第三VHH靶向MSLN。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第一VH、第一CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和第一CL结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第三VHH、第二VH、第二CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第四VHH。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和第二CL结构域。第一CH1结构域和第一CL结构域可以相互缔合。第二CH1结构域和第二CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25D所示的结构。在一些实施方案中，第一VHH和第三VHH靶向VEGF；第二VHH和第四VHH靶向Ang-2；第一VH和第一VL相互缔合，形成靶向PD-1的第一抗原结合位点；第二VH和第二VL相互缔合，形成靶向PD-1的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25E所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第一VHH和第二多肽中的第一VHH靶向VEGF；第一多肽中的第二VHH靶向Ang-2；并且第二多肽中的第二VHH靶向MSLN。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25F所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向Ang-2；第二多肽中的VHH靶向MSLN；第三和第四多肽中的VHH靶向VEGF。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25G所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第一VHH和第三多肽中的VHH靶向VEGF；第一多肽中的第二VHH靶向Ang-2；并且第二多肽中的VHH靶向MSLN。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第一VH、第一CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和第一CL结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第二VH、第二CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和第二CL结构域。第一CH1结构域和第一CL结构域可以相互缔合。第二CH1结构域和第二CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25H所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向VEGF；第三多肽中的VHH靶向Ang-2；第一VH和第一VL相互缔合，形成靶向PD-1的第一抗原结合位点；第二VH和第二VL相互缔合，形成靶向PD-1的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VL和CL结构域。第二多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25I所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第一VHH和第二多肽中的VHH靶向VEGF；第一多肽中的第二VHH靶向Ang-2；VH和VL相互缔合，形成靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VH、第一CH1结构域、VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和第一CL结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VH、第二CH1结构域、VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和第二CL结构域。第一CH1结构域和第一CL结构域可以相互缔合。第二CH1结构域和第二CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图25J所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向VEGF；第三多肽中的VHH靶向Ang-2；第一VH和第一VL相互缔合，形成靶向PD-1的第一抗原结合位点；第二VH和第二VL相互缔合，形成靶向PD-1的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图36A所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第一VHH靶向VEGF；第一多肽中的第二VHH靶向Ang-2；第二多肽中的VHH靶向MSLN；并且第三多肽中的VHH靶向GITR。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图36B所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第一VHH靶向VEGF；第一多肽中的第二VHH靶向Ang-2；第二多肽中的第一VHH靶向MSLN；并且第二多肽中的第二VHH靶向GITR。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为三条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VL和CL结构域。第二多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图36C所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的第一VHH靶向VEGF；第一多肽中的第二VHH靶向Ang-2；第二多肽中的VHH靶向MSLN；VH和VL相互缔合，形成靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域、第三VHH和第四VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域、第三VHH和第四VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图36D所示的结构。在一些实施方案中，第一和第二多肽中的第一VHH靶向VEGF；第一和第二多肽中的第二VHH靶向Ang-2；第一和第二多肽中的第三VHH靶向MSLN；第一和第二多肽中的第四VHH靶向GITR。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、VH和CH1结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、VL和CL结构域。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图41A所示的结构。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH靶向VEGF；第二多肽中的VHH靶向Ang-2；VH和VL相互缔合，形成靶向PD-1的抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图43A中V1所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图43B中V2所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V2R所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为三个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为三个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V3所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V4所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为三个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为三个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V5所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和三个VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和三个VHH。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V5R所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为四个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为四个VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V6所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V7所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和第二VHH。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V8所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个VHH和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V9所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V10所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个第二VHH。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图46A中H39所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和两个第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，引入了KIH突变(例如，在CH3结构域中)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图46B中H40所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第一VL和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第二VL和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。第一多肽中的第一VH和第三多肽中的第一VL可以相互缔合，形成第一抗原结合位点。第二多肽中的第二VH和第四多肽中的第二VL可以相互缔合，形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第三多肽中的VHH和第四多肽中的VHH是相同的。在一些实施方案中，第三多肽中的VHH和第四多肽中的VHH是不同的。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点靶向相同的抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点靶向不同的抗原。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中G6所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL、CL结构域和VHH。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL、CL结构域和VHH。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。第一多肽中的第一VH和第三多肽中的第一VL可以相互缔合，形成第一抗原结合位点。第二多肽中的第二VH和第四多肽中的第二VL可以相互缔合，形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第三多肽中的VHH和第四多肽中的VHH是相同的。在一些实施方案中，第三多肽中的VHH和第四多肽中的VHH是不同的。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点靶向相同的抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点靶向不同的抗原。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中G7所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第一VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第二VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。第一多肽中的第一VH和第三多肽中的第一VL可以相互缔合，形成第一抗原结合位点。第二多肽中的第二VH和第四多肽中的第二VL可以相互缔合，形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH和第二多肽中的VHH是相同的。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH和第二多肽中的VHH是不同的。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点靶向相同的抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点靶向不同的抗原。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中G8所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为四条多肽。第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和VHH。第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VH、CH1结构域、任选的铰链区序列、CH2结构域、CH3结构域和VHH。第三多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VL和CL结构域。第四多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第二VL和CL结构域。第一多肽中的CH1结构域和第三多肽中的CL结构域可以相互缔合。第二多肽中的CH1结构域和第四多肽中的CL结构域可以相互缔合。第一多肽中的第一VH和第三多肽中的第一VL可以相互缔合，形成第一抗原结合位点。第二多肽中的第二VH和第四多肽中的第二VL可以相互缔合，形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH和第二多肽中的VHH是相同的。在一些实施方案中，第一多肽中的VHH和第二多肽中的VHH是不同的。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点靶向相同的抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点靶向不同的抗原。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中G9所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH和第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图46C中V14所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH和两个第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图46D中V15所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为三个第一VHH和三个第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图46E中V16所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、第二VHH和两个第一VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图46F中V11所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为三个第一VHH、第二VHH和三个第一VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V12所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为四个第一VHH、第二VHH和四个第一VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中V13所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、两个第二VHH和第三VHH。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH互不相同。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中有两个是相同的。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中的所有三个都是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图53A中D1所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、第二VHH和两个第三VHH。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH互不相同。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中有两个是相同的。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中的所有三个都是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图53B中D2所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH和第三VHH。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH互不相同。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中有两个是相同的。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中的所有三个都是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42或图53C中D3所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VHH、第一scFv和第二scFv。在一些实施方案中，第一scFv和第二scFv是不同的。在一些实施方案中，第一scFv和第二scFv是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中D4所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一scFv、VHH和第二scFv。在一些实施方案中，第一scFv和第二scFv是不同的。在一些实施方案中，第一scFv和第二scFv是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中D5所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一scFv、第二scFv和VHH。在一些实施方案中，第一scFv和第二scFv是不同的。在一些实施方案中，第一scFv和第二scFv是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中D6所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为两条多肽。在一些实施方案中，第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为scFv、VH、CH1结构域和VHH；并且第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为scFv、VL和CL结构域。在一些实施方案中，第一多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为scFv、VL、CL结构域和VHH；并且第二多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为scFv、VH和CH1结构域。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，VH和VL可以相互缔合，形成抗原结合位点。在一些实施方案中，第一多肽中的scFv和第二多肽中的scFv是相同的。在一些实施方案中，第一多肽中的scFv和第二多肽中的scFv是不同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中D8所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、scFv和第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中D24所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH和scFv。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中D25所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为scFv、第一VHH和第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中D26所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、scFv和两个第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为如图42中D39所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、第二VHH和scFv。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为图42中如D40所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为scFv、两个第一VHH和第二VHH。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为图42中如D41所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。在一些实施方案中，该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、VH、CH1结构域、VL和CL结构域。在一些实施方案中，该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH、VL、CL结构域、VH和CH1结构域。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为图42中如D31所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。在一些实施方案中，该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VH、CH1结构域、VL、CL结构域、第一VHH和第二VHH。在一些实施方案中，该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为VL、CL结构域、VH、CH1结构域、第一VHH和第二VHH。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为图42中如D32所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。在一些实施方案中，该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、VH、CH1结构域、VL、CL结构域和两个第二VHH。在一些实施方案中，该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、VL、CL结构域、VH、CH1结构域和两个第二VHH。CH1结构域和CL结构域可以相互缔合。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是不同的。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为图42中如D33所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为第一VHH、第二VHH和两个第三VHH。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH互不相同。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中有两个是相同的。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中的所有三个都是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为图42或图53D中如D43所示的结构。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含单个多肽或由单个多肽组成。该多肽可以包含或由以下组成，例如，优选地从N-末端到C-末端为两个第一VHH、第二VHH和第三VHH。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH互不相同。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中有两个是相同的。在一些实施方案中，第一VHH、第二VHH和第三VHH中的所有三个都是相同的。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含或组成为图42或图53E中如D44所示的结构。
