KR20230126718A - 다중특이적 항원 결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 다중특이적 및 다가 항원 결합 단백질들을 제공한다. 일 측면에서, 본 개시는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 VHH를 포함하는 제1 항원 결합 부위; 및 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 항원 결합 단백질을 제공한다.

Description

다중특이적 항원 결합 단백질
본 개시는 다중특이적 및 다가 항원 결합 단백질, 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
다중특이적 항체들은 치료용으로 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 천연 항체들은 단일특이적이지만, 다중특이적 항체들(예를 들어, 이중특이적 항체들)은 동일한 항원들 또는 다른 항원들 상의 둘 이상의 다른 에피토프들을 인식한다. 표적 세포와 상호작용하는 부위가 2개 이상 있으면, 보다 많은 표적화된 결합을 달성할 수 있다. 보다 많은 표적화된 결합은 새로운 단백질 복합체의 형성을 야기하고, 새로운 세포 접촉을 유발할 수 있다. 많은 경우에, T 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 세포독성 면역 이펙터 세포의 방향 전환(redirection)을 통해 추가 면역 반응이 활성화되어 훨씬 더 큰 표적화된 세포독성 효과를 유발할 수 있다. 이러한 향상은 때때로 두 개의 개별 단클론 항체들이 병용 요법으로 투여되는 경우보다 훨씬 더 클 수 있다. 다중특이적 항체들의 치료적 사용은 초기에 암 치료를 위한 이펙터 세포 재표적화에 초점이 맞춰졌다. 지난 10년 동안, 다중특이적 항체들을 기반으로 한 많은 다른 치료 전략들이 확립되었다. 현재, 다중특이적 항체들은, 예를 들어, 진단, 이미징, 예방, 및 치료를 포함하는 광범위한 용도를 갖는다.
다중특이적 항체들의 수많은 장점에도 불구하고, 다중특이적 항체들을 개발하고 제조하는 것은 여전히 어려운 과제이다. 그 이유는 주로, 기존의 방법들이 단클론 항체들의 항원 결합 부분들에 크게 의존하기 때문이다. 이들 항원 결합 부분들은 다중특이적 항원 결합 작제물들에서 이들의 바람직한 생화학적 및/또는 생물물리학적 특성들을 상실할 수 있다. 또한, 많은 다중특이적 항체 포맷에는 페어링 오류(mispairing) 문제가 있으며, 이는 종종 응집 및 낮은 발현 수준과도 관련이 있다. 상기 다중특이적 항체 포맷은 정제 및 제조가 어렵다. 약물 개발 및 제조를 위한 다목적의 다중특이적 항체 플랫폼에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
본 개시는 다중특이적 및 다가 항원 결합 단백질, 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 본원에서는 다목적의 다중특이적 항체 플랫폼도 제공된다. 다중특이적 및 다가 항원 결합 단백질들의 항원 결합 부분은 적절하게 폴딩될 수 있고, 항원과의 높은 결합 친화성을 유지할 수 있다. 또한, 이러한 다중특이적 및 다가 항원 결합 단백질들은 쉽게 고수준으로 발현될 수 있고, 용이하게 정제 및 제조될 수 있다. 이러한 다중특이적 항원 결합 단백질들은 약물 개발 및 제조에 특히 적합하다.
일 측면에서, 본 개시는 (a) Fc; (b) 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH)을 포함하는 제1 항원 결합 부위; 및 (c) 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 항원 결합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 Fc에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 VHH는 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 VHH는 힌지 영역을 통해 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 VHH는 Fc의 CH3의 C 말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 VHH는 CH1 도메인에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, CH1 도메인은 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 VHH는 VH 도메인 및 CH1 도메인에 연결되어 있고, CH1 도메인은 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 VL 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 VHH를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH는 VL 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 항원 결합 부위는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 서로 결합하여 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 항원 결합 부위는 제2 VHH를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 VHH는 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 VHH는 힌지 영역을 통해 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 VHH는 Fc의 CH3의 C 말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 VHH는 CH1 도메인에 연결되어 있고, CH1 도메인은 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 VHH는 VH 도메인 및 CH1 도메인에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, CH1 도메인은 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 VH 도메인 및 VL 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 제2 VHH는 VH 도메인에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 제2 VHH는 VL 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 제3 VHH를 포함하는 제3 항원 결합 부위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 VHH는 제1 VHH에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제3 항원 결합 부위는 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제3 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제3 항원 결합 부위는 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제3 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 VEGF, Ang-2, MSLN, GITR 및 PD-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원들 중 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위, 제2 항원 결합 부위, 및 제3 항원 결합 부위는 VEGF, Ang-2, MSLN, GITR, 및 PD-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원들 중 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합한다.
일 측면에서, 본 개시는 (a) 제1 에피토프 및 CH1 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1)을 포함하는 제1 폴리펩티드; (b) 제2 에피토프 및 CL 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 다중특이적 항원 결합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 CH1 도메인 및 CL 도메인을 통해 이량체를 형성한다.
일부 구현예에서, VH 도메인은 VHH1과 CH1 도메인 사이에 위치하고, VL 도메인은 VHH2와 CL 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, VH와 VL은 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, VHH1 및 VHH2는 VEGF, Ang-2, MSLN, GITR, 및 PD-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원들 중 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합한다.
일 측면에서, 본 개시는 (a) 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 VHH(VHH1)를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (b) 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 VHH(VHH2)를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 다중특이적 항원 결합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 이량체를 형성한다.
일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제1 면역글로불린 힌지 영역, 제1 CH2 도메인, 및 제1 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제2 면역글로불린 힌지 영역, 제2 CH2 도메인, 및 제2 CH3 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, VHH1은 제1 면역글로불린 힌지 영역에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, VHH2는 제2 면역글로불린 힌지 영역에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제1 CH1 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH1은 제1 CH1 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 제3 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 (a) 제3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제3 단일 도메인 항체(VHH3); 및 (b) 제1 CL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인 사이의 상호작용을 통해 서로 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제3 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제3 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제2 CH1 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, VHH2는 제2 CH1 도메인에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 (a) 제4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제4 VHH(VHH4); 및 (b) 제2 CL 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드는 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인 사이의 상호작용을 통해 서로 결합한다.
일부 구현예에서, 제2 에피토프 및 제4 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 에피토프 및 제4 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제5 에피토프에 특이적으로 결합하는 제5 VHH(VHH5)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH5는 제1 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제5 에피토프에 특이적으로 결합하는 제5 VHH(VHH5)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH5는 제1 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제6 에피토프에 특이적으로 결합하는 제6 VHH(VHH6)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH6은 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제6 에피토프에 특이적으로 결합하는 제6 VHH(VHH6)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH6은 제2 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 제3 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 제7 에피토프에 특이적으로 결합하는 제7 VHH(VHH7)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH7은 제3 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 제3 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 제7 에피토프에 특이적으로 결합하는 제7 VHH(VHH7)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH7은 제3 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 제4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 폴리펩티드는 제8 에피토프에 특이적으로 결합하는 제8 VHH(VHH8)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH8은 제4 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 제4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 폴리펩티드는 제8 에피토프에 특이적으로 결합하는 제8 VHH(VHH8)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH8은 제4 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있다.
일 측면에서, 본 개시는 (a) 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 VHH(VHH1)를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (b) 제1 중쇄 가변 도메인(VH1) 및 제1 Fab 도메인의 제1 CH1 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제1 Fab 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 이량체를 형성한다.
일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 면역글로불린 힌지 영역, 제1 CH2 도메인, 및 제1 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH1은 제1 면역글로불린 힌지 영역에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 Fab 도메인의 제2 중쇄 가변 도메인 VH(VH2) 및 제2 CH1 도메인, 제1 면역글로불린 힌지 영역, 제1 CH2 도메인, 및 제1 CH3 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, VHH1은 VH2의 N-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, VHH1은 제2 CH1 도메인과 제1 면역글로불린 힌지 영역 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 제2 VHH(VHH2)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH2는 제2 Fab 도메인의 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 면역글로불린 힌지 영역; 제2 CH2 도메인; 및 제2 CH3 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 제3 VHH(VHH3)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH3은 VH1의 N-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 제3 VHH(VHH3)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH3은 제1 CH1 도메인과 제2 면역글로불린 힌지 영역 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 제4 VHH(VHH4)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH4는 제1 Fab 도메인의 제1 경쇄 가변 도메인(VL1)에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제5 에피토프에 특이적으로 결합하는 제5 VHH(VHH5)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH5는 제1 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제5 에피토프에 특이적으로 결합하는 제5 VHH(VHH5)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH5는 제1 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제6 에피토프에 특이적으로 결합하는 제6 VHH(VHH6)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH6은 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제6 에피토프에 특이적으로 결합하는 제6 VHH(VHH6)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VHH6은 제2 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, VHH1, VHH2, VHH3, VHH4, VHH5, VHH6, VHH7, 및/또는 VHH8은 암 관련 항원 또는 암 특이적 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, VHH1, VHH2, VHH3, VHH4, VHH5, VHH6, VHH7, 및/또는 VHH8은 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항원은 VEGF, Ang2, 메소텔린(Mesothelin), GITR, HER2, BRAF, EGFR, VEGFR2, CD20, RANKL, CD38, 및 CD52로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, VHH1, VHH2, VHH3, VHH4, VHH5, VHH6, VHH7, 및/또는 VHH8은 VEGF, Ang2, 메소텔린, 또는 GITR에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, VHH1, VHH2, VHH3, VHH4, VHH5, VHH6, VHH7, 및/또는 VHH8은 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, B7-H3, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, 4-1BB, OX40, GITR, 및 CD40으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일 측면에서, 본 개시는 하기 항원 결합 부위들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질에 관한 것이다:
(a) 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 표적화하는 항원 결합 부위;
(b) 안지오포이에틴-2(Ang-2)를 표적화하는 항원 결합 부위;
(c) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)을 표적화하는 항원 결합 부위; 및/또는
(d) 메소텔린(MSLN)을 표적화하는 항원 결합 부위; 및/또는
(e) 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련 단백질(GITR)을 표적화하는 항원 결합 부위.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 VEGF를 표적화하는 항원 결합 부위 및 Ang-2를 표적화하는 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 VEGF를 표적화하는 항원 결합 부위 및 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 Ang-2를 표적화하는 항원 결합 부위 및 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 VEGF를 표적화하는 항원 결합 부위, Ang-2를 표적화하는 항원 결합 부위, 및 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 VEGF를 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ang-2를 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 MSLN을 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 GITR을 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 PD-1을 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 부위는 VHH를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 5mg/L, 적어도 6mg/L, 적어도 7mg/L, 적어도 8mg/L, 적어도 9mg/L, 적어도 10mg/L, 적어도 20mg/L, 적어도 30mg/L, 적어도 40mg/L, 적어도 50mg/L, 적어도 60mg/L, 적어도 70mg/L, 적어도 80mg/L, 적어도 90mg/L, 적어도 100mg/L, 적어도 110mg/L, 적어도 120mg/L, 적어도 130mg/L, 적어도 140mg/L, 적어도 150mg/L, 적어도 160mg/L, 적어도 170mg/L, 적어도 180mg/L, 적어도 190mg/L, 또는 적어도 200mg/L의 발현 수준으로 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 약 100%(예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된 후)의 순도로 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Tm이 적어도 57℃, 적어도 58℃, 적어도 59℃, 적어도 60℃, 적어도 61℃, 적어도 62℃, 적어도 63℃, 적어도 64℃, 또는 적어도 65℃이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은, VEGF, Ang-2, MSLN, PD-1, 또는 GITR과의 결합에 대한 EC50 값이 0.01μg/ml 미만, 0.02μg/ml 미만, 0.03μg/ml 미만, 0.04μg/ml 미만, 0.05μg/ml 미만, 0.06μg/ml 미만, 0.07μg/ml 미만, 0.08μg/ml 미만, 0.09μg/ml 미만, 0.10μg/ml 미만, 0.11μg/ml 미만, 0.12μg/ml 미만, 0.13μg/ml 미만, 0.14μg/ml 미만, 0.15μg/ml 미만, 0.16μg/ml 미만, 0.17μg/ml 미만, 0.18μg/ml 미만, 0.19μg/ml 미만, 0.20μg/ml 미만, 0.21μg/ml 미만, 0.22μg/ml 미만, 0.23μg/ml 미만, 0.24μg/ml 미만, 0.25μg/ml 미만, 또는 0.30μg/ml 미만이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 동일한 대상을 표적으로 하는 모 항체의 결합 친화도의 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 결합 친화도를 갖는다.
일 측면에서, 본 개시는 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 VEGF-발현 암, Ang-2-발현 암, 및/또는 MSLN-발현 암을 갖는다.
일부 구현예에서, 암은 유방암, 신장암, 흑색종, 폐암, 교모세포종, 두경부암, 전립선암, 난소 암종, 방광 암종, 및 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 개시는 자가면역 질병 또는 염증성 질병을 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일 측면에서, 본 개시는 치료제에 공유 결합된 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 치료제는 세포독성제 또는 세포증식억제제이다.
일 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 항체-약물 접합체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시는 항원 결합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 항원 결합 단백질을 생산하기에 적합한 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질" 또는 "항원 결합 작제물"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 함유하는 단백질을 지칭한다. 항원 결합 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 초과의 폴리펩티드를 가질 수 있다. 항원 결합 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 초과의 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들어, 면역글로불린 경쇄의 3개의 CDR들 중 어느 것, 또는 면역글로불린 중쇄의 3개 CDR들 중 어느 것)을 함유하고, 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항원 결합 분자를 지칭한다. 항체의 비제한적 예로는 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 단일 사슬 항체, 단일 가변 도메인(VHH) 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 및 인간화 항체가 포함된다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체의 Fc 영역을 함유할 수 있다. 용어 항체는 또한 유도체, 예를 들어, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 단일 사슬 항체, 디아바디, 및 이들 항체들 또는 항체 단편들로부터 형성된 선형 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단편"은 항체의 일부가 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 전장 항체의 일부를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 적어도 하나의 가변 도메인(예를 들어, 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL), 또는 VHH)을 함유한다. 항체 단편들의 비제한적 예로는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편들, ScFv, 및 VHH가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 명세서 전반에 걸쳐 혼용되어 사용되며, 본 발명의 방법에 따른 치료가 제공되는 동물, 인간, 또는 비-인간을 기술한다. 수의학적 및 비-수의학적 적용도 본 개시에서 고려된다. 인간 환자는 성인 인간 또는 청소년 인간(예를 들어, 18세 미만의 인간)일 수 있다. 인간 이외에, 환자는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 페럿, 고양이, 개, 및 영장류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 고릴라 등), 설치류(예를 들어, 래트, 마우스, 게르빌루스쥐(gerbil), 햄스터, 페럿, 토끼), 토끼류(lagomorph), 돼지(swine)(예를 들어, 돼지(pig), 미니어처 피그), 말, 개, 고양이, 소, 및 기타 가축, 농장 동물, 및 동물원 동물이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항원 결합 단백질, 항체 또는 항원 결합 단편을 언급할 때, "특이적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합하다"라는 문구는, 항체 또는 항원 결합 단편이 바람직하게는 다른 분자들보다 이의 표적 분자와 상호작용한다는 것을 의미하며, 그 이유는 상기 상호작용이 표적 분자 상의 특정 구조(즉, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존하기 때문이고; 즉, 시약이 일반적으로 모든 분자가 아닌 특정 구조를 포함하는 분자를 인식하고 이에 결합하기 때문이다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 표적 특이적 항체로 지칭할 수 있다. 예를 들어, PD-1에 특이적으로 결합하는 항체를 PD1 특이적 항체 또는 항-PD1 항체로 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이중특이적 항체"는 2개의 상이한 에피토프들에 결합하는 항체를 지칭한다. 에피토프는 동일한 항원 또는 상이한 항원들 상에 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "삼중특이적 항체"는 3개의 서로 다른 에피토프들에 결합하는 항체를 지칭한다. 에피토프는 동일한 항원 또는 상이한 항원들 상에 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "다중특이적 항체"는 2개 이상의 서로 다른 에피토프들에 결합하는 항체를 지칭한다. 에피토프는 동일한 항원 또는 상이한 항원들 상에 있을 수 있다. 다중특이적 항체는, 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 초과의 서로 다른 에피토프들에 결합한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "VHH"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 가변 도메인을 지칭한다. 이는 중쇄 항체 또는 단일 도메인 항체(나노바디)의 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, VHH는 인간화 VHH이다. VHH 자체가 항원에 결합할 수 있기 때문에, VHH는 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 나노바디로도 알려져 있다. VHH는, 예를 들어, 단봉낙타, 낙타, 라마, 알파카 또는 상어의 면역화, 파지 디스플레이 라이브러리, 또는 항체 공학으로부터 얻을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "가(valent)"는 항원 결합 단백질 또는 항체 분자에서 특정 결합 부위 수를 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체 또는 전장 항체는 2개의 결합 부위들을 가지며, 2가이다. 이와 같이, 용어 "3가", "4가", "5가", 및 "6가"는 항체 또는 항원 결합 단백질에서 각각 2개의 결합 부위들, 3개의 결합 부위들, 4개의 결합 부위들, 5개의 결합 부위들, 및 6개의 결합 부위들이 존재함을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "Fc 영역"은 항체의 단편 결정화 가능 영역(fragment crystallizable region)을 지칭한다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변경된 Fc 영역일 수 있다. Fc는, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgA, IgD, IgE 및 IgM과 같은 다른 부류들을 포함하는 다양한 면역글로불린들로부터 유래할 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "연결하다(link)"는 폴리펩티드가 하나 이상의 공유 결합을 통해 또 다른 폴리펩티드에 연결됨을 의미한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 이황화 결합에 의해 또 다른 폴리펩티드에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 펩티드 링커 서열을 통해 또 다른 폴리펩티드에 연결되어 있다. 펩티드 링커 서열에는 하나 이상의 아미노산이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 폴리펩티드들은 이들 사이에 임의의 펩티드 링커 서열들 없이 펩티드 결합을 통해 직접 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 융합에 의해 또 다른 폴리펩티드에 연결되어 융합 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 많은 경우에, 융합 폴리펩티드들은 이들 폴리펩티드들을 암호화하는 둘 이상의 핵산 서열들의 연결을 통해 생성된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 임의의 펩티드 링커 서열 없이 또 다른 폴리펩티드에 직접 융합된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 펩티드 링커 서열을 사용하여 또 다른 폴리펩티드에 융합된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에서의 사용을 위해 본원에 기재되어 있으며; 당업계에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료도 사용될 수 있다. 재료, 방법, 및 예시는 실례일 뿐, 한정하려는 것이 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 기타 참고문헌은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다. 서로 상충하는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 다음의 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 자명할 것이다.
도 1a는 본 개시내용에 기재된 다중특이적 항원 결합 단백질들의 구조적 요소들의 개략도를 보여주는 표이다.
도 1b는 W366001-T1U1.F82-1.uIgG4V1(또는 "F82")의 개략적인 구조이다.
도 1c는 W366001-T1U1.F83-1.uIgG4V1(또는 "F83")의 개략적인 구조이다.
도 1d는 W366001-U1T1.F84-1.uIgG4V1(또는 "F84")의 개략적인 구조이다.
도 1e는 W366001-U1T1.G1-1.uIgG4V1(또는 "G1")의 개략적인 구조이다.
도 1f는 W366001-U1T1.G32-1.uIgG4V1(또는 "G32")의 개략적인 구조이다.
도 1g는 W366001-U1T1.G33-1.uIgG4V1(또는 "G33")의 개략적인 구조이다.
도 1h는 W366001-U1T1.H9-1.uIgG4V1(또는 "H9")의 개략적인 구조이다.
도 2a는 F82의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 2b는 F82의 SEC 결과를 나타낸다.
도 2c는 F82의 용융 곡선을 나타낸다.
도 2d는 F82, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 2e는 F82, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 3a는 F83의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 3b는 F83의 SEC 결과를 나타낸다.
도 3c는 F83의 용융 곡선을 나타낸다.
도 3d는 F83, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 3e는 F83, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 4a는 F84의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 4b는 F84의 SEC 결과를 나타낸다.
도 4c는 F84의 용융 곡선을 나타낸다.
도 4d는 F84, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 4e는 F84, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 5a는 G1의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5b는 G1의 SEC 결과를 나타낸다.
도 5c는 G1의 용융 곡선을 나타낸다.
도 5d는 G1, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 5e는 G1, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 6a는 G32의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 6b는 G32의 SEC 결과를 나타낸다.
도 6c는 G32의 용융 곡선을 나타낸다.
도 6d는 G32, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 6e는 G32, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 7a는 G33의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 7b는 G33의 SEC 결과를 나타낸다.
도 7c는 G33의 용융 곡선을 나타낸다.
도 7d는 G33, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 7e는 G33, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 8a는 H9의 겔 전기영동 결과를 나타낸다. 레인 1은 정제 전의 상청액 샘플이다.
도 8b는 H9의 SEC 결과를 나타낸다.
도 8c는 H9의 용융 곡선을 나타낸다.
도 8d는 H9, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 8e는 H9, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 9a는 W366001-T1U1.E32-1.uIgG4V1(또는 "E32")의 개략적인 구조이다.
도 9b는 W366001-U1T1.G44-1.uIgG4V1(또는 "G44")의 개략적인 구조이다.
도 9c는 W366001-U1T1.G45-1.uIgG4V1(또는 "G45")의 개략적인 구조이다.
도 9d는 W366001-U1T1.G46-1.uIgG4V1(또는 "G46")의 개략적인 구조이다.
도 9e는 W366001-U1T1.H14-1.uIgG4V1(또는 "H14")의 개략적인 구조이다.
도 9f는 W366001-U1T1.H6-1.uIgG4V1(또는 "H6")의 개략적인 구조이다.
도 10a는 E32의 겔 전기영동 결과를 나타낸다. M은 단백질 마커이다.
도 10b는 E32의 SEC 결과를 나타낸다.
도 10c는 E32의 용융 곡선을 나타낸다.
도 10d는 E32, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 10e는 E32, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 11a는 G44의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 11b는 G44의 SEC 결과를 나타낸다.
도 11c는 G44의 용융 곡선을 나타낸다.
도 11d는 G44, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 11e는 G44, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 12a는 G45의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 12b는 G45의 SEC 결과를 나타낸다.
도 12c는 G45의 용융 곡선을 나타낸다.
도 12d는 G45, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 12e는 G45, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 13a는 G46의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 13b는 G46의 SEC 결과를 나타낸다.
도 13c는 G46의 용융 곡선을 나타낸다.
도 13d는 G46, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 13e는 G46, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 14a는 H14의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 14b는 H14의 SEC 결과를 나타낸다.
도 14c는 H14의 용융 곡선을 나타낸다.
도 14d는 H14, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 14e는 H14, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 15a는 H6의 겔 전기영동 결과를 나타낸다. M과 N으로 표시된 두 레인들 사이의 레인은 정제 전의 상청액 샘플이다.
도 15b는 H6의 SEC 결과를 나타낸다.
