CN117915940A - 包含经编码的佐剂的疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗组合物，其包含(1)第一组一种或多于一种载体，该载体包含编码一种或多于一种佐剂的核酸，其中第一组一种或多于一种载体是腺病毒载体，和(2)抗原或抗原的组合或编码所述抗原或抗原的组合的核酸，或包含所述核酸的第二组一种或多于一种载体。本发明还涉及所述疫苗组合物用于治疗疾病或预防疾病的用途。此外，本发明涉及用于诱导免疫应答的疫苗组合物或疫苗试剂盒，其包含(1)编码一种或多于一种佐剂的第一核酸或包含所述第一核酸的第一组一种或多于一种载体，和(2)抗原或抗原的组合或编码所述第二抗原或抗原的组合的第二核酸或包含所述第二核酸的第二组一种或多于一种载体，其中(1)在第一位置对患者施用，和(2)在第二位置对患者施用，其中第一位置与第二位置相同或在第二位置的20cm以内，并且第一和第二位置的淋巴系统引流至相同的淋巴结。本发明还涉及疫苗接种方案，其包括第一施用步骤和第二施用步骤，第一施用步骤包括施用抗原和经编码的佐剂，第二施用步骤包括施用抗原和/或经编码的佐剂。

Description

包含经编码的佐剂的疫苗组合物

本发明涉及包含抗原或抗原的组合以及一种或多于一种经编码的佐剂的疫苗组合物。本发明还涉及该疫苗组合物用于癌症治疗的用途。

背景技术

疫苗领域正在迅速发展，目的是诱导针对各种传染性和肿瘤性疾病的强大免疫应答。在这种情况下，基因癌症疫苗有可能在未来几年成为癌症治疗的重要方式。

癌症疫苗必须面对诱导针对肿瘤抗原的T细胞应答的复杂性，该肿瘤抗原是i)来源于在肿瘤中过度表达的自身蛋白的肿瘤相关抗原(TAA)，或ii)来源于突变的自身蛋白的新抗原。肿瘤中最常见的基因突变是单核苷酸变异，导致侧边是野生型蛋白质氨基酸残基的单个氨基酸改变。因此，大多数新抗原含有重要的“自身”成分，被认为是弱免疫原。需要克服对“自身”的免疫耐受，以获得强大的免疫应答。

佐剂是疫苗中使用的一种成分，有助于在接种疫苗的人中产生更强的免疫应答。然而，一些有效的佐剂伴随着严重的副作用。因此，非常需要优化癌症疫苗的效力，同时将毒性降至最低。

本发明基于这样的发现，即如果抗原与经编码的佐剂共同施用，则针对该抗原的免疫应答可以显著增加。出乎意料地，发明人发现，当疫苗组合物包含一组一种或多于一种腺病毒载体，优选编码一种或多于一种佐剂的人腺病毒载体时，针对抗原或抗原的组合的免疫应答被放大。因此，根据本发明的疫苗组合物主要用于：(i)增强针对抗原或抗原的组合的免疫应答；(ii)将次优的弱免疫应答转变为更强的免疫应答；(iii)使针对原本不会产生任何免疫应答的抗原的免疫应答成为可能；(iv)将抗原从非免疫原性转变成免疫原性；(v)使针对TAA的免疫应答成为可能；(vi)使针对单一抗原或仅少量抗原的组合的免疫应答成为可能，特别是TAA或癌症新抗原；(vii)使针对自身抗原的免疫耐受性能够局部和暂时地被破坏；(viii)使佐剂能够进行有限的全身性暴露；(ix)使佐剂具有有限的非特异性活性；(x)能够产生有限的毒性；(xi)使得抗原和佐剂能够容易地共同配制；(xii)使抗原和佐剂的同时共定位作用成为可能。

发明内容

在第一方面，本发明涉及疫苗组合物，其包含(1)包含编码一种或多于一种佐剂的核酸的第一组一种或多于一种载体，其中第一组一种或多于一种载体是腺病毒载体，和(2)抗原或抗原的组合或编码所述抗原或抗原的组合的核酸，或包含所述核酸的第二组一种或多于一种载体。