在一些实施方案中，可以将一个或多个额外的VHH添加到如本文所述的抗原结合蛋白中。在一些实施方案中，可以将一个或多个额外的Fab结构域(包括例如与VL-CL缔合的VH-CH1)添加到如本文所述的抗原结合蛋白中。
在一些实施方案中，VHH、VH或VL可以通过接头肽序列与多肽的N末端或C末端相连。接头肽序列可以相同或不同。可以对每个肽接头序列各自进行优化。接头序列可以具有至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40个或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头具有不超过50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，肽接头具有不超过约30个(诸如不超过25个、20个或15个中的任何一项)氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度约为1～30、1～20、5～30、5～20或5～10个氨基酸。
肽接头可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，可以将源自重链铰链区的序列用作接头。在WO1996/34103中描述了这些序列，WO1996/34103的全部内容通过引用方式并入本文。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:1)和(GGGS)n(SEQ ID NO:2)，其中n为至少或约1、2、3、4或5的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物，以及本领域已知的其他柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包括氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:3)或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，肽接头包括IgG的铰链区，诸如人IgG1的铰链区。在一些实施方案中，肽接头包括氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，肽接头包括源自IgG铰链区，诸如人IgG1铰链区的经修饰序列。例如，可以将IgG铰链区中的一个或多个半胱氨酸氨基酸替换为丝氨酸。在一些实施方案中，肽接头包括氨基酸序列EPKSSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO:6)。
抗原结合位点
抗原结合蛋白可以包含或组成为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个抗原结合位点或抗原结合部分。抗原结合位点指的是蛋白质中能够与抗原特异性结合的功能性结构。抗原结合位点可以由一对VH和VL形成。备选地，抗原结合位点还可以由VHH形成。
如本文所述的抗原结合蛋白可以结合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个表位或抗原。这些表位可以相同或不同。在一些实施方案中，这些表位可以不同，但它们都位于相同抗原中。在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白能结合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12种不同的抗原。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白能与一种或多种免疫检查点分子结合。这些免疫检查点分子是免疫系统的调节因子。在一些实施方案中，免疫检查点分子包括，例如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、TNF受体超家族成员9(4-1BB或CD137)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、LAG-3、T细胞免疫球蛋白和含黏蛋白结构域-3(TIM-3)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、程序性细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、CD40、CD47、CD122、ICOS、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、糖皮质激素诱导性TNFR相关蛋白(GITR)、A2AR、CD278、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、NOX2、VISTA、SIGLEC7或TNF受体超家族成员4(TNFRSF4；或OX40)。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白能结合一种或多种癌症特异性抗原。如本文所用的，术语“癌症特异性抗原”指的是在癌细胞表面上特异性表达的抗原。这些抗原可用于鉴定肿瘤细胞。正常细胞很少表达癌症特异性抗原。一些示例性癌症特异性抗原包括，例如CD20、PSA、PSCA、PD-L1、Her2、Her3、Her1、β-连环蛋白(β-Catenin)、CD19、CEACAM3、EGFR、c-Met、EPCAM、PSMA、CD40、MUC1和IGF1R等。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白能结合一种或多种癌症相关抗原。如本文所用的，术语“癌症相关抗原”指的是在癌细胞上以相对较高水平表达但也可能在正常细胞上以相对较低水平表达的抗原。CD55、CD59、CD46以及许多粘附分子诸如N-钙粘蛋白、VE-钙粘蛋白、NCAM、Mel-CAM、ICAM、NrCAM、VCAM1、ALCAM、MCAM等是癌症相关抗原。虽然癌症特异性抗原和癌症相关抗原都在癌细胞表面上表达，但癌症特异性抗原与癌症相关抗原之间的区别在于，癌症相关抗原也在正常细胞上表达但其表达水平与癌细胞上的水平相比相对较低。相比之下，癌症特异性抗原很少在正常细胞上表达，即使在正常细胞上表达，其量也极低。
在一些实施方案中，癌症抗原包括，例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、突变型热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、存活素(survivin)和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
可以与抗原结合蛋白结合的抗原的非限制性实例进一步包括，例如分化抗原诸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2以及肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达胚胎抗原诸如CEA；过表达癌基因和突变型肿瘤抑制基因诸如p53、Ras、HER2/neu；染色体易位产生的独特肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，诸如EB病毒抗原EBVA以及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大型抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一些实施方案中，细胞表面抗原是免疫效应细胞，诸如T细胞(例如，辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆性T细胞)、B细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞上的抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原是T细胞表面抗原，例如CD3。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白与选自由VEGF、Ang-2、MSLN、GITR和PD-1组成的组中的两种或更多种抗原结合。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白(例如，双特异性抗体)能够将肿瘤细胞募集到免疫细胞(例如，T细胞)并激活该免疫细胞。在一些实施方案中，抗原结合蛋白能增强免疫应答。
在一些实施方案中，将抗原结合蛋白设计成包括靶向癌症抗原的额外抗原结合区。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白可具有源自多种治疗性抗体的抗原结合位点，或者结合与多种治疗性抗体相同的表位或抗原，这些治疗性抗体包括例如阿达木单抗(Adalimumab)、贝洛托舒单抗(Bezlotoxumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、度普利尤单抗(Dupilumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、奥卡利珠单抗(Ocrelizumab)、布达鲁单抗(Brodalumab)、瑞替珠单抗(Reslizumab)、奥拉单抗(Olaratumab)、达雷木单抗(Daratumumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、英夫利西单抗(Infliximab)、奥托萨昔单抗(Obiltoxaximab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、司库奇尤单抗(Secukinumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、纳武单抗(Nivolumab)、阿利西尤单抗(Alirocumab)、依洛尤单抗(Evolocumab)、地努图希单抗(Dinutuximab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、奥妥珠单抗(Obinutuzumab)、布妥昔单抗(Brentuximab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、贝利木单抗(Belimumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、地诺单抗(Denosumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、贝索单抗(Besilesomab)、托珠单抗(Tocilizumab)、卡那奴单抗(Canakinumab)、戈利木单抗(Golimumab)、尤特克单抗(Ustekinumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、依库珠单抗(Eculizumab)、兰尼单抗(Ranibizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、依法利珠单抗(Efalizumab)、伊莫单抗(Ibritumomab)、法索单抗(Fanolesomab)、托西莫单抗(Tositumomab)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、利妥昔单抗(Rituximab)、卡罗单抗(Capromab)、沙妥莫单抗(Satumomab)和莫罗单抗(Muromonab)。
本公开提供了例如抗VEGF抗体、抗ANG-2抗体、抗MSLN抗体、抗GITR抗体、抗PD-1抗体、其修饰抗体、其嵌合抗体和其人源化抗体。这些抗体的抗原结合部分可以用于如本文所述的各种抗原结合蛋白形式。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个与VEGF特异性结合的VHH。与VEGF特异性结合的VHH是本领域已知的，并描述于例如US20170247475A1中，其全部内容都通过引用方式并入本文。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个与Ang-2特异性结合的VHH。与Ang-2特异性结合的VHH是本领域已知的，并描述于例如US20190135907A1中，其全部内容都通过引用方式并入本文。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个与MSLN特异性结合的VHH。与MSLN特异性结合的VHH是本领域已知的，并描述于例如AU2018/265860A1或US20180327508A1中，其全部内容都通过引用方式并入本文。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个与GITR特异性结合的VHH。与GITR特异性结合的VHH是本领域已知的，并描述于例如US10093742B2中，其全部内容都通过引用方式并入本文。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个与PD-1特异性结合的抗原结合位点。与PD-1特异性结合的抗原结合片段是本领域已知的，并描述于例如US2012135408或US8952136B2中，其全部内容都通过引用方式并入本文。
抗原结合蛋白的特性
如本文所述的抗原结合蛋白可包括源自如本文所述的任何抗体(例如，亲本抗体)或其任何抗原结合片段的抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以结合表达如本文所述的各种抗原(例如，VEGF、Ang-2、PD-1、MSLN或GITR)的细胞。
在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白可以增强免疫应答。在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白可以将免疫应答、T细胞(例如，CD3+细胞、CD8+和/或CD4+细胞)的活性或数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白可以诱导T细胞活化。在一些实施方案中，与由同种型对照抗体诱导的T细胞活化水平相比，由本文所述的抗原结合蛋白诱导的T细胞活化水平为至少或约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白在正常细胞(例如，非肿瘤细胞)中或在肿瘤细胞不存在的情况下不会诱导免疫应答。
在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白是拮抗剂。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是激动剂。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白可以与T细胞结合。因此，抗原结合蛋白可以将T细胞募集到靶细胞。在一些实施方案中，抗原结合蛋白可以同时与肿瘤细胞和免疫细胞(例如，T细胞)结合，从而桥接癌细胞与免疫细胞之间的相互作用。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白与如本文所述的抗原特异性结合，其解离速率(koff)小于0.1s-1、小于0.01s-1、小于0.001s-1、小于0.0001s-1或小于0.00001s-1。在一些实施方案中，解离速率(koff)大于0.01s-1、大于0.001s-1、大于0.0001s-1、大于0.00001s-1或大于0.000001s-1。在一些实施方案中，动力学结合速率(kon)大于1x102/Ms、大于1x103/Ms、大于1x104/Ms、大于1x105/Ms或大于1x106/Ms。在一些实施方案中，动力学结合速率(kon)小于1x105/Ms、小于1x106/Ms或小于1x107/Ms。
可以从动力学速率常数的商推导出亲和力(Kd＝koff/kon)。在一些实施方案中，Kd小于1x10-4M、小于1x10-5M、小于1x10-6M、小于1x10-7M、小于1x10-8M、小于1x10-9M或小于1x10-10M。在一些实施方案中，Kd小于50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一些实施方案中，Kd大于1x10-4M、大于1x10-5M、大于1x10-6M、大于1x10-7M、大于1x10-8M、大于1x10-9M、大于1x10-10M、大于1x10-11M或大于1x10-12M。
用于测量抗原结合蛋白对抗原的亲和力的常规技术包括例如ELISA、RIA和表面等离子体共振(SPR)。
在一些实施方案中，将抗原结合蛋白的结合亲和力与亲本抗体(例如，抗原结合蛋白中的抗原结合位点来源于其中的单克隆抗体或纳米抗体)的结合亲和力进行比较。在一些实施方案中，抗原结合蛋白中抗原结合位点的结合亲和力降低不超过10％、20％、30％或40％。
在一些实施方案中，可以使用ELISA来测量结合亲和力。计算出EC50。(1)抗原结合蛋白的EC50与(2)亲本抗体的EC50的结合比率不高于200％、150％、140％、130％、120％、110％或100％。事实上，由于抗原结合蛋白对于同一抗原可能具有多于一个抗原结合位点，因此在一些实施方案中，结合比率小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5或0.4。
在一些实施方案中，测定了热稳定性。如本文所述的抗原结合蛋白具有的Tm可以大于58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。
由于可以将抗原结合蛋白描述为多结构域蛋白，因此熔解曲线有时显示两个转变，存在第一变性温度Tm1和第二变性温度Tm2。这两个峰的存在通常表明两个不同结构域(例如，Fc、Fab和/或VH-VL对)的变性。当存在两个峰时，Tm1指的是随着温度升高的第一个峰。因此，在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白具有的Tm1大于58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白具有的Tm2大于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。在一些实施方案中，Tm、Tm1、Tm2低于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有高度长期稳定性。在一些实施方案中，抗原结合蛋白在约4℃稳定至少约1天、3天、7天、2周、3周、4周或更长时间中的任何一项。在一些实施方案中，抗原结合蛋白在升高的温度具有高度长期稳定性。在一些实施方案中，抗原结合蛋白在室温，例如在约25℃或更高温度稳定至少约1天、3天、7天、2周、3周、4周或更长时间中的任何一项。在一些实施方案中，抗原结合蛋白在生理温度，例如在约37℃或更高温度稳定至少约1天、2天、3天、4天、6天、7天、10天、2周或更长时间中的任何一项。在一些实施方案中，抗原结合蛋白在高浓度(例如，至少或约50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL或更高)具有高度长期稳定性。
稳定的组合物基本上不存在(诸如少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低中的任何一项)沉淀和/或聚集。可以通过光学光谱法检测沉淀。可以通过例如DLS检测聚集。在一些实施方案中，抗原结合蛋白在冻融循环期间具有高度稳定性。在一些实施方案中，可以将包含抗原结合蛋白的组合物冻融至少约3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次中的任何一项，而不会丧失该抗原结合蛋白的结构完整性(例如，形成聚集体)和/或活性。在一些实施方案中，包含抗原结合蛋白的组合物可以在高浓度(例如，至少或约50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL或更高)下冻融。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白或任何抗原结合片段可以将补体依赖性细胞毒性(CDC)增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白或任何抗原结合片段可以将抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白或任何抗原结合片段可以将吞噬作用率增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白或任何抗原结合片段可增强T细胞功能，例如，通过增加效应性T细胞增殖和/或增加效应性T细胞的γ干扰素产生(例如，与用抗原结合蛋白或抗原结合片段处理之前的增殖和/或细胞因子产生相比)。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白或抗原结合片段增强CD4+效应性T细胞功能，例如，通过增加CD4+效应性T细胞增殖和/或增加CD4+效应性T细胞的γ干扰素产生(例如，与用抗原结合蛋白或抗原结合片段处理之前的增殖和/或细胞因子产生相比)。在一些实施方案中，细胞因子是γ干扰素。在一些实施方案中，抗原结合蛋白或抗原结合片段增加瘤内(浸润性)CD4+效应性T细胞的数量(例如，CD4+效应性T细胞总数或例如，CD45+细胞中CD4+细胞的百分比)，例如，与用抗原结合蛋白或抗原结合片段处理之前瘤内(浸润性)CD4+T细胞的数量相比。在一些实施方案中，抗原结合蛋白或抗原结合片段增加表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+效应性T细胞的数量(例如，总的表达γ干扰素的CD4+细胞或例如，总CD4+细胞中表达γ干扰素的CD4+细胞的百分比)，例如，与处理之前表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+T细胞的数量相比。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白增加瘤内(浸润性)CD8+效应性T细胞的数量(例如，CD8+效应性T细胞的总数或例如，CD45+细胞中CD8+细胞的百分比)，例如，与处理之前瘤内(浸润性)CD8+效应性T细胞的数量相比。在一些实施方案中，抗原结合蛋白增加表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+效应性T细胞的数量(例如，总CD8+细胞中表达γ干扰素的CD8+细胞的百分比)，例如，与用抗原结合蛋白处理之前表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+T细胞的数量相比。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白增强记忆性T细胞功能，例如通过增加记忆性T细胞增殖和/或增加记忆细胞的细胞因子(例如γ干扰素)产生。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有功能性Fc区。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应功能是吞噬作用。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应功能是ADCC和吞噬作用。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的Fc区。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白可以诱导细胞凋亡。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白不具有功能性Fc区。例如，抗原结合蛋白是Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白是人源化抗体。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有对称结构。在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有不对称结构。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗原结合蛋白包含2、3、4、5或6个靶向癌症抗原的抗原结合位点(例如，抗原结合Fab结构域、scFV或纳米抗体(VHH))。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗原结合蛋白包含2、3、4、5或6个靶向T细胞特异性抗原(例如，CD3)的抗原结合位点(例如，抗原结合Fab结构域、scFV或纳米抗体(VHH))。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗原结合蛋白包含至少2、3、4、5、6或7条通用轻链。在一些实施方案中，所述至少2、3、4、5、6或7条常见轻链具有相同的VL序列。在一些实施方案中，结合癌症特异性抗原的Fab结构域的C-末端与同一多特异性抗原结合蛋白内相邻的结合癌症特异性抗原的Fab结构域的N-末端相连(例如，共价连接或化学连接)。
本公开内容还提供了与如本文所述的任何抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段交叉竞争的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段。交叉竞争测定是本领域已知的，并描述于例如Moore等人,"Antibody cross-competition analysis of the humanimmunodeficiency virus type 1gp120 exterior envelope glycoprotein."Journal ofvirology 70.3(1996):1863-1872，其全部内容通过引用方式并入本文。一方面，本公开还提供了与如本文所述的任何抗原结合蛋白、任何抗体或抗原结合片段结合相同表位或区域的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段。表位分仓测定是本领域已知的，并描述于例如下列中，即Estep等人,"High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning"MAbs.第5卷第2期Taylor&Francis,2013，其全部内容通过引用方式并入本文。