도 15c는 H6의 용융 곡선을 나타낸다.
도 15d는 H6, W366001-cAb1 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 15e는 H6, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 16a는 W366002-U12T1.E28-1.uIgG4V1(또는 "E28")의 개략적인 구조이다.
도 16b는 W366002-T1U12.F43-1.uIgG4V1(또는 "F43")의 개략적인 구조이다.
도 16c는 W366002-U12T1.F85R-1.uIgG4V1(또는 F85R)의 개략적인 구조이다.
도 16d는 W366002-U12T1.F45R-1.uIgG4V1(또는 "F45R")의 개략적인 구조이다.
도 16e는 W366002-U12T1.G58-1.uIgG4V1(또는 "G58")의 개략적인 구조이다.
도 16f는 W366002-T1U12.H27-1.uIgG4V1(또는 "H27")의 개략적인 구조이다.
도 16g는 W366002-T1U12.H22-1.uIgG4V1(또는 "H22")의 개략적인 구조이다.
도 16h는 W366002-T1U12.G47-1.uIgG4V1(또는 "G47")의 개략적인 구조이다.
도 17a는 E28의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 17b는 E28의 SEC 결과를 나타낸다.
도 17c는 E28의 용융 곡선을 나타낸다.
도 17d는 E28, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 17e는 E28, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 18a는 F43의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 18b는 F43의 SEC 결과를 나타낸다.
도 18c는 F43의 용융 곡선을 나타낸다.
도 18d는 F43, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 18e는 F43, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 19a는 F85R의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 19b는 F85R의 SEC 결과를 나타낸다.
도 19c는 F85R의 용융 곡선을 나타낸다.
도 19d는 F85R, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 19e는 F85R, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 20a는 F45R의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 20b는 F45R의 SEC 결과를 나타낸다.
도 20c는 F45R의 용융 곡선을 나타낸다.
도 20d는 F45R, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 20e는 F45R, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 21a는 G58의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 21b는 G58의 SEC 결과를 나타낸다.
도 21c는 G58의 용융 곡선을 나타낸다.
도 21d는 G58, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 21e는 G58, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 22a는 H27의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 22b는 H27의 SEC 결과를 나타낸다.
도 22c는 H27의 용융 곡선을 나타낸다.
도 22d는 H27, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 22e는 H27, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 23a는 H22의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 23b는 H22의 SEC 결과를 나타낸다.
도 23c는 H22의 용융 곡선을 나타낸다.
도 23d는 H22, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 23e는 H22, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 24a는 G47의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 24b는 G47의 SEC 결과를 나타낸다.
도 24c는 G47의 용융 곡선을 나타낸다.
도 24d는 G47, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 24e는 G47, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 25a는 W366003-T1U1W1.I23-1.uIgG4V1(또는 "I23")의 개략적인 구조이다.
도 25b는 W366003-T1U1W1.L52-1.uIgG4V1(또는 "L52")의 개략적인 구조이다.
도 25c는 W366003-T1U1W3.L1-1.uIgG4V1(또는 "L1")의 개략적인 구조이다.
도 25d는 W366003-T1W1U1.H27-1.uIgG4V1(또는 "H27-1")의 개략적인 구조이다.
도 25e는 W366003-T1U1W3.L54-1.uIgG4V1(또는 "L54")의 개략적인 구조이다.
도 25f는 W366003-T1U1W3.L55-1.uIgG4V1(또는 "L55")의 개략적인 구조이다.
도 25g는 W366003-T1U1W3.L56-1.uIgG4V1(또는 "L56")의 개략적인 구조이다.
도 25h는 W366003-T1U1W1.L51-1.uIgG4V1(또는 "L51")의 개략적인 구조이다.
도 25i는 W366003-T1U1W1.L57-1.uIgG4V1(또는 "L57")의 개략적인 구조이다.
도 25j는 W366003-T1U1W1.L58-1.uIgG4V1(또는 "L58")의 개략적인 구조이다.
도 26a는 I23의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 26b는 I23의 SEC 결과를 나타낸다.
도 26c는 I23의 용융 곡선을 나타낸다.
도 26d는 I23, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 26e는 I23, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 26f는 I23, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 27a는 L52의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 27b는 L52의 SEC 결과를 나타낸다.
도 27c는 L52의 용융 곡선을 나타낸다.
도 27d는 L52, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 27e는 L52, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 27f는 L52, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 28a는 L1의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 28b는 L1의 SEC 결과를 나타낸다.
도 28c는 L1의 용융 곡선을 나타낸다.
도 28d는 L1, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 28e는 L1, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 28f는 L1, W366001-cAb5, 및 W366001-cAb6의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb5(1가 버전) 및 W366001-cAb6(2가 버전)은 MSLN을 표적화하는 모 항체들이다.
도 29a는 H27-1의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 29b는 H27-1의 SEC 결과를 나타낸다.
도 29c는 H27-1의 용융 곡선을 나타낸다.
도 29d는 H27-1, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 29e는 H27-1, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 29f는 H27-1, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 30a는 L54의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 30b는 L54의 SEC 결과를 나타낸다.
도 30c는 L54의 용융 곡선을 나타낸다.
도 30d는 L54, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 30e는 L54, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 30f는 L54, W366001-cAb5, 및 W366001-cAb6의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb5(1가 버전) 및 W366001-cAb6(2가 버전)은 MSLN을 표적화하는 모 항체들이다.
도 31a는 L55의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 31b는 L55의 SEC 결과를 나타낸다.
도 31c는 L55의 용융 곡선을 나타낸다.
도 31d는 L55, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 31e는 L55, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 31f는 L55, W366001-cAb5, 및 W366001-cAb6의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb5(1가 버전) 및 W366001-cAb6(2가 버전)은 MSLN을 표적화하는 모 항체들이다.
도 32a는 L56의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 32b는 L56의 SEC 결과를 나타낸다.
도 32c는 L56의 용융 곡선을 나타낸다.
도 32d는 L56, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 32e는 L56, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 32f는 L56, W366001-cAb5, 및 W366001-cAb6의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb5(1가 버전) 및 W366001-cAb6(2가 버전)은 MSLN을 표적화하는 모 항체들이다.
도 33a는 L51의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 33b는 L51의 SEC 결과를 나타낸다.
도 33c는 L51의 용융 곡선을 나타낸다.
도 33d는 L51, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 33e는 L51, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 33f는 L51, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 34a는 L57의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 34b는 L57의 SEC 결과를 나타낸다.
도 34c는 L57의 용융 곡선을 나타낸다.
도 34d는 L57, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 34e는 L57, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 34f는 L57, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 35a는 L58의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 35b는 L58의 SEC 결과를 나타낸다.
도 35c는 L58의 용융 곡선을 나타낸다.
도 35d는 L58, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 35e는 L58, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 35f는 L58, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 36a는 W366004-T1U1W1X1.N1-1.uIgG4V1(또는 "N1")의 개략적인 구조이다.
도 36b는 W366004-T1U1W1X1.N2-1.uIgG4V1(또는 "N2")의 개략적인 구조이다.
도 36c는 W366004-T1U1W1X1.N3-1.uIgG4V1(또는 "N3")의 개략적인 구조이다.
도 36d는 W366004-T1U1W1X1.N4-1.uIgG4V1(또는 "N4")의 개략적인 구조이다.
도 37a는 N1의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 37b는 N1의 SEC 결과를 나타낸다.
도 37c는 N1의 용융 곡선을 나타낸다.
도 37d는 N1, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 37e는 N1, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 37f는 N1, W366001-cAb5, 및 W366001-cAb6의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb5(1가 버전) 및 W366001-cAb6(2가 버전)은 MSLN을 표적화하는 모 항체들이다.
도 37g는 N1, W366001-cAb7, 및 W366001-cAb8의 GITR 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb7(1가 버전) 및 W366001-cAb8(2가 버전)은 GITR을 표적화하는 모 항체들이다.
도 38a는 N2의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 38b는 N2의 SEC 결과를 나타낸다.
도 38c는 N2의 용융 곡선을 나타낸다.
도 38d는 N2, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 38e는 N2, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 38f는 N2, W366001-cAb5, 및 W366001-cAb6의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb5(1가 버전) 및 W366001-cAb6(2가 버전)은 MSLN을 표적화하는 모 항체들이다.
도 38g는 N2, W366001-cAb7, 및 W366001-cAb8의 GITR 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb7(1가 버전) 및 W366001-cAb8(2가 버전)은 GITR을 표적화하는 모 항체들이다.
도 39a는 N3의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 39b는 N3의 SEC 결과를 나타낸다.
도 39c는 N3의 용융 곡선을 나타낸다.
도 39d는 N3, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 39e는 N3, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 39f는 N3, W366001-cAb5, 및 W366001-cAb6의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb5(1가 버전) 및 W366001-cAb6(2가 버전)은 MSLN을 표적화하는 모 항체들이다.
도 39g는 N3, W366001-cAb11, 및 W366001-cAb12의 PD-1 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb11(1가 버전) 및 W366001-cAb12(2가 버전)는 PD-1을 표적화하는 모 항체들이다.
도 40a는 N4의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 40b는 N4의 SEC 결과를 나타낸다.
도 40c는 N4의 용융 곡선을 나타낸다.
도 40d는 N4, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 40e는 N4, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 40f는 N4, W366001-cAb5, 및 W366001-cAb6의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb5(1가 버전) 및 W366001-cAb6(2가 버전)은 MSLN을 표적화하는 모 항체들이다.
도 40g는 N4, W366001-cAb7, 및 W366001-cAb8의 GITR 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb7(1가 버전) 및 W366001-cAb8(2가 버전)은 GITR을 표적화하는 모 항체들이다.
도 41a는 W366003-T1U1W1.D38-1.His(또는 "D38")의 개략적인 구조이다.
도 41b는 D38의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 41c는 D38의 SEC 결과를 나타낸다.
도 41d는 D38의 용융 곡선을 나타낸다.
도 42a-b는 추가적인 다중특이적 항원 결합 단백질 포맷의 개략적인 구조를 나타낸다.
도 43a는 W366000-T1.V1-1.uIgG4V1(또는 "V1")의 개략적인 구조이다.
도 43b는 W366000-T1.V2-1.uIgG4V1(또는 "V2")의 개략적인 구조이다.
도 44a는 V1의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 44b는 V1의 SEC 결과를 나타낸다.
도 44c는 V1의 용융 곡선을 나타낸다.
도 44d는 V1, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 45a는 V2의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 45b는 V2의 SEC 결과를 나타낸다.
도 45c는 V2의 용융 곡선을 나타낸다.
도 45d는 V2, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 46a는 W366001-U1T1.H39-1.uIgG4V1(또는 "H39")의 개략적인 구조이다.
도 46b는 W366001-U1T1.H40-1.uIgG4V1(또는 "H40")의 개략적인 구조이다.
도 46c는 W366001-U1T1.V14-1.His(또는 "V14")의 개략적인 구조이다.
도 46d는 W366001-U1T1.V15-1.His(또는 "V15")의 개략적인 구조이다.
도 46e는 W366001-U1T1.V16-1.His(또는 "V16")의 개략적인 구조이다.
도 46f는 W366001-U1T1.V11-1.His(또는 "V11")의 개략적인 구조이다.
도 47a는 H39의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 47b는 H39의 SEC 결과를 나타낸다.
도 47c는 H39의 용융 곡선을 나타낸다.
도 47d는 H39, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 47e는 H39, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 48a는 H40의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 48b는 H40의 SEC 결과를 나타낸다.
도 48c는 H40의 용융 곡선을 나타낸다.
도 48d는 H40, W366001-cAb1, 및 W366001-cAb2의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb1(1가 버전) 및 W366001-cAb2(2가 버전)는 VEGF를 표적화하는 모 항체들이다.
도 48e는 H40, W366001-cAb3, 및 W366001-cAb4의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다. W366001-cAb3(1가 버전) 및 W366001-cAb4(2가 버전)는 Ang-2를 표적화하는 모 항체들이다.
도 49a는 V14의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 49b는 V14의 SEC 결과를 나타낸다.
도 49c는 V14의 용융 곡선을 나타낸다.
도 49d는 V14의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 49e는 V14의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 50a는 V15의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 50b는 V15의 SEC 결과를 나타낸다.
도 50c는 V15의 용융 곡선을 나타낸다.
도 50d는 V15의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 50e는 V15의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 51a는 V16의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 51b는 V16의 SEC 결과를 나타낸다.
도 51c는 V16의 용융 곡선을 나타낸다.
도 51d는 V16의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 51e는 V16의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 52a는 V11의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 52b는 V11의 SEC 결과를 나타낸다.
도 52c는 V11의 용융 곡선을 나타낸다.
도 52d는 V11의 VEGF 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 52e는 V11의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 53a는 W366003-U1W3X1.D1-1(또는 "D1")의 개략적인 구조이다.
도 53b는 W366003-U1W3X1.D2-1.His(또는 "D2")의 개략적인 구조이다.
도 53c는 W366003-U1W3X1.D3-1.His(또는 "D3")의 개략적인 구조이다.
도 53d는 W366003-U1W3X1.D43-1.His(또는 "D43")의 개략적인 구조이다.
도 53e는 W366003-U1W3X1.D44-1.His(또는 "D44")의 개략적인 구조이다.
도 54a는 D1의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 54b는 D1의 SEC 결과를 나타낸다.
도 54c는 D1의 용융 곡선을 나타낸다.
도 54d는 D1의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 54e는 D1의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 54f는 D1의 GITR 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 55a는 D2의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 55b는 D2의 SEC 결과를 나타낸다.
도 55c는 D2의 용융 곡선을 나타낸다.
도 55d는 D2의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 55e는 D2의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 55f는 D2의 GITR 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 56a는 D3의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 56b는 D3의 SEC 결과를 나타낸다.
도 56c는 D3의 용융 곡선을 나타낸다.
도 56d는 D3의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 56e는 D3의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 56f는 D3의 GITR 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 57a는 D43의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 57b는 D43의 SEC 결과를 나타낸다.
도 57c는 D43의 용융 곡선을 나타낸다.
도 57d는 D43의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 57e는 D43의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 57f는 D43의 GITR 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 58a는 D44의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 58b는 D44의 SEC 결과를 나타낸다.
도 58c는 D44의 용융 곡선을 나타낸다.
도 58d는 D44의 Ang-2 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 58e는 D44의 MSLN 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
도 58f는 D44의 GITR 결합 결과를 나타낸다. NC는 음성 대조군이다.
다중특이적 항체들의 사용 범위는 광범위하지만, 다중특이적 항체들을 개발하고 제조하는 것은 여전히 어려운 과제이다. 예를 들어, 항원 결합 부위들이 경쇄 및 중쇄(VL, VH)의 가변 도메인에 의해 구축된다는 사실 때문에 이중특이적 IgG 분자들의 생성은 어렵다. 이중특이적 IgG 항체는 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄를 필요로 하고, 적어도 2개의 상이한 항원 결합 부위들의 존재로 인해 비대칭성을 나타낸다. 하나의 세포에서 발현된 2개의 항체들의 중쇄 및 경쇄의 무차별적 페어링은 이론적으로 16가지의 상이한 조합들(10가지의 상이한 분자들)을 생성할 수 있으며, 단 하나만 이중특이적이고, 나머지 페어링은 비기능성 또는 단일특이적 분자들을 생성한다. 예를 들어, 중쇄와 경쇄 및 2개의 상이한 중쇄들 사이에 정확한 결합 부위들의 정확한 조립을 지시하고 강제하는 것은 다중특이적 항체들의 생성 과제 중 하나이다.
본 개시는 다목적 다중특이적 항체 플랫폼을 제공한다. 특히, 다중특이적 항원 결합 단백질들의 항원 결합 부위는 적절하게 폴딩될 수 있고, 항원과 높은 결합 친화력을 유지할 수 있다. 또한, 본원에 설명된 방법들은 페어링 오류 가능성을 크게 줄일 수 있다. 또한, 본 개시는 이러한 다중특이적 및 다가 항원 결합 단백질들이 쉽게 높은 수준으로 발현될 수 있고, 용이하게 정제 및 제조될 수 있음을 입증한다.
다중특이적 항원 결합 단백질들
다중특이적 항원 결합 단백질은 2개 이상의 상이한 유형의 에피토프들에 동시에 결합할 수 있는 인공 단백질이다. 에피토프들은 동일한 항원 또는 상이한 항원들에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 단백질은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상의 항원 결합 부위들을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 1개의 중쇄 가변 영역(VH) 및 1개의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 하나의 VHH를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 이들 항원 결합 단백질들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 12개 초과의 VHH를 포함하거나 이로 이루어진다.
VHH는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 가변 도메인이다. 이는 중쇄 항체 또는 단일 도메인 항체의 가변 도메인이다. 중쇄 항체는 2개의 중쇄만을 가지고 있으며, CH1 영역은 없지만 N-말단에는 여전히 항원 결합 도메인이 있다. 중쇄 항체는 종종 낙타류(camelid)로부터 얻는다. 모든 포유동물들과 마찬가지로, 낙타류(예를 들어, 라마)는 Y 모양의 이황화 결합으로 함께 결합된 2개의 중쇄들과 2개의 경쇄들로 구성된 기존의 항체들(예를 들어, IgG1)을 생산할 수 있다. 그러나, 이는 또한 중쇄 항체로도 알려진, 두 가지 고유한 IgG 하위부류들: IgG2 및 IgG3을 생성한다. 기존의 Ig는 항원-항체 상호작용의 높은 다양성을 허용하기 위해 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역들의 결합을 필요로 한다. 단리된 중쇄 및 경쇄는 여전히 이러한 능력을 나타내지만, 페어링된 중쇄 및 경쇄와 비교할 때 친화력이 매우 낮다. 중쇄 항체의 고유한 특징은 다른 영역과 페어링할 필요 없이 기존 항체들에 필적하는 특이성, 친화성 및 특히 다양성으로 항원들에 결합하는 단량체 항원 결합 영역들의 능력이다. 이 특징은 주로 기존의 Ig와 비교할 때 깊은 입체형태 변화(deep conformational change)를 유도하는 두 개의 중쇄들의 가변 영역의 아미노산 서열 내의 몇 가지 주요 변이들 때문이다.
이들 항체들의 단일 가변 도메인(VHH, sdAb, 나노바디, 또는 중쇄 항체 가변 도메인으로 지정됨)은 적응 면역 시스템에 의해 생성된 가장 작은 항원 결합 도메인이다. 이들 항체들의 가변 영역 중 제3 상보성 결정 영역(CDR3)은 기존의 것보다 2배 더 긴 것으로 종종 밝혀졌다. 이는 항원과의 상호작용 표면을 증가시킬 뿐만 아니라 항원-항체 상호작용의 다양성을 증가시켜 경쇄의 부재를 보상한다. 긴 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 통해, VHH는 효소의 활성 부위 또는 바이러스 표면의 수용체 결합 협곡(receptor-binding canyon)과 같은 기능적으로 흥미로운 부위들을 포함하여, 기존 항체들에 접근할 수 없는 단백질의 틈새로 확장될 수 있다. 또한, 추가 시스테인 잔기는 구조를 보다 안정하게 하여 상호작용의 강도를 증가시킨다.
VHH는 기존 항체들의 가변 도메인들(VH 및 VL)을 보유하는 기존 항체들에 비해 더 높은 안정성, 용해도, 발현 수율, 및 리폴딩(refolding) 능력뿐만 아니라 더 나은 생체내 조직 침투를 포함하여 많은 다른 이점들을 제공한다. 또한, 기존 항체들의 VH 도메인들과 대조적으로 VHH는 경쇄에 결합하는 본질적인 경향을 나타내지 않는다. 이는 기능적 경쇄 유전자좌의 존재 하에 중쇄 항체들의 유도를 용이하게 한다. 또한, VHH가 VL 도메인에 결합하지 않기 때문에, 기존의 VH-VL 쌍 또는 VH 도메인을 기반으로 하는 단일 도메인을 포함하는 작제물보다 VHH를 다중특이적 항체 작제물로 재구성(reformat)하는 것이 훨씬 쉽다.
본 개시는 하나 이상의 VHH를 포함하는 다중특이적 항원 결합 단백질들에 대한 다양한 포맷들을 제공한다. 이들 포맷들 중 다수는 도 1b-1h, 도 9a-9f, 도 16a-16h, 도 25a-25j, 도 36a-36d, 및 도 41a에 도시되어 있다. 구조 요소들의 개략도는 도 1a에 도시되어 있다. 추가 포맷들은 도 42a-b에 도시되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 12개 초과의 VHH를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 12개 초과의 항원 결합 부위를 추가로 포함하며, 이때 이들 항원 결합 부위들은 한 쌍의 VH 및 VL에 의해 형성된다.
일부 구현예에서, 이들 항원 결합 부위들은 함께 융합된다. 일부 구현예에서, 이들 항원 결합 부위들은 스캐폴드(예를 들어, 폴리펩티드, 전장 항체, Fc)에 부착된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH 및/또는 하나 이상의 VH/VL 쌍이 Fc에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH 및/또는 하나 이상의 VH/VL 쌍은 링커 서열, 즉 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열을 통해 Fc에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 힌지 영역 서열, CH1, 또는 CL이다. 일부 구현예에서, Fc는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 다양한 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 하위부류에서 유래할 수 있는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 유래한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 1, 2, 3, 4개, 또는 그 이상의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 전장 항체(예를 들어, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 전장 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 전장 항체는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 이루어진 전장 단클론 항체이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH 및/또는 하나 이상의 VH/VL 쌍은 중쇄의 C 말단에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH 및/또는 하나 이상의 VH/VL 쌍은 중쇄의 N 말단에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH 및/또는 하나 이상의 VH/VL 쌍은 경쇄의 C 말단에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH 및/또는 하나 이상의 VH/VL 쌍은 경쇄의 N 말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 다양한 항체 변이체들(유도체들 및 접합체들 포함) 또는 항체 단편들 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체들 또는 항체 단편들로부터 유래될 수 있다. 본원에서 제공되는 이들 항체들은, 예를 들어, 다클론, 단클론, 다중특이적(다량체, 예를 들어, 이중특이적), 인간 항체들, 키메라 항체들(예를 들어, 인간-마우스 키메라), 단일 사슬 항체들, 세포내에서 제조된 항체들(즉, 인트라바디들), 및 이들의 항원 결합 단편들을 포함한다.
다중특이적 항원 결합 단백질들에 대한 다양한 포맷들이 제공된다. 일 측면에서, 본 개시는 다중특이적 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 6개 초과의 Fc를 포함하거나 이로 이루어진다. Fc는 단백질 스캐폴드의 역할을 할 수 있으며, 이때 하나 이상의 VHH는 단백질 스캐폴드에 직접 또는 간접적으로 연결, 부착, 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 12개 초과의 VHH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질에서 VHH 대 Fc의 비율은 적어도 또는 약 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 또는 1:1이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 12개 초과의 VH-VL 쌍을 포함하거나 이로 이루어지며, 이때 VH와 VL은 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질에서 VHH 대 VH-VL 쌍의 비율은 적어도 또는 약 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 또는 1:4이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Fc를 갖지 않는다. 항원 결합 단백질에서 VHH 대 VH-VL 쌍의 비율은 적어도 또는 약 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 또는 1:4이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH는 VH, CH1, CH2, CH3, CH4에, 예를 들어 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 연결되거나, 융합되거나, 부착된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH는 VL 또는 CL에, 예를 들어 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 연결되거나, 융합되거나, 부착된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH는 다른 VHH에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 연결되어 있다.