在第二方面，本发明涉及根据本发明第一方面的疫苗组合物用于疾病治疗或预防疾病的用途。

在第三方面，本发明涉及用于诱导针对抗原或抗原的组合的免疫应答的疫苗组合物或疫苗试剂盒，其包含(1)第一组合物，其包含编码一种或多于一种佐剂的核酸或包含所述核酸的第一组一种或多于一种载体，和(2)第二组合物，其包含抗原或抗原的组合或编码所述抗原或抗原的组合的核酸或包含所述核酸的第二组一种或多于一种载体，其中(1)在第一位置处对患者施用，和(2)在第二位置处对患者施用，其中第一位置在第二位置的20em以内，并且第一位置的淋巴系统与第二位置的淋巴系统引流至相同的淋巴结，或者其中第一位置与第二位置相同。

在第四方面，本发明涉及包括第一和第二施用步骤的疫苗接种方案，其中(a)第一施用步骤包括施用根据本发明第一、第二或第三方面的疫苗组合物，和(b)第二施用步骤包括施用(1)第一组合物，其包含编码一种或多于一种佐剂的核酸、或包含所述核酸的第一组一种或多于一种载体；和/或(2)第二组合物，其包含抗原或抗原的组合、或编码所述抗原或抗原的组合的核酸、或包含所述核酸的第二组一种或多于一种载体。

具体实施方式

在下面详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

优选地，本文所用的术语的定义如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和H.eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland)中所述以及如“Pharmaceutical Substances：Syntheses，Patents，Applications”by Axel Kleemannand Jurgen Engel，Thieme Medical Publishing，1999；the“Merck Index：AnEncyclopedia of Chemicals，Drugs，and Biologicals”，edited by Susan Budavari etal.，CRC Press，1996和the United States Pharmacopeia-25/National Formulary-20，published by the United States Pharmcopeial Convention，Inc.，Rockville Md.，2001中所述。

在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文需要否则单词“包含”和其变体，将被理解为意味着包含所述的特征、整体或步骤或特征、整体或步骤的组但不排除任何其他特征、整体或步骤或特征、整体或步骤的组。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他一种或多于一种方面结合，除非明确的相反指示。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一种或多于一种特征组合。

在本说明书的全文中引用了若干文献。无论是上文还是下文，本文引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，其全部内容均通过引用并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类公开内容。

定义

在下文中，提供了本说明书中经常使用的术语的一些定义。在本说明书的其余部分中，这些术语在其使用的每种情况下将分别具有定义的含义和优选的含义。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并被理解为由核苷酸单体制成的聚合或寡聚大分子。核苷酸单体由核碱基、五碳糖(例如但不限于核糖或2′-脱氧核糖)和一个至三个磷酸基团组成。通常，核酸是通过单个核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成的。在本发明的上下文中，优选的核酸分子包括但不限于核糖核酸(RNA)、经修饰的RNA、脱氧核糖核酸(DNA)及其混合物，例如RNA-DNA杂交体。核酸可以是例如化学合成的，例如按照磷酸三酯法合成(参见，例如，Uhlmann，E.&Peyman，A.(1990)Chemical Reviews，90，543-584)。

如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”全文可互换使用。这些术语在本发明的上下文中用于指天然存在的肽(例如天然存在的蛋白质)和可以包括天然或非天然存在的氨基酸的合成肽两者。

在本发明上下文中的术语“免疫应答”包括细胞免疫应答和体液免疫应答。

在本发明的上下文中，术语“抗原”用于指由免疫应答的分子识别的任何结构，例如抗体、T细胞受体(TCR)等。优选的抗原是与特定疾病相关的细胞蛋白或其片段。抗原被适应性免疫系统的高度可变的抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)识别，并可能引发体液或细胞免疫应答。引发这种反应的抗原也被称为“免疫原”。不论细胞内的蛋白质是外来的还是细胞的，细胞内的一部分蛋白质都被加工成较小的肽，并由主要组织相容性复合体(MHC)呈递。