抗体和抗原结合片段
如本文所述的抗原结合蛋白可以包括如本文所述的各种抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，可以将一个或多个抗原结合位点(例如，VHH和/或VH/VL对)添加到这些抗体或其抗原结合片段中。在一些实施方案中，抗原结合位点可源自如本文所述的这些多种抗体和抗原结合片段。
一般来说，抗体(也称为免疫球蛋白)由两类多肽链，即轻链和重链组成。本公开的非限制性抗体可以是包含两条重链和两条轻链的完整的四免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以属于任何同种型(包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD)或亚同种型(包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等)。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可以包含两个相同拷贝的轻链和/或两个相同拷贝的重链。各自包含一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链通过在其恒定结构域内的二硫键合而相互结合，以形成抗体的“主干”。各自包含一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区)的轻链各通过二硫键合与一条重链结合。每条轻链的可变区与其所结合的重链的可变区对齐。轻链和重链的可变区都包含三个高变区，夹在更保守的框架区(FR)之间。
这些称为互补决定区(CDR)的高变区形成环，其构成抗体的主要抗原结合表面。四个框架区主要采用β层构象，并且CDR形成连接β层结构的环，在某些情况下形成β层结构的一部分。每条链中的CDR通过框架区保持在非常接近的位置，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗原结合区的形成。
通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定抗体CDR区的方法是众所周知的，并且通常使用CDR的多种定义。Kabat定义基于序列变异性，而Chothia定义基于结构性环区域的位置。例如，在下列中描述了这些方法和定义，即Martin,"Protein sequence and structureanalysis of antibody variable domains,"Antibody engineering,Springer BerlinHeidelberg,2001.422-439；Abhinandan等人"Analysis and improvements to Kabat andstructurally correct numbering of antibody variable domains,"Molecularimmunology 45.14(2008):3832-3839；Wu,T.T.和Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132:211-250；Martin等人,Methods Enzymol.203:121-53(1991)；Morea等人,Biophys Chem.68(1-3):9-16(1997年10月)；Morea等人,J Mol Biol.275(2):269-94(1998年1月)；Chothia等人,Nature 342(6252):877-83(1989年12月)；Ponomarenko和Bourne,BMC StructuralBiology 7:64(2007)；Kontermann,R.,&Dübel,S.(编著).(2010).Antibody engineering:第2卷Springer；其中每一项的全部内容都通过引用方式并入本文。在一些实施方案中，CDR根据Kabat定义。在一些实施方案中，CDR根据Chothia定义。在一些实施方案中，CDR是由Kabat、Chothia、AbM、IMGT或contact定义确定的最长的CDR序列。
CDR对于识别抗原的表位很重要。如本文所用的，“表位”是能够由抗体的抗原结合结构域特异性结合的靶分子的最小部分。表位的最小尺寸可以约为三个、四个、五个、六个或七个氨基酸，但这些氨基酸不需要处于抗原一级结构的连续线性序列中，因为表位可能取决于基于抗原二级和三级结构的抗原三维构型。
在一些实施方案中，抗体是完整免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，不同之处在于它们的恒定区，特别是它们的铰链和上部CH2结构域。IgG亚类的序列和差异是本领域已知的，并在例如以下文献中进行了描述，即Vidarsson等人,"IgG subclasses and allotypes:fromstructure to effector functions."Frontiers in immunology 5(2014)；Irani等人,"Molecular properties of human IgG subclasses and their implications fordesigning therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases."Molecular immunology 67.2(2015):171-182；Shakib,Farouk编著,The human IgGsubclasses:molecular analysis of structure,function and regulation.Elsevier,2016；其中每一项的全部内容都通过引用方式并入本文。
抗体也可以是来源于任何物种(例如，人类、啮齿类动物、小鼠、大鼠、骆驼科动物)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体以及包含与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留完整抗体特异性结合活性的抗体一部分，即能够与完整抗体的靶分子上的表位特异性结合的抗体的任何部分。它包括例如Fab、Fab'、F(ab')2以及这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是，例如，scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体，以及包括作为抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括，例如，完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链、或者来自完整抗体重链或轻链的单个CDR。
在一些实施方案中，scFV具有两个重链可变结构域和两个轻链可变结构域。在一些实施方案中，scFV具有两个抗原结合区，并且这两个抗原结合区可以以不同的亲和力结合各自的靶抗原。
在一些实施方案中，抗原结合片段可以形成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是如本文所述的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜和胞内结构域融合而成的融合体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含来自多种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含多个信号传导结构域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以提高效力。因此，一方面，本公开进一步提供了表达如本文所述嵌合抗原受体的细胞(例如，T细胞)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合两种不同的抗原或两种不同的表位。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合三种不同的抗原或三种不同的表位。
Fv片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成，其本质上可以是共价的，例如在scFv中。正是在这种构型下，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上定义抗原结合位点。总体来说，六个CDR或其子集赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单可变结构域(或仅包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)也可能具有识别和结合抗原的能力，尽管通常其亲和力低于整个结合位点。
单链Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区域)，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含位于VH和VL结构域之间的多肽接头，该接头使scFv能够形成用于抗原结合所需的结构。
在一些实施方案中，本文所述的scFv从N-末端到C-末端包含：VH；多肽接头；和VL。在一些实施方案中，本文所述的scFv从N-末端到C-末端包含：VL；多肽接头；和VH。
Fab片段包含轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段，这些Fab片段通常在其羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸共价连接。抗体片段的其他化学偶联物也是本领域已知的。
双链抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一多肽链中的VL相连的VH(VH和VL)。通过使用太短而不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
抗体的多聚化可以通过抗体的天然聚集或者通过本领域已知的化学或重组连接技术来实现。例如，一定百分比的纯化抗体制剂(例如，纯化IgG1分子)会自发形成含有抗体同二聚体和其他更高级抗体多聚体的蛋白聚集体。
线性抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
备选地，抗体同二聚体也可以通过本领域已知的化学键合技术形成。例如，异型双功能交联剂包括但不限于SMCC(琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)和SATA(N-琥珀酰亚胺S-乙酰巯基乙酸酯)，可用于形成抗体多聚体。在以下文献中描述了形成抗体同二聚体的示例性方案，即Ghetie等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:7509-7514,1997)。可以通过胃蛋白酶消化，将抗体同二聚体转化为Fab’2同二聚体。形成抗体同二聚体的另一种方式是通过使用在以下文献中描述的自亲性(autophilic)T15肽，即Zhao等人(J.Immunol.25:396-404,2002)。
可以对本公开的抗体和抗体片段在Fc区进行修饰以提供所需的效应功能或血清半衰期。
本文所述的任何抗体或抗原结合片段都可以与稳定化分子(例如，增加抗体或其抗原结合片段在受试者或溶液中的半衰期的分子)缀合。稳定化分子的非限制性实例包括：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白质(例如，血清白蛋白，诸如人血清白蛋白)。稳定化分子的缀合可以在体外(例如，在组织培养中或作为药物组合物储存时)或体内(例如，在人类中)增加抗体或抗原结合片段的半衰期或延长其生物学活性。
在一些实施方案中，可以将本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，双特异性抗体)与治疗剂缀合。包含抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物可以共价或非共价结合治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂(例如，细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素(dihydroxy anthracin)、美登木素生物碱类诸如DM-1和DM-4、二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表阿霉素和环磷酰胺以及它们的类似物)。
重组载体
本公开还提供了包含本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如，表达载体)、将重组载体导入其中的宿主细胞(即，使得宿主细胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的载体)，以及通过重组技术产生抗原结合蛋白。
如本文所用的，“载体”是指当将载体导入宿主细胞时，能够将一种或多种所关注的多核苷酸递送至该宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够递送一种或多种所关注的多核苷酸并能够在已经将表达载体导入其中的宿主细胞中表达它们作为所编码多肽。因此，在表达载体中，所关注的多核苷酸通过与调节元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位用于在载体中表达，这些调节元件在载体内或在宿主细胞的基因组中，位于所关注的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼，如此使得所关注的多核苷酸将在导入表达载体的宿主细胞中进行翻译。
可以通过本领域已知的方法将载体导入宿主细胞，例如，电穿孔、化学转染(如DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如，使用重组病毒)。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子型凝聚剂结合的DNA或RNA表达载体。
在一些实施方式中，使用病毒表达系统(例如，痘苗病毒或其他痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)导入本文公开的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，这可能涉及使用非致病性(缺陷型)的可复制病毒，或者可以使用复制缺陷型病毒。在后一种情况下，病毒繁殖通常只发生在互补的病毒包装细胞中。例如，在以下文献中公开了合适的系统，即Fisher-Hoch等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321；Flexner等人,1989,Ann.N.Y.Acad Sci.569:86-103；Flexner等人,1990,Vaccine,8:17-21；第4,603,112号、第4,769,330号和第5,017,487号美国专利；WO 89/01973；第4,777,127号美国专利；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner-Biotechniques,6:616-627,1988；Rosenfeld等人,1991,Science,252:431-434；Kolls等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:215-219；Kass-Eisler等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11498-11502；Guzman等人,1993,Circulation,88:2838-2848；以及Guzman等人,1993,Cir.Res.,73:1202-1207。将DNA引入这种表达系统的技术对于本领域普通技术人员来说是众所周知的。DNA也可能是“裸的”，如在以下文献中所描述的那样，即Ulmer等人,1993,Science,259:1745-1749和Cohen,1993,Science,259:1691-1692。可以通过将裸DNA涂覆到可生物降解的微珠上而这些微珠高效地转运到细胞中来提高DNA的摄取。
为了表达，包含本文公开的编码多肽的多核苷酸的DNA插入物可以可操作性地连接于合适的启动子(例如，异源启动子)，诸如λ噬菌体PL启动子，大肠杆菌lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子等等。其他合适的启动子也是技术人员已知的。表达构建体可以进一步包含用于转录起始、终止的位点，并且在转录区域中包含用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录本的编码部分可以包括在待翻译多肽开始处的翻译起始和适当位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可以包括至少一种可选择标志物。此类标志物包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因以及用于大肠杆菌和其他细菌培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞；昆虫细胞，诸如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、人黑色素瘤和HK 293细胞；以及植物细胞。本文所述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。
用于细菌的非限制性载体包括pQE70、pQE60和pQE-9，可从Qiagen获得；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可从Stratagene获得；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可从Pharmacia获得。非限制性真核细胞载体包括pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可从Stratagene获得；以及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，可从Pharmacia获得。其他合适的载体对技术人员来说是容易显而易见的。
适用的非限制性细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR启动子和λPL启动子以及trp启动子。合适的真核生物启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子诸如劳斯肉瘤病毒(RSV)的启动子以及金属硫蛋白启动子诸如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用许多含有组成型或诱导型启动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。对于综述，请参见Ausubel等人,(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.和Grant等人,Methods Enzymol.,153:516-544(1997)。
将构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法来实现。这些方法在许多标准实验室手册中都有描述，诸如Davis等人,Basic Methods In Molecular Biology(1986)，其全部内容通过引用方式并入本文。
可以通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核生物对编码本公开的抗原结合蛋白的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常为约10至300bp，在给定的宿主细胞类型中起到增加启动子转录活性的作用。增强子的实例包括位于复制起点后侧第100至270碱基对处的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。
为了将所翻译的蛋白质分泌到内质网腔中、周质空间中或细胞外环境中，可以将适当的分泌信号引入所表达的多肽中。信号可以是对多肽而言的内源性信号或者它们可以是异源信号。
蛋白复合物(例如，抗原结合蛋白)可以以修饰形式表达，诸如融合蛋白(例如，GST融合体)或带有组氨酸标签，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括额外的异源功能区。例如，在纯化过程中，或者在后续的处理和储存过程中，可以在多肽的N-末端添加额外的氨基酸区域，特别是带电氨基酸，以提高在宿主细胞中的稳定性和持久性。同样，可以将肽部分添加到多肽中以促进纯化。可以在最终制备多肽之前去除这类区域。将肽部分添加到多肽中以引起分泌或排出、提高稳定性和促进纯化等是本领域中熟悉的常规技术。
本公开还提供了与如本文所述的任何核苷酸序列存在至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列，以及与如本文所述的任何氨基酸序列存在至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的核酸序列，以及与如本文所述的任何氨基酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开涉及编码本文所述任何肽的核苷酸序列，或者由如本文所述任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸序列小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500个或600个核苷酸。在一些实施方案中，氨基酸序列小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350个或400个氨基酸残基。
在一些实施方案中，氨基酸序列(i)包含以下氨基酸序列；或者(ii)由以下氨基酸序列组成，其中该氨基酸序列是如本文所述序列中的任何一种。
在一些实施方案中，核酸序列(i)包含以下核酸序列；或者(ii)由以下核酸序列组成，其中该核酸序列是如本文所述序列中的任何一种。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，将序列进行比对以达到最佳比较目的(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以实现最佳比对)。然后再比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的某个位置由与第二序列中相应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则在此位置处的分子是相同的。两个序列之间的同一性百分比是由序列共有的相同位置数量的函数，同时要考虑到空位的数量和每个空位的长度，为了实现两个序列的最佳比对，需要引入这些空位。例如，序列比较和确定两个序列之间的同一性百分比可以使用Blossum 62评分矩阵来完成，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移框空位罚分为5。
还可以确定序列同源性(例如，氨基酸序列同源性或核酸同源性)的百分比。如何确定序列同源性的百分比是本领域已知的。在一些实施方案中，具有相似物理化学性质的保守氨基酸残基(同源性百分比)，例如亮氨酸和异亮氨酸，可用于测量序列相似性。本领域已经定义了具有相似物理化学性质的氨基酸残基家族。这些家族包括例如具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在许多情况下，同源性百分比高于同一性百分比。
制备抗原结合蛋白的方法
如本文所述的抗原结合蛋白可具有源自如本文所述的抗体的抗原结合位点或任何部分。分离的蛋白质或其片段可用作免疫原以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术生成抗体。通过多次注射(例如，皮下注射或腹膜内注射)抗原肽或抗原蛋白，可以在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或抗原蛋白与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，抗原肽或抗原蛋白可以与在待免疫物种中具有免疫原性的作用剂缀合。可以给动物注射多于一次(例如，两次、三次或四次)的抗原肽或抗原蛋白。
免疫原通常用于通过免疫合适的受试者(例如，人类或表达至少一种人免疫球蛋白基因座的转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以包含例如重组表达的多肽或化学合成的多肽。该制剂可进一步包括佐剂，诸如弗氏完全佐剂或不完全佐剂，或者类似的免疫刺激剂。
多克隆抗体可以如上所述通过用多肽或其抗原肽(例如，蛋白质的一部分)作为免疫原对合适的受试者进行免疫来制备。可以通过标准技术，诸如使用固定化多肽或肽的酶联免疫吸附测定法(ELISA)，随时间变化监测所免疫受试者中的抗体滴度。如需要，可以将抗体分子从哺乳动物(例如，从血液)中分离出来，并通过众所周知的技术诸如蛋白A或蛋白G层析进一步纯化，以获得IgG级分。在免疫后的适当时间，例如当特异性抗体滴度最高时，可从受试者中获得抗体产生细胞，并用于通过标准技术，诸如最初由Kohler等人(Nature256:495-497,1975)描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunol.Today4:72,1983)、EBV杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页,1985)或三源杂交瘤技术来制备单克隆抗体。用于产生杂交瘤的技术是众所周知的(一般来说，参见Current Protocols in Immunology,1994,Coligan等人(编著),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养上清液中结合所关注的多肽或表位的抗体来检测，例如，使用标准ELISA测定法。
VHH也可以获自天然或经设计的合成的美洲驼VHH文库，或者获自抗体工程。可以获得来自美洲驼的PBMC，并且可以分离出RNA以通过逆转录生成cDNA。然后，可以通过PCR扩增VHH基因并将其克隆到噬菌体展示载体中以构建天然VHH文库。合成(例如，人源化)VHH文库可以通过将由重叠PCR生成的改组的VHH CDR1、CDR2和CDR3引入经修饰的人VH支架中来制备，以生成更强的多样性并保持低免疫原性。然后可以针对抗原对VHH文库进行淘选以获得具有所需结合亲和力的VHH。