VHH는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, VHH는 본원에 기재된 바와 같은 링커 서열을 통해 폴리펩티드에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH는 CH3의 C 말단에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH는 CH1 또는 CL의 C 말단에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH는 CH2의 N 말단에 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 VHH는 VH 또는 VL의 N 말단에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 8개 초과의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 이들 폴리펩티드들은 CH2 도메인들 및/또는 CH3 도메인들을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 CH1 도메인들을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 CL 도메인들을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 12개 초과의 VHH를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 12개 초과의 VH 또는 VL을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Fab-유사 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Fab-유사(Fab-like)" 도메인은 CH1 및 CL을 포함하는 구조를 지칭하며, 이때 CH1 및 CL은 서로 결합하여 이량체를 형성한다. 일부 구현예에서, VHH는 CH1에 연결되어 있고, VHH는 CL에 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 VH와 VL을 포함하거나 이로 이루어진 제1 항원 결합 부위, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어진 제2 항원 결합 부위를 포함하거나 이로 이루어지며, 이때 제1 항원 결합 부위와 제2 항원 결합 부위는 서로 연결, 융합, 또는 부착되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 1b에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제2 폴리펩티드의 2개의 VHH들은 Ang-2를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 1c에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제2 및 제3 폴리펩티드의 VHH들은 Ang-2를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제3 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 1d에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제3 VHH는 Ang-2를 표적화하고; 제2 VHH는 VEGF를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 1e에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제1 VHH들은 Ang-2를 표적화하고; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제2 VHH들은 VEGF를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 1f에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제1 VHH들은 Ang-2를 표적화하고; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제2 VHH들은 VEGF를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 1g에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 VHH들은 VEGF를 표적화하고; 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 VHH들은 Ang-2를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 1h에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 2개의 제1 VHH들은 Ang-2를 표적화하고; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 2개의 제2 VHH들은 VEGF를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 9a에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고, 제2 폴리펩티드의 VHH는 Ang-2를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 9b에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제2 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 제1 VHH, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 VHH들은 Ang-2를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 9c에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 및 제4 폴리펩티드의 VHH들은 Ang-2를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 9d에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제1 VHH, 제2 폴리펩티드의 제1 VHH 및 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 제2 VHH는 VEGF를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 9e에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제1 VHH들, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 VHH들은 Ang-2를 표적화하고; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제2 VHH들은 VEGF를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 9f에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 2개의 제1 VHH들은 Ang-2를 표적화하고; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제2 VHH들은 VEGF를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 16a에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 VH와 제3 폴리펩티드의 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제1 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 16b에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 VH와 제1 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제1 항원 결합 부위를 형성하고; 제2 VH와 제2 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제2 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 16c에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드의 2개의 VHH들은 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 VH와 제2 폴리펩티드의 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, VL, 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 16d에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제2 폴리펩티드의 VH와 제3 폴리펩티드의 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VH, 제1 CH1 도메인, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 제1 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VH, 제2 CH1 도메인, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 제2 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 16e에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 VH와 제1 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제1 항원 결합 부위를 형성하고; 제2 VH와 제2 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제1 VH, 제1 CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어진다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 제1 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제3 VHH, 제2 VH, 제2 CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제4 VHH를 포함하거나 이로 이루어진다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 제2 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 16f에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 제3 VHH, 및 제4 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 VH와 제1 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제1 항원 결합 부위를 형성하고; 제2 VH와 제2 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제1 VH, 제1 CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제1 VL 및 제1 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제2 VH, 제2 CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제2 VL, 및 제2 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 16g에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 VH 및 제1 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제1 항원 결합 부위를 형성하고; 제2 VH와 제2 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 16h에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; VH와 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제2 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25a에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드의 제1 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제3 폴리펩티드의 제1 VHH는 Ang-2를 표적화하며; VH와 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제1 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25b에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제1 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제2 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제1 VH 및 제1 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제1 항원 결합 부위를 형성하고; 제2 VH와 제2 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제3 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제3 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25c에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제1 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제3 VHH들은 MSLN을 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제1 VH, 제1 CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어진다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 제1 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제3 VHH, 제2 VH, 제2 CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제4 VHH를 포함하거나 이로 이루어진다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 제2 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25d에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제3 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제2 VHH 및 제4 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제1 VH와 제1 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제1 항원 결합 부위를 형성하고; 제2 VH와 제2 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25e에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제1 VHH 및 제2 폴리펩티드의 제1 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제2 폴리펩티드의 제2 VHH는 MSLN을 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25f에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 Ang-2를 표적화하고; 제2 폴리펩티드의 VHH는 MSLN을 표적화하며; 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25g에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제1 VHH 및 제3 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제2 폴리펩티드의 VHH는 MSLN을 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제1 VH, 제1 CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 제1 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제2 VH, 제2 CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 제2 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25h에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제3 폴리펩티드의 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제1 VH와 제1 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제1 항원 결합 부위를 형성하고; 제2 VH와 제2 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25i에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제1 VHH 및 제2 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; VH와 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VH, 제1 CH1 도메인, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 제1 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VH, 제2 CH1 도메인, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 제2 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 25j에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제3 폴리펩티드의 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제1 VH와 제1 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제1 항원 결합 부위를 형성하고; 제2 VH와 제2 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 36a에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제1 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제2 폴리펩티드의 VHH는 MSLN을 표적화하고; 제3 폴리펩티드의 VHH는 GITR을 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 36b에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제1 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제2 폴리펩티드의 제1 VHH는 MSLN을 표적화하고; 제2 폴리펩티드의 제2 VHH는 GITR을 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 3개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 36c에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 제1 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제2 폴리펩티드의 VHH는 MSLN을 표적화하고; VH와 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 제3 VHH, 및 제4 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 제3 VHH, 및 제4 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 36d에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제1 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제2 VHH는 Ang-2를 표적화하며; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제3 VHH는 MSLN을 표적화하고; 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 제4 VHH는 GITR을 표적화한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, VH, 및 CH1 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, VL, 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 41a에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH는 VEGF를 표적화하고; 제2 폴리펩티드의 VHH는 Ang-2를 표적화하며; VH와 VL은 서로 결합하여 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 43a에서 V1로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 43b에서 V2로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V2R로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 3개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 3개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V3으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V4로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 3개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 3개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V5로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 3개의 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 3개의 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V5R로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 4개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 4개의 VHH들, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V6으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V7로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V8로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 VHH들 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V9로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V10으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 46a에서 H39로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, KIH 돌연변이들이 도입된다(예를 들어, CH3 도메인들에 도입된다). 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 46b에서 H40으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제1 VL, 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제2 VL, 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제1 폴리펩티드의 제1 VH와 제3 폴리펩티드의 제1 VL은 서로 결합하여 제1 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 제2 VH와 제4 폴리펩티드의 제2 VL은 서로 결합하여 제2 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드의 VHH 및 제4 폴리펩티드의 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드의 VHH와 제4 폴리펩티드의 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 동일한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 상이한 항원들을 표적화한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 G6으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL, CL 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL, CL 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제1 폴리펩티드의 제1 VH와 제3 폴리펩티드의 제1 VL은 서로 결합하여 제1 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 제2 VH와 제4 폴리펩티드의 제2 VL은 서로 결합하여 제2 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드의 VHH 및 제4 폴리펩티드의 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드의 VHH 및 제4 폴리펩티드의 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 동일한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 상이한 항원들을 표적화한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 G7로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제1 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제2 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제1 폴리펩티드의 제1 VH와 제3 폴리펩티드의 제1 VL은 서로 결합하여 제1 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 제2 VH와 제4 폴리펩티드의 제2 VL은 서로 결합하여 제2 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH 및 제2 폴리펩티드의 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH 및 제2 폴리펩티드의 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 동일한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 상이한 항원들을 표적화한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 G8로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VH, CH1 도메인, 선택적인 힌지 영역 서열, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제3 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제4 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제2 VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 제1 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제3 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 CH1 도메인과 제4 폴리펩티드의 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 제1 폴리펩티드의 제1 VH와 제3 폴리펩티드의 제1 VL은 서로 결합하여 제1 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 제2 폴리펩티드의 제2 VH와 제4 폴리펩티드의 제2 VL은 서로 결합하여 제2 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH 및 제2 폴리펩티드의 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 VHH 및 제2 폴리펩티드의 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 동일한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 상이한 항원들을 표적화한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 G9로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 46c에서 V14로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 46d에서 V15로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 3개의 제1 VHH들 및 3개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 46e에서 V16으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 제2 VHH, 및 2개의 제1 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 46f에서 V11로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 3개의 제1 VHH들, 제2 VHH, 및 3개의 제1 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V12로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 4개의 제1 VHH들, 제2 VHH, 및 4개의 제1 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 V13으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 2개의 제2 VHH들, 및 제3 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 중 2개는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 3개 모두는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 53a에서 D1로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 제2 VHH, 및 2개의 제3 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 중 2개는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 3개 모두는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 53b에서 D2로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 중 2개는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 3개 모두는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 53c에서 D3으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VHH, 제1 scFv, 및 제2 scFv를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 scFv 및 제2 scFv는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 scFv 및 제2 scFv는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D4로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 scFv, VHH, 및 제2 scFv를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 scFv 및 제2 scFv는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 scFv 및 제2 scFv는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D5로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 scFv, 제2 scFv, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 scFv 및 제2 scFv는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 scFv 및 제2 scFv는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D6으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드들을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, scFv, VH, CH1 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있고; 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, scFv, VL 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, scFv, VL, CL 도메인, 및 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있고; 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, scFv, VH, 및 CH1 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, VH 및 VL은 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 scFv 및 제2 폴리펩티드의 scFv는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 scFv 및 제2 폴리펩티드의 scFv는 상이하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D8로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, scFv, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D24로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 scFv를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D25로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, scFv, 제1 VHH, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D26으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, scFv, 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D39로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 제2 VHH, 및 scFv를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D40으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, scFv, 2개의 제1 VHH들, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D41로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, VH, CH1 도메인, VL, 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, VL, CL 도메인, VH, 및 CH1 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D31로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VH, CH1 도메인, VL, CL 도메인, 제1 VHH, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, VL, CL 도메인, VH, CH1 도메인, 제1 VHH, 및 제2 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D32로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, VH, CH1 도메인, VL, CL 도메인, 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, VL, CL 도메인, VH, CH1 도메인, 및 2개의 제2 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CH1 도메인과 CL 도메인은 서로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b에서 D33으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 2개의 제3 VHH들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 중 2개는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 3개 모두는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 53d에서 D43으로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단까지, 2개의 제1 VHH들, 제2 VHH, 및 제3 VHH를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 중 2개는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 VHH, 제2 VHH, 및 제3 VHH 3개 모두는 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 도 42a-b 또는 도 53e에서 D44로 나타낸 구조를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 VHH가 본원에 기재된 바와 같이 항원 결합 단백질에 추가될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 Fab 도메인(예를 들어, VL-CL과 결합된 VH-CH1 포함)이 본원에 기재된 바와 같이 항원 결합 단백질에 추가될 수 있다.
일부 구현예에서, VHH, VH, 또는 VL은 링커 펩티드 서열을 통해 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결될 수 있다. 링커 펩티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 각 펩티드 링커 서열은 개별적으로 최적화될 수 있다. 링커 서열은 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개, 또는 그 미만의 아미노산을 갖는다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 약 30개 이하(예를 들어 약 25개, 20개, 또는 15개 중 어느 하나의 개수 이하)의 아미노산을 갖는다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커의 길이는 약 1 내지 30개, 1 내지 20개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 또는 5 내지 10개 아미노산이다.
펩티드 링커는 천연 발생 서열, 또는 비천연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄의 힌지 영역에서 유래된 서열이 링커로 사용될 수 있다. 이들 서열들은 WO1996/34103에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 가요성 링커이다. 예시적인 가요성 링커에는 글리신 폴리머 (G)n, 글리신-세린 폴리머(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(서열 번호: 1) 및 (GGGS)n(서열 번호: 2) 포함, 이때 n은 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수임), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS(서열 번호: 3) 또는 GGGGSGGGGS(서열 번호: 4)를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 인간 IgG1의 힌지 영역과 같은 IgG의 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCP(서열 번호: 5)를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 인간 IgG1의 힌지 영역과 같은 IgG의 힌지 영역으로부터 유래된 변형된 서열을 포함한다. 예를 들어, IgG의 힌지 영역에 있는 하나 이상의 시스테인 아미노산은 세린으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 EPKSSDKTHTSPPSP(서열 번호: 6)를 포함한다.
항원 결합 부위들
항원 결합 단백질들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 12개 초과의 항원 결합 부위들 또는 항원 결합 부분들을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 항원 결합 부위는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질의 기능적 구조를 지칭한다. 항원 결합 부위는 한 쌍의 VH와 VL에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, 항원 결합 부위는 VHH에 의해 형성될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 12개 초과의 에피토프 또는 항원에 결합할 수 있다. 이들 에피토프들은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 에피토프들은 상이할 수 있지만 동일한 항원에 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 12개 초과의 상이한 항원들에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은 하나 이상의 면역 체크포인트 분자들에 결합할 수 있다. 이들 면역 체크포인트 분자들은 면역 시스템의 조절인자들이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자들은, 예를 들어, 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1; PD-1), TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(4-1BB 또는 CD137), 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4; CTLA-4), LAG-3, T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(mucin-domain containing-3; TIM-3), B 및 T 림프구 관련(B And T Lymphocyte Associated; BTLA), 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1(Programmed Cell Death 1 Ligand 1; PD-L1), CD27, CD28, CD40, CD47, CD122, ICOS, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역수용체(T-Cell Immunoreceptor With Ig And ITIM Domains; TIGIT), 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질(Glucocorticoid-Induced TNFR-Related Protein; GITR), A2AR, CD278, VTCN1, BTLA, IDO, KIR, NOX2, VISTA, SIGLEC7, 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNF Receptor Superfamily Member 4; TNFRSF4; 또는 OX40)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은 하나 이상의 암 특이적 항원들에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "암 특이적 항원"은 암 세포 표면에서 특이적으로 발현되는 항원을 지칭한다. 이 항원은 종양 세포를 식별하는 데 사용될 수 있다. 정상 세포는 암 특이적 항원을 거의 발현하지 않는다. 일부 예시적인 암 특이적 항원들로는, 예를 들어, CD20, PSA, PSCA, PD-L1, Her2, Her3, Her1, β-카테닌, CD19, CEACAM3, EGFR, c-Met, EPCAM, PSMA, CD40, MUC1, 및 IGF1R 등이 포함된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 암 관련 항원에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "암 관련 항원(cancer-associated antigen)"은 암 세포에서 상대적으로 높은 수준으로 발현되지만 정상 세포에서는 상대적으로 낮은 수준으로 발현될 수 있는 항원을 지칭한다. CD55, CD59, CD46, 및 많은 접착 분자들, 예를 들어, N-카드헤린(cadherin), VE-카드헤린, NCAM, Mel-CAM, ICAM, NrCAM, VCAM1, ALCAM, MCAM 등이 암 관련 항원들이다. 암 특이적 항원과 암 관련 항원은 모두 암 세포 표면에서 발현되지만, 암 특이적 항원과 암 관련 항원 간의 차이점은, 암 관련 항원이 암 세포에서의 수준과 비교하여 상대적으로 낮은 수준이긴 하지만 정상 세포들에서도 발현된다는 점이다. 이에 반해, 암 특이적 항원은 정상 세포에서는 거의 발현되지 않으며, 정상 세포에서 발현되더라도 그 양이 극히 적다.
일부 구현예에서, 암 항원으로는, 예를 들어, 신경아교종 관련 항원, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen; CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파태아단백질(alphafetoprotein; AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카복실 에스테라아제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타아제, 전립선 특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서바이빈 및 텔로머라아제, 전립선 암종 종양 항원-1(prostate-carcinoma tumor antigen-1; PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린이 포함된다.
항원 결합 단백질들이 결합할 수 있는 항원들의 비제한적 예로는, 예를 들어, 분화 항원(differentiation antigen), 예를 들어, MART-1/MelanA(MART-I), gp 100(Pmel 17), 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 및 종양 특이적 다중 계통 항원(tumor-specific multilineage antigen)들, 예를 들어, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; CEA와 같은 과발현된 태아 항원(embryonic antigen)들; 과발현된 종양 유전자들 및 돌연변이된 종양 억제 유전자들, 예를 들어, p53, Ras, HER2/neu; 염색체 전좌로 인한 독특한 종양 항원들, 예를 들어, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예를 들어 엡스타인-바 바이러스 항원(Epstein Barr virus antigen; EBVA)들, 및 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원들 E6 및 E7이 추가로 포함된다. 다른 대형 단백질 기반 항원에는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG , BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C 관련 단백질(cyclophilin C-associated protein), TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS가 포함된다.
일부 구현예에서, 세포 표면 항원은 T 세포들(예를 들어, 헬퍼 T 세포들, 세포독성 T 세포들, 기억 T 세포들), B 세포들, 대식세포들, 및 자연 살해(NK) 세포들과 같은 면역 이펙터 세포들 상의 항원이다. 일부 구현예에서, 세포 표면 항원은 T 세포 표면 항원, 예를 들어, CD3이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은 VEGF, Ang-2, MSLN, GITR, 및 PD-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 항원들에 결합한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들(예를 들어, 이중특이적 항체)은 종양 세포를 면역 세포(예를 들어, T 세포)로 모집하여 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은 암 항원을 표적으로 하는 추가적인 항원 결합 영역을 포함하도록 설계된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은, 예를 들어, 아달리무맙(Adalimumab), 베즐로톡수맙(Bezlotoxumab), 아벨루맙(Avelumab), 두필루맙(Dupilumab), 더발루맙(Durvalumab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 브로달루맙(Brodalumab), 레슬리주맙(Reslizumab), 올라라투맙(Olaratumab), 다라투무맙(Daratumumab), 엘로투주맙(Elotuzumab), 네시투무맙(Necitumumab), 인플릭시맙(Infliximab), 오빌톡사시맙(Obiltoxaximab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 세쿠키누맙(Secukinumab), 메폴리주맙(Mepolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 알리로쿠맙(Alirocumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 디누툭시맙(Dinutuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 실툭시맙(Siltuximab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 브렌툭시맙(Brentuximab), 락시바쿠맙(Raxibacumab), 벨리무맙(Belimumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 데노수맙(Denosumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 베실레소맙(Besilesomab), 토실리주맙(Tocilizumab), 카나키누맙(Canakinumab), 골리무맙(Golimumab), 우스테키누맙(Ustekinumab), 세르톨리주맙(Certolizumab), 카투막소맙(Catumaxomab), 에쿨리주맙(Eculizumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 오말리주맙(Omalizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 에팔리주맙(Efalizumab), 이브리투모맙(Ibritumomab), 파놀레소맙(Fanolesomab), 토시투모맙(Tositumomab), 젬투주맙(Gemtuzumab), 팔리비주맙(Palivizumab), 네시투무맙(Necitumumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 리툭시맙(Rituximab), 카프로맙(Capromab), 사투모맙(Satumomab), 및 무로모납(Muromonab)을 포함하는 다양한 치료 항체들과 동일한 에피토프 또는 항원으로부터 유래된 항원 결합 부위를 가질 수 있거나 상기 에피토프 또는 항원에 결합할 수 있다.
본 개시는, 예를 들어, 항-VEGF 항체, 항-ANG-2 항체, 항-MSLN 항체, 항-GITR 항체, 항-PD-1 항체, 이들의 변형된 항체들, 이들의 키메라 항체들, 및 이들의 인간화 항체들을 제공한다. 이들 항체들의 항원 결합 부분들은 본원에 기재된 바와 같이 다양한 항원 결합 단백질 포맷들로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 VEGF에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 VHH를 포함한다. VEGF에 특이적으로 결합하는 VHH는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, US20170247475A1에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ang-2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 VHH를 포함한다. Ang-2에 특이적으로 결합하는 VHH는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, US20190135907A1에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 MSLN에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 VHH를 포함한다. MSLN에 특이적으로 결합하는 VHH는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, AU2018/265860 A1 또는 US20180327508A1에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 GITR에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 VHH를 포함한다. GITR에 특이적으로 결합하는 VHH는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, US10093742B2에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 PD-1에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, US2012135408 또는 US8952136B2에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
항원 결합 단백질들의 특성들
본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항체(예를 들어, 모 항체) 또는 이의 임의의 항원 결합 단편으로부터 유래된 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기재된 바와 같은 다양한 항원들(예를 들어, VEGF, Ang-2, PD-1, MSLN, 또는 GITR)을 발현하는 세포들에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 T 세포들(예를 들어, CD3+ 세포, CD8+ 및/또는 CD4+ 세포)의 면역 반응, 활성 또는 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배, 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질에 의해 유도된 T 세포 활성화 수준은 이소형 대조군 항체에 의해 유도된 것과 비교하여 적어도 또는 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 정상 세포(예를 들어, 비-종양 세포)에서 또는 종양 세포의 부재 하에 면역 반응을 유도하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 길항제(antagonist)이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 효능제(agonist)이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 T 세포에 결합할 수 있다. 따라서, 항원 결합 단백질은 T 세포를 표적 세포로 모집할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 종양 세포와 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 동시에 결합하여 암 세포와 면역 세포 사이의 상호작용을 가교할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 0.1s-1 미만, 0.01s-1 미만, 0.001s-1 미만, 0.0001s-1 미만, 또는 0.00001s-1 미만의 해리 속도(koff)로 본원에 기재된 바와 같은 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 해리 속도(koff)는 0.01s-1 초과, 0.001s-1 초과, 0.0001s-1 초과, 0.00001s-1 초과, 또는 0.000001s-1 초과이다. 일부 구현예에서, 동역학적 결합 속도(kon)는 1 x 102/Ms 초과, 1 x 103/Ms 초과, 1 x 104/Ms 초과, 1 x 105/Ms 초과, 또는 1 x 106/Ms 초과이다. 일부 구현예에서, 동역학적 결합 속도(kon)는 1 x 105/Ms 미만, 1 x 106/Ms 미만, 또는 1 x 107/Ms 미만이다.
동역학적 속도 상수(Kd=koff/kon)의 몫에서 친화도를 추론할 수 있다. 일부 구현예에서, Kd는 1 x 10-4M 미만, 1 x 10-5M 미만, 1 x 10-6M 미만, 1 x 10-7M 미만, 1 x 10-8M 미만 , 1 x 10-9M 미만, 또는 1 x 10-10M 미만이다. 일부 구현예에서, Kd는 50nM, 30nM, 20nM, 15nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 또는 1nM 미만이다. 일부 구현예에서, Kd는 1 x 10-4M 초과, 1 x 10-5M 초과, 1 x 10-6M 초과, 1 x 10-7M 초과, 1 x 10-8M 초과, 1 x 10-9M 초과, 1 x 10-10M 초과, 1 x 10-11M 초과, 또는 1 x 10-12M 초과이다.