本发明中使用的术语“载体”是指多核苷酸或多核苷酸和蛋白质的混合物，其能够将外源遗传物质，特别是DNA或RNA，导入细胞，优选哺乳动物细胞，并在其中复制和/或表达。载体的实例包括但不限于质粒、黏粒、噬菌体、病毒或人工染色体。表达载体可以包含“复制子”多核苷酸序列，其促进表达载体在宿主细胞中的自主复制。一旦进入宿主细胞，表达载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以产生载体及其插入的DNA的几个拷贝。在使用无复制能力的表达载体的情况下(这通常是出于安全原因)，载体可能不复制，而只是直接表达核酸。根据表达载体的类型，表达载体可能从细胞中丢失，即仅瞬时表达由核酸编码的抗原或佐剂，或者可能在细胞中稳定表达。表达载体通常包含表达盒，即允许核酸转录成mRNA分子的必需元件。

术语“腺病毒载体”和“腺载体”在本申请中可互换使用。

术语“腺相关病毒”(AAV)是指属于细小病毒科的病毒，包含几个属，这些属可细分为细小病毒亚科，包括细小病毒属、红病毒属、依赖病毒属、阿留申群岛水貂疾病病毒属和牛科细小病毒属，以及浓核病毒亚科，包括浓稠病毒属、重复病毒属、短浓稠病毒属、环星黑烟浓稠病毒属和康特拉病毒属。AAV独特的生命周期及其感染持续表达的非分裂和分裂细胞的能力使其成为有吸引力的载体。野生型AAV病毒的另一个吸引人的特征是缺乏明显的致病性。

术语“腺相关病毒载体”或“AAV载体”在本申请中可互换使用。

本发明所述的疫苗组合物包括抗原或抗原的组合，或编码所述抗原或抗原的组合的核酸，或包含所述核酸的一种或多于一种载体。所述疫苗组合物还包含一种或多于一种编码的佐剂，并且还可以包含稳定剂、其他佐剂、抗生素和防腐剂。

在根据本发明的疫苗组合物的上下文中，术语“抗原”指递送至对象以诱导免疫应答的一种或多于一种蛋白质或其片段。抗原可以以蛋白质的形式递送，或者可以被编码，其中编码抗原的核酸可以包含或不包含在载体中。

术语“佐剂”在本发明的上下文中用于指增加、刺激、激活、增强或调节对疫苗组合物中包含的抗原的免疫应答的试剂。这种佐剂的实例包括但不限于细胞因子、细胞因子类似物、细胞因子受体、检查点分子的调节剂、合成多核苷酸佐剂(例如多聚精氨酸或多聚赖氨酸)、干扰素(IFN)基因激活剂、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂、腺苷脱氨酶(ADA)或增殖物激活受体γ辅激活因子1-α(PGC-1)。优选的佐剂选自OX40的激动剂，优选OX40L，ICOS的激动剂，优选ICOSL，CD40的激动剂，优选CD40L和拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白。在本发明的上下文中，疫苗组合物包含一种或多于一种经编码的佐剂。因此，在根据本发明的疫苗组合物的上下文中，术语佐剂是指经编码的佐剂。在本发明第一方面的疫苗组合物中，一种或多于一种佐剂由包含在腺病毒载体，优选人腺病毒载体中的核酸编码。在用于本发明第三方面的疫苗组合物或疫苗试剂盒和本发明第四方面的疫苗接种方案中，一种或多于一种经编码的佐剂的递送不限于病毒载体。