各种VHH、VH和VL可用于制备如本文所述的多特异性抗体。VHH、VH和VL的序列可以获自例如US 2017/0247475A1、US2019/0135907A1、US20180327508A1、US10093742B2、US201213540，其中每一项的全部内容都通过引用方式并入本文。
本文所述抗体或抗原结合片段的变体可通过将适当的核苷酸变化引入编码本文所述的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或者其抗原结合片段的DNA中来制备，或者通过肽合成来制备。此类变体包括例如构成抗体的抗原结合位点或抗原结合结构域的氨基酸序列内残基的缺失、插入或置换。在此类变体的群体中，一些抗体或抗原结合片段对靶蛋白的亲和力提高。可以进行缺失、插入和/或置换的任何组合，以获得对靶标具有更高结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入抗体或抗原结合片段中的氨基酸变化也可以改变或引入新的翻译后修饰到抗体或抗原结合片段中，诸如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量、改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列，使得通过细胞中存在的酶附接不同的糖)或引入新的糖基化位点。
本文公开的抗体可来源于任何动物物种，包括哺乳动物。天然抗体的非限制性实例包括源自人类、灵长类动物例如猴和猿类、牛、猪、马、绵羊、骆驼科动物(例如，骆驼和美洲驼)、鸡、山羊和啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠和兔)，包括经基因工程改造以产生人源抗体的转基因啮齿类动物的抗体。
噬菌体展示(淘选)可用于优化具有所需结合亲和力的抗体序列。在该技术中，可以将编码单链Fv(包含VH或VL)的基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使该噬菌体在其外部“展示”scFv，同时在其内部包含蛋白质基因，从而在基因型和表型之间建立联系。然后可以针对靶抗原筛选这些展示噬菌体，以便检测所展示的抗原结合位点与该靶抗原之间的相互作用。因此，可以在称为体外选择的过程中筛选和扩增大型蛋白质文库，并可以获得具有所需结合亲和力的抗体序列。
人抗体和人源化抗体包括具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(或者具有与源自人类种系免疫球蛋白序列的氨基酸序列相同的氨基酸序列)的抗体。人抗体可以包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。
人源化抗体通常具有移植有非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗体具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸序列。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变结构域。人源化基本上可以通过例如用啮齿类动物CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列来进行。在例如以下文献中描述了这些方法，即Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)；其中每一项的全部内容都通过引用方式并入本文。相应地，“人源化”抗体是这样的嵌合抗体，其中已将远少于完整的人V结构域替换为来自非人类物种的相应序列。在实践中，人源化抗体通常是小鼠抗体，其中将一些CDR残基和一些FR残基替换为来自人抗体中类似位点的残基。
进一步地重要的是，对抗体进行人源化，同时保留对抗原的高特异性和亲和力以及其他有利的生物学特性。为实现这一目标，可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可用的并且为本领域技术人员所熟悉。可以利用计算机程序来说明和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。对这些显示物的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从接受序列和输入序列中选择FR残基并进行组合，从而实现所需的抗体特性，诸如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。
相对于原始序列而言的同一性或同源性通常是在对齐序列并引入空位(如果有必要的话)以获得最大的序列同一性百分比之后，候选序列内存在的与人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或者片段内存在的序列相同的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守性置换视为序列同一性的一部分。
在一些实施方案中，可以对如本文所述的抗原结合蛋白进行共价修饰。这些共价修饰可以通过化学或酶促合成，或者通过酶促或化学裂解来进行。通过使抗原结合蛋白的所靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或者N-末端或C-末端残基发生反应的有机衍生剂进行反应，将抗原结合蛋白的其他类型共价修饰引入分子中。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白来源于抗体变体。在一些实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，该碳水化合物结构缺乏附接(直接或间接)到Fc区的岩藻糖。例如，这种抗原结合蛋白中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。例如，如WO 2008/077546中所述采用MALDI-TOF质谱法测量，通过计算相对于附接到Asn 297的所有糖结构(例如，复杂、杂合和高甘露糖结构)的总和的Asn297处糖链内岩藻糖的平均量，来测定岩藻糖的量。Asn297指的是位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(对Fc区残基进行Eu编号；或者Kabat编号中的第314位)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可能位于297位的上游或下游约±3个氨基酸，即294位至300位。这种岩藻糖基化变体可能具有更强的ADCC功能。在一些实施方案中，为降低多糖异质性，可进一步工程化改造Fc区，将297位的天冬酰胺替换为丙氨酸(N297A)。
在一些实施方案中，为了通过避免Fab臂交换来提高生产效率，进一步工程化改造Fc区以将IgG4的228位(EU编号)丝氨酸替换为脯氨酸(S228P)。例如，在以下文献中描述了关于S228突变的详细说明，即Silva等人"The S228Pmutation prevents in vivo and invitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novelquantitative immunoassays and physiological matrix preparation."Journal ofBiological Chemistry 290.9(2015):5462-5469，其全部内容通过引用方式并入。
在一些实施方案中，可以通过对一对重链多肽之间的界面(例如，在恒定结构域处)进行工程化改造来制备多特异性抗原结合蛋白，以最大限度地提高从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比。例如，界面可以包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，将来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。在第二抗体分子的界面上创建与一个或多个大侧链大小相同或相似的补偿性“内腔”，其通过将大氨基酸侧链替换为较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)。这提供了一种提高异二聚体而不是其他不想要的终产物诸如同二聚体的产量的机制。例如在WO 96/27011中描述了这种方法，其全部内容通过引用方式并入。虽然对Fc区进行了修饰，但本公开还表明该修饰与把手入孔(knobs-in-holes)相容。“把手入孔”方法在一条重链中引入一个具有大侧链的氨基酸突变，并在另一条重链中引入一个具有小侧链的氨基酸突变。因此，相同的重链不太可能相互缔合，而两条不同的重链相互结合的可能性较大。例如，在以下文献中描述了“把手入孔”方法，即Ridgway,John BB,Leonard G.Presta和Paul Carter."‘Knobs-into-holes’engineering of antibody CH3 domains forheavy chain heterodimerization."Protein Engineering,Design and Selection 9.7(1996)，其全部内容都通过引用方式并入本文。
在一些实施方案中，置换了IgG的CH3部分中的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，一条重链具有一个或多个以下置换Y349C和T366W。另一条重链可以具有一个或多个以下置换E356C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，一条重链具有T366Y、T366W、T366W/D399C、T366W/K392C、S354C/T366W、Y349C/T366W、E356C/T366W、Y349C/T366W、E357C/T366W或Y349C/T366W(把手)置换，并且另一条重链具有Y407T、T366S/L368A/Y407V、T366S/L368A/K392C/Y407V、T366S/D399C/L368A/Y407V、Y349C/T366S/L368A/Y407V、S354C/T366S/L368A/Y407V、Y349C/T366S/L368A/Y407V、E356C/T366S/L368A/Y407V、Y349C/T366S/L368A/Y407V或E357C/T366S/L368A/Y407V(孔)置换(EU编号)。在一些实施方案中，一个或多个置换选自Y349C、T366W、T366S、T366Y、S354C、E356C、E357C、T366S、L368A、K392C、D399C、Y407V和Y407T。例如，在US8216805B2中描述了一些把手入孔突变，其通过引用方式并入本文。
可以使用各种分子生物学技术构建编码各种抗原结合蛋白的序列。在一些实施方案中，可以将序列克隆到表达载体(例如，pcDNA3.3)中。可以用所构建的能够表达抗原结合蛋白的质粒转染细胞(例如，Expi293)。然后可以培养所转染的细胞，并可以收集上清液用于蛋白质纯化。
在一些实施方案中，可以通过使用蛋白A层析来纯化抗原结合蛋白。获得的抗原结合蛋白可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和/或高效液相色谱以及随后的尺寸排阻色谱(HPLC-SEC)进一步分析。
本公开证明了如本文所述的抗原结合蛋白可以易于表达和纯化。在一些实施方案中，通过蛋白A层析纯化抗原结合蛋白。通过蛋白A层析纯化后，产率可以为至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450或500mg/L。抗原结合蛋白的纯度可以是至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，例如通过HPLC-SEC分析的。
治疗方法
本文所述的方法包括用于治疗多种病症的方法。总体来说，该方法包括将治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白施用于需要或已确定为需要这种治疗的受试者。在一些实施方案中，病症为癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、中枢神经系统疾病、代谢性疾病等。
如在此上下文中所用的，“治疗”意指改善病症的至少一种症状。在一些实施方案中，病症是癌症。通常，癌症会导致死亡；因此，治疗可以延长预期寿命(例如，延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或者延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年)。施用治疗有效量的本文所述的用于治疗与癌症相关的病况的药剂会引起癌细胞数量减少和/或症状缓解。
如本文所用的，术语“癌症”指的是具有自主生长能力的细胞，即以快速增殖细胞生长为特征的异常状态或状况。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭性阶段如何。如本文所用的术语“肿瘤”指的是癌性细胞，例如大量癌性细胞。可以使用本文所述的方法治疗或诊断的癌症包括各种器官系统的恶性肿瘤，诸如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和生殖泌尿道的恶性肿瘤，以及腺癌，其包括恶性肿瘤，诸如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌。在一些实施方案中，将本文所述的药剂设计成用于治疗或诊断受试者中的癌症。术语“癌”是本领域公认的并且指的是上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠道系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾癌或黑色素瘤。示例性癌包括由宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈部、结肠和卵巢的组织形成的癌。该术语还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌瘤性组织和肉瘤样组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”指的是来源于腺体组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的，并且指的是间充质来源的恶性肿瘤。
一方面，本公开还提供了用于治疗受试者中的癌症的方法、降低受试者中肿瘤体积随时间增大的速率的方法、减少发生转移的风险的方法或者降低受试者中发生其他转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以阻止、减缓、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可以引起受试者中癌症的一种或多种症状的数量、严重程度和/或持续时间的降低。
一方面，本公开的特征在于包括将治疗有效量的本文公开的抗原结合片段施用于有此需要的受试者的方法，该受试者为例如患有或者经鉴定或诊断为患有癌症的受试者，这些癌症例如乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系统恶性肿瘤。
如本文所用的，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述根据本发明的方法向其提供治疗的动物、人类或非人类。本发明考虑了兽医和非兽医应用。人类患者可以是成年人或未成年人(例如，未满18岁的人)。除了人类之外，患者还包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类动物。例如，包括非人灵长类动物(如猴、黑猩猩、大猩猩以及诸如此类)、啮齿类动物(如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔形目动物、猪科动物(如猪、小型猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物以及其他家养动物、农场动物和动物园动物。
在一些实施方案中，癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或者转移性激素难治性前列腺癌。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，癌症是头颈部的鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。在一些实施方案中，受试者患有霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者患有三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、尿路上皮癌、Merkel细胞癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、血液系统恶性肿瘤尤其是非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病或晚期实体瘤。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗处于癌症风险中的患者。可以用本领域已知的各种方法鉴定患有癌症的患者。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗处于自身免疫性疾病风险中的患者。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗感染，例如病毒感染或细菌感染。
如本文所用的，所谓“有效量”意指足以实现有益或预期结果的量或剂量，包括阻止、减缓、延缓或抑制癌症的进展。有效量将根据例如待向其施用抗原结合蛋白的受试者的年龄和体重、症状的严重程度和施用途径而变化，因此可以在个体基础上确定施用。
有效量可以在一次或多次施用中进行。举例来说，抗原结合蛋白的有效量是足以缓解、阻止、稳定、逆转、抑制、减缓和/或延迟患者中自身免疫性疾病或癌症的进展的量，或者是在体外足以缓解、阻止、稳定、逆转、减缓和/或延迟细胞(例如，活检细胞、本文所述的任何癌细胞或细胞系(例如，癌细胞系))增殖的量。
可以根据经验确定用于施用本文公开的抗原结合蛋白的有效量和时间表，并且进行此类确定在本领域技术范围内。本领域技术人员会理解的是，必须施用的剂量将根据例如下列因素而变化，即，将接受本文公开的抗原结合蛋白的哺乳动物、施用途径、抗原结合蛋白的具体类型和/或所用的本文公开的组合物以及向哺乳动物施用的其他药物。
有效量的抗原结合蛋白的典型每日剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。
在本文所述的任何方法中，可以每周至少一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次或每天三次)向受试者施用本文所述的至少一种抗原结合蛋白或药物组合物和任选的至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，将至少两种不同的抗原结合蛋白在同一组合物(例如，液态组合物)中施用。在一些实施方案中，将至少一种抗原结合蛋白和至少一种另外的治疗剂在同一组合物(例如，液态组合物)中施用。在一些实施方案中，将至少一种抗原结合蛋白和至少一种另外的治疗剂在两种不同的组合物(例如，含有至少一种抗原结合蛋白的液态组合物和含有至少一种另外的治疗剂的固态口服组合物)中施用。在一些实施方案中，将至少一种另外的治疗剂以丸剂、片剂或胶囊剂的形式施用。在一些实施方案中，将至少一种另外的治疗剂以缓释口服制剂的形式施用。
在一些实施方案中，可以在施用至少一种抗原结合蛋白之前或之后将一种或多种另外的治疗剂施用于受试者。在一些实施方案中，将一种或多种另外的治疗剂和至少一种抗原结合蛋白施用于受试者，使得在该受试者中一种或多种另外的治疗剂和至少一种抗原结合蛋白的生物活性期存在重叠。
在一些实施方案中，可以将一种或多种另外的治疗剂施用于受试者。另外的治疗剂可以包括一种或多种选自于由下列组成的组中的抑制剂：B-Raf的抑制剂、EGFR抑制剂、MEK的抑制剂、ERK的抑制剂、K-Ras的抑制剂、c-Met的抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)的抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂、Akt的抑制剂、mTOR的抑制剂、PI3K/mTOR双重抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂以及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)的抑制剂(例如，艾卡哚司他(epacadostat))。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包括一种或多种选自于由下列组成的组中的抑制剂：HER3的抑制剂、LSD1的抑制剂、MDM2的抑制剂、BCL2的抑制剂、CHK1的抑制剂、活化刺猬蛋白信号传导通路的抑制剂以及选择性降解雌激素受体的作用剂。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包括一种或多种选自于由下列组成的组中的治疗剂：曲贝替定(Trabectedin)、白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、特伯纳尼(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕博西尼(Palbociclib)、依维莫司(everolimus)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)、IFL、瑞格菲尼(regorafenib)、里奥溶素(Reolysin)、力比泰(Alimta)、色瑞替尼(Zykadia)、索坦(Sutent)、坦罗莫司(temsirolimus)、阿昔替尼(axitinib)、依维莫司(everolimus)、索拉非尼(sorafenib)、维全特(Votrient)、帕唑帕尼(Pazopanib)、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、长春碱(vinblastine)、沙利度胺(Thalomid)、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺(lenalidomide)、氮杂胞苷(azacytidine)、来那度胺(lenalidomide)、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)和恩扎妥林(enzastaurin)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包括一种或多种选自于由下列组成的组中的治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择素激动剂。
在一些实施方案中，将卡铂、白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞(pemetrexed)、吉西他滨(gemcitabine)、FOLFOX或FOLFIRI施用于受试者。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体或抗GITR抗体。
药物组合物和施用途径
本文还提供了包含至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)本文所述的抗原结合蛋白的药物组合物。本文所述的任何抗原结合蛋白中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物组合物中。药物组合物可以以本领域已知的任何方式配制。
配制药物组合物以与其拟用的施用途径(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)相容。组合物可以包括无菌稀释剂(例如，无菌水或盐水)、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂、抗细菌剂或抗真菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞以及诸如此类、抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂诸如乙二胺四乙酸、缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和等渗剂诸如糖类(例如，葡萄糖)、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)或盐类(例如，氯化钠)或者其任意组合。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载剂(参见，例如第4,522,811号美国专利)。可以配制组合物的制剂并将其封装在安瓿、一次性注射器或多剂小瓶中。在必要时(例如，如在可注射制剂中)，可以通过例如使用包衣(如卵磷脂)或表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过加入延迟吸收的作用剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，来延长治疗剂的吸收。备选地，控制释放可以通过植入物和微囊化递送系统来实现，其中可以包括可生物降解的生物相容性聚合物(例如，乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐类、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯类和聚乳酸；AlzaCorporation和Nova Pharmaceutical,Inc.)。
可以将含有本文所述的任何抗原结合蛋白中的一种或多种的组合物配制成剂量单位形式(即，含有预定数量活性化合物的物理上离散单位，便于施用和剂量均匀性)用于胃肠外(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)施用。
可以在细胞培养物或实验动物(例如，猴)中通过标准药物规程来确定组合物的毒性和疗效。可以确定LD50(半数致死剂量)和ED50(半数治疗有效剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比值。优选表现出高治疗指数的药剂。当药剂表现出不期望的副作用时，应注意最大限度地减少潜在损害(即，减少不想要的副作用)。还可以通过其他标准药物规程来确定毒性和治疗功效。
可以将药物组合物与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。本公开还提供了制备抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段或者抗体-药物缀合物的方法，用于如本文所述的各种用途。
实施例
在以下实施例中进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例1：材料和方法
下表列出了实施例中使用的材料。
表1.