항원에 대한 항원 결합 단백질의 친화도를 측정하기 위한 일반적인 기술은, 예를 들어, ELISA, RIA, 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질의 결합 친화도는 모 항체(예를 들어, 항원 결합 단백질의 항원 결합 부위가 유래된 단클론 항체 또는 나노바디)의 결합 친화도와 비교된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질의 항원 결합 부위의 결합 친화도는 10%, 20%, 30% 또는 40% 이상 감소되지 않는다.
일부 구현예에서, 결합 친화도를 측정하기 위해 ELISA를 사용할 수 있다. EC50이 계산된다. (2) 모 항체의 EC50에 대한 (1) 항원 결합 단백질의 EC50의 결합 비율(binding ratio)은 200%, 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 또는 100% 이하이다. 사실, 항원 결합 단백질은 동일한 항원에 대해 하나 초과의 항원 결합 부위들을 가질 수 있으므로, 일부 구현예에서, 결합 비율은 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 또는 0.4보다 작다.
일부 구현예에서, 열적 안정성이 결정된다. 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 Tm이 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95℃ 초과일 수 있다.
항원 결합 단백질은 다중 도메인 단백질로 설명될 수 있으므로, 용융 곡선은 때때로 첫 번째 변성 온도 Tm1과 두 번째 변성 온도 Tm2의 두 번의 전이(transition)를 나타낸다. 이들 2개의 피크들의 존재는 종종 2개의 다른 도메인들(예를 들어, Fc, Fab 및/또는 VH-VL 쌍들)의 변성을 나타낸다. 두 개의 피크가 존재하는 경우, Tm1은 온도 증가에 따른 첫 번째 피크를 나타낸다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 Tm1이 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95℃ 초과이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 Tm2가 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95℃ 초과이다. 일부 구현예에서, Tm, Tm1, Tm2는 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95℃ 미만이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 높은 장기 안정성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 약 4℃에서 적어도 약 1일, 3일, 7일, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상 중 어느 하나의 기간 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 상승된 온도에서 높은 장기 안정성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 실온, 예를 들어, 약 25℃ 이상에서 적어도 약 1일, 3일, 7일, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상의 기간 중 어느 하나의 기간 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 생리학적 온도, 예를 들어, 약 37℃ 또는 그 이상의 온도에서 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 6일, 7일, 10일, 2주 또는 그 이상 중 어느 하나의 기간 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 고농도, 예를 들어, 적어도 또는 약 50mg/mL, 100mg/mL, 150mg/mL, 200mg/mL 또는 그 이상의 농도에서 높은 장기 안정성을 갖는다.
안정한 조성물은 실질적으로 침전 및/또는 응집이 없다(예를 들어, 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만의 양보다 적음). 침전은 광학 분광법(optical spectroscopy)에 의해 감지될 수 있다. 응집은, 예를 들어, DLS에 의해 감지될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 동결-해동 사이클에 대해 높은 안정성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물은 구조적 완전성을 잃지 않고(예를 들어, 응집체를 형성하지 않고) 및/또는 항원 결합 단백질의 활성을 상실하지 않고 적어도 약 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 10회, 또는 그 이상의 횟수 중 어느 하나 이상의 횟수 동안 동결-해동될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물은 고농도, 예를 들어, 적어도 또는 약 50mg/mL, 100mg/mL, 150mg/mL, 200mg/mL 또는 그 이상의 농도에서 동결-해동될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들 또는 임의의 항원 결합 단편들은 보체 의존성 세포독성(CDC)을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배, 또는 20배 증가시킬 수 있다. .
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들 또는 임의의 항원 결합 단편들은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배, 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들 또는 임의의 항원 결합 단편들은 식세포작용 비율(phagocytosis rate)을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배, 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들 또는 임의의 항원 결합 단편들은, 예를 들어, 이펙터 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나 이펙터 T 세포에 의한 감마 인터페론 생성을 증가시킴으로써(예를 들어, 항원 결합 단백질들 또는 항원 결합 단편들로 처리하기 전의 증식 및/또는 사이토카인 생산과 비교하여) T 세포 기능을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들 또는 항원 결합 단편들은, 예를 들어, CD4+ 이펙터 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나 CD4+ 이펙터 T 세포에 의한 감마 인터페론 생산을 증가시킴으로써(예를 들어, 항원 결합 단백질들 또는 항원 결합 단편들로 처리하기 전의 증식 및/또는 사이토카인 생산과 비교하여) CD4+ 이펙터 T 세포 기능을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 감마 인터페론이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들 또는 항원 결합 단편들은, 예를 들어, 항원 결합 단백질들 또는 항원 결합 단편들로 처리하기 전의 종양내(침윤성) CD4+ T 세포들의 수와 비교하여 종양내(침윤성) CD4+ 이펙터 T 세포들의 수(예를 들어, CD4+ 이펙터 T 세포들의 총 수, 또는 예를 들어, CD45+ 세포들에서 CD4+ 세포들의 백분율)를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들 또는 항원 결합 단편들은, 예를 들어, 처리 전에 감마 인터페론을 발현하는 종양내(침윤성) CD4+ T 세포들의 수와 비교하여 감마 인터페론을 발현하는 종양내(침윤성) CD4+ 이펙터 T 세포들 수(예를 들어, 총 감마 인터페론 발현 CD4+ 세포들의 수, 또는 예를 들어, 총 CD4+ 세포들에서 감마 인터페론 발현 CD4+ 세포들의 백분율)를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은, 예를 들어, 처리 전 종양내(침윤성) CD8+ 이펙터 세포들의 수와 비교하여 종양내(침윤성) CD8+ 이펙터 T 세포들의 수(예를 들어, 총 CD8+ 이펙터 T 세포들의 수, 또는 예를 들어, CD45+ 세포들에서 CD8+의 백분율)를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은, 예를 들어, 항원 결합 단백질로 처리하기 전에 감마 인터페론을 발현하는 종양내(침윤성) CD8+ T 세포들의 수와 비교하여 감마 인터페론을 발현하는 종양내(침윤성) CD8+ 이펙터 T 세포들의 수(예를 들어, 총 CD8+ 세포들에서 감마 인터페론을 발현하는 CD8+ 세포들의 백분율)를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은, 예를 들어, 기억 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나 기억 세포에 의한 사이토카인(예를 들어, 감마 인터페론) 생산을 증가시킴으로써 기억 T 세포 기능을 향상시킨다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 기능적 Fc 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 이펙터 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)이다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 이펙터 기능은 식세포작용이다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 이펙터 기능은 ADCC 및 식세포작용이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 또는 인간 IgG4이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 아폽토시스를 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 기능성 Fc 영역을 갖지 않는다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 대칭 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 비대칭 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 항원 결합 단백질은 암 항원을 표적화하는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 항원 결합 부위들(예를 들어, 항원 결합 Fab 도메인들, scFV, 또는 나노바디(VHH))을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 항원 결합 단백질은 T 세포 특이적 항원(예를 들어, CD3)을 표적화하는 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 항원 결합 부위들(예를 들어, 항원 결합 Fab 도메인들, scFV 또는 나노바디(VHH))을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 항원 결합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 공통 경쇄들을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 공통 경쇄들은 동일한 VL 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 암 특이적 항원 결합 Fab 도메인의 C-말단은 동일한 다중특이적 항원 결합 단백질 내에서 이웃하는 암 특이적 항원 결합 Fab 도메인의 N-말단에 연결(예를 들어, 공유결합으로 연결 또는 화학적으로 연결)된다.
본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항원 결합 단백질, 항체 또는 항원 결합 단편과 교차 경쟁하는 항원 결합 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 교차 경쟁 검정은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(참조: Moore et al., "Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein." Journal of virology 70.3 (1996): 1863-1872)에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다. 일 측면에서, 본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항원 결합 단백질, 임의의 항체 또는 항원 결합 단편과 동일한 에피토프 또는 부위에 결합하는 항원 결합 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 에피토프 비닝 검정(epitope binning assay)은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌(참조: Estep et al. "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning." MAbs. Vol. 5. No. 2. Taylor & Francis, 2013), 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
항체들 및 항원 결합 단편들
본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질들은 본원에 기재된 바와 같은 다양한 항체들 및 이들의 항원 결합 단편들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 부위들(예를 들어, VHH들 및/또는 VH/VL 쌍들)이 이들 항체들 또는 이들의 항원 결합 단편들에 추가될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위들은 본원에 기재된 바와 같은 이러한 다양한 항체들 및 항원 결합 단편들로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, 항체(면역글로불린이라고도 함)들은 경쇄와 중쇄라는 두 종류의 폴리펩티드 사슬들로 구성된다. 본 개시의 비제한적 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 4개의 면역글로불린 사슬 항체일 수 있다. 항체의 중쇄는 IgM, IgG, IgE, IgA, 또는 IgD를 포함하는 임의의 이소형, 또는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 등을 포함하는 하위 이소형일 수 있다. 경쇄는 카파 경쇄 또는 람다 경쇄일 수 있다. 항체는 2개의 동일한 경쇄 카피들 및/또는 2개의 동일한 중쇄 카피들을 포함할 수 있다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VH) 및 다수의 불변 도메인들(또는 불변 영역들)을 포함하는 중쇄들은 불변 도메인들 내에서 이황화 결합을 통해 서로 결합하여 항체의 "줄기(stem)"를 형성한다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VL) 및 하나의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 포함하는 경쇄들은 각각 이황화 결합을 통해 하나의 중쇄에 결합한다. 각 경쇄의 가변 영역은 결합된 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 보다 보존된 프레임워크 영역(FR)들 사이에 끼인 3개의 초가변 영역들을 포함한다.
상보성 결정 영역(CDR)으로 알려진 이러한 초가변 영역은 항체의 주 항원 결합 표면을 포함하는 루프를 형성한다. 4개의 프레임워크 영역들은 대체로 베타-시트 입체형태를 채택하고, CDR들은 루프 연결을 형성하며, 경우에 따라 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 CDR들은 프레임워크 영역들에 의해 매우 근접하게 유지되며, 다른 사슬의 CDR들과 함께 항원 결합 영역의 형성에 기여한다.
항체의 아미노산 서열을 분석하여 항체의 CDR 영역들을 식별하는 방법은 잘 알려져 있으며, 다수의 CDR 정의들이 일반적으로 사용된다. Kabat 정의는 서열 가변성을 기반으로 하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역들의 위치를 기반으로 한다. 이러한 방법 및 정의는, 예를 들어, 문헌(참조: Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan .1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007); Kontermann, R., & Duebel, S. (Eds.). (2010). Antibody engineering: Volume 2. Springer)에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다. 일부 구현예에서, CDR은 Kabat 정의를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, CDR은 Chothia 정의를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, CDR은 Kabat, Chothia, AbM, IMGT, 또는 접촉 정의(contact definition)에 의해 결정되는 가장 긴 CDR 서열이다.
CDR은 항원의 에피토프를 인식하는 데 중요하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 항체의 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 표적 분자의 가장 작은 부분이다. 에피토프의 최소 크기는 약 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 아미노산일 수 있지만, 이러한 아미노산은, 에피토프가 항원의 2차 및 3차 구조에 기반한 항원의 3차원 배치 형태에 따라 달라질 수 있기 때문에, 항원의 1차 구조의 연속적인 선형 서열일 필요는 없다.
일부 구현예에서, 항체는 온전한 면역글로불린 분자(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA)이다. IgG 하위부류들(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)은 고도로 보존되어 있으며, 불변 영역, 특히 힌지와 상부 CH2 도메인이 다르다. IgG 하위부류들의 서열 및 차이점은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(참조: Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016)에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
항체는 또한 임의의 종(예를 들어, 인간, 설치류, 마우스, 래트, 낙타류)으로부터 유래된 면역글로불린 분자일 수 있다. 본원에 개시된 항체들은 또한 다클론, 단클론, 단일특이적, 다중특이적 항체, 및 또 다른 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 단편"이라는 용어는 온전한 항체의 특이적 결합 활성을 보유하는 항체의 일부, 즉 온전한 항체의 표적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분이다. 여기에는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 및 이들 단편들의 변이체들이 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, scFv, Fv, Fd, dAb, 이중특이적 항체, 이중특이적 scFv, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체, 및 항체 결합 도메인이거나 항체 결합 도메인과 상동성인 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 항원 결합 도메인들의 비제한적 예로는, 예를 들어, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 온전한 항체의 전장 중쇄 또는 경쇄, 또는 온전한 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 개별 CDR이 포함된다.
일부 구현예에서, scFV는 2개의 중쇄 가변 도메인들 및 2개의 경쇄 가변 도메인들을 갖는다. 일부 구현예에서, scFV는 2개의 항원 결합 영역들을 갖고, 2개의 항원 결합 영역들은 상이한 친화도로 각각의 표적 항원들에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 CD3-제타 막횡단- 및 엔도도메인(endodomain)에 융합된, 본원에 기재된 단일 사슬 가변 단편(scFv)들의 융합체이다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 또한 다양한 동시자극 단백질 수용체들(예를 들어, CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인들을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 효능(potency)을 증가시키기 위해 다중 신호전달 도메인들, 예를 들어, CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40을 포함한다. 따라서, 일 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포)를 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 상이한 항원들 또는 2개의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 3개의 상이한 항원들 또는 3개의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다.
Fv 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 이 영역은, 예를 들어, scFv에서 본질적으로 공유결합될 수 있는, 긴밀하게 결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 각 가변 도메인의 3개의 CDR들이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에서 항원 결합 부위를 한정하는 것이 이러한 배치 형태이다. 통틀어, 6개의 CDR들 또는 이의 서브셋(subset)이 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR들만 포함하는 Fv의 절반)조차도 일반적으로 전체 결합 부위보다 친화도가 낮지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있다.
단일 사슬 Fv 또는 (scFv) 항체 단편들은 항체의 VH 및 VL 도메인들(또는 영역들)을 포함하며, 이때 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 scFv는 N-말단에서 C-말단까지, VH; 폴리펩티드 링커; 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 scFv는 N-말단에서 C-말단까지, VL; 폴리펩티드 링커; 및 VH를 포함한다.
Fab 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편들은 일반적으로 이들 사이의 힌지 시스테인들에 의해 이들의 카복시 말단 근처에서 공유 결합되는 한 쌍의 Fab 단편들을 포함한다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
디아바디들은 2개의 항원 결합 부위들을 갖는 작은 항체 단편들이며, 이 단편들은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH 및 VL)에서 VL에 연결된 VH를 포함한다. 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬에 있는 두 도메인들 간의 페어링을 허용하지 않는 경우, 도메인들은 다른 사슬의 상보적인 도메인들과 강제로 페어링되어 두 개의 항원 결합 부위들을 생성한다.
항체의 다량체화(multimerization)는 항체들의 자연적 응집을 통해 또는 당업계에 공지된 화학적 또는 재조합 연결 기술들을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체 제제들(예를 들어, 정제된 IgG1 분자들) 중 일부는 항체 동종이량체들 및 기타 고차 항체 다량체들을 함유하는 단백질 응집체들을 자발적으로 형성한다.
선형 항체들은 상보적인 경쇄 폴리펩티드들과 함께 한 쌍의 항원 결합 영역들을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 세그먼트들(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체들은 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
대안적으로, 항체 동종이량체들은 당업계에 공지된 화학적 연결 기술을 통해 형성될 수 있다. 예를 들어, SMCC(석신이미딜 4-(말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트) 및 SATA(N-석신이미딜 S-아세틸티오-아세테이트)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 이종이작용성(heterobifunctional) 가교제들이 항체 다량체들을 형성하는 데 사용될 수 있다. 항체 동종이량체를 형성하기 위한 예시적인 프로토콜은 Ghetie 등(참조: Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 7509-7514, 1997)에 기재되어 있다. 항체 동종이량체는 펩신에 의한 소화를 통해 Fab'2 동종이량체로 전환될 수 있다. 항체 동종이량체를 형성하는 또 다른 방법은 Zhao 등(Zhao et al., J. Immunol. 25:396-404, 2002)에 기재된 자가친화성(autophilic) T15 펩티드를 사용하는 것이다.
본 개시의 항체들 및 항체 단편들은 목적하는 이펙터 기능들 또는 혈청 반감기를 제공하기 위해 Fc 영역에서 변형될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항체들 또는 항원 결합 단편들은 안정화 분자(예를 들어, 대상체에서 또는 용액 중에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 반감기를 증가시키는 분자)에 접합될 수 있다. 안정화 분자의 비제한적 예로는 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민)이 포함된다. 안정화 분자의 접합은 시험관내에서(예를 들어, 조직 배양에서 또는 약제학적 조성물로 저장되는 경우) 또는 생체내에서(예를 들어, 인간에서) 항체 또는 항원 결합 단편의 반감기를 증가시키거나 생물학적 활성을 연장시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체들 또는 항원 결합 단편들(예를 들어, 이중특이적 항체들)은 치료제에 접합될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체는 치료제에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 세포독성제 또는 세포증식억제제(예를 들어, 사이토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 브롬화에티듐, 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신(dihydroxy anthracin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 예를 들어, DM-1 및 DM-4, 디온(dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin) D, 1-데하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol), 퓨로마이신(puromycin), 에피루비신(epirubicin), 및 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) 및 유사체들)이다.
재조합 벡터들
본 개시는 또한 본원에 개시된 단리된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 재조합 벡터들(예를 들어, 발현 벡터들), 재조합 벡터들이 도입되는 숙주 세포들(즉, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유하는 숙주 세포들), 및 재조합 기술에 의한 항원 결합 단백질들의 생산을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 벡터가 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포에 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 전달할 수 있는 임의의 작제물이다. "발현 벡터"는 암호화된 폴리펩티드로서 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(들)를, 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포에 전달하고 발현시킬 수 있다. 따라서, 발현 벡터에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터와 함께 도입된 숙주 세포에서 번역될 수 있도록 관심 폴리뉴클레오티드의 통합 부위에서 또는 근처에 또는 측면에 있는 숙주 세포의 게놈에서 또는 벡터 내에서 프로모터, 인핸서, 및/또는 폴리-A 테일과 같은 조절 요소들과 작동가능하게 연결됨으로써 벡터에서 발현되도록 위치된다.
벡터는 당업계에 공지된 방법들, 예를 들어, 전기천공법, 화학적 형질감염(예를 들어, DEAE-덱스트란), 형질전환, 형질감염, 및 감염 및/또는 형질도입(예를 들어, 재조합 바이러스 사용)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 벡터들의 비제한적 예로는 바이러스 벡터(재조합 바이러스를 생성하기 위해 사용될 수 있음), 네이키드(naked) DNA 또는 RNA, 플라스미드, 코스미드, 파지 벡터, 및 양이온성 축합제(condensing agent)와 결합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터가 포함된다.
일부 구현에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)는 바이러스 발현 시스템(예를 들어, 백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입되며, 이는 비병원성(결함) 복제 적격 바이러스를 사용하거나 복제 결함 바이러스를 사용할 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 바이러스 패키징 세포를 보완하는 경우에만 발생할 것이다. 적합한 시스템들은, 예를 들어, 문헌(참조: Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8:17-21; U.S. Pat. Nos. 4,603,112, 4,769,330, and 5,017,487; WO 89/01973; U.S. Pat. No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88:2838-2848; and Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73:1202-1207)에 개시되어 있다. 이러한 발현 시스템들에 DNA를 통합하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. DNA는 또한, 예를 들어, 문헌(참조: Ulmer et al., 1993, Science, 259:1745-1749, and Cohen, 1993, Science, 259:1691-1692)에 기재된 바와 같이 "네이키드"일 수 있다. 네이키드 DNA의 흡수는 세포 내로 효율적으로 운반되는 생분해성 비드 상에 DNA를 코팅함으로써 증가될 수 있다.
발현을 위해, 본원에 개시된 폴리펩티드-암호화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 삽입물은, 예를 들면, 파지 람다 PL 프로모터, 이. 콜라이(E. coli) lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터와 같은 적절한 프로모터(예를 들어, 이종 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 적합한 프로모터들은 숙련가에게 공지되어 있다. 발현 작제물은 전사 개시, 종결을 위한 부위들, 및 전사된 영역에서 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 함유할 수 있다. 작제물에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 코딩 부분은 시작 부분에서 번역 개시 코돈 및 번역될 폴리펩티드의 끝에 적절하게 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 수 있다.
나타낸 바와 같이, 발현 벡터는 적어도 하나의 선별 마커(selectable marker)를 포함할 수 있다. 이러한 마커는 진핵 세포 배양을 위한 디하이드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase) 또는 네오마이신 내성 및 이. 콜라이 및 다른 박테리아에서 배양하기 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 세포와 같은 박테리아 세포; 효모 세포와 같은 진균 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS, Bowes 흑색종, 및 HK 293 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.
박테리아에 사용하기 위한 비제한적 벡터에는 Qiagen에서 입수가능한 pQE70, pQE60 및 pQE-9; Stratagene에서 입수가능한 pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 Pharmacia에서 입수가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5가 포함된다. 비제한적 진핵 벡터는 Stratagene에서 입수가능한 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, 및 pSG; 및 Pharmacia에서 입수가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL를 포함한다. 다른 적합한 벡터는 숙련가에게 손쉽게 자명할 것이다.
사용하기에 적합한 비제한적인 박테리아 프로모터는 이. 콜라이 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적합한 진핵 프로모터는 CMV 전초기 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, Rous 육종 바이러스(Rous sarcoma virus; RSV)의 것과 같은 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터(metallothionein promoter), 예를 들어 마우스 메탈로티오네인-프로모터를 포함한다.
효모 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에서는 알파 인자, 알코올 옥시다아제, 및 PGH와 같은 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터를 함유하는 다수의 벡터들이 사용될 수 있다. 이와 관련된 리뷰는 문헌[참조: Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, and Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997)]을 참조한다.
작제물을 숙주 세포 내로 도입하는 것은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기천공법, 형질도입, 감염 또는 기타 방법들에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법들은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예를 들어, 문헌[참조: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)]에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 본 개시의 항원 결합 단백질을 암호화하는 DNA의 고등 진핵생물에 의한 전사를 증가시킬 수 있다. 인핸서는 일반적으로 주어진 숙주 세포 유형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키는 작용을 하는 약 10 내지 300bp의 DNA의 시스 작용 요소이다. 인핸서의 예로는 염기쌍 100 내지 270에서 복제 개시점(replication origin)의 후기 쪽(late side)에 위치한 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 개시점의 후기 쪽에 있는 폴리오마 인핸서(polyoma enhancer), 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다.
번역된 단백질을 소포체의 내강으로, 주변세포질 공간으로 또는 세포외 환경으로 분비하기 위해, 적절한 분비 신호들이 발현된 폴리펩티드에 통합될 수 있다. 상기 신호들은 폴리펩티드에 대해 내인성일 수 있거나 이종 신호들일 수 있다.