技术人员很清楚递送编码抗原和/或佐剂的不同合适方式。可以通过例如DNA，特别是质粒DNA来实现递送；RNA，特别是体外转录的(IVT)RNA、非复制信使RNA和/或自扩增RNA(SAM)；病毒载体；甲病毒载体、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒载体、辛德比斯(SIN)病毒载体、塞姆利基森林病毒(SFV)病毒载体，还优选具有复制能力或不具有复制能力的腺病毒载体痘病毒载体、痘病毒载体、痘苗病毒载体或改良的痘苗安卡拉(MVA)载体、猿猴或人巨细胞病毒(CMV)载体、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体、逆转录病毒或慢病毒载体。

在抗原或佐剂由RNA编码的情况下，施用或者以裸核酸的形式或者以与载体的复合物的形式实现。RNA也可以与稳定物质如核糖核酸酶抑制剂联合施用。根据本发明有用的载体包括，例如，含脂质的载体，如阳离子脂质、脂质体、胶束、脂质纳米颗粒和脂质-聚合物混合纳米颗粒。用于施用RNA的优选载体是脂质纳米颗粒或脂质-聚合物混合纳米颗粒。典型的脂质纳米粒制剂由携带叔胺或季胺的pH响应性脂质或阳离子脂质组成，以包封聚阴离子的mRNA；中性辅助脂质，例如两性离子脂质[即1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)]和/或甾醇脂质(即胆固醇)，以稳定脂质纳米颗粒的脂质双层并提高mRNA递送效率；和聚乙二醇(PEG)-脂质，以通过减少血浆蛋白的非特异性吸收并在纳米颗粒上形成水合层来改善生物环境中的胶体稳定性。脂质-聚合物杂化纳米颗粒由包裹有脂质层的可生物降解的载有mRNA的聚合物核组成。通常，脂质包膜被组织成含有阳离子或可离子化脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的混合物的脂质双层或脂质单层(Guevara等人，2020，Advances in Lipid nanopols for mRNA-BasedCancer immunology).Front.Chem.8：589-959)。

术语“免疫调节剂”是指选自检查点分子的调节剂和细胞因子或细胞因子类似物的化合物。在本发明的上下文中，免疫调节剂可与本发明的疫苗组合物联合施用，在疫苗组合物之前或之后或同时施用。因此，如果存在的话，免疫调节剂是除佐剂之外的疫苗组合物的另一组分。免疫调节剂优选以蛋白质的形式施用，其中佐剂是经编码的。优选的免疫调节剂选自拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白、拮抗性PD-1特异性抗体或抗体样蛋白和IL-2或其类似物。

术语“抗体”在本发明的上下文中用于指属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白。抗体是指可以由浆细胞产生的蛋白质分子，它被免疫系统用来识别和中和异物，如细菌和病毒。抗体识别外源靶标即抗原的独特部分。术语“抗体”指具有抗体整体结构的分子，例如IgG抗体。当泛指IgG时，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，除非另有定义。IgG抗体分子是包含四条多肽链的Y形分子：两条重链和两条轻链。每个轻链由两个结构域组成，N-末端结构域被称为可变或VL结构域(或区域)，C-末端结构域被称为恒定(或CL)结构域(恒定κ(Cκ)或恒定λ(Cλ)结构域)。每个重链由四个结构域组成。重链的N-末端结构域被称为可变(或VH)结构域(或区域)，其后是第一恒定结构域(CH1)、铰链区，然后是第二和第三恒定结构域(CH2和CH3)。在组装的抗体中，VL和VH结构域结合在一起形成抗原结合位点。而且，CL和CHI结构域缔合在一起以保持一个重链与一个轻链缔合。两个重-轻链异二聚体通过CH2和CH3结构域的相互作用以及两个重链铰链区之间的相互作用而结合。本文使用的术语“抗体”还包括可能具有嵌合结构域替代物(即至少一个结构域被来自不同抗体的结构域替代)的分子，例如包含IgG3结构域(例如IgG3的CH3结构域)的IgG1抗体。此外，该术语通常指多特异性抗体，例如双特异性或三特异性抗体。术语抗体还包括在重链恒定区内携带一种或多于一种突变的分子。