多特异性抗体的生成
按照分子生物学方案构建编码多特异性抗体的序列。靶向VEGF的VHH序列从VEGFBII0038获得，如US 2017/0247475A1中所述。靶向Ang-2的VHH序列从VHH 00938获得，如US2019/0135907A1中所述。靶向MSLN的VHH序列从MH6T获得，如AU2018/265860A1或US20180327508A1中所述。靶向GITR的VHH序列从hzC06获得，如US10093742B2中所述。靶向PD-1的VH和VL序列从MK-3475获得，如US2012135408中所述。这些序列和前述申请中的其他序列通过引用方式整体并入本文。然后将该序列克隆到经修饰的pcDNA3.3表达载体中。用所构建的可以表达多特异性抗体的质粒转染Expi293细胞。然后将所转染的细胞培养5天，并收集上清液以使用蛋白A柱(GE Healthcare,货号175438)进行蛋白纯化。获得的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效液相色谱以及随后的尺寸排阻色谱(HPLC-SEC)进行分析，然后在-80℃储存。
通过HPLC-SEC纯化多特异性抗体
收集表达抗体的Expi293细胞(Thermo Fisher Scientific,货号A14635)的上清液，然后进行过滤并使用蛋白A柱(GE Healthcare,货号175438)进行蛋白纯化。根据280nm处的吸光度测量所纯化抗体的浓度。分别通过SDS-PAGE和HPLC-SEC测试多特异性抗体的大小和纯度。然后将所纯化的抗体在-80℃储存。
通过ELISA测定靶标结合
对于酶联免疫吸附测定(ELISA)，将未经处理(通过组织培养)的平底96孔板(NuncMaxiSorpTM,Thermo Fisher Scientific)在4℃用适当浓度(0.25mg/ml或0.2mg/ml)的人靶蛋白预包被过夜。在用2％牛血清白蛋白(BSA)封闭后，将100μL 100nM至0.00128nM 5倍滴定抗体吸取到每个孔中，并在环境温度孵育2小时。去除未结合物质后，将100μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG(Bethyl Laboratories,Inc.,货号A80-304P)加入孔中，并孵育1小时。通过分别加100μL TMB底物在每个孔中显色，然后通过加入100μL 2MHCl终止显色。使用微孔板分光光度计(M5e)测量450nm和540nm处的吸光度值。
通过差示扫描荧光法(DSF)测定热稳定性
使用QuantStudioTM 7Flex实时PCR系统(Applied Biosystems)测定抗体的熔解温度(Tm)。具体而言，将19μL抗体溶液与1μL 80×SYPRO橙染料溶液(Invitrogen)混合，然后将混合物转移至96孔板(Biosystems)中。以0.9℃/分钟的速率将该板从26℃加热到95℃，并收集由此所得的荧光数据。计算出荧光变化相对于不同温度的负导数，并将最大值定义为熔解温度Tm。备选地，如果一种蛋白质显示出多个去折叠转变，则将前两个Tm值计算为Tm1和Tm2。数据收集和Tm计算由操作软件(QuantStudioTM实时PCR软件v1.3)自动进行。
实施例2：多特异性抗体
设计了七种靶向VEGF和Ang-2的多特异性抗体，其结构示意图如图1B-1H所示。T1和U1分别代表靶向VEGF和Ang-2的VHH。将多特异性抗体分别命名为W366001-T1U1.F82-1.uIgG4V1(或“F82”)、W366001-T1U1.F83-1.uIgG4V1(或“F83”)、W366001-U1T1.F84-1.uIgG4V1(或“F84”)、W366001-U1T1.G1-1.uIgG4V1(或“G1”)、W366001-U1T1.G32-1.uIgG4V1(或“G32”)、W366001-U1T1.G33-1.uIgG4V1(或“G33”)和W366001-U1T1.H9-1.uIgG4V1(或“H9”)。
通过蛋白A柱纯化多特异性抗体。如果样品的纯度低于90％，则通过HPLC-SEC纯化进一步纯化样品。测定纯化后的产量和纯度。通过DSF测定熔解温度(例如，Tm1和/或Tm2)。还进行了ELISA以确定与靶标的结合亲和力。计算出EC50并将其与亲本抗体进行比较。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是单价的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的单价亲本抗体。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是多价(例如，二价)的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的二价亲本抗体。还测定了每种多特异性抗体相对于亲本抗体的结合比(EC50比)。结果汇总在下表中。
表2.
a)F82
多特异性抗体F82的结构示意图如图1B所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的F82。如图2A所示，结果表明F82抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图2B所示，其中观察到单个主峰。F82抗体的最终纯度确定为94.55％。另外，基于图2C所示的熔解曲线，F82的Tm1值确定为61.6℃。
另外，通过ELISA测量F82与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图2D和图2E所示。F82与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.139μg/ml和0.026μg/ml。
b)F83
多特异性抗体F83的结构示意图如图1C所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的F83。如图3A所示，结果表明F83抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图3B所示，其中观察到单个主峰。F83抗体的最终纯度确定为93.18％。另外，基于图3C所示的熔解曲线，F83的Tm1和Tm2值分别确定为61.8℃和67.2℃。
通过ELISA测量F83与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图3D和图3E所示。F83与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.122μg/ml和0.041μg/ml。
c)F84
多特异性抗体F84的结构示意图如图1D所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的F84。如图4A所示，结果表明F84抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图4B所示，其中观察到单个主峰。F84抗体的最终纯度确定为95.27％。另外，基于图4C所示的熔解曲线，F84的Tm1值确定为61.1℃。
通过ELISA测量F84与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图4D和图4E所示。F84与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.222μg/ml和0.026μg/ml。
d)G1
多特异性抗体G1的结构示意图如图1E所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的G1。如图5A所示，结果表明G1抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图5B所示，其中观察到单个主峰。G1抗体的最终纯度确定为97.99％。另外，基于图5C所示的熔解曲线，G1的Tm1值确定为61.8℃。
通过ELISA测量G1与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图5D和图5E所示。G1与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.016μg/ml和0.030μg/ml。
e)G32
多特异性抗体G32的结构示意图如图1F所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的G32。如图6A所示，结果表明G32抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图6B所示，其中观察到单个主峰。G32抗体的最终纯度确定为98.31％。另外，基于图6C所示的熔解曲线，G32的Tm1值确定为58.5℃。
通过ELISA测量G32与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图6D和图6E所示。G32与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.017μg/ml和0.023μg/ml。
f)G33
多特异性抗体G33的结构示意图如图1G所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的G33。如图7A所示，结果表明G33抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图7B所示，其中观察到单个主峰。G33抗体的最终纯度确定为92.54％。另外，基于图7C所示的熔解曲线，G33的Tm1值确定为61.1℃。
通过ELISA测量G33与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图7D和图7E所示。G33与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.016μg/ml和0.021μg/ml。
g)H9
多特异性抗体H9的结构示意图如图1H所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的H9。如图8A所示，结果表明H9抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图8B所示，其中观察到单个主峰。H9抗体的最终纯度确定为99.33％。另外，基于图8C所示的熔解曲线，H9的Tm1值确定为58.5℃。
通过ELISA测量H9与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图8D和图8E所示。H9与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.017μg/ml和0.020μg/ml。
实施例3：靶向VEGF和Ang-2的多特异性抗体
设计了六种靶向VEGF和Ang-2的多特异性抗体，其结构示意图如图9A-9F所示。T1和U1分别代表靶向VEGF和Ang-2的VHH。将多特异性抗体分别命名为W366001-T1U1.E32-1.uIgG4V1(或“E32”)、W366001-U1T1.G44-1.uIgG4V1(或“G44”)、W366001-U1T1.G45-1.uIgG4V1(或“G45”)、W366001-U1T1.G46-1.uIgG4V1(或“G46”)、W366001-U1T1.H14-1.uIgG4V1(或“H14”)和W366001-U1T1.H6-1.uIgG4V1(或“H6”)。
通过蛋白A柱纯化多特异性抗体。如果样品的纯度低于90％，则通过HPLC-SEC纯化进一步纯化样品。测定纯化后的产量和纯度。通过DSF测定熔解温度(例如，Tm1和/或Tm2)。还进行了ELISA以确定与靶标的结合亲和力。计算出EC50并将其与亲本抗体进行比较。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是单价的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的单价亲本抗体。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是多价(例如，二价)的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的二价亲本抗体。还测定了每种多特异性抗体相对于亲本抗体的结合比(EC50比)。结果汇总在下表中。
表3.
a)E32
多特异性抗体E32的结构示意图如图9A所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的E32。如图10A所示，在所纯化的E32抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图10B所示，其中观察到单个主峰。E32抗体的最终纯度确定为91.71％。另外，基于图10C所示的熔解曲线，E32的Tm1值确定为63.3℃。
通过ELISA测量E32与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图10D和图10E所示。E32与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.161μg/ml和0.064μg/ml。
b)G44
多特异性抗体G44的结构示意图如图9B所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的G44。如图11A所示，在所纯化的G44抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图11B所示，其中观察到单个主峰。G44抗体的最终纯度确定为91.31％。另外，基于图11C所示的熔解曲线，G44的Tm1值确定为62.5℃。
通过ELISA测量G44与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图11D和图11E所示。G44与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.204μg/ml和0.055μg/ml。
c)G45
多特异性抗体G45的结构示意图如图9C所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的G45。如图12A所示，在所纯化的G45抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图12B所示，其中观察到单个主峰。G45抗体的最终纯度确定为86.36％。另外，基于图12C所示的熔解曲线，G45的Tm1值确定为62.6℃。
通过ELISA测量G45与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图12D和图12E所示。G45与VEGF结合的EC50值确定为0.113μg/ml。
d)G46
多特异性抗体G46的结构示意图如图9D所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的G46。如图13A所示，在所纯化的G46抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图13B所示，其中观察到单个主峰。G46抗体的最终纯度确定为86.98％。另外，基于图13C所示的熔解曲线，G46的Tm1值确定为63.1℃。
通过ELISA测量G46与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图13D和图13E所示。G46与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.288μg/ml和0.047μg/ml。
e)H14
多特异性抗体H14的结构示意图如图9E所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的H14。如图14A所示，结果表明H14抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图14B所示，其中观察到单个主峰。H14抗体的最终纯度确定为92.27％。另外，基于图14C所示的熔解曲线，H14的Tm1值确定为63.1℃。
通过ELISA测量H14与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图14D和图14E所示。H14与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.020μg/ml和0.022μg/ml。
f)H6
多特异性抗体H6的结构示意图如图9F所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的H6。如图15A所示，结果表明H6抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图15B所示，其中观察到单个主峰。H6抗体的最终纯度确定为99.07％。另外，基于图15C所示的熔解曲线，H6的Tm1值确定为61.5℃。
通过ELISA测量H6与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图15D和图15E所示。H6与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.020μg/ml和0.015μg/ml。
实施例4：靶向VEGF和PD-1的多特异性抗体
设计了八种靶向VEGF和PD-1的多特异性抗体，其结构示意图如图16A-16H所示。T1代表靶向VEGF的VHH。U12代表靶向PD-1的Fab结构域。将多特异性抗体分别命名为W366002-U12T1.E28-1.uIgG4V1(或“E28”)、W366002-T1U12.F43-1.uIgG4V1(或“F43”)、W366002-U12T1.F85R-1.uIgG4V1(或F85R)、W366002-U12T1.F45R-1.uIgG4V1(或“F45R”)、W366002-U12T1.G58-1.uIgG4V1(或“G58”)、W366002-T1U12.H27-1.uIgG4V1(或“H27”)、W366002-T1U12.H22-1.uIgG4V1(或“H22”)和W366002-T1U12.G47-1.uIgG4V1(或“G47”)。
通过蛋白A柱纯化多特异性抗体。如果样品的纯度低于90％，则通过HPLC-SEC纯化进一步纯化样品。测定纯化后的产量和纯度。通过DSF测定熔解温度(例如，Tm1和/或Tm2)。还进行了ELISA以确定与靶标的结合亲和力。计算出EC50并将其与亲本抗体进行比较。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是单价的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的单价亲本抗体。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是多价(例如，二价)的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的二价亲本抗体。还测定了每种多特异性抗体相对于亲本抗体的结合比(EC50比)。结果汇总在下表中。
表4.