단백질 복합체(예를 들어, 항원 결합 단백질들)는 히스티딘-태그와 함께 또는 융합 단백질(예를 들어, GST-융합체)과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 신호들뿐만 아니라 추가 이종 기능 영역들도 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산들, 특히 전하를 띤 아미노산들의 영역이 폴리펩티드의 N-말단에 추가되어 정제 동안 또는 후속 취급 및 저장 동안 숙주 세포에서 안정성 및 지속성을 개선시킬 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위해 폴리펩티드에 펩티드 모이어티들을 추가할 수 있다. 이러한 영역들은 폴리펩티드의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 무엇보다도 안정성을 개선하고 정제를 용이하게 하기 위해, 분비 또는 배출을 발생시키기 위해 폴리펩티드들에 펩티드 모이어티들을 추가하는 것은 당업계에서 친숙하고 일상적인 기술이다.
본 개시는 또한, 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열, 및 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 제공한다.
본 개시는 또한, 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 핵산 서열, 및 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 임의의 펩티드들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열들에 의해 암호화되는 임의의 아미노산 서열들에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 또는 600개 미만의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 또는 400개 미만의 아미노산 잔기이다.
일부 구현예에서, 아미노산 서열은 (i) 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 아미노산 서열로 이루어지며, 이때 상기 아미노산 서열은 본원에 기재된 서열들 중 어느 하나이다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 (i) 핵산 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 핵산 서열로 이루어지며, 이때 상기 핵산 서열은 본원에 기재된 서열들 중 어느 하나이다.
2개의 아미노산 서열들 또는 2개의 핵산 서열들의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열들이 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있음). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들을 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 상기 분자들은 상기 위치에서 동일하다. 두 서열들 간의 동일성 백분율은, 두 서열들의 최적의 정렬을 위해 도입해야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 예를 들어, 서열들의 비교 및 두 서열들 간의 동일성 백분율 결정은 갭 패널티(gap penalty) 12, 갭 확장 패널티(gap extend penalty) 4, 및 프레임시프트 갭 패널티(frameshift gap penalty) 5로 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다.
서열 상동성(예를 들어, 아미노산 서열 상동성 또는 핵산 상동성) 백분율도 결정될 수 있다. 서열 상동성 백분율을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 물리화학적 특성(상동성 백분율)이 유사한 보존된 아미노산 잔기들, 예를 들어, 류신 및 이소류신을 사용하여 서열 유사성을 측정할 수 있다. 물리화학적 특성이 유사한 아미노산 잔기들의 계열은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 계열에는, 예를 들어, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 포함된다. 많은 경우에 상동성 백분율은 동일성 백분율보다 높다.
항원 결합 단백질들을 제조하는 방법들
본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질들은 항원 결합 부위들 또는 본원에 기재된 바와 같은 항체들로부터 유래된 임의의 부분들을 가질 수 있다. 이의 단편에 대한 단리된 단백질은 다클론 및 단클론 항체 제조를 위한 표준 기술을 사용하여 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 다클론 항체는 항원성 펩티드 또는 단백질의 다회 주사(예를 들어, 피하 또는 복강내 주사)에 의해 동물에게서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원성 펩티드 또는 단백질은 적어도 하나의 애쥬번트(adjuvant)와 함께 주사된다. 일부 구현예에서, 항원성 펩티드 또는 단백질은 면역화될 종에서 면역원성인 제제(agent)에 접합될 수 있다. 동물에게 항원성 펩티드 또는 단백질을 1회 이상(예를 들어, 2회, 3회, 또는 4회) 주사할 수 있다.
면역원은 통상적으로 적합한 대상체(예를 들어, 적어도 하나의 인간 면역글로불린 유전자좌를 발현하는 인간 또는 유전자이식 동물)를 면역화함으로써 항체를 제조하는 데 사용된다. 적절한 면역원성 제제는, 예를 들어, 재조합적으로 발현되거나 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 상기 제제는 프로인트 완전 또는 불완전 애쥬번트(Freund's complete or incomplete adjuvant), 또는 유사한 면역자극제와 같은 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다.
다클론 항체는 적절한 대상체를 면역원으로서 폴리펩티드 또는 이의 항원성 펩티드(예를 들어, 단백질의 일부)로 면역화함으로써 상기 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 면역화된 대상체의 항체 역가(antibody titer)는 고정된 폴리펩티드 또는 펩티드를 사용하는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 표준 기술에 의해 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있다. 요망되는 경우, 항체 분자들은 포유동물로부터(예를 들어, 혈액으로부터) 단리될 수 있고, IgG 분획을 얻기 위한 단백질 G 크로마토그래피의 단백질 A와 같이 잘 알려진 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다. 면역화 후 적절한 시기에, 예를 들어, 특정 항체 역가가 가장 높을 때, 대상체로부터 항체 생성 세포를 얻을 수 있으며, Kohler 등(Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975)이 최초로 설명한 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983), EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985), 또는 트리오마 기술과 같은 표준 기술에 의해 단클론 항체를 제조하는 데 사용된다. 하이브리도마 생산 기술은 잘 알려져 있다(일반적으로 Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY 참조). 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 예를 들어, 표준 ELISA 검정을 사용하여 관심 폴리펩티드 또는 에피토프에 결합하는 항체에 대해 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝함으로써 검출된다.
VHH는 나이브(naive) 또는 설계된 합성 라마 VHH 라이브러리, 또는 항체 공학으로부터 얻을 수도 있다. 라마로부터 PBMC를 얻을 수 있고, RNA를 단리하여 역전사에 의해 cDNA를 생성할 수 있다. 그런 다음, VHH 유전자를 PCR로 증폭하고 파지 디스플레이 벡터에 클로닝하여 나이브 VHH 라이브러리를 구축할 수 있다. 합성(예를 들어, 인간화) VHH 라이브러리는 다양성을 향상시키고, 낮은 면역원성을 유지하기 위해 중첩 PCR(overlapping PCR)에 의해 생성된 셔플링된 VHH CDR1, 2 및 3을 변형된 인간 VH 스캐폴드에 통합하여 제조될 수 있다. 그런 다음, VHH 라이브러리를 항원에 대해 패닝(panning)하여 목적하는 결합 친화도를 갖는 VHH를 얻을 수 있다.
다양한 VHH들, VH들, 및 VL들을 사용하여 본원에 기재된 다중특이적 항체들을 제조할 수 있다. VHH들, VH들, 및 VL들에 대한 서열들은, 예를 들어, US 2017/0247475A1, US2019/0135907 A1, US20180327508A1, US10093742B2, US201213540에서 입수할 수 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 본원에 기재된 인간, 인간화, 또는 키메라 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 도메인의 항원 결합 부위를 구성하는 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 이러한 변이체 집단에서, 일부 항체들 또는 항원 결합 단편들은 표적 단백질에 대해 증가된 친화도를 나타낼 것이다. 표적에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 도달하도록 결실, 삽입, 및/또는 조합의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편에 도입된 아미노산 변화는 또한, 글리코실화 부위의 수를 변화(예를 들어, 증가 또는 감소)시키거나, 글리코실화 부위의 유형을 변화(예를 들어, 세포에 존재하는 효소에 의해 다른 당이 부착되도록 아미노산 서열을 변화)시키거나, 또는 새로운 글리코실화 부위를 도입하는 것과 같이, 항체 또는 항원 결합 단편으로의 새로운 번역 후 변형을 도입하거나 변경할 수 있다.
본원에 개시된 항체는 포유동물을 포함한 임의의 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 천연 항체의 비제한적 예로는 인간, 영장류, 예를 들어, 원숭이 및 유인원, 소, 돼지, 말, 양, 낙타류(예를 들어, 낙타 및 라마), 닭, 염소, 및 인간 항체를 생산하도록 유전자 조작된 유전자이식 설치류를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터 및 토끼)로부터 유래된 항체가 포함된다.
목적하는 결합 친화도로 항체 서열들을 최적화하기 위해 파지 디스플레이(패닝)를 사용할 수 있다. 이 기술에서 단일 사슬 Fv(VH 또는 VL 포함)를 암호화하는 유전자가 파지 외피 단백질 유전자에 삽입되어 파지가 내부에 상기 단백질에 대한 유전자를 포함하면서 외부에 scFv를 "디스플레이(display)"하여 유전자형과 표현형이 연결되도록 한다. 이어서, 디스플레이된 항원 결합 부위들과 표적 항원 사이의 상호작용을 검출하기 위해 이들 디스플레이 파지들은 표적 항원들에 대해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 단백질의 큰 라이브러리는 시험관내 선별이라는 과정에서 스크리닝 및 증폭될 수 있으며, 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체 서열들을 얻을 수 있다.
인간 및 인간화 항체들은 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유래된(또는 유래된 아미노산 서열들과 동일한 아미노산 서열들을 갖는) 가변 및 불변 영역들을 갖는 항체들을 포함한다. 인간 항체들은, 예를 들어, CDR들에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열들에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기들(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이들)을 포함할 수 있다.
인간화 항체는 통상적으로 비-인간 CDR들로 이식된 인간 프레임워크(FR)를 갖는다. 따라서, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 상기 항체에 도입된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 통상적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 필수적으로, 예를 들어, 인간 항체의 상응하는 서열들을 설치류 CDR들 또는 CDR 서열들로 치환함으로써 수행될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 문헌(참조: Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 따라서, "인간화" 항체는 실질적으로 온전한 인간 V 도메인보다 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 일부 FR 잔기가 인간 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 마우스 항체이다.
항체가 항원에 대한 높은 특이성과 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하며 당업자에게 친숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 보여주고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능성 있는 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 이의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은 목적하는 항체 특성이 달성되도록 수용체 및 유입 서열들로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합할 수 있다.
최초 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 일반적으로, 서열들을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 단편 내에 존재하는 서열과 동일한 후보 서열 내에 존재하는 아미노산 잔기의 백분율이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 항원 결합 단백질에 공유 변형(covalent modification)이 이루어질 수 있다. 이러한 공유 변형은 화학적 또는 효소적 합성, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 항원 결합 단백질의 다른 유형의 공유 변형이, 항원 결합 단백질의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응시킬 수 있는 유기 유도체화제(derivatization agent)와 반응시킴으로써 분자 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 항체 변이체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항원 결합 단백질에서 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석기에 의해 측정된 바와 같은 Asn297에 부착된 모든 글리코구조물(glycostructure)들(예를 들어, 복합, 하이브리드 및 고 만노오스 구조물들)의 합에 대한 Asn297에 있는 당 사슬 내 푸코오스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 297번 위치(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링; 또는 카밧 넘버링(Kabat numbering)에서는 314번 위치)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체 내 사소한 서열 변이로 인해 297번 위치의 상류 또는 하류의 약 ±3개 아미노산 위치에, 즉 294번과 300번 위치 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 글리칸 이질성(heterogeneity)을 감소시키기 위해, 297번 위치에서 아스파라긴을 알라닌으로 대체(N297A)하도록 Fc 영역을 추가로 조작할 수 있다.
일부 구현예에서, Fab-암 교환(arm exchange)을 피함으로써 생산 효율을 촉진하기 위해, Fc 영역을 추가로 조작하여 IgG4의 228번 위치(EU 넘버링)에서 세린을 프롤린으로 대체(S228P)하였다. S228 돌연변이에 관한 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌(참조: Silva et al. "The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation." Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015): 5462-5469, 이는 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 단백질은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하기 위해 (예를 들어, 불변 도메인에 있는) 한 쌍의 중쇄 폴리펩티드들 사이의 계면을 조작함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 교체함으로써 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "공동(cavity)"들이 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 원치 않는 다른 최종 생성물보다 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어, 전문이 참조로 포함된 WO 96/27011에 기재되어 있다. Fc 영역에 대한 변형이 이루어지지만, 본 개시는 또한 상기 변형이 놉-인-홀(knobs-in-holes)과 양립할 수 있음을 보여준다. "놉 인투 홀(knobs into holes)" 접근법은 하나의 중쇄에 큰 측쇄가 있는 아미노산에 대한 돌연변이, 및 다른 중쇄에 작은 측쇄가 있는 아미노산에 대한 돌연변이를 도입한다. 따라서, 동일한 중쇄들은 서로 결합할 가능성이 적고, 두 개의 다른 중쇄들은 서로 결합할 가능성이 더 높다. "놉 인투 홀" 접근법은, 예를 들어, 문헌(참조: Ridgway, John BB, Leonard G. Presta, and Paul Carter. "'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization." Protein Engineering, Design and Selection 9.7 (1996), 이는 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, IgG의 CH3 부분에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환된다. 일부 구현예에서, 하나의 중쇄는 다음 치환 Y349C 및 T366W 중 하나 이상을 갖는다. 다른 중쇄는 다음 치환 E356C, T366S, L368A, 및 Y407V 중 하나 이상을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 중쇄는 T366Y, T366W, T366W/D399C, T366W/K392C, S354C/T366W, Y349C/T366W, E356C/T366W, Y349C/T366W, E357C/T366W, 또는 Y349C/T366W(놉) 치환을 가지며, 다른 중쇄는 Y407T, T366S/L368A/Y407V, T366S/L368A/K392C/Y407V, T366S/D399C/L368A/Y407V, Y349C/T366S/L368A/Y407V, S354C/T366S/L368A/Y407V, Y349C/T366S/L368A/Y407V, E356C/T366S/L368A/Y407V, Y349C/T366S/L368A/Y407V, 또는 E357C/T366S/L368A/Y407V(홀) 치환(EU 넘버링)을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 치환은 Y349C, T366W, T366S, T366Y, S354C, E356C, E357C, T366S, L368A, K392C, D399C, Y407V, 및 Y407T로부터 선택된다. 놉 인투 홀 돌연변이들 중 일부는, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 US8216805B2에 기재되어 있다.
다양한 항원 결합 단백질들을 암호화하는 서열들은 다양한 분자 생물학 기술들을 사용하여 구축될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 서열들은 발현 벡터(예를 들어, pcDNA3.3) 내로 클로닝될 수 있다. 세포들(예를 들어, Expi293)은 항원 결합 단백질들을 발현할 수 있는 구축된 플라스미드들로 형질감염될 수 있다. 이어서, 형질감염된 세포들을 배양하고, 상청액을 수집하여 단백질 정제할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 얻어진 항원 결합 단백질들은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피에 이어서 크기 배제 크로마토그래피(HPLC-SEC)에 의해 추가로 분석될 수 있다.
본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질들이 용이하게 발현되고 정제될 수 있음을 입증한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질들은 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 수율은 적어도 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 또는 500mg/L일 수 있다. 항원 결합 단백질들의 순도는, 예를 들어, HPLC-SEC에 의해 분석된 경우, 적어도 또는 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 수 있다.
치료 방법들
본원에 기재된 방법들은 다양한 질환들을 치료하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하거나 필요로 하는 것으로 결정된 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 질환은 암, 자가면역 질병, 감염성 질병, 중추신경계 질병, 대사 질병 등이다.
이러한 맥락에서 사용되는 "치료하다(treat)"는 상기 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 질환은 암이다. 종종 암은 사망을 초래하며; 따라서, 치료는 기대 수명을 연장시킬 수 있다(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년). 암과 관련된 상태의 치료를 위해 본원에 기재된 제제의 치료적 유효량을 투여하면 암 세포의 수가 감소하고/하거나 증상이 완화될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 자율적 성장 능력을 갖는 세포, 즉 빠르게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적인 상태(state) 또는 상태(condition)를 지칭한다. 이 용어는 조직병리학적 유형이나 침습 단계에 관계없이, 모든 유형의 암성 성장(cancerous growth) 또는 발암 과정(oncogenic process), 전이 조직 또는 악성으로 변형된 세포, 조직, 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "종양"은 암성 세포, 예를 들어 암성 세포 덩어리를 지칭한다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료 또는 진단될 수 있는 암에는 폐, 유방, 갑상선, 림프계, 위장관, 및 비뇨생식관에 영향을 미치는 것과 같은 다양한 장기 시스템의 악성종양(malignancy), 뿐만 아니라 대부분의 결장암, 신세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 폐의 비소세포 암종, 소장암, 및 식도암과 같은 악성종양을 포함하는 선암종이 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 제제는 대상체에서 암종을 치료 또는 진단하기 위해 설계된다. 용어 "암종(carcinoma)"은 당업계에 알려져 있으며, 호흡기계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식기계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종, 및 흑색종을 포함하는 상피 또는 내분비 조직의 악성종양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 암은 신장 암종 또는 흑색종이다. 암종의 예로는 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장, 및 난소의 조직으로부터 형성되는 암종이 포함된다. 상기 용어는 또한, 예를 들어, 암종성 및 육종성 조직으로 구성된 악성 종양을 포함하는 암육종을 포함한다. "선암종(adenocarcinoma)"은 선 조직(glandular tissue)에서 유래하거나 종양 세포가 인식할 수 있는 선 구조물(glandular structure)을 형성하는 암종을 지칭한다. 용어 "육종"은 당업계에 알려져 있으며, 중간엽 유래의 악성 종양을 지칭한다.
일 측면에서, 본 개시는 또한 대상체에서 암을 치료하는 방법, 시간 경과에 따른 대상체에서 종양 부피의 증가 속도를 감소시키는 방법, 전이가 발생할 위험을 감소시키는 방법, 또는 대상체에서 추가적인 전이가 발생할 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 치료는 암의 진행을 멈추거나, 둔화시키거나, 지체시키거나, 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 치료는 대상체에서 암의 하나 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 지속 기간을 감소시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 개시는 치료적 유효량의 본원에 개시된 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 암, 예를 들어, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암), 카르시노이드암(carcinoid cancer), 자궁경부암, 자궁내막암, 신경아교종, 두경부암, 간암, 폐암, 소세포폐암, 림프종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 결장직장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 방광암, 요도암, 또는 혈액암을 앓거나, 앓는 것으로 확인되거나 진단된 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 명세서 전반에 걸쳐 혼용되어 사용되며, 본 발명의 방법에 따른 치료가 제공되는 동물, 인간, 또는 비-인간을 기술한다. 수의적 및 비수의적 적용이 본 발명에 고려된다. 인간 환자는 성인 인간 또는 청소년 인간(예를 들어, 18세 미만의 인간)일 수 있다. 인간 이외에, 환자는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 페럿, 고양이, 개, 및 영장류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 고릴라 등), 설치류(예를 들어, 래트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 페럿, 토끼), 토끼류, 돼지(예를 들어, 돼지, 미니어처 피그), 말, 개, 고양이, 소, 및 기타 가축, 농장 동물, 및 동물원 동물이 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 암은 절제 불가능한 흑색종 또는 전이성 흑색종, 비소세포 폐암종(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 방광암, 또는 전이성 호르몬 불응성 전립선암이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 고형 종양을 지니고 있다. 일부 구현예에서, 상기 암은 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 신세포 암종(RCC), 삼중 음성 유방암(TNBC), 또는 결장직장 암종이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 호지킨 림프종을 지니고 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 삼중 음성 유방암(TNBC), 위암, 요로상피암, 메르켈 세포 암종, 또는 두경부암을 지니고 있다. 일부 구현예에서, 상기 암은 흑색종, 췌장 암종, 중피종, 혈액 악성종양, 특히 비호지킨 림프종, 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 또는 진행성 고형 종양이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 암에 걸릴 위험이 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 암 환자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 식별될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 자가면역 질병에 걸릴 위험이 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 감염, 예를 들어, 바이러스 감염 또는 박테리아 감염의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유효량"은 질병의 진행을 멈추거나, 둔화시키거나, 지체시키거나, 억제하는 것을 포함하는 유리하거나 목적하는 결과를 달성하기에 충분한 양 또는 투여량을 의미한다. 유효량은, 예를 들어, 항원 결합 단백질을 투여할 대상체의 연령 및 체중, 증상의 중증도, 및 투여 경로에 따라 달라질 것이므로 개인에 따라 투여가 결정될 수 있다.
유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질의 유효량은 환자의 자가면역 질병 또는 암의 진행을 개선, 중단, 안정화, 역전, 억제, 둔화 및/또는 지연시키기에 충분한 양이거나, 시험관내에서 세포(예를 들어, 생검된 세포, 본원에 기재된 임의의 암 세포, 또는 세포주(예를 들어, 암 세포주))의 증식을 개선, 중단, 안정화, 역전, 둔화 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다.
본원에 개시된 항원 결합 단백질을 투여하기 위한 유효량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 당업자는, 투여되어야 하는 투여량이, 예를 들어, 본원에 개시된 항원 결합 단백질을 수용할 포유동물, 투여 경로, 특정 항원 결합 단백질 유형, 및/또는 사용된 본원에 개시된 조성물, 및 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다.
항원 결합 단백질의 유효량의 통상적인 일일 투여량은 0.01mg/kg 내지 100mg/kg이다. 일부 구현예에서, 상기 투여량은 100mg/kg, 10mg/kg, 9mg/kg, 8mg/kg, 7mg/kg, 6mg/kg, 5mg/kg, 4mg/kg, 3mg/kg, 2mg/kg, 1mg/kg, 0.5mg/kg, 또는 0.1mg/kg 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 투여량은 10mg/kg, 9mg/kg, 8mg/kg, 7mg/kg, 6mg/kg, 5mg/kg, 4mg/kg, 3mg/kg, 2mg/kg, 1mg/kg, 0.5mg/kg, 0.1mg/kg, 0.05mg/kg, 또는 0.01mg/kg 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 투여량은 약 10mg/kg, 9mg/kg, 8mg/kg, 7mg/kg, 6mg/kg, 5mg/kg, 4mg/kg, 3mg/kg, 2mg/kg, 1mg/kg, 0.9mg/kg, 0.8mg/kg, 0.7mg/kg, 0.6mg/kg, 0.5mg/kg, 0.4mg/kg, 0.3mg/kg, 0.2mg/kg, 또는 0.1mg/kg이다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 적어도 하나의 항원 결합 단백질, 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물 및 선택적으로, 적어도 하나의 추가 치료제는 적어도 일주일에 한 번(예를 들어, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 1일 1회, 1일 2회, 또는 1일 3회) 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 항원 결합 단백질들이 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 추가 치료제가 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 추가 치료제는 상이한 2개의 조성물들(예를 들어, 적어도 하나의 항원 결합 단백질을 함유하는 액체 조성물과 적어도 하나의 추가 치료제를 함유하는 고체 경구 조성물)로 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 알약, 정제, 또는 캡슐로 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 서방성(sustained-release) 경구 제형으로 투여된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 적어도 하나의 항원 결합 단백질을 투여하기 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제 및 적어도 하나의 항원 결합 단백질은, 대상체에서 하나 이상의 추가 치료제 및 적어도 하나의 항원 결합 단백질의 생리활성(bioactive) 기간이 겹치도록 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 추가 치료제는 B-Raf 억제제, EGFR 억제제, MEK 억제제, ERK 억제제, K-Ras 억제제, c-Met 억제제, 역형성 림프종 키나아제(anaplastic lymphoma kinase; ALK) 억제제, 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K) 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, 이중 PI3K/mTOR 억제제, 브루톤 티로신 키나아제(Bruton's tyrosine kinase; BTK) 억제제, 및 이소시트레이트 탈수소효소 1(IDH1) 및/또는 이소시트레이트 탈수소효소 2(IDH2)의 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 인돌아민 2,3-디옥시게나아제-1(IDO1)의 억제제(예를 들어, 에파카도스타트(epacadostat))이다.