a)E28
多特异性抗体E28的结构示意图如图16A所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的E28。如图17A所示，结果表明E28抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图17B所示，其中观察到单个主峰。E28抗体的最终纯度确定为97.85％。另外，基于图17C所示的熔解曲线，E28的Tm1和Tm2值分别确定为63.4℃和70.0℃。
另外，通过ELISA测量E28与VEGF和PD-1的结合能力，并且结果分别如图17D和图17E所示。E28与VEGF和PD-1结合的EC50值分别确定为0.056μg/ml和0.154μg/ml。
b)F43
多特异性抗体F43的结构示意图如图16B所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的F43。如图18A所示，结果表明F43抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图18B所示，其中观察到单个主峰。F43抗体的最终纯度确定为91.88％。另外，基于图18C所示的熔解曲线，F43的Tm1和Tm2值分别确定为64.7℃和69.7℃。
另外，通过ELISA测量F43与VEGF和PD-1的结合能力，并且结果分别如图18D和图18E所示。F43与VEGF和PD-1结合的EC50值分别确定为0.102μg/ml和0.306μg/ml。
c)F85R
多特异性抗体F85R的结构示意图如图16C所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的F85R。如图19A所示，结果表明F85R抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图19B所示，其中观察到单个主峰。F85R抗体的最终纯度确定为96.68％。另外，基于图19C所示的熔解曲线，F85R的Tm1和Tm2值分别确定为61.5℃和67.9℃。
另外，通过ELISA测量F85R与VEGF和PD-1的结合能力，并且结果分别如图19D和图19E所示。F85R与VEGF和PD-1结合的EC50值分别确定为0.040μg/ml和0.124μg/ml。
d)F45R
多特异性抗体F45R的结构示意图如图16D所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的F45R。如图20A所示，结果表明F45R抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图20B所示，其中观察到单个主峰。F45R抗体的最终纯度确定为92.75％。另外，基于图20C所示的熔解曲线，F45R的Tm1值确定为64.6℃。
另外，通过ELISA测量F45R与VEGF和PD-1的结合能力，并且结果分别如图20D和图20E所示。F45R与VEGF和PD-1结合的EC50值分别确定为0.042μg/ml和0.705μg/ml。
e)G58
多特异性抗体G58的结构示意图如图16E所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的G58。如图21A所示，结果表明G58抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图21B所示，其中观察到单个主峰。G58抗体的最终纯度确定为91.71％。另外，基于图21C所示的熔解曲线，G58的Tm1和Tm2值分别确定为62.0℃和67.9℃。
另外，通过ELISA测量G58与VEGF和PD-1的结合能力，并且结果分别如图21D和图21E所示。G58与VEGF和PD-1结合的EC50值分别确定为0.222μg/ml和0.029μg/ml。
f)H27
多特异性抗体H27的结构示意图如图16F所示。在纯化步骤之后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的H27。如图22A所示，结果表明H27抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图22B所示，其中观察到单个主峰。H27抗体的最终纯度确定为90.25％。另外，基于图22C所示的熔解曲线，H27的Tm1和Tm2值分别确定为62.9℃和67.2℃。
另外，通过ELISA测量H27与VEGF和PD-1的结合能力，并且结果分别如图22D和图22E所示。H27与VEGF和PD-1结合的EC50值分别确定为0.031μg/ml和0.031μg/ml。
g)H22
多特异性抗体H22的结构示意图如图16G所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的H22。如图23A所示，结果表明H22抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图23B所示，其中观察到一个主峰和一个次峰。H22抗体的最终纯度确定为对于主峰是66.73％和对于次峰是24.08％。另外，基于图23C所示的熔解曲线，H22的Tm1值确定为63.1℃。
另外，通过ELISA测量H22与VEGF和PD-1的结合能力，并且结果分别如图23D和图23E所示。H22与VEGF和PD-1结合的EC50值分别确定为0.021μg/ml和0.020μg/ml。
h)G47
多特异性抗体G47的结构示意图如图16H所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的G47。如图24A所示，结果表明G47抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图24B所示，其中观察到单个主峰。G47抗体的最终纯度确定为94.68％。另外，基于图24C所示的熔解曲线，G47的Tm1值确定为62.8℃。
另外，通过ELISA测量G47与VEGF和PD-1的结合能力，并且结果分别如图24D和图24E所示。G47与VEGF和PD-1结合的EC50值分别确定为0.040μg/ml和0.065μg/ml。
实施例5：靶向VEGF、Ang-2、间皮素和/或PD-1的多特异性抗体
设计了十种靶向VEGF、Ang-2、间皮素和/或PD-1的多特异性抗体，其结构示意图如图25A-25J所示。T1、U1、W3分别代表靶向VEGF、Ang-2和间皮素(MSLN)的VHH。W1代表靶向PD-1的Fab结构域。将多特异性抗体分别命名为W366003-T1U1W1.I23-1.uIgG4V1(或“I23”)、W366003-T1U1W1.L52-1.uIgG4V1(或“L52”)、W366003-T1U1W3.L1-1.uIgG4V1(或“L1”)、W366003-T1W1U1.H27-1.uIgG4V1(或“H27-1”)、W366003-T1U1W3.L54-1.uIgG4V1(或“L54”)、W366003-T1U1W3.L55-1.uIgG4V1(或“L55”)、W366003-T1U1W3.L56-1.uIgG4V1(或“L56”)、W366003-T1U1W1.L51-1.uIgG4V1(或“L51”)、W366003-T1U1W1.L57-1.uIgG4V1(或“L57”)和W366003-T1U1W1.L58-1.uIgG4V1(或“L58”)。
通过蛋白A柱纯化多特异性抗体。如果样品的纯度低于90％，则通过HPLC-SEC纯化进一步纯化样品。测定纯化后的产量和纯度。通过DSF测定熔解温度(例如，Tm1和/或Tm2)。还进行了ELISA以确定与靶标的结合亲和力。计算出EC50并将其与亲本抗体进行比较。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是单价的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的单价亲本抗体。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是多价(例如，二价)的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的二价亲本抗体。还测定了每种多特异性抗体相对于亲本抗体的结合比(EC50比)。结果汇总在下表中。
表5.
a)I23(VEGF/Ang-2/PD-1)
多特异性抗体I23的结构示意图如图25A所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的I23。如图26A所示，结果表明I23抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图26B所示，其中观察到单个主峰。I23抗体的最终纯度确定为99.93％。另外，基于图26C所示的熔解曲线，I23的Tm1值确定为64.1℃。
另外，通过ELISA测量I23与VEGF、Ang-2和PD-1的结合能力，并且结果分别如图26D-26F所示。I23与VEGF、Ang-2和PD-1结合的EC50值分别确定为0.124μg/ml、0.067μg/ml和0.106μg/ml。
b)L52(VEGF/Ang-2/PD-1)
多特异性抗体L52的结构示意图如图25B所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的L52。如图27A所示，结果表明L52抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图27B所示，其中观察到单个主峰。L52抗体的最终纯度确定为98.12％。另外，基于图27C所示的熔解曲线，L52的Tm1值确定为64.1℃。
另外，通过ELISA测量L52与VEGF、Ang-2和PD-1的结合能力，并且结果分别如图27D-27F所示。L52与VEGF、Ang-2和PD-1结合的EC50值分别确定为0.204μg/ml、0.190μg/ml和0.023μg/ml。
c)L1(VEGF/Ang-2/MSLN)
多特异性抗体L1的结构示意图如图25C所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的L1。如图28A所示，结果表明L1抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图28B所示，其中观察到单个主峰。L1抗体的最终纯度确定为98.75％。另外，基于图28C所示的熔解曲线，L1的Tm1值确定为60.2℃。
另外，通过ELISA测量L1与VEGF、Ang-2和MSLN的结合能力，并且结果分别如图28D-28F所示。L1与VEGF、Ang-2和MSLN结合的EC50值分别确定为0.031μg/ml、0.027μg/ml和0.092μg/ml。
d)H27-1(VEGF/Ang-2/PD-1)
多特异性抗体H27-1的结构示意图如图25D所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的H27-1。如图29A所示，结果表明H27-1抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图29B所示，其中观察到单个主峰。H27-1抗体的最终纯度确定为91.19％。另外，基于图29C所示的熔解曲线，H27-1的Tm1值确定为65.1℃。
另外，通过ELISA测量H27-1与VEGF、Ang-2和PD-1的结合能力，并且结果分别如图29D-29F所示。H27-1与VEGF、Ang-2和PD-1结合的EC50值分别确定为0.055μg/ml、0.052μg/ml和0.033μg/ml。
e)L54(VEGF/Ang-2/MSLN)
多特异性抗体L54的结构示意图如图25E所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的L54。如图30A所示，结果表明L54抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图30B所示，其中观察到单个主峰。L54抗体的最终纯度确定为94.28％。另外，基于图30C所示的熔解曲线，L54的Tm1值确定为59.3℃。
另外，通过ELISA测量L54与VEGF、Ang-2和MSLN的结合能力，并且结果分别如图30D-30F所示。L54与VEGF、Ang-2和MSLN结合的EC50值分别确定为0.027μg/ml、0.030μg/ml和0.073μg/ml。
f)L55(VEGF/Ang-2/MSLN)
多特异性抗体L55的结构示意图如图25F所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的L55。如图31A所示，结果表明L55抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图31B所示，其中观察到单个主峰。L55抗体的最终纯度确定为92.57％。另外，基于图31C所示的熔解曲线，L55的Tm1值确定为61.3℃。
另外，通过ELISA测量L55与VEGF、Ang-2和MSLN的结合能力，并且结果分别如图31D-31F所示。L55与VEGF、Ang-2和MSLN结合的EC50值分别确定为0.034μg/ml、0.043μg/ml和0.121μg/ml。
g)L56(VEGF/Ang-2/MSLN)
多特异性抗体L56的结构示意图如图25G所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的L56。如图32A所示，结果表明L56抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图32B所示，其中观察到单个主峰。L56抗体的最终纯度确定为87.42％。另外，基于图32C所示的熔解曲线，L56的Tm1值确定为61.8℃。
另外，通过ELISA测量L56与VEGF、Ang-2和MSLN的结合能力，并且结果分别如图32D-32F所示。L56与VEGF、Ang-2和MSLN结合的EC50值分别确定为0.048μg/ml、0.053μg/ml和0.200μg/ml。
h)L51(VEGF/Ang-2/PD-1)
多特异性抗体L51的结构示意图如图25H所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的L51。如图33A所示，结果表明L51抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图33B所示，其中观察到单个主峰。L51抗体的最终纯度确定为98.74％。另外，基于图33C所示的熔解曲线，L51的Tm1值确定为65.9℃。
另外，通过ELISA测量L51与VEGF、Ang-2和PD-1的结合能力，并且结果分别如图33D-33F所示。L51与VEGF、Ang-2和PD-1结合的EC50值分别确定为0.095μg/ml、0.082μg/ml和3.245μg/ml。
i)L57(VEGF/Ang-2/PD-1)
多特异性抗体L57的结构示意图如图25I所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的L57。如图34A所示，结果表明L57抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图34B所示，其中观察到单个主峰。L57抗体的最终纯度确定为97.32％。另外，基于图34C所示的熔解曲线，L57的Tm1值确定为62.9℃。
另外，通过ELISA测量L57与VEGF、Ang-2和PD-1的结合能力，并且结果分别如图34D-34F所示。L57与VEGF、Ang-2和PD-1结合的EC50值分别确定为0.031μg/ml、0.044μg/ml和0.102μg/ml。
j)L58(VEGF/Ang-2/PD-1)
多特异性抗体L58的结构示意图如图25J所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的L58。如图35A所示，结果表明L58抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图35B所示，其中观察到单个主峰。L58抗体的最终纯度确定为91.35％。另外，基于图35C所示的熔解曲线，L58的Tm1值确定为63.8℃。
另外，通过ELISA测量L58与VEGF、Ang-2和PD-1的结合能力，并且结果分别如图35D-35F所示。L58与VEGF、Ang-2和PD-1结合的EC50值分别确定为0.306μg/ml、0.145μg/ml和0.027μg/ml。
实施例6：靶向VEGF、Ang-2、间皮素和GITR/PD-1的多特异性抗体
设计了十种靶向VEGF、Ang-2、间皮素和GITR/PD-1的多特异性抗体，其结构示意图如图36A-36D所示。T1、U1和W1分别代表靶向VEGF、Ang-2和间皮素(MSLN)的VHH。X1代表靶向GITR的VHH。X12代表靶向PD-1的Fab结构域。将多特异性抗体分别命名为W366004-T1U1W1X1.N1-1.uIgG4V1(或“N1”)、W366004-T1U1W1X1.N2-1.uIgG4V1(或“N2”)、W366004-T1U1W1X1.N3-1.uIgG4V1(或“N3”)和W366004-T1U1W1X1.N4-1.uIgG4V1(或“N4”)。
通过蛋白A柱纯化多特异性抗体。如果样品的纯度低于90％，则通过HPLC-SEC纯化进一步纯化样品。测定纯化后的产量和纯度。通过DSF测定熔解温度(例如，Tm1和/或Tm2)。还进行了ELISA以确定与靶标的结合亲和力。计算出EC50并将其与亲本抗体进行比较。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是单价的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的单价亲本抗体。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是多价(例如，二价)的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的二价亲本抗体。还测定了每种多特异性抗体相对于亲本抗体的结合比(EC50比)。结果汇总在下表中。
表6.
a)N1(VEGF/Ang-2/MSLN/GITR)
多特异性抗体N1的结构示意图如图36A所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的N1。如图37A所示，结果表明N1抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图37B所示，其中观察到单个主峰。N1抗体的最终纯度确定为97.31％。另外，基于图37C所示的熔解曲线，N1的Tm1值确定为63.1℃。
另外，通过ELISA测量N1与VEGF、Ang-2、间皮素和GITR的结合能力，并且结果分别如图37D-37G所示。
b)N2(VEGF/Ang-2/MSLN/GITR)
多特异性抗体N2的结构示意图如图36B所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的N2。如图38A所示，结果表明N2抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图38B所示，其中观察到单个主峰。N2抗体的最终纯度确定为97.56％。另外，基于图38C所示的熔解曲线，N2的Tm1和Tm2值分别确定为58.0℃和67.7℃。
另外，通过ELISA测量N2与VEGF、Ang-2、间皮素和GITR的结合能力，并且结果分别如图38D-38G所示。
c)N3(VEGF/Ang-2/MSLN/PD-1)
多特异性抗体N3的结构示意图如图36C所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的N3。如图39A所示，结果表明N3抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图39B所示，其中观察到单个主峰。N3抗体的最终纯度确定为95.74％。另外，基于图39C所示的熔解曲线，N3的Tm1和Tm2值分别确定为62.8℃和67.5℃。
另外，通过ELISA测量N3与VEGF、Ang-2、间皮素和PD-1的结合能力，并且结果分别如图39D-39G所示。
d)N4(VEGF/Ang-2/MSLN/GITR)
多特异性抗体N4的结构示意图如图36D所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的N4。如图40A所示，结果表明N4抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图40B所示，其中观察到单个主峰。N4抗体的最终纯度确定为91.50％。另外，基于图40C所示的熔解曲线，N4的Tm1和Tm2值分别确定为57.7℃和67.2℃。
另外，通过ELISA测量N4与VEGF、Ang-2、间皮素和GITR的结合能力，并且结果分别如图40D-40G所示。
实施例7：靶向VEGF、Ang-2和PD-1的多特异性抗体
设计了一种靶向VEGF、Ang-2和PD-1的多特异性抗体，其结构示意图如图41A所示。T1和U1分别代表靶向VEGF和Ang-2的VHH。W1代表靶向PD-1的Fab区。将多特异性抗体命名为W366003-T1U1W1.D38-1.His(或“D38”)。
如上所述纯化D38。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的D38。如图41B所示，结果表明D38抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图41C所示，其中观察到单个主峰。D38抗体的最终纯度确定为99.01％。如图41D所示，通过DSF测量熔解曲线。
实施例8：靶向VEGF的单特异性抗体
设计了两种靶向VEGF的单特异性抗体，其结构示意图如图43A-43B所示。T1代表靶向VEGF的VHH。将单特异性抗体分别命名为W366000-T1.V1-1.uIgG4V1(或“V1”)和W366000-T1.V2-1.uIgG4V1(或“V2”)。
通过蛋白A柱纯化单特异性抗体。如果样品的纯度低于90％，则通过HPLC-SEC纯化进一步纯化样品。测定纯化后的产量和纯度。通过DSF测定熔解温度(例如，Tm1和/或Tm2)。还进行了ELISA以确定与靶标的结合亲和力。计算出EC50并将其与亲本抗体进行比较。如果所测试的单特异性抗体对于靶标而言是单价的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的单价亲本抗体。如果所测试的单特异性抗体对于靶标而言是多价(例如，二价)的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的二价亲本抗体。还测定了每种单特异性抗体相对于亲本抗体的结合比(EC50比)。结果汇总在下表中。
表7.