일부 구현예에서, 추가 치료제는 HER3 억제제, LSD1 억제제, MDM2 억제제, BCL2 억제제, CHK1 억제제, 활성화된 고슴도치(hedgehog) 신호전달 경로의 억제제, 및 에스트로겐 수용체를 선택적으로 분해하는 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 치료제는 트라벡테딘(Trabectedin), nab-파클리탁셀, 트레바나닙(Trebananib), 파조파닙(Pazopanib), 세디라닙(Cediranib), 팔보시클립(Palbociclib), 에베로리무스(everolimus), 플루오로피리미딘(fluoropyrimidine), IFL, 레고라페닙(regorafenib), 레오리신(Reolysin), 알림타(Alimta), 자이카디아(Zykadia), 수텐트(Sutent), 템시롤리무스(temsirolimus), 악시티닙(axitinib), 에베로리무스, 소라페닙(sorafenib), 보트리엔트(Votrient), 파조파닙(Pazopanib), IMA-901, AGS-003, 카보잔티닙(cabozantinib), 빈플루닌(Vinflunine), Hsp90 억제제, Ad-GM-CSF, 테마졸로마이드(Temazolomide), IL-2, IFNa, 빈블라스틴(vinblastine), 탈로미드(Thalomid), 다카르바진(dacarbazine), 사이클로포스파미드, 레날리도마이드(lenalidomide), 아자시티딘(azacytidine), 레날리도마이드, 보르테조미드(bortezomid), 암루비신(amrubicine), 카르필조밉(carfilzomib), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 및 엔자스타우린(enzastaurin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 치료제는 애쥬번트, TLR 효능제, 종양 괴사 인자(TNF) 알파, IL-1, HMGB1, IL-10 길항제, IL-4 길항제, IL-13 길항제, IL-17 길항제, HVEM 길항제, ICOS 효능제, CX3CL1을 표적으로 하는 치료, CXCL9를 표적으로 하는 치료, CXCL10을 표적으로 하는 치료, CCL5를 표적으로 하는 치료, LFA-1 효능제, ICAM1 효능제, 및 셀렉틴 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 카보플라틴(carboplatin), nab-파클리탁셀, 파클리탁셀, 시스플라틴(cisplatin), 페메트렉세드(pemetrexed), 겜시타빈(gemcitabine), FOLFOX, 또는 FOLFIRI가 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 추가 치료제는 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-GITR 항체이다.
약제학적 조성물 및 투여 경로
본원에서는, 본원에 기재된 항원 결합 단백질들 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)를 함유하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 본원에 기재된 임의의 항원 결합 단백질들 중 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개)이 임의의 조합으로 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 의도된 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내)에 적합하도록 제형화된다. 상기 조성물은 멸균 희석제(예를 들어, 멸균수 또는 식염수), 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매들, 항균제 또는 항진균제, 예를 들어 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등, 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산, 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트, 및 등장화제(isotonic agent), 예를 들어, 당(예를 들어, 덱스트로스), 폴리알코올(예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨), 또는 염(예를 들어, 염화나트륨), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 리포솜 현탁액이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811 참조). 상기 조성물의 제제는 제형화되고 앰플, 일회용 주사기, 또는 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다. 필요한 경우(예를 들어, 주사용 제형에서와 같이), 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제, 또는 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 치료제의 흡수는 흡수를 지연시키는 제제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 포함시킴으로써 연장될 수 있다. 대안적으로, 제어 방출은 생분해성, 생체적합성 폴리머들(예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산; Alza Corporation 및 Nova Pharmaceutical, Inc.)을 포함할 수 있는 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템에 의해 달성될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항원 결합 단백질들 중 하나 이상을 함유하는 조성물들은 투여 단위 형태(즉, 투여 용이성과 투여량 균일성을 위해 사전 결정된 양의 활성 화합물을 포함하는 물리적으로 분리된 단위들)로 비경구(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복강내) 투여를 위해 제형화될 수 있다.
상기 조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물(예를 들어, 원숭이)에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. LD50(모집단의 50%에게 치명적인 용량)과 ED50(모집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정할 수 있으며: 치료 지수는 LD50:ED50의 비율이다. 높은 치료 지수를 나타내는 작용제들이 바람직하다. 작용제가 바람직하지 않은 부작용을 나타내는 경우, 잠재적인 손상을 최소화(즉, 원치 않는 부작용 감소)하기 위해 주의를 기울여야 한다. 독성 및 치료 효능은 다른 표준 약제학적 절차들에 의해 결정될 수 있다.
약제학적 조성물은 투여 지침서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 다양한 용도들을 위해 항원 결합 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체-약물 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
실시예
본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예에 사용된 재료는 하기 표에 나열되어 있다.
다중특이적 항체들의 생성
다중특이적 항체들을 암호화하는 서열들을 분자 생물학 프로토콜에 따라 구축하였다. VEGF를 표적화하는 VHH에 대한 서열은 US 2017/0247475A1에 기재된 바와 같이 VEGFBII0038로부터 얻었다. Ang-2를 표적화하는 VHH에 대한 서열은 US2019/0135907 A1에 기재된 바와 같이 VHH 00938로부터 얻었다. MSLN을 표적화하는 VHH에 대한 서열은 AU2018/265860 A1 또는 US20180327508A1에 기재된 바와 같이 MH6T로부터 얻었다. GITR을 표적화하는 VHH에 대한 서열은 US10093742B2에 기재된 바와 같이 hzC06으로부터 얻었다. PD-1을 표적화하는 VH 및 VL에 대한 서열은 US2012135408에 기재된 바와 같이 MK-3475로부터 얻었다. 전술한 출원들에서의 이들 서열들 및 기타 서열들은 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다. 그런 다음 상기 서열들을 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 클로닝했다. Expi293 세포들은 다중특이적 항체들을 발현할 수 있는 구축된 플라스미드들로 형질감염되었다. 그런 다음 형질감염된 세포를 5일 동안 배양하고, 상청액을 수집한 후 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, 카탈로그 번호 175438)을 사용하여 단백질 정제하였다. 얻어진 항체들은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 고성능 액체 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피(HPLC-SEC)로 분석한 후 -80℃에서 보관하였다.
HPLC-SEC에 의한 다중특이적 항체들의 정제
항체 발현 Expi293 세포들(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 A14635)의 상등액을 수집한 후, 여과한 다음 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, 카탈로그 번호 175438)을 사용하여 단백질 정제하였다. 정제된 항체들의 농도는 280nm에서의 흡광도에 따라 측정되었다. 다중특이적 항체들의 크기와 순도는 각각 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC로 테스트하였다. 그런 다음 정제된 항체들을 -80℃에서 보관했다.
ELISA에 의한 표적 결합 결정
효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 위해, 처리되지 않은(조직 배양액에 의해) 평평한 바닥 96웰 플레이트들(Nunc MaxiSorp™, Thermo Fisher Scientific)을 적절한 농도(0.25mg/ml 또는 0.2mg/ml)의 인간 표적 단백질로 4℃에서 밤새 사전 코팅했다. 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단한 후, 100nM에서 0.00128nM까지 5배 적정 항체(titrated antibody)들 100μL를 각 웰에 피펫팅하고, 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 결합되지 않은 물질들을 제거한 후, 1:5000 희석된 HRP 표지 염소 항-인간 IgG(Bethyl Laboratories, Inc., 카탈로그 번호 A80-304P) 100μL를 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션했다. 각 웰에 TMB 기질 100μL을 분배하여 색을 발색시킨 다음, 2M HCl 100μL를 첨가하여 중단시켰다. 마이크로플레이트 분광광도계(SpectraMax® M5e)를 사용하여 450nm 및 540nm에서의 흡광도 값을 측정하였다.
시차 주사 형광측정법(DSF)에 의한 열 안정성 측정
QuantStudio™ 7 Flex 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 항체들의 융점(Tm)을 결정했다. 구체적으로, 항체 용액 19μL를 80×SYPRO 오렌지 용액(Invitrogen) 1μL와 혼합한 후, 혼합물을 96웰 플레이트(Biosystems)로 옮겼다. 상기 플레이트를 0.9℃/분의 속도로 26℃에서 95℃까지 가열하고, 생성된 형광 데이터를 수집했다. 상이한 온도에 대한 형광 변화의 음의 도함수(negative derivative)를 계산하였고, 최대값을 용융 온도 Tm으로 정의하였다. 대안적으로, 단백질이 여러 언폴딩 전이를 나타내는 경우, 처음 두 Tm 값들을 Tm1 및 Tm2로 계산했다. 데이터 수집 및 Tm 계산은 운영 소프트웨어(QuantStudio™ 실시간 PCR 소프트웨어 v1.3)에 의해 자동으로 수행되었다.
실시예 2: 다중특이적 항체들
VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 7개의 다중특이적 항체들을 도 1b 내지 1h에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. T1 및 U1은 각각 VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 VHH들을 나타낸다. 다중특이적 항체들은 각각 W366001-T1U1.F82-1.uIgG4V1(또는 "F82"), W366001-T1U1.F83-1.uIgG4V1(또는 "F83"), W366001-U1T1.F84-1.uIgG4V1(또는 " F84"), W366001-U1T1.G1-1.uIgG4V1(또는 "G1"), W366001-U1T1.G32-1.uIgG4V1(또는 "G32"), W366001-U1T1.G33-1.uIgG4V1(또는 "G33"), 및 W366001-U1T1.H9-1.uIgG4V1(또는 "H9")로 명명되었다.
다중특이적 항체들은 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플들의 순도가 90% 미만인 경우, 샘플들을 HPLC-SEC 정제에 의해 추가로 정제하였다. 정제 후 수율 및 순도를 측정하였다. 용융 온도(예를 들어, Tm1 및/또는 Tm2)는 DSF에 의해 측정되었다. 표적에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA도 수행되었다. EC50을 계산하고, 모 항체와 비교하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 단일가(single valent)인 경우, 동일한 결합 부위를 갖는 단일가의 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 다가(예를 들어, 2가)인 경우, 동일한 결합 부위들을 갖는 2가 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 모 항체에 대한 각 다중특이적 항체의 결합 비율(EC50의 비율)도 결정되었다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
a) F82
다중특이적 항체 F82의 개략적인 구조는 도 1b에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 F82를 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 결과는 F82 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 2b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. F82 항체의 최종 순도는 94.55%로 결정되었다. 또한, F82의 Tm1 값은 도 2c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 61.6℃로 결정되었다.
또한, F82의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 2d 및 도 2e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 F82 결합의 EC50 값은 각각 0.139μg/ml 및 0.026μg/ml로 결정되었다.
b) F83
다중특이적 항체 F83의 개략적인 구조는 도 1c에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 F83을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 결과는 F83 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 3b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. F83 항체의 최종 순도는 93.18%로 결정되었다. 또한, F83의 Tm1 및 Tm2 값은 도 3c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 61.8℃ 및 67.2℃로 결정되었다.
F83의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 3d 및 도 3e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 F83 결합의 EC50 값은 각각 0.122μg/ml 및 0.041μg/ml로 결정되었다.
c) F84
다중특이적 항체 F84의 개략적인 구조는 도 1d에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 F84를 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 결과는 F84 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 4b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. F84 항체의 최종 순도는 95.27%로 결정되었다. 또한, F84의 Tm1 값은 도 4c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 61.1℃로 결정되었다.
F84의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 4d 및 도 4e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 F84 결합의 EC50 값은 각각 0.222μg/ml 및 0.026μg/ml로 결정되었다.
d) G1
다중특이적 항체 G1의 개략적인 구조는 도 1e에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 G1을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 결과는 G1 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 5b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. G1 항체의 최종 순도는 97.99%로 결정되었다. 또한, G1의 Tm1 값은 도 5c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 61.8℃로 결정되었다.
G1의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 5d 및 도 5e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 G1 결합의 EC50 값은 각각 0.016μg/ml 및 0.030μg/ml로 결정되었다.
e) G32
다중특이적 항체 G32의 개략적인 구조는 도 1f에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 G32를 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 결과는 G32 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. 분석 SEC 결과는 도 6b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. G32 항체의 최종 순도는 98.31%로 결정되었다. 또한, G32의 Tm1 값은 도 6c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 58.5℃로 결정되었다.
G32의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 6d 및 도 6e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 G32 결합의 EC50 값은 각각 0.017μg/ml 및 0.023μg/ml로 결정되었다.
f) G33
다중특이적 항체 G33의 개략적인 구조는 도 1g에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 G33을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 결과는 G33 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 7b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. G33 항체의 최종 순도는 92.54%로 결정되었다. 또한, G33의 Tm1 값은 도 7c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 61.1℃로 결정되었다.
G33의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 7d 및 도 7e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 G33 결합의 EC50 값은 각각 0.016μg/ml 및 0.021μg/ml로 결정되었다.
g) H9
다중특이적 항체 H9의 개략적인 구조는 도 1h에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 H9를 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 결과는 H9 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 8b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. H9 항체의 최종 순도는 99.33%로 결정되었다. 또한, H9의 Tm1 값은 도 8c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 58.5℃로 결정되었다.
H9의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 8d 및 도 8e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 H9 결합의 EC50 값은 각각 0.017μg/ml 및 0.020μg/ml로 결정되었다.
실시예 3: VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 다중특이적 항체들
VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 6개의 다중특이적 항체들을 도 9a 내지 도 9f에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. T1 및 U1은 각각 VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 VHH들을 나타낸다. 다중특이적 항체들은 각각 W366001-T1U1.E32-1.uIgG4V1(또는 "E32"), W366001-U1T1.G44-1.uIgG4V1(또는 "G44"), W366001-U1T1.G45-1.uIgG4V1(또는 "G45"), W366001-U1T1.G46-1.uIgG4V1(또는 "G46"), W366001-U1T1.H14-1.uIgG4V1(또는 "H14") 및 W366001-U1T1.H6-1.uIgG4V1(또는 "H6")로 명명되었다.
다중특이적 항체들은 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플들의 순도가 90% 미만인 경우, 샘플들을 HPLC-SEC 정제에 의해 추가로 정제하였다. 정제 후 수율 및 순도를 측정하였다. 용융 온도(예를 들어, Tm1 및/또는 Tm2)는 DSF에 의해 측정되었다. 표적에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA도 수행되었다. EC50을 계산하고, 모 항체와 비교하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 단일가인 경우, 동일한 결합 부위를 갖는 단일가의 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 다가(예를 들어, 2가)인 경우, 동일한 결합 부위들을 갖는 2가 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 모 항체에 대한 각 다중특이적 항체의 결합 비율(EC50의 비율)도 결정되었다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
a) E32
다중특이적 항체 E32의 개략적인 구조는 도 9a에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 E32를 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, 정제된 E32 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 10b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. E32 항체의 최종 순도는 91.71%로 결정되었다. 또한, E32의 Tm1 값은 도 10c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 63.3℃로 결정되었다.
E32의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 10d 및 도 10e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 E32 결합의 EC50 값은 각각 0.161μg/ml 및 0.064μg/ml로 결정되었다.
b) G44
다중특이적 항체 G44의 개략적인 구조는 도 9b에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 G44를 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, 정제된 G44 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 11b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. G44 항체의 최종 순도는 91.31%로 결정되었다. 또한, G44의 Tm1 값은 도 11c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 62.5℃로 결정되었다.
G44의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 11d 및 도 11e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 G44 결합의 EC50 값은 각각 0.204μg/ml 및 0.055μg/ml로 결정되었다.
c) G45
다중특이적 항체 G45의 개략적인 구조는 도 9c에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 G45를 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, 정제된 G45 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 12b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. G45 항체의 최종 순도는 86.36%로 결정되었다. 또한, G45의 Tm1 값은 도 12c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 62.6℃로 결정되었다.
G45의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 12d 및 도 12e에 나타내었다. VEGF에 대한 G45 결합의 EC50 값은 0.113μg/ml로 결정되었다.
d) G46
다중특이적 항체 G46의 개략적인 구조는 도 9d에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 G46을 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 13a에 나타낸 바와 같이, 정제된 G46 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 13b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. G46 항체의 최종 순도는 86.98%로 결정되었다. 또한, G46의 Tm1 값은 도 13c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 63.1℃로 결정되었다.
G46의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 13d 및 도 13e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 G46 결합의 EC50 값은 각각 0.288μg/ml 및 0.047μg/ml로 결정되었다.
e) H14
다중특이적 항체 H14의 개략적인 구조는 도 9e에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 H14를 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 14a에 나타낸 바와 같이, 결과는 H14 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 14b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. H14 항체의 최종 순도는 92.27%로 결정되었다. 또한, H14의 Tm1 값은 도 14c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 63.1℃로 결정되었다.
H14의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 14d 및 도 14e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 H14 결합의 EC50 값은 각각 0.020μg/ml 및 0.022μg/ml로 결정되었다.
f) H6
다중특이적 항체 H6의 개략적인 구조는 도 9f에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 H6을 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 15a에 나타낸 바와 같이, 결과는 H6 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 15b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. H6 항체의 최종 순도는 99.07%로 결정되었다. 또한, H6의 Tm1 값은 도 15c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 61.5℃로 결정되었다.
H6의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 15d 및 도 15e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 H6 결합의 EC50 값은 각각 0.020μg/ml 및 0.015μg/ml로 결정되었다.
실시예 4: VEGF 및 PD-1을 표적화하는 다중특이적 항체들
VEGF 및 PD-1을 표적화하는 8개의 다중특이적 항체들을 도 16a 내지 16h에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. T1은 VEGF를 표적화하는 VHH를 나타낸다. U12는 PD-1을 표적화하는 Fab 도메인을 나타낸다. 다중특이적 항체들은 각각 W366002-U12T1.E28-1.uIgG4V1(또는 "E28"), W366002-T1U12.F43-1.uIgG4V1(또는 "F43"), W366002-U12T1.F85R-1.uIgG4V1(또는 F85R), W366002-U12T1.F45R-1.uIgG4V1(또는 "F45R"), W366002-U12T1.G58-1.uIgG4V1(또는 "G58"), W366002-T1U12.H27-1.uIgG4V1(또는 "H27"), W366002-T1U12.H22-1.uIgG4V1(또는 "H22"), 및 W366002-T1U12.G47-1.uIgG4V1(또는 "G47")로 명명되었다.
다중특이적 항체들은 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플들의 순도가 90% 미만인 경우, 샘플들을 HPLC-SEC 정제에 의해 추가로 정제하였다. 정제 후 수율 및 순도를 측정하였다. 용융 온도(예를 들어, Tm1 및/또는 Tm2)는 DSF에 의해 측정되었다. 표적에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA도 수행되었다. EC50을 계산하고, 모 항체와 비교하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 단일가인 경우, 동일한 결합 부위를 갖는 단일가의 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 다가(예를 들어, 2가)인 경우, 동일한 결합 부위들을 갖는 2가 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 모 항체에 대한 각 다중특이적 항체의 결합 비율(EC50의 비율)도 결정되었다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
a) E28
다중특이적 항체 E28의 개략적인 구조는 도 16a에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 E28을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 17a에 나타낸 바와 같이, 결과는 E28 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 17b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. E28 항체의 최종 순도는 97.85%로 결정되었다. 또한, E28의 Tm1 및 Tm2 값은 도 17c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 63.4℃ 및 70.0℃로 결정되었다.
또한, E28의 VEGF 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 17d 및 도 17e에 나타내었다. VEGF 및 PD-1에 대한 E28 결합의 EC50 값은 각각 0.056μg/ml 및 0.154μg/ml로 결정되었다.
b) F43
다중특이적 항체 F43의 개략적인 구조는 도 16b에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 F43을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 18a에 나타낸 바와 같이, 결과는 F43 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 18b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. F43 항체의 최종 순도는 91.88%로 결정되었다. 또한, F43의 Tm1 및 Tm2 값은 도 18c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 64.7℃ 및 69.7℃로 결정되었다.
또한, F43의 VEGF 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 18d 및 도 18e에 나타내었다. VEGF 및 PD-1에 대한 F43 결합의 EC50 값은 각각 0.102μg/ml 및 0.306μg/ml로 결정되었다.
c) F85R
다중특이적 항체 F85R의 개략적인 구조는 도 16c에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 F85R을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 19a에 나타낸 바와 같이, 결과는 F85R 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 19b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. F85R 항체의 최종 순도는 96.68%로 결정되었다. 또한, F85R의 Tm1 및 Tm2 값은 도 19c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 61.5℃ 및 67.9℃로 결정되었다.
또한, F85R의 VEGF 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 19d 및 도 19e에 나타내었다. VEGF 및 PD-1에 대한 F85R 결합의 EC50 값은 각각 0.040μg/ml 및 0.124μg/ml로 결정되었다.
d) F45R
다중특이적 항체 F45R의 개략적인 구조는 도 16d에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 F45R을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 20a에 나타낸 바와 같이, 결과는 F45R 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 20b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. F45R 항체의 최종 순도는 92.75%로 결정되었다. 또한, F45R의 Tm1 값은 도 20c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 64.6℃로 결정되었다.
또한, F45R의 VEGF 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 20d 및 도 20e에 나타내었다. VEGF 및 PD-1에 대한 F45R 결합의 EC50 값은 각각 0.042μg/ml 및 0.705μg/ml로 결정되었다.
e) G58
다중특이적 항체 G58의 개략적인 구조는 도 16e에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 G58을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 21a에 나타낸 바와 같이, 결과는 G58 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 21b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. G58 항체의 최종 순도는 91.71%로 결정되었다. 또한, G58의 Tm1 및 Tm2 값은 도 21c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 62.0℃ 및 67.9℃로 결정되었다.
또한, G58의 VEGF 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 21d 및 도 21e에 나타내었다. VEGF 및 PD-1에 대한 G58 결합의 EC50 값은 각각 0.222μg/ml 및 0.029μg/ml로 결정되었다.
f) H27
다중특이적 항체 H27의 개략적인 구조는 도 16f에 도시되어 있다. 정제 단계 후, 정제된 H27을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 결과는 H27 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 22b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. H27 항체의 최종 순도는 90.25%로 결정되었다. 또한, H27의 Tm1 및 Tm2 값은 도 22c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 62.9℃ 및 67.2℃로 결정되었다.
또한, H27의 VEGF 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 22d 및 도 22e에 나타내었다. VEGF 및 PD-1에 대한 H27 결합의 EC50 값은 각각 0.031μg/ml 및 0.031μg/ml로 결정되었다.
g) H22
다중특이적 항체 H22의 개략적인 구조는 도 16g에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 H22를 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 23a에 나타낸 바와 같이, 결과는 H22 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 23b에 나타내었고, 주요 피크와 작은 피크(minor peak)가 관찰되었다. H22 항체의 최종 순도는 주요 피크의 경우 66.73%, 작은 피크의 경우 24.08%로 결정되었다. 또한, H22의 Tm1 값은 도 23c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 63.1℃로 결정되었다.