a)V1(VEGF)
单特异性抗体V1的结构示意图如图43A所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的V1。如图44A所示，结果表明V1抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图44B所示，其中观察到单个主峰。V1抗体的最终纯度确定为100％。另外，基于图44C所示的熔解曲线，V1的Tm1值确定为57.5℃。
通过ELISA测量V1与VEGF的结合能力，并且结果如图44D所示。V1与VEGF结合的EC50值确定为0.0434μg/ml。
b)V2(VEGF)
单特异性抗体V2的结构示意图如图43B所示。纯化后，分别通过非还原性和还原性凝胶电泳分析所纯化的V2。如图45A所示，结果表明V2抗体成功纯化，其分子量正确。SEC分析结果如图45B所示，其中观察到单个主峰。V2抗体的最终纯度确定为92.89％。另外，基于图45C所示的熔解曲线，V2的Tm1和Tm2值分别确定为58.0℃和62.8℃。
通过ELISA测量V2与VEGF的结合能力，并且结果如图45D所示。V2与VEGF结合的EC50值确定为0.0876μg/ml。
实施例9：靶向VEGF和Ang-2的多特异性抗体
设计了六种靶向VEGF和Ang-2的多特异性抗体，其结构示意图如图46A-46F所示。T1和U1分别代表靶向VEGF和Ang-2的VHH。将多特异性抗体分别命名为W366001-U1T1.H39-1.uIgG4V1(或“H39”)、W366001-U1T1.H40-1.uIgG4V1(或“H40”)、W366001-U1T1.V14-1.His(或“V14”)、W366001-U1T1.V15-1.His(或“V15”)、W366001-U1T1.V16-1.His(或“V16”)和W366001-U1T1.V11-1.His(或“V11”)。
通过蛋白A柱纯化多特异性抗体。如果样品的纯度低于90％，则通过HPLC-SEC纯化进一步纯化样品。测定纯化后的产量和纯度。通过DSF测定熔解温度(例如，Tm1和/或Tm2)。还进行了ELISA以确定与靶标的结合亲和力。计算出EC50并将其与亲本抗体进行比较。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是单价的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的单价亲本抗体。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是多价(例如，二价)的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的二价亲本抗体。还测定了每种多特异性抗体相对于亲本抗体的结合比(EC50比)。结果汇总在下表中。
表8.
a)H39(VEGF/Ang-2)
多特异性抗体H39的结构示意图如图46A所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的H39。如图47A所示，在所纯化的H39抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图47B所示，其中观察到单个主峰。H39抗体的最终纯度确定为99.28％。另外，基于图47C所示的熔解曲线，H39的Tm1值确定为58.2℃。
通过ELISA测量H39与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图47D和图47E所示。H39与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.0528μg/ml和0.1114μg/ml。
b)H40(VEGF/Ang-2)
多特异性抗体H40的结构示意图如图46B所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的H40。如图48A所示，在所纯化的H40抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图48B所示，其中观察到单个主峰。H40抗体的最终纯度确定为97.35％。另外，基于图48C所示的熔解曲线，H40的Tm1值和Tm2值分别确定为60.5℃和64.4℃。
通过ELISA测量H40与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图48D和图48E所示。H40与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为0.0528μg/ml和0.1114μg/ml。
c)V14(VEGF/Ang-2)
多特异性抗体V14的结构示意图如图46C所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的V14。如图49A所示，在所纯化的V14抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图49B所示，其中观察到单个主峰。V14抗体的最终纯度确定为90.58％。另外，基于图49C所示的熔解曲线，V14的Tm1值确定为62.3℃。
通过ELISA测量V14与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图49D和图49E所示。V14与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为1.5680μg/ml和0.5059μg/ml。
d)V15(VEGF/Ang-2)
多特异性抗体V15的结构示意图如图46D所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的V15。如图50A所示，在所纯化的V15抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图50B所示，其中观察到单个主峰。V15抗体的最终纯度确定为92.31％。另外，基于图50C所示的熔解曲线，Tm1值和Tm2值分别确定为59.0℃和64.7℃。
通过ELISA测量V15与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图50D和图50E所示。V15与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为1.7380μg/ml和0.1380μg/ml。
e)V16(VEGF/Ang-2)
多特异性抗体V16的结构示意图如图46E所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的V16。如图51A所示，在所纯化的V16抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图51B所示，其中观察到单个主峰。V16抗体的最终纯度确定为99.47％。另外，基于图51C所示的熔解曲线，Tm1和Tm2值分别确定为58.4℃和71.5℃。
通过ELISA测量V16与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图51D和图51E所示。V16与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为1.0560μg/ml和0.6202μg/ml。
f)V11(VEGF/Ang-2)
多特异性抗体V11的结构示意图如图46F所示。纯化后，分别通过非还原性(N)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的V11。如图52A所示，在所纯化的V11抗体样品中观察到多个非目标条带。SEC分析结果如图52B所示，其中观察到单个主峰。V11抗体的最终纯度确定为99.05％。另外，基于图52C所示的熔解曲线，V11的Tm1值确定为61.3℃。
通过ELISA测量V11与VEGF和Ang-2的结合能力，并且结果分别如图52D和图52E所示。V11与VEGF和Ang-2结合的EC50值分别确定为1.1350μg/ml和0.3108μg/ml。
实施例10：靶向Ang-2、间皮素和GITR的多特异性抗体
设计了五种靶向Ang-2、间皮素和GITR的多特异性抗体，其结构示意图如图53A-53E所示。U1和W3分别代表靶向Ang-2和间皮素(MSLN)的VHH。X1代表靶向GITR的VHH。将多特异性抗体分别命名为W366003-U1W3X1.D1-1.His(或“D1”)、W366003-U1W3X1.D2-1.His(或“D2”)、W366003-U1W3X1.D3-1.His(或“D3”)、W366003-U1W3X1.D43-1.His(或“D43”)和W366003-U1W3X1.D44-1.His(或“D44”)。
通过蛋白A柱纯化多特异性抗体。如果样品的纯度低于90％，则通过HPLC-SEC纯化进一步纯化样品。测定纯化后的产量和纯度。通过DSF测定熔解温度(例如，Tm1和/或Tm2)。还进行了ELISA以确定与靶标的结合亲和力。计算出EC50并将其与亲本抗体进行比较。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是单价的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的单价亲本抗体。如果所测试的多特异性抗体对于靶标而言是多价(例如，二价)的，则出于比较目的选择具有相同结合位点的二价亲本抗体。还测定了每种多特异性抗体相对于亲本抗体的结合比(EC50比)。结果汇总在下表中。
表9.
a)D1(Ang-2/MSLN/GITR)
多特异性抗体D1的结构示意图如图53A所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的D1。如图54A所示，结果表明D1抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图54B所示，其中观察到单个主峰。D1抗体的最终纯度确定为92.93％。另外，基于图54C所示的熔解曲线，D1的Tm1和Tm2值分别确定为58.2℃和66.5℃。
另外，通过ELISA测量D1与Ang-2、间皮素和GITR的结合能力，并且结果分别如图54D-54F所示。D1与Ang-2、间皮素和GITR结合的EC50值分别确定为0.2955μg/ml、0.3934μg/ml和1.2280μg/ml。
b)D2(Ang-2/MSLN/GITR)
多特异性抗体D2的结构示意图如图53B所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的D2。如图55A所示，结果表明D2抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图55B所示，其中观察到单个主峰。D2抗体的最终纯度确定为95.97％。另外，基于图55C所示的熔解曲线，D2的Tm1和Tm2值分别确定为56.9℃和67.9℃。
另外，通过ELISA测量D2与Ang-2、间皮素和GITR的结合能力，并且结果分别如图55D-55F所示。D2与Ang-2、间皮素和GITR结合的EC50值分别确定为0.1269μg/ml、0.2724μg/ml和0.3624μg/ml。
c)D3(Ang-2/MSLN/GITR)
多特异性抗体D3的结构示意图如图53C所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的D3。如图56A所示，结果表明D3抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图56B所示，其中观察到单个主峰。D3抗体的最终纯度确定为98.92％。另外，基于图56C所示的熔解曲线，D3的Tm1和Tm2值分别确定为58.2℃和72.5℃。
另外，通过ELISA测量D3与Ang-2、间皮素和GITR的结合能力，并且结果分别如图56D-56F所示。D3与Ang-2、间皮素和GITR结合的EC50值分别确定为0.1036μg/ml、0.2305μg/ml和0.8347μg/ml。
d)D43(Ang-2/MSLN/GITR)
多特异性抗体D43的结构示意图如图53D所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的D43。如图57A所示，结果表明D43抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图57B所示，其中观察到单个主峰。D43抗体的最终纯度确定为99.38％。另外，基于图57C所示的熔解曲线，D43的Tm1值分别确定为57.1℃。
另外，通过ELISA测量D43与Ang-2、间皮素和GITR的结合能力，并且结果分别如图57D-57F所示。D43与Ang-2、间皮素和GITR结合的EC50值分别确定为0.8960μg/ml、0.6219μg/ml和0.5783μg/ml。
e)D44(Ang-2/MSLN/GITR)
多特异性抗体D44的结构示意图如图53E所示。纯化后，分别通过非还原性(NR)和还原性(R)凝胶电泳分析所纯化的D44。如图58A所示，结果表明D44抗体成功纯化，其分子量正确。SEC结果如图58B所示，其中观察到单个主峰。D44抗体的最终纯度确定为93.01％。另外，基于图58C所示的熔解曲线，D44的Tm1和Tm2值分别确定为58.5℃和67.7℃。
另外，通过ELISA测量D44与Ang-2、间皮素和GITR的结合能力，并且结果分别如图58D-58F所示。D44与Ang-2、间皮素和GITR结合的EC50值分别确定为0.3288μg/ml、0.2144μg/ml和0.9958μg/ml。
其他实施方案
应当理解的是，虽然已经结合本发明的详细描述对本发明进行了描述，但前述描述旨在说明而并非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围来限定。其他方面、有益效果和改进都处于以下权利要求的范围内。

Claims (117)

1.一种抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH)；和
(b)第二组分，所述第二组分包含Fc、Fab、scFv或第二VHH；
其中所述第一抗原结合位点和所述第二组分位点相连。
2.权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述第一VHH与所述Fc中的CH2结构域相连。
3.权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述第一VHH通过铰链区与所述Fc中的CH2结构域相连。
4.权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述第一VHH与所述Fc中CH3的C末端相连。
5.权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述第一VHH与CH1结构域相连，其中所述CH1结构域与所述Fc中的CH2结构域相连。
6.权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述第一VHH与VH结构域和CH1结构域相连，并且所述CH1结构域与所述Fc中的CH2结构域相连。
7.权利要求6所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包括VL结构域，其中所述VH结构域和VL结构域相互缔合，形成抗原结合位点。
8.权利要求7所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包括VHH，其中所述VHH与所述VL结构域相连。
9.权利要求1-8中任一项所述的抗原结合蛋白，其中第二抗原结合位点包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域和VL结构域相互缔合，形成所述第二抗原结合位点。
10.权利要求1-9中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括两条重链和两条轻链。
11.权利要求1-8中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点包含第二VHH。
12.权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中所述第二VHH与所述Fc中的CH2结构域相连。
13.权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中所述第二VHH通过铰链区与所述Fc中的CH2结构域相连。
14.权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中所述第二VHH与所述Fc中CH3的C末端相连。
15.权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中所述第二VHH与CH1结构域相连，并且所述CH1结构域与所述Fc中的CH2结构域相连。
16.权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中所述第二VHH与VH结构域和CH1结构域相连，其中所述CH1结构域与所述Fc中的CH2结构域相连。
17.权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包括VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域和VL结构域相互缔合，形成抗原结合位点。
18.权利要求17所述的抗原结合蛋白，其中所述第二VHH与所述VH结构域相连。
19.权利要求17所述的抗原结合蛋白，其中所述第二VHH与所述VL结构域相连。
20.权利要求1-19中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第二表位来自不同的抗原。
21.权利要求1-19中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第二表位来自相同的抗原。
22.权利要求1-21中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包括含有第三VHH的第三抗原结合位点，其中所述第三VHH与所述第一VHH相连。
23.权利要求22所述的抗原结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点与第三表位特异性结合，其中所述第一表位和第三表位来自不同的抗原。
24.权利要求22所述的抗原结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点与第三表位特异性结合，其中所述第一表位和第三表位来自相同的抗原。
25.权利要求1-21中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点和第二抗原结合位点与选自下组的一种或多种下列抗原特异性结合：VEGF、Ang-2、MSLN、GITR和PD-1。
26.权利要求22-24中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点、第二抗原结合位点和第三抗原结合位点与选自下组的一种或多种下列抗原特异性结合：VEGF、Ang-2、MSLN、GITR和PD-1。
27.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；和
CH1结构域；
(b)第二多肽，所述第二多肽包含
与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；和
CL结构域，
其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
28.权利要求27所述的抗原结合蛋白，其中VH结构域位于所述VHH1和CH1结构域之间，并且VL结构域位于所述VHH2和CL结构域之间，其中所述VH和VL相互缔合，形成抗原结合位点。
29.权利要求27或28所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第二表位来自不同的抗原。
30.权利要求27或28所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第二表位来自相同的抗原。
31.权利要求27-30中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1和VHH2与选自下组的一种或多种下列抗原特异性结合：VEGF、Ang-2、MSLN、GITR和PD-1。
32.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含与第一表位特异性结合的第一VHH(VHH1)；和
(b)第二多肽，所述第二多肽包含与第二表位特异性结合的第二VHH(VHH2)，
其中所述第一多肽和第二多肽相互缔合以形成二聚体。
33.权利要求32所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第二表位来自相同的抗原。
34.权利要求32所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第二表位来自不同的抗原。
35.权利要求32-34中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽进一步包含第一免疫球蛋白铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域，其中所述第二多肽进一步包含第二免疫球蛋白铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域。
36.权利要求35所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1与所述第一免疫球蛋白铰链区相连。
37.权利要求35或36所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH2与所述第二免疫球蛋白铰链区相连。
38.权利要求32-34中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽进一步包含第一CH1结构域。
39.权利要求38所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1与所述第一CH1结构域相连。
40.权利要求38或39所述的抗原结合蛋白，其进一步包括第三多肽，其中所述第三多肽包含：
(a)与第三表位特异性结合的第三单域抗体(VHH3)；和
(b)第一CL结构域，
其中所述第一多肽和第三多肽通过所述第一CH1结构域和第一CL结构域之间的相互作用而相互缔合。
41.权利要求40所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第三表位来自相同的抗原。
42.权利要求40所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第三表位来自不同的抗原。
43.权利要求38-42中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽进一步包含第二CH1结构域。
44.权利要求43所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH2与所述第二CH1结构域相连。
45.权利要求43或44所述的抗原结合蛋白，其进一步包括第四多肽，所述第四多肽包含：
(a)与第四表位特异性结合的第四VHH(VHH4)；和
(b)第二CL结构域，
其中所述第二多肽和第四多肽通过所述第二CH1结构域和第二CL结构域之间的相互作用而相互缔合。
46.权利要求45所述的抗原结合蛋白，其中所述第二表位和第四表位来自相同的抗原。
47.权利要求45所述的抗原结合蛋白，其中所述第二表位和第四表位来自不同的抗原。
48.权利要求32-47中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽进一步包含与第五表位特异性结合的第五VHH(VHH5)，其中所述VHH5与所述第一多肽的N-末端相连。
49.权利要求32-47中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽进一步包含与第五表位特异性结合的第五VHH(VHH5)，其中所述VHH5与所述第一多肽的C-末端相连。
50.权利要求32-49中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽进一步包含与第六表位特异性结合的第六VHH(VHH6)，其中所述VHH6与所述第二多肽的N-末端相连。
51.权利要求32-49中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽进一步包含与第六表位特异性结合的第六VHH(VHH6)，其中所述VHH6与所述第二多肽的C-末端相连。
52.权利要求32-51中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括第三多肽，其中所述第三多肽进一步包含与第七表位特异性结合的第七VHH(VHH7)，其中所述VHH7与所述第三多肽的N-末端相连。
53.权利要求32-51中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括第三多肽，其中所述第三多肽进一步包含与第七表位特异性结合的第七VHH(VHH7)，其中所述VHH7与所述第三多肽的C-末端相连。
54.权利要求52或53所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括第四多肽，其中所述第四多肽进一步包含与第八表位特异性结合的第八VHH(VHH8)，其中所述VHH8与所述第四多肽的N-末端相连。
55.权利要求52或53所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括第四多肽，其中所述第四多肽进一步包含与第八表位特异性结合的第八VHH(VHH8)，其中所述VHH8与所述第四多肽的C-末端相连。
56.一种抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含与第一表位特异性结合的第一VHH(VHH1)；和
(b)第二多肽，所述第二多肽包含第一Fab结构域的第一重链可变结构域(VH1)和第一CH1结构域，其中所述第一Fab结构域与第二表位特异性结合，其中所述第一多肽和第二多肽相互缔合以形成二聚体。
57.权利要求56所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第二表位来自相同的抗原。
58.权利要求56所述的抗原结合蛋白，其中所述第一表位和第二表位来自不同的抗原。
59.权利要求56-58中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽从N-末端到C-末端进一步包含：
第一免疫球蛋白铰链区，
第一CH2结构域，和
第一CH3结构域，
其中所述VHH1与所述第一免疫球蛋白铰链区相连。
60.权利要求56-58中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽从N-末端到C-末端进一步包含：
第二Fab结构域的第二重链可变结构域VH(VH2)和第二CH1结构域，第一免疫球蛋白铰链区，
第一CH2结构域，和
第一CH3结构域。
61.权利要求60所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1与所述VH2的N-末端相连。
62.权利要求57所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1位于所述第二CH1结构域和第一免疫球蛋白铰链区之间。
63.权利要求60-62中任一项所述的抗原结合蛋白，其进一步包括第二VHH(VHH2)，其中所述VHH2与所述第二Fab结构域的第二轻链可变结构域(VL2)相连。
64.权利要求56-63中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽从N-末端到C-末端进一步包含：
第二免疫球蛋白铰链区；
第二CH2结构域；和
第二CH3结构域。
65.权利要求63所述的抗原结合蛋白，其进一步包括第三VHH(VHH3)，其中所述VHH3与所述VH1的N-末端相连。
66.权利要求63所述的抗原结合蛋白，其进一步包括第三VHH(VHH3)，其中所述VHH3位于所述第一CH1结构域和第二免疫球蛋白铰链区之间。
67.权利要求56-66中任一项所述的抗原结合蛋白，其进一步包括第四VHH(VHH4)，其中所述VHH4与所述第一Fab结构域的第一轻链可变结构域(VL1)相连。
68.权利要求56-67中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽进一步包含与第五表位特异性结合的第五VHH(VHH5)，其中所述VHH5与所述第一多肽的N-末端相连。
69.权利要求56-67中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽进一步包含与第五表位特异性结合的第五VHH(VHH5)，其中所述VHH5与所述第一多肽的C-末端相连。
70.权利要求56-69中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽进一步包含与第六表位特异性结合的第六VHH(VHH6)，其中所述VHH6与所述第二多肽的N-末端相连。
71.权利要求56-69中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽进一步包含与第六表位特异性结合的第六VHH(VHH6)，其中所述VHH6与所述第二多肽的C-末端相连。
72.权利要求27-71中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5、VHH6、VHH7和/或VHH8与癌症相关抗原或癌症特异性抗原特异性结合。
73.权利要求27-71中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5、VHH6、VHH7和/或VHH8与抗原特异性结合，其中所述抗原选自下组：VEGF、Ang2、间皮素、GITR、HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。
74.权利要求27-71中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5、VHH6、VHH7和/或VHH8与VEGF、Ang2、间皮素或GITR特异性结合。
75.权利要求27-71中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5、VHH6、VHH7和/或VHH8与免疫检查点分子特异性结合。
76.权利要求75所述的抗原结合蛋白，其中所述免疫检查点分子选自下组：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。
77.权利要求76所述的抗原结合蛋白，其中所述免疫检查点分子是PD-1。
78.权利要求27-77中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个表位特异性结合。
79.一种抗原结合蛋白，其包括一个或多个以下抗原结合位点：
(a)靶向血管内皮生长因子(VEGF)的抗原结合位点；
(b)靶向血管生成素-2(Ang-2)的抗原结合位点；
(c)靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的抗原结合位点；和/或
(d)靶向间皮素(MSLN)的抗原结合位点；和/或
(e)靶向糖皮质激素诱导性TNFR相关蛋白(GITR)的抗原结合位点。
80.权利要求79所述的抗原结合蛋白，其包括靶向VEGF的抗原结合位点和靶向Ang-2的抗原结合位点。
81.权利要求79所述的抗原结合蛋白，其包括靶向VEGF的抗原结合位点和靶向PD-1的抗原结合位点。
82.权利要求79所述的抗原结合蛋白，其包括靶向Ang-2的抗原结合位点和靶向PD-1的抗原结合位点。
83.权利要求79所述的抗原结合蛋白，其包括靶向VEGF的抗原结合位点、靶向Ang-2的抗原结合位点和靶向PD-1的抗原结合位点。
84.权利要求79-83中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向VEGF的抗原结合位点。
85.权利要求79-84中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向Ang-2的抗原结合位点。
86.权利要求79-85中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向MSLN的抗原结合位点。
87.权利要求79-86中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向GITR的抗原结合位点。
88.权利要求79-87中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个靶向PD-1的抗原结合位点。
89.权利要求79-88中任一项所述的抗原结合蛋白，其中一个或多个抗原结合位点包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
90.权利要求79-89中任一项所述的抗原结合蛋白，其中一个或多个抗原结合位点包含VHH。
91.权利要求1-90中任一项所述的抗原结合蛋白，其中能以至少5mg/L、至少6mg/L、至少7mg/L、至少8mg/L、至少9mg/L、至少10mg/L、至少20mg/L、至少30mg/L、至少40mg/L、至少50mg/L、至少60mg/L、至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L或至少200mg/L的表达水平产生所述抗原结合蛋白。
92.权利要求1-91中任一项所述的抗原结合蛋白，其中能以至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％的纯度(例如，通过蛋白A层析纯化后)产生所述抗原结合蛋白。
93.权利要求1-92中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的Tm为至少57℃、至少58℃、至少59℃、至少60℃、至少61℃、至少62℃、至少63℃、至少64℃或至少65℃。
94.权利要求1-93中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与VEGF、Ang-2、MSLN、PD-1或GITR结合的EC50值小于0.01μg/ml、小于0.02μg/ml、小于0.03μg/ml、小于0.04μg/ml、小于0.05μg/ml、小于0.06μg/ml、小于0.07μg/ml、小于0.08μg/ml、小于0.09μg/ml、小于0.10μg/ml、小于0.11μg/ml、小于0.12μg/ml、小于0.13μg/ml、小于0.14μg/ml、小于0.15μg/ml、小于0.16μg/ml、小于0.17μg/ml、小于0.18μg/ml、小于0.19μg/ml、小于0.20μg/ml、小于0.21μg/ml、小于0.22μg/ml、小于0.23μg/ml、小于0.24μg/ml、小于0.25μg/ml或小于0.30μg/ml。
95.权利要求1-94中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的结合亲和力为针对相同靶标的亲本抗体的结合亲和力的至少80％、85％、90％、95％或100％。
96.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含权利要求1-95中任一项所述的抗原结合蛋白的组合物。
97.权利要求96所述的方法，其中所述受试者患有表达VEGF、表达Ang-2和/或表达MSLN的癌症。
98.权利要求96所述的方法，其中所述癌症选自由乳腺癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤组成的组。
99.一种治疗患有自身免疫性疾病或炎症性疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含权利要求1-95中任一项所述的抗原结合蛋白的组合物。
100.一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的权利要求1-95中任一项所述的抗原结合蛋白。
101.权利要求100所述的抗体-药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
102.一种药物组合物，其包含权利要求1-95中任一项所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载剂。
103.一种药物组合物，其包含权利要求100或101所述的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载剂。
104.一种核酸，其编码权利要求1-95中任一项所述的抗原结合蛋白。
105.一种载体，其包含权利要求104所述的核酸。
106.一种宿主细胞，其包含权利要求104所述的核酸或权利要求105所述的载体。
107.一种用于产生抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在适于产生所述抗原结合蛋白的条件下培养权利要求106所述的宿主细胞。
108.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
Fc；
CH1结构域；和
与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；
(b)第二多肽，所述第二多肽包含
另一个VHH2；和
CL结构域，
其中所述VHH1与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，并且所述VHH2与CH1结构域的C末端相连，
其中所述另一个VHH2与CL结构域的C末端相连，
其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
109.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
第一CH1结构域；
Fc；
第二CH1结构域；和
另一个VHH1；
(b)两个第二多肽，所述第二多肽包含
与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；和
CL结构域，
其中所述VHH1与所述第一CH1结构域的N末端相连，并且所述第一CH1结构域与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，
其中所述VHH2与CL结构域的C末端相连，
其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
110.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
Fc；
CH1结构域；和
与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；
(b)第二多肽，所述第二多肽包含
VHH2；和
CL结构域，
其中所述VHH1与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，所述VHH2与CH1结构域的C末端相连，并且另一个VHH2与所述VHH1的N末端相连，其中所述第二多肽中的VHH2与CL结构域的C末端相连，其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
111.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
第一CH1结构域；
Fc；
第二CH1结构域；和
与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；
(b)两个第二多肽，所述第二多肽包含
另一个VHH2；和
CL结构域，
其中所述VHH1与所述CH1结构域的N末端相连，所述CH1结构域与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，并且所述VHH2与所述第二CH1结构域的C末端相连，
其中所述另一个VHH2与CL结构域的C末端相连，
其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
112.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
第一CH1结构域；
Fc；
第二CH1结构域；和
第二VHH1；
(b)两个第二多肽，所述第二多肽包含
第三VHH1；和
CL结构域，
其中所述VHH1与所述CH1结构域的N末端相连，并且所述CH1结构域与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，所述第二VHH1与所述第二CH1结构域的C末端相连，并且所述Fc中的每个CH3结构域与特异性结合第二表位的第二单域抗体可变结构域(VHH2)相连，
其中所述第三VHH2与CL结构域的C末端相连，
其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
113.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；
第一CH1结构域；
Fc；
第二CH1结构域；
另一个VHH2；
另一个VHH1；
(b)两个第二多肽，所述第二多肽包含
第三VHH1；
第三VHH2；和
CL结构域，
其中所述VHH1与所述VHH2的N末端相连，所述VHH2与所述第一CH1结构域的N末端相连，并且所述第一CH1结构域与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，所述另一个VHH2与所述第二CH1结构域的C末端相连，并且所述另一个VHH2与所述另一个VHH1的C末端相连，
其中所述第三VHH1与所述第三VHH2的C末端相连，并且所述第三VHH2与所述CL结构域的C末端相连，
其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
114.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；
Fc；
CH1结构域；和
与第三表位特异性结合的第三单域抗体可变结构域(VHH3)；
(b)第二多肽，所述第二多肽包含
与第四表位特异性结合的第四单域抗体可变结构域(VHH4)；和
CL结构域，
其中所述VHH1通过接头序列与所述VHH2的N末端相连，所述VHH2与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，所述VHH3与所述CH1结构域的C末端相连，
其中所述VHH4与CL结构域的C末端相连，
其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
115.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)Fc；
(b)与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
(c)与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；
(d)与第三表位特异性结合的第三单域抗体可变结构域(VHH3)；
(e)与第四表位特异性结合的第四单域抗体可变结构域(VHH4)；
其中所述VHH1通过接头序列与所述VHH2的N末端相连，并且所述VHH2与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，
其中所述VHH3与所述Fc中另一个CH2结构域的C末端相连，并且所述VHH4通过接头序列与所述VHH3的C末端相连。
116.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含
与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；
Fc；
CH1结构域；
与第三表位特异性结合的第三单域抗体可变结构域(VHH3)；和
与第四表位特异性结合的第四单域抗体可变结构域(VHH4)；(b)第二多肽，所述第二多肽包含
另一个VHH3；和
CL结构域，
其中所述VHH1通过接头序列与所述VHH2的N末端相连，并且所述VHH2与所述Fc中CH2结构域的N末端相连，
其中所述CH1结构域与所述Fc中另一个CH2结构域的C末端相连，所述VHH3与所述CH1结构域的C末端相连，并且所述VHH4通过接头序列与所述VHH3的C末端相连，
其中所述第一多肽和第二多肽通过所述CH1结构域和CL结构域相互缔合以形成二聚体。
117.一种多特异性抗原结合蛋白，其包括
(a)Fc；
(b)与第一表位特异性结合的第一单域抗体可变结构域(VHH1)；
(c)与第二表位特异性结合的第二单域抗体可变结构域(VHH2)；
(d)与第三表位特异性结合的第三单域抗体可变结构域(VHH3)；
(e)与第四表位特异性结合的第四单域抗体可变结构域(VHH4)；
其中所述VHH1通过接头序列与所述VHH2的N末端相连，所述VHH3通过接头序列与所述VHH4相连，每个CH2结构域与所述VHH2相连，并且每个CH3结构域与所述VHH3相连。
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