또한, H22의 VEGF 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 23d 및 도 23e에 나타내었다. VEGF 및 PD-1에 대한 H22 결합의 EC50 값은 각각 0.021μg/ml 및 0.020μg/ml로 결정되었다.
h) G47
다중특이적 항체 G47의 개략적인 구조는 도 16h에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 G47을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 24a에 나타낸 바와 같이, 결과는 G47 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 24b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. G47 항체의 최종 순도는 94.68%로 결정되었다. 또한, G47의 Tm1 값은 도 24c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 62.8℃로 결정되었다.
또한, G47의 VEGF 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 24d 및 도 24e에 나타내었다. VEGF 및 PD-1에 대한 G47 결합의 EC50 값은 각각 0.040μg/ml 및 0.065μg/ml로 결정되었다.
실시예 5: VEGF, Ang-2, 메소텔린, 및/또는 PD-1을 표적화하는 다중특이적 항체들
VEGF, Ang-2, 메소텔린, 및/또는 PD-1을 표적화하는 10개의 다중특이적 항체들을 도 25a 내지 25j에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. T1, U1, W3은 각각 VEGF, Ang-2, 및 메소텔린(MSLN)을 표적화하는 VHH들을 나타낸다. W1은 PD-1을 표적화하는 Fab 도메인을 나타낸다. 다중특이적 항체들은 각각 W366003-T1U1W1.I23-1.uIgG4V1(또는 "I23"), W366003-T1U1W1.L52-1.uIgG4V1(또는 "L52"), W366003-T1U1W3.L1-1.uIgG4V1(또는 "L1"), W366003-T1W1U1.H27-1.uIgG4V1(또는 "H27-1"), W366003-T1U1W3.L54-1.uIgG4V1(또는 "L54"), W366003-T1U1W3.L55-1.uIgG4V1(또는 "L55"), W366003-T1U1W3.L56-1.uIgG4V1(또는 "L56"), W366003-T1U1W1.L51-1.uIgG4V1(또는 "L51"), W366003-T1U1W1.L57-1.uIgG4V1(또는 "L57"), 및 W366003-T1U1W1.L58-1.uIgG4V1(또는 "L58")로 명명되었다.
다중특이적 항체들은 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플들의 순도가 90% 미만인 경우, 샘플들을 HPLC-SEC 정제에 의해 추가로 정제하였다. 정제 후 수율 및 순도를 측정하였다. 용융 온도(예를 들어, Tm1 및/또는 Tm2)는 DSF에 의해 측정되었다. 표적에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA도 수행되었다. EC50을 계산하고, 모 항체와 비교하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 단일가인 경우, 동일한 결합 부위를 갖는 단일가의 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 다가(예를 들어, 2가)인 경우, 동일한 결합 부위들을 갖는 2가 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 모 항체에 대한 각 다중특이적 항체의 결합 비율(EC50의 비율)도 결정되었다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
a) I23(VEGF/Ang-2/PD-1)
다중특이적 항체 I23의 개략적인 구조는 도 25a에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 I23을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 26a에 나타낸 바와 같이, 결과는 I23 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 26b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. I23 항체의 최종 순도는 99.93%로 결정되었다. 또한, I23의 Tm1 값은 도 26c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 64.1℃로 결정되었다.
또한, I23의 VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 26d 내지 26f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 I23 결합의 EC50 값은 각각 0.124μg/ml, 0.067μg/ml, 및 0.106μg/ml로 결정되었다.
b) L52(VEGF/Ang-2/PD-1)
다중특이적 항체 L52의 개략적인 구조는 도 25b에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 L52를 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 27a에 나타낸 바와 같이, 결과는 L52 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 27b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. L52 항체의 최종 순도는 98.12%로 결정되었다. 또한, L52의 Tm1 값은 도 27c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 64.1℃로 결정되었다.
또한, L52의 VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 27d 내지 27f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 L52 결합의 EC50 값은 각각 0.204μg/ml, 0.190μg/ml, 및 0.023μg/ml로 결정되었다.
c) L1(VEGF/Ang-2/MSLN)
다중특이적 항체 L1의 개략적인 구조는 도 25c에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 L1을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 28a에 나타낸 바와 같이, 결과는 L1 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 28b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. L1 항체의 최종 순도는 98.75%로 결정되었다. 또한, L1의 Tm1 값은 도 28c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 60.2℃로 결정되었다.
또한, L1의 VEGF, Ang-2, MSLN에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 28d 내지 28f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 MSLN에 대한 L1 결합의 EC50 값은 각각 0.031μg/ml, 0.027μg/ml, 및 0.092μg/ml로 결정되었다.
d) H27-1(VEGF/Ang-2/PD-1)
다중특이적 항체 H27-1의 개략적인 구조는 도 25d에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 H27-1을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 29a에 나타낸 바와 같이, 결과는 H27-1 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 29b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. H27-1 항체의 최종 순도는 91.19%로 결정되었다. 또한, H27-1의 Tm1 값은 도 29c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 65.1℃로 결정되었다.
또한, H27-1의 VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 29d 내지 29f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 H27-1 결합의 EC50 값은 각각 0.055μg/ml, 0.052μg/ml, 및 0.033μg/ml로 결정되었다.
e) L54(VEGF/Ang-2/MSLN)
다중특이적 항체 L54의 개략적인 구조는 도 25e에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 L54를 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 30a에 나타낸 바와 같이, 결과는 L54 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 30b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. L54 항체의 최종 순도는 94.28%로 결정되었다. 또한, L54의 Tm1 값은 도 30c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 59.3℃로 결정되었다.
또한, L54의 VEGF, Ang-2, 및 MSLN에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 30d 내지 30f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 MSLN에 대한 L54 결합의 EC50 값은 각각 0.027μg/ml, 0.030μg/ml, 및 0.073μg/ml로 결정되었다.
f) L55(VEGF/Ang-2/MSLN)
다중특이적 항체 L55의 개략적인 구조는 도 25f에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 L55를 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 31a에 나타낸 바와 같이, 결과는 L55 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 31b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. L55 항체의 최종 순도는 92.57%로 결정되었다. 또한, L55의 Tm1 값은 도 31c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 61.3℃로 결정되었다.
또한, L55의 VEGF, Ang-2, 및 MSLN에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 31d 내지 31f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 MSLN에 대한 L55 결합의 EC50 값은 각각 0.034μg/ml, 0.043μg/ml, 및 0.121μg/ml로 결정되었다.
g) L56(VEGF/Ang-2/MSLN)
다중특이적 항체 L56의 개략적인 구조는 도 25g에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 L56을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 32a에 나타낸 바와 같이, 결과는 L56 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 32b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. L56 항체의 최종 순도는 87.42%로 결정되었다. 또한, L56의 Tm1 값은 도 32c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 61.8℃로 결정되었다.
또한, L56의 VEGF, Ang-2, 및 MSLN에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 32d 내지 32f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 MSLN에 대한 L56 결합의 EC50 값은 각각 0.048μg/ml, 0.053μg/ml, 및 0.200μg/ml로 결정되었다.
h) L51(VEGF/Ang-2/PD-1)
다중특이적 항체 L51의 개략적인 구조는 도 25h에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 L51을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 33a에 나타낸 바와 같이, 결과는 L51 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 33b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. L51 항체의 최종 순도는 98.74%로 결정되었다. 또한, L51의 Tm1 값은 도 33c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 65.9℃로 결정되었다.
또한, L51의 VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 33d 내지 33f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 L51 결합의 EC50 값은 각각 0.095μg/ml, 0.082μg/ml, 및 3.245μg/ml로 결정되었다.
i) L57(VEGF/Ang-2/PD-1)
다중특이적 항체 L57의 개략적인 구조는 도 25i에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 L57을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 34a에 나타낸 바와 같이, 결과는 L57 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 34b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. L57 항체의 최종 순도는 97.32%로 결정되었다. 또한, L57의 Tm1 값은 도 34c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 62.9℃로 결정되었다.
또한, L57의 VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 34d 내지 34f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 L57 결합의 EC50 값은 각각 0.031μg/ml, 0.044μg/ml, 및 0.102μg/ml로 결정되었다.
j) L58(VEGF/Ang-2/PD-1)
다중특이적 항체 L58의 개략적인 구조는 도 25j에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 L58을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 35a에 나타낸 바와 같이, 결과는 L58 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 35b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. L58 항체의 최종 순도는 91.35%로 결정되었다. 또한, L58의 Tm1 값은 도 35c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 63.8℃로 결정되었다.
또한, L58의 VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 35d 내지 35f에 나타내었다. VEGF, Ang-2, 및 PD-1에 대한 L58 결합의 EC50 값은 각각 0.306μg/ml, 0.145μg/ml, 및 0.027μg/ml로 결정되었다.
실시예 6: VEGF, Ang-2, 메소텔린, 및 GITR/PD-1을 표적화하는 다중특이적 항체들
VEGF, Ang-2, 메소텔린, 및 GITR/PD-1을 표적화하는 10개의 다중특이적 항체들을 도 36a 내지 36d에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. T1, U1, 및 W1은 각각 VEGF, Ang-2, 및 메소텔린(MSLN)을 표적화하는 VHH들을 나타낸다. X1은 GITR을 표적화하는 VHH를 나타낸다. X12는 PD-1을 표적화하는 Fab 도메인을 나타낸다. 다중특이적 항체들은 각각 W366004-T1U1W1X1.N1-1.uIgG4V1(또는 "N1"), W366004-T1U1W1X1.N2-1.uIgG4V1(또는 "N2"), W366004-T1U1W1X1.N3-1.uIgG4V1(또는 "N3"), 및 W366004-T1U1W1X1.N4-1.uIgG4V1(또는 "N4")로 명명되었다.
다중특이적 항체들은 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플들의 순도가 90% 미만인 경우, 샘플들을 HPLC-SEC 정제에 의해 추가로 정제하였다. 정제 후 수율 및 순도를 측정하였다. 용융 온도(예를 들어, Tm1 및/또는 Tm2)는 DSF에 의해 측정되었다. 표적에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA도 수행되었다. EC50을 계산하고, 모 항체와 비교하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 단일가인 경우, 동일한 결합 부위를 갖는 단일가의 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 다가(예를 들어, 2가)인 경우, 동일한 결합 부위들을 갖는 2가 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 모 항체에 대한 각 다중특이적 항체의 결합 비율(EC50의 비율)도 결정되었다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
a) N1(VEGF/Ang-2/MSLN/GITR)
다중특이적 항체 N1의 개략적인 구조는 도 36a에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 N1을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 37a에 나타낸 바와 같이, 결과는 N1 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 37b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. N1 항체의 최종 순도는 97.31%로 결정되었다. 또한, N1의 Tm1 값은 도 37c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 63.1℃로 결정되었다.
또한, N1의 VEGF, Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 37d 내지 37g에 나타내었다.
b) N2(VEGF/Ang-2/MSLN/GITR)
다중특이적 항체 N2의 개략적인 구조는 도 36b에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 N2를 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 38a에 나타낸 바와 같이, 결과는 N2 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 38b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. N2 항체의 최종 순도는 97.56%로 결정되었다. 또한, N2의 Tm1 및 Tm2 값은 도 38c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 58.0℃ 및 67.7℃로 결정되었다.
또한, N2의 VEGF, Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 38d 내지 38g에 나타내었다.
c) N3(VEGF/Ang-2/MSLN/PD-1)
다중특이적 항체 N3의 개략적인 구조는 도 36c에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 N3을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 39a에 나타낸 바와 같이, 결과는 N3 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 39b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. N3 항체의 최종 순도는 95.74%로 결정되었다. 또한, N3의 Tm1 및 Tm2 값은 도 39c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 62.8℃ 및 67.5℃로 결정되었다.
또한, N3의 VEGF, Ang-2, 메소텔린, 및 PD-1에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 39d 내지 39g에 나타내었다.
d) N4(VEGF/Ang-2/MSLN/GITR)
다중특이적 항체 N4의 개략적인 구조는 도 36d에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 N4를 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 40a에 나타낸 바와 같이, 결과는 N4 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 40b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. N4 항체의 최종 순도는 91.50%로 결정되었다. 또한, N4의 Tm1 및 Tm2 값은 도 40c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 57.7℃ 및 67.2℃로 결정되었다.
또한, N4의 VEGF, Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 40d 내지 40g에 나타내었다.
실시예 7: VEGF, Ang-2, 및 PD-1을 표적화하는 다중특이적 항체들
VEGF, Ang-2, 및 PD-1을 표적화하는 다중특이적 항체들을 도 41a에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. T1 및 U1은 각각 VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 VHH들을 나타낸다. W1은 PD-1을 표적화하는 Fab 영역을 나타낸다. 다중특이적 항체는 W366003-T1U1W1.D38-1.His(또는 "D38")로 명명되었다.
D38은 상기 기재된 바와 같이 정제되었다. 정제 후, 정제된 D38을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 41b에 나타낸 바와 같이, 결과는 D38 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 41c에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. D38 항체의 최종 순도는 99.01%로 결정되었다. 도 41d에 도시된 바와 같이, 용융 곡선은 DSF에 의해 측정되었다.
실시예 8: VEGF를 표적화하는 단일특이적 항체들
VEGF를 표적화하는 2개의 단일특이적 항체들을 도 43a 내지 43b에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. T1은 VEGF를 표적화하는 VHH들을 나타낸다. 단일특이적 항체들은 각각 W366000-T1.V1-1.uIgG4V1(또는 "V1") 및 W366000-T1.V2-1.uIgG4V1(또는 "V2")로 명명되었다.
단일특이성 항체들은 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플들의 순도가 90% 미만인 경우, 샘플들을 HPLC-SEC 정제에 의해 추가로 정제하였다. 정제 후 수율 및 순도를 측정하였다. 용융 온도(예를 들어, Tm1 및/또는 Tm2)는 DSF에 의해 측정되었다. 표적에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA도 수행되었다. EC50을 계산하고, 모 항체와 비교하였다. 테스트된 단일특이성 항체가 표적에 대해 단일가인 경우, 동일한 결합 부위를 갖는 단일가의 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 테스트된 단일특이적 항체가 표적에 대해 다가(예를 들어, 2가)인 경우, 동일한 결합 부위들을 갖는 2가 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 모 항체에 대한 각 단일특이적 항체의 결합 비율(EC50의 비율)도 결정되었다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
a) V1(VEGF)
단일특이적 항체 V1의 개략적인 구조는 도 43a에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 V1을 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 44a에 나타낸 바와 같이, 결과는 V1 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 44b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. V1 항체의 최종 순도는 100%로 결정되었다. 또한, V1의 Tm1 값은 도 44c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 57.5℃로 결정되었다.
V1의 VEGF에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였으며, 그 결과를 도 44d에 나타내었다. VEGF에 대한 V1 결합의 EC50 값은 0.0434μg/ml로 결정되었다.
b) V2(VEGF)
단일특이적 항체 V2의 개략적인 구조는 도 43b에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 V2를 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 45a에 나타낸 바와 같이, 결과는 V2 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 분석 결과는 도 45b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. V2 항체의 최종 순도는 92.89%로 결정되었다. 또한, V2의 Tm1 및 Tm2 값은 도 45c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 58.0℃ 및 62.8℃로 결정되었다.
V2의 VEGF에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 도 45d에 나타내었다. VEGF에 대한 V2 결합의 EC50 값은 0.0876μg/ml로 결정되었다.
실시예 9: VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 다중특이적 항체들
VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 6개의 다중특이적 항체들을 도 46a 내지 46f에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. T1 및 U1은 각각 VEGF 및 Ang-2를 표적화하는 VHH들을 나타낸다. 다중특이적 항체들은 각각 W366001-U1T1.H39-1.uIgG4V1(또는 "H39"), W366001-U1T1.H40-1.uIgG4V1(또는 "H40"), W366001-U1T1.V14-1.His(또는 "V14"), W366001-U1T1.V15-1.His(또는 "V15"), W366001-U1T1.V16-1.His(또는 "V16"), 및 W366001-U1T1.V11-1.His(또는 "V11")로 명명되었다.
다중특이적 항체들은 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플들의 순도가 90% 미만인 경우, 샘플들을 HPLC-SEC 정제에 의해 추가로 정제하였다. 정제 후 수율 및 순도를 측정하였다. 용융 온도(예를 들어, Tm1 및/또는 Tm2)는 DSF에 의해 측정되었다. 표적에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA도 수행되었다. EC50을 계산하고, 모 항체와 비교하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 단일가인 경우, 동일한 결합 부위를 갖는 단일가의 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 다가(예를 들어, 2가)인 경우, 동일한 결합 부위들을 갖는 2가 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 모 항체에 대한 각 다중특이적 항체의 결합 비율(EC50의 비율)도 결정되었다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
a) H39(VEGF/Ang-2)
다중특이적 항체 H39의 개략적인 구조는 도 46a에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 H39를 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 47a에 나타낸 바와 같이, 정제된 H39 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 47b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. H39 항체의 최종 순도는 99.28%로 결정되었다. 또한, H39의 Tm1 값은 도 47c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 58.2℃로 결정되었다.
H39의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 47d 및 도 47e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 H39 결합의 EC50 값은 각각 0.0528μg/ml 및 0.1114μg/ml로 결정되었다.
b) H40(VEGF/Ang-2)
다중특이적 항체 H40의 개략적인 구조는 도 46b에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 H40을 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 48a에 나타낸 바와 같이, 정제된 H40 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 48b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. H40 항체의 최종 순도는 97.35%로 결정되었다. 또한, H40의 Tm1 값 및 Tm2 값은 도 48c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 60.5℃ 및 64.4℃로 결정되었다.
H40의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 48d 및 도 48e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 H40 결합의 EC50 값은 각각 0.0528μg/ml 및 0.1114μg/ml로 결정되었다.
c) V14(VEGF/Ang-2)
다중특이적 항체 V14의 개략적인 구조는 도 46c에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 V14를 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 49a에 나타낸 바와 같이, 정제된 V14 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 49b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. V14 항체의 최종 순도는 90.58%로 결정되었다. 또한, V14의 Tm1 값은 도 49c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 62.3℃로 결정되었다.
V14의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 49d 및 도 49e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 V14 결합의 EC50 값은 각각 1.5680μg/ml 및 0.5059μg/ml로 결정되었다.
d) V15(VEGF/Ang-2)
다중특이적 항체 V15의 개략적인 구조는 도 46d에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 V15를 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 50a에 나타낸 바와 같이, 정제된 V15 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 50b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. V15 항체의 최종 순도는 92.31%로 결정되었다. 또한, Tm1 값 및 Tm2 값은 도 50c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 59.0℃ 및 64.7℃로 결정되었다.
V15의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 50d 및 도 50e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 V15 결합의 EC50 값은 각각 1.7380μg/ml 및 0.1380μg/ml로 결정되었다.
e) V16(VEGF/Ang-2)
다중특이적 항체 V16의 개략적인 구조는 도 46e에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 V16을 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 51a에 나타낸 바와 같이, 정제된 V16 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 51b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. V16 항체의 최종 순도는 99.47%로 결정되었다. 또한, Tm1 값 및 Tm2 값은 도 51c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 58.4℃ 및 71.5℃로 결정되었다.
V16의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 51d 및 도 51e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 V16 결합의 EC50 값은 각각 1.0560μg/ml 및 0.6202μg/ml로 결정되었다.
f) V11(VEGF/Ang-2)
다중특이적 항체 V11의 개략적인 구조는 도 46f에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 V11을 각각 비환원(N) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 52a에 나타낸 바와 같이, 정제된 V11 항체 샘플에서 다수의 비표적 밴드들이 관찰되었다. SEC 분석 결과는 도 52b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. V11 항체의 최종 순도는 99.05%로 결정되었다. 또한, V11의 Tm1 값은 도 52c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 61.3℃로 결정되었다.
V11의 VEGF 및 Ang-2에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 52d 및 도 52e에 나타내었다. VEGF 및 Ang-2에 대한 V11 결합의 EC50 값은 각각 1.1350μg/ml 및 0.3108μg/ml로 결정되었다.
실시예 10: Ang-2, 메소텔린, 및 GITR을 표적화하는 다중특이적 항체들
Ang-2, 메소텔린, 및 GITR을 표적화하는 5개의 다중특이적 항체들을 도 53a 내지 53e에 도시된 바와 같은 개략적인 구조들로 설계하였다. U1 및 W3은 각각 Ang-2 및 메소텔린(MSLN)을 표적화하는 VHH들을 나타낸다. X1은 GITR을 표적화하는 VHH를 나타낸다. 다중특이적 항체들은 각각 W366003-U1W3X1.D1-1.His(또는 "D1"), W366003-U1W3X1.D2-1.His(또는 "D2"), W366003-U1W3X1.D3-1.His(또는 "D3"), W366003-U1W3X1.D43-1.His(또는 "D43") 및 W366003-U1W3X1.D44-1.His(또는 "D44")로 명명되었다.
다중특이적 항체들은 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플들의 순도가 90% 미만인 경우, 샘플들을 HPLC-SEC 정제에 의해 추가로 정제하였다. 정제 후 수율 및 순도를 측정하였다. 용융 온도(예를 들어, Tm1 및/또는 Tm2)는 DSF에 의해 측정되었다. 표적에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA도 수행되었다. EC50을 계산하고, 모 항체와 비교하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 단일가인 경우, 동일한 결합 부위를 갖는 단일가의 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 테스트된 다중특이적 항체가 표적에 대해 다가(예를 들어, 2가)인 경우, 동일한 결합 부위들을 갖는 2가 모 항체를 비교 목적으로 선택하였다. 모 항체에 대한 각 다중특이적 항체의 결합 비율(EC50의 비율)도 결정되었다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
a) D1(Ang-2/MSLN/GITR)
다중특이적 항체 D1의 개략적인 구조는 도 53a에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 D1을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 54a에 나타낸 바와 같이, 결과는 D1 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 54b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. D1 항체의 최종 순도는 92.93%로 결정되었다. 또한, D1의 Tm1 및 Tm2 값은 도 54c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 58.2℃ 및 66.5℃로 결정되었다.
또한, D1의 Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 54d 내지 54f에 나타내었다. Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 D1 결합의 EC50 값은 각각 0.2955μg/ml, 0.3934μg/ml, 및 1.2280μg/ml로 결정되었다.
b) D2(Ang-2/MSLN/GITR)
다중특이적 항체 D2의 개략적인 구조는 도 53b에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 D2를 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 55a에 나타낸 바와 같이, 결과는 D2 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 55b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. D2 항체의 최종 순도는 95.97%로 결정되었다. 또한, D2의 Tm1 및 Tm2 값은 도 55c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 56.9℃ 및 67.9℃로 결정되었다.
또한, D2의 Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 55d 내지 55f에 나타내었다. Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 D2 결합의 EC50 값은 각각 0.1269μg/ml, 0.2724μg/ml, 및 0.3624μg/ml로 결정되었다.
c) D3(Ang-2/MSLN/GITR)
다중특이적 항체 D3의 개략적인 구조는 도 53c에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 D3을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 56a에 나타낸 바와 같이, 결과는 D3 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 56b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. D3 항체의 최종 순도는 98.92%로 결정되었다. 또한, D3의 Tm1 및 Tm2 값은 도 56c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 58.2℃ 및 72.5℃로 결정되었다.
또한, D3의 Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 56d 내지 56f에 나타내었다. Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 D3 결합의 EC50 값은 각각 0.1036μg/ml, 0.2305μg/ml, 및 0.8347μg/ml로 결정되었다.
d) D43(Ang-2/MSLN/GITR)
다중특이적 항체 D43의 개략적인 구조는 도 53d에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 D43을 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 57a에 나타낸 바와 같이, 결과는 D43 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 57b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. D43 항체의 최종 순도는 99.38%로 결정되었다. 또한, D43의 Tm1 값은 도 57c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 57.1℃로 결정되었다.
또한, D43의 Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 57d 내지 57f에 나타내었다. Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 D43 결합의 EC50 값은 각각 0.8960μg/ml, 0.6219μg/ml, 및 0.5783μg/ml로 결정되었다.
e) D44(Ang-2/MSLN/GITR)
다중특이적 항체 D44의 개략적인 구조는 도 53e에 도시되어 있다. 정제 후, 정제된 D44를 각각 비환원(NR) 및 환원(R) 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 58a에 나타낸 바와 같이, 결과는 D44 항체가 정확한 분자량을 나타내면서 성공적으로 정제되었음을 나타낸다. SEC 결과는 도 58b에 나타내었고, 여기서 하나의 주요 피크가 관찰되었다. D44 항체의 최종 순도는 93.01%로 결정되었다. 또한, D44의 Tm1 및 Tm2 값은 도 58c에 도시된 용융 곡선에 기초하여 각각 58.5℃ 및 67.7℃로 결정되었다.
또한, D44의 Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 결합 능력을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 각각 도 58d 내지 58f에 나타내었다. Ang-2, 메소텔린, 및 GITR에 대한 D44 결합의 EC50 값은 각각 0.3288μg/ml, 0.2144μg/ml, 및 0.9958μg/ml로 결정되었다.
다른 구현예들
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이지 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 측면들, 이점들, 및 변형들은 하기 청구범위의 범위 내에 있다.

Claims (117)

  1. 항원 결합 단백질로서, 상기 항원 결합 단백질은,
    (a) 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH)을 포함하는 제1 항원 결합 부위; 및
    (b) Fc, Fab, scFv 또는 제2 VHH를 포함하는 제2 성분;을 포함하고,
    이때 상기 제1 항원 결합 부위와 상기 제2 성분 부위는 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 VHH는 상기 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 VHH는 힌지 영역을 통해 상기 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 VHH는 상기 Fc의 CH3의 C 말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 VHH는 CH1 도메인에 연결되어 있고, 상기 CH1 도메인은 상기 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 VHH는 VH 도메인 및 CH1 도메인에 연결되어 있고, 상기 CH1 도메인은 상기 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 VL 도메인을 추가로 포함하고, 상기 VH 도메인 및 상기 VL 도메인은 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성하는 것인, 항원 결합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 VHH를 추가로 포함하고, 상기 VHH는 상기 VL 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원 결합 부위는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 상기 VH 도메인 및 상기 VL 도메인은 서로 결합하여 제2 항원 결합 부위를 형성하는 것인, 항원 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 2개의 중쇄들 및 2개의 경쇄들을 포함하는 것인, 항원 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원 결합 부위는 제2 VHH를 포함하는 것인, 항원 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제2 VHH는 상기 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제2 VHH는 힌지 영역을 통해 상기 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  14. 제11항에 있어서, 상기 제2 VHH는 상기 Fc에서 CH3의 C 말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  15. 제11항에 있어서, 상기 제2 VHH는 CH1 도메인에 연결되어 있고, 상기 CH1 도메인은 상기 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  16. 제11항에 있어서, 상기 제2 VHH는 VH 도메인 및 CH1 도메인에 연결되어 있고, 상기 CH1 도메인은 상기 Fc의 CH2 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  17. 제11항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 VH 도메인 및 VL 도메인을 추가로 포함하고, 상기 VH 도메인 및 상기 VL 도메인은 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성하는 것인, 항원 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 VHH는 상기 VH 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  19. 제17항에 있어서, 상기 제2 VHH는 상기 VL 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제3 VHH를 포함하는 제3 항원 결합 부위를 추가로 포함하고, 상기 제3 VHH는 상기 제1 VHH에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제3 항원 결합 부위는 제3 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 제1 에피토프 및 상기 제3 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  24. 제22항에 있어서, 상기 제3 항원 결합 부위는 제3 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 제1 에피토프 및 상기 제3 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위 및 상기 제2 항원 결합 부위는 VEGF, Ang-2, MSLN, GITR, 및 PD-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원들 중 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  26. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위, 상기 제2 항원 결합 부위, 및 상기 제3 항원 결합 부위는 VEGF, Ang-2, MSLN, GITR, 및 PD-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원들 중 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  27. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1); 및
    CH1 도메인;
    (b) 하기를 포함하는 제2 폴리펩티드:
    제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2); 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    이때 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 상기 CH1 도메인 및 상기 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, VH 도메인은 상기 VHH1과 상기 CH1 도메인 사이에 위치하고, VL 도메인은 상기 VHH2와 상기 CL 도메인 사이에 위치하며, 상기 VH와 VL은 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성하는 것인, 항원 결합 단백질.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH1 및 상기 VHH2는 VEGF, Ang-2, MSLN, GITR, 및 PD-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원들 중 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  32. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 VHH(VHH1)를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (b) 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 VHH(VHH2)를 포함하는 제2 폴리펩티드;를 포함하고,
    이때 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  34. 제32항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 제1 면역글로불린 힌지 영역, 제1 CH2 도메인, 및 제1 CH3 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 제2 면역글로불린 힌지 영역, 제2 CH2 도메인, 및 제2 CH3 도메인을 추가로 포함하는 것인, 항원 결합 단백질.
  36. 제35항에 있어서, 상기 VHH1은 상기 제1 면역글로불린 힌지 영역에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 VHH2는 상기 제2 면역글로불린 힌지 영역에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  38. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 제1 CH1 도메인을 추가로 포함하는 것인, 항원 결합 단백질.
  39. 제38항에 있어서, 상기 VHH1은 상기 제1 CH1 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때 상기 제3 폴리펩티드는,
    (a) 제3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제3 단일 도메인 항체(VHH3); 및
    (b) 제1 CL 도메인;을 포함하고,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제3 폴리펩티드는 상기 제1 CH1 도메인과 상기 제1 CL 도메인 사이의 상호작용을 통해 서로 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  41. 제40항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제3 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  42. 제40항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제3 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 제2 CH1 도메인을 추가로 포함하는 것인, 항원 결합 단백질.
  44. 제43항에 있어서, 상기 VHH2는 상기 제2 CH1 도메인에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 하기를 포함하는 제4 폴리펩티드를 추가로 포함하고:
    (a) 제4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제4 VHH(VHH4); 및
    (b) 제2 CL 도메인;
    이때 상기 제2 폴리펩티드 및 상기 제4 폴리펩티드는 상기 제2 CH1 도메인과 상기 제2 CL 도메인 사이의 상호작용을 통해 서로 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제2 에피토프 및 상기 제4 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  47. 제45항에 있어서, 상기 제2 에피토프 및 상기 제4 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 제5 에피토프에 특이적으로 결합하는 제5 VHH(VHH5)를 추가로 포함하고, 상기 VHH5는 상기 제1 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  49. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 제5 에피토프에 특이적으로 결합하는 제5 VHH(VHH5)를 추가로 포함하고, 상기 VHH5는 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  50. 제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 제6 에피토프에 특이적으로 결합하는 제6 VHH(VHH6)를 추가로 포함하고, 상기 VHH6은 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  51. 제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 제6 에피토프에 특이적으로 결합하는 제6 VHH(VHH6)를 추가로 포함하고, 상기 VHH6은 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  52. 제32항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제3 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드는 제7 에피토프에 특이적으로 결합하는 제7 VHH(VHH7)를 추가로 포함하며, 상기 VHH7은 상기 제3 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  53. 제32항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제3 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드는 제7 에피토프에 특이적으로 결합하는 제7 VHH(VHH7)를 추가로 포함하며, 상기 VHH7은 상기 제3 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제4 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제4 폴리펩티드는 제8 에피토프에 특이적으로 결합하는 제8 VHH(VHH8)를 추가로 포함하며, 상기 VHH8은 상기 제4 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제4 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제4 폴리펩티드는 제8 에피토프에 특이적으로 결합하는 제8 VHH(VHH8)를 추가로 포함하며, 상기 VHH8은 상기 제4 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  56. 항원 결합 단백질로서, 상기 항원 결합 단백질은,
    (a) 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 VHH(VHH1)를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (b) 제1 중쇄 가변 도메인(VH1) 및 제1 Fab 도메인의 제1 CH1 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 - 이때 상기 제1 Fab 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합함 -;를 포함하고,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 이량체를 형성하는 것인, 항원 결합 단백질.
  57. 제56항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  58. 제56항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프는 상이한 항원들로부터 유래된 것인, 항원 결합 단백질.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 하기를 추가로 포함하고:
    제1 면역글로불린 힌지 영역;
    제1 CH2 도메인; 및
    제1 CH3 도메인;
    상기 VHH1은 상기 제1 면역글로불린 힌지 영역에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  60. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 하기를 추가로 포함하는 것인, 항원 결합 단백질:
    제2 중쇄 가변 도메인 VH(VH2) 및 제2 Fab 도메인의 제2 CH1 도메인;
    제1 면역글로불린 힌지 영역;
    제1 CH2 도메인; 및
    제1 CH3 도메인.
  61. 제60항에 있어서, 상기 VHH1은 상기 VH2의 N-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  62. 제57항에 있어서, 상기 VHH1은 상기 제2 CH1 도메인과 상기 제1 면역글로불린 힌지 영역 사이에 위치하는 것인, 항원 결합 단백질.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제2 VHH(VHH2)를 추가로 포함하고, 이때 상기 VHH2는 상기 제2 Fab 도메인의 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 하기를 추가로 포함하는 것인, 항원 결합 단백질:
    제2 면역글로불린 힌지 영역;
    제2 CH2 도메인; 및
    제2 CH3 도메인.
  65. 제63항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제3 VHH(VHH3)를 추가로 포함하고, 이때 상기 VHH3은 상기 VH1의 N-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  66. 제63항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제3 VHH(VHH3)를 추가로 포함하고, 이때 상기 VHH3은 상기 제1 CH1 도메인과 상기 제2 면역글로불린 힌지 영역 사이에 위치하는 것인, 항원 결합 단백질.
  67. 제56항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 제4 VHH(VHH4)를 추가로 포함하고, 이때 상기 VHH4는 상기 제1 Fab 도메인의 제1 경쇄 가변 도메인(VL1)에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  68. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 제5 에피토프에 특이적으로 결합하는 제5 VHH(VHH5)를 추가로 포함하고, 상기 VHH5는 상기 제1 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  69. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 제5 에피토프에 특이적으로 결합하는 제5 VHH(VHH5)를 추가로 포함하고, 상기 VHH5는 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  70. 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 제6 에피토프에 특이적으로 결합하는 제6 VHH(VHH6)를 추가로 포함하고, 상기 VHH6은 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  71. 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 제6 에피토프에 특이적으로 결합하는 제6 VHH(VHH6)를 추가로 포함하고, 상기 VHH6은 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 연결되어 있는 것인, 항원 결합 단백질.
  72. 제27항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH1, VHH2, VHH3, VHH4, VHH5, VHH6, VHH7, 및/또는 VHH8은 암 관련 항원 또는 암 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  73. 제27항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH1, VHH2, VHH3, VHH4, VHH5, VHH6, VHH7, 및/또는 VHH8은 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 항원은 VEGF, Ang2, 메소텔린(Mesothelin), GITR, HER2, BRAF, EGFR, VEGFR2, CD20, RANKL, CD38, 및 CD52로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 항원 결합 단백질.
  74. 제27항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH1, VHH2, VHH3, VHH4, VHH5, VHH6, VHH7, 및/또는 VHH8은 VEGF, Ang2, 메소텔린, 또는 GITR에 특이적으로 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  75. 제27항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH1, VHH2, VHH3, VHH4, VHH5, VHH6, VHH7, 및/또는 VHH8은 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  76. 제75항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, B7-H3, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, 4-1BB, OX40, GITR, 및 CD40으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 항원 결합 단백질.
  77. 제76항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 분자는 PD-1인 것인, 항원 결합 단백질.
  78. 제27항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항원 결합 단백질.
  79. 항원 결합 단백질로서, 상기 항원 결합 단백질은,
    (a) 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 표적화하는 항원 결합 부위;
    (b) 안지오포이에틴-2(Ang-2)를 표적화하는 항원 결합 부위;
    (c) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)을 표적화하는 항원 결합 부위;
    (d) 메소텔린(MSLN)을 표적화하는 항원 결합 부위; 및/또는
    (e) 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련 단백질(GITR)을 표적화하는 항원 결합 부위; 중 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  80. 제79항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 VEGF를 표적화하는 항원 결합 부위 및 Ang-2를 표적화하는 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  81. 제79항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 VEGF를 표적화하는 항원 결합 부위 및 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  82. 제79항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 Ang-2를 표적화하는 항원 결합 부위 및 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  83. 제79항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 VEGF를 표적화하는 항원 결합 부위, Ang-2를 표적화하는 항원 결합 부위, 및 PD-1을 표적화하는 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  84. 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 VEGF를 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  85. 제79항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 Ang-2를 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  86. 제79항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 MSLN을 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  87. 제79항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 GITR을 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  88. 제79항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 PD-1을 표적화하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  89. 제79항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것인, 항원 결합 단백질.
  90. 제79항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원 결합 부위는 VHH를 포함하는 것인, 항원 결합 단백질.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 적어도 5mg/L, 적어도 6mg/L, 적어도 7mg/L, 적어도 8mg/L, 적어도 9mg/L, 적어도 10mg/L, 적어도 20mg/L, 적어도 30mg/L, 적어도 40mg/L, 적어도 50mg/L, 적어도 60mg/L, 적어도 70mg/L, 적어도 80mg/L, 적어도 90mg/L, 적어도 100mg/L, 적어도 110mg/L, 적어도 120mg/L, 적어도 130mg/L, 적어도 140mg/L, 적어도 150mg/L, 적어도 160mg/L, 적어도 170mg/L, 적어도 180mg/L, 적어도 190mg/L, 또는 적어도 200mg/L의 발현 수준으로 생산될 수 있는, 항원 결합 단백질.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 약 100%(예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된 후)의 순도로 생산될 수 있는, 항원 결합 단백질.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 Tm이 적어도 57℃, 적어도 58℃, 적어도 59℃, 적어도 60℃, 적어도 61℃, 적어도 62℃, 적어도 63℃, 적어도 64℃, 또는 적어도 65℃인, 항원 결합 단백질.
  94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 VEGF, Ang-2, MSLN, PD-1, 또는 GITR과의 결합에 대한 EC50 값이 0.01μg/ml 미만, 0.02μg/ml 미만, 0.03μg/ml 미만, 0.04μg/ml 미만, 0.05μg/ml 미만, 0.06μg/ml 미만, 0.07μg/ml 미만, 0.08μg/ml 미만, 0.09μg/ml 미만, 0.10μg/ml 미만, 0.11μg/ml 미만, 0.12μg/ml 미만, 0.13μg/ml 미만, 0.14μg/ml 미만, 0.15μg/ml 미만, 0.16μg/ml 미만, 0.17μg/ml 미만, 0.18μg/ml 미만, 0.19μg/ml 미만, 0.20μg/ml 미만, 0.21μg/ml 미만, 0.22μg/ml 미만, 0.23μg/ml 미만, 0.24μg/ml 미만, 0.25μg/ml 미만, 또는 0.30μg/ml 미만인, 항원 결합 단백질.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 동일한 대상을 표적으로 하는 모 항체의 결합 친화도의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 결합 친화도를 갖는, 항원 결합 단백질.
  96. 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 대상체는 VEGF-발현 암, Ang-2-발현 암, 및/또는 MSLN-발현 암을 갖는 것인, 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 암은 유방암, 신장암, 흑색종, 폐암, 교모세포종, 두경부암, 전립선암, 난소 암종, 방광 암종, 및 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
  99. 자가면역 질병 또는 염증성 질병을 앓는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  100. 치료제에 공유 결합된, 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체.
  101. 제100항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제 또는 세포증식억제제인 것인, 항체-약물 접합체.
  102. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  103. 제100항 또는 제101항의 항체-약물 접합제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  104. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산.
  105. 제104항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
  106. 제104항에 기재된 핵산 또는 제105항에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  107. 항원 결합 단백질을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 항원 결합 단백질을 생산하기에 적합한 조건 하에 제106항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  108. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    Fc;
    CH1 도메인; 및
    제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2);
    (b) 하기를 포함하는 제2 폴리펩티드:
    추가 VHH2; 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    상기 VHH1은 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH2는 상기 CH1 도메인의 C 말단에 연결되어 있으며,
    상기 추가 VHH2는 상기 CL 도메인의 C 말단에 연결되어 있고,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 상기 CH1 도메인 및 상기 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  109. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    제1 CH1 도메인;
    Fc;
    제2 CH1 도메인; 및
    추가 VHH1;
    (b) 하기를 포함하는 2개의 제2 폴리펩티드들:
    제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2); 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    상기 VHH1은 상기 제1 CH1 도메인의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 제1 CH1 도메인은 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있으며,
    상기 VHH2는 상기 CL 도메인의 C 말단에 연결되어 있고,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 상기 CH1 도메인 및 상기 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  110. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    Fc;
    CH1 도메인; 및
    제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2);
    (b) 하기를 포함하는 제2 폴리펩티드:
    VHH2; 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    상기 VHH1은 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH2는 상기 CH1 도메인의 C 말단에 연결되어 있으며, 추가 VHH2는 상기 VHH1의 N 말단에 연결되어 있고,
    상기 제2 폴리펩티드의 VHH2는 상기 CL 도메인의 C 말단에 연결되어 있으며,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 상기 CH1 도메인 및 상기 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  111. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    제1 CH1 도메인;
    Fc;
    제2 CH1 도메인; 및
    제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2);
    (b) 하기를 포함하는 2개의 제2 폴리펩티드들:
    추가 VHH2; 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    상기 VHH1은 상기 CH1 도메인의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 CH1 도메인은 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있으며, 상기 VHH2는 상기 제2 CH1 도메인의 C 말단에 연결되어 있고,
    상기 추가 VHH2는 상기 CL 도메인의 C 말단에 연결되어 있고,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 상기 CH1 도메인 및 상기 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  112. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    제1 CH1 도메인;
    Fc;
    제2 CH1 도메인; 및
    제2 VHH1;
    (b) 하기를 포함하는 2개의 제2 폴리펩티드들:
    제3 VHH1; 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    상기 VHH1은 상기 CH1 도메인의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 CH1 도메인은 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있으며, 상기 제2 VHH1은 상기 제2 CH1 도메인의 C 말단에 연결되어 있고, 상기 Fc의 각 CH3 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2)에 연결되어 있으며,
    상기 제3 VHH2는 상기 CL 도메인의 C 말단에 연결되어 있고,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 상기 CH1 도메인 및 상기 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  113. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2);
    제1 CH1 도메인;
    Fc;
    제2 CH1 도메인;
    추가 VHH2;
    추가 VHH1;
    (b) 하기를 포함하는 2개의 제2 폴리펩티드들:
    제3 VHH1;
    제3 VHH2; 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    상기 VHH1은 상기 VHH2의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH2는 상기 제1 CH1 도메인의 N 말단에 연결되어 있으며, 상기 제1 CH1 도메인은 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 추가 VHH2는 상기 제2 CH1 도메인의 C 말단에 연결되어 있으며, 상기 추가 VHH2는 상기 추가 VHH1의 C 말단에 연결되어 있고,
    상기 제3 VHH1은 상기 제3 VHH2의 C 말단에 연결되어 있고, 상기 제3 VHH2는 상기 CL 도메인의 C 말단에 연결되어 있으며,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 상기 CH1 도메인 및 상기 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  114. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2);
    Fc;
    CH1 도메인; 및
    제3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제3 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH3);
    (b) 하기를 포함하는 제2 폴리펩티드:
    제4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제4 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH4); 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    상기 VHH1은 링커 서열을 통해 상기 VHH2의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH2는 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있으며, 상기 VHH3은 상기 CH1 도메인의 C 말단에 연결되어 있고,
    상기 VHH4는 상기 CL 도메인의 C 말단에 연결되어 있으며,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 CH1 도메인 및 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  115. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) Fc;
    (b) 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    (c) 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2);
    (d) 제3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제3 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH3);
    (e) 제4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제4 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH4);을 포함하고,
    상기 VHH1은 링커 서열을 통해 상기 VHH2의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH2는 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있으며,
    상기 VHH3은 상기 Fc의 다른 CH2 도메인의 C 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH4는 링커 서열을 통해 상기 VHH3의 C 말단에 연결되어 있는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  116. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) 하기를 포함하는 제1 폴리펩티드:
    제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2);
    Fc;
    CH1 도메인;
    제3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제3 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH3); 및
    제4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제4 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH4);
    (b) 하기를 포함하는 제2 폴리펩티드:
    추가 VHH3; 및
    CL 도메인;을 포함하고,
    상기 VHH1은 링커 서열을 통해 상기 VHH2의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH2는 상기 Fc의 CH2 도메인의 N 말단에 연결되어 있으며,
    상기 CH1 도메인은 상기 Fc의 다른 CH2 도메인의 C 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH3은 상기 CH1 도메인의 C 말단에 연결되어 있으며, 상기 VHH4는 링커 서열을 통해 상기 VHH3의 C 말단에 연결되어 있고,
    상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 서로 결합하여 CH1 도메인 및 CL 도메인을 통해 이량체를 형성하는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
  117. 다중특이적 항원 결합 단백질로서, 상기 다중특이적 항원 결합 단백질은,
    (a) Fc;
    (b) 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH1);
    (c) 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH2);
    (d) 제3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제3 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH3);
    (e) 제4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제4 단일 도메인 항체 가변 도메인(VHH4);을 포함하고,
    상기 VHH1은 링커 서열을 통해 상기 VHH2의 N 말단에 연결되어 있고, 상기 VHH3은 링커 서열을 통해 상기 VHH4에 연결되어 있으며, 각 CH2 도메인은 상기 VHH2에 연결되어 있고, 각 CH3 도메인은 상기 VHH3에 연결되어 있는 것인, 다중특이적 항원 결합 단백질.
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