本说明书上下文中使用的术语“抗体样分子”包括抗体衍生物和抗体模拟物。

术语“抗体模拟物”是指能够特异性结合抗原的化合物，类似于抗体，但在结构上与抗体无关。通常，抗体模拟物是分子量约为3kDa至20kDa的人工肽或蛋白质，其包含一个、两个或多于两个与抗原特异性结合的暴露结构域。典型地，这种抗体模拟物包含至少一个可变肽环，该可变肽环的两端连接到蛋白质支架上。这种双重结构限制极大地提高了抗体样蛋白的结合亲和力，使其亲和力水平可与抗体相当。可变肽环的长度通常由10个至20个氨基酸组成。支架蛋白可以是任何具有良好溶解性的蛋白质。优选地，支架蛋白是小球状蛋白。实例尤其包括LACI-D1(脂蛋白相关凝血抑制剂)；亲和蛋白，例如人-γB晶体或人泛素；胱抑素；来自酸热硫化叶菌的Sac7D；脂质运载蛋白和来源于脂质运载蛋白的Anticalin蛋白；DARPins(设计的锚蛋白重复结构域)；Fyn的SH3结构域；蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域；单体，例如纤连蛋白的第10类III型结构域；Adnectins蛋白：胱氨酸结蛋白(半胱氨酸结微蛋白)；三聚物；Evibody，例如基于CTLA4的结合物；亲和体，例如来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z结构域的三螺旋束；细胞渗透性抗体，例如人转铁蛋白；四连蛋白，例如单体或三聚体人类C型凝集素结构域；微体，例如胰蛋白酶抑制剂-II；亲和蛋白；犰狳重复蛋白。核酸和小分子有时也被认为是抗体模拟物(适配体)，但不是人工抗体、抗体片段和由其组成的融合蛋白。相对于抗体的共同优势是更好的溶解性、组织渗透性、对热和酶的稳定性以及相对较低的生产成本。

根据本发明的术语“结合”优选地涉及特异性结合。术语“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如靶标或抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。“特异性结合”是指结合部分(例如抗体)与靶标更强地结合，例如与其与另一靶标结合的特异性表位。如果结合部分与第一靶标结合时，其解离常数(Kd)低于第二靶标的解离常数，则其与第一靶标的结合比第二靶标的结合更强。与结合部分特异性结合的靶标的解离常数(Kd)比结合部分非特异性结合的靶标的解离常数(Kd)低超过10倍，优选超过20倍，更优选超过50倍，甚至更优选超过100倍、超过200倍、超过500倍或超过1000倍。

因此，术语“Kd”(以“摩尔/升”测量，有时缩写为“M”)意指结合部分(例如抗体或其片段)与靶标分子(例如抗原或其表位)之间的特定相互作用的解离平衡常数。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括但不限于基于表面等离子体共振的测定(例如BIAcore测定)；石英晶体微量天平测定(如Attana测定)；酶联免疫吸附试验(ELISA)；和竞争性分析(例如RIA)。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持更长时间的结合。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的，其中任何方法都可用于本发明的目的。

通常，抗体或抗体模拟物以足够的结合亲和力与它们的靶标结合，例如，Kd值为500nM至1pM，即约500nM、约450nM、约400nM、约350nM、约300nM、约250nM、约200nM、约150nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、或约1pM、例如500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、50nM、10nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM或1pM。

本文使用的术语“免疫球蛋白(Ig)”是指赋予免疫性的免疫球蛋白超家族的糖蛋白。“表面免疫球蛋白”通过它们的跨膜区附着于例如效应细胞或内皮细胞的膜上，并且包括例如但不限于新生儿Fc受体、B细胞受体、T细胞受体、I类和II类主要组织相容性复合体(MHC)蛋白、β-2微球蛋白(β2M)、CD3、CD4和CD8的分子。

本文所用的术语“抗体衍生物”是指至少包含特定结构域的分子，但不具有抗体的整体结构，如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY或IgW，尽管仍能结合靶分子。所述衍生物可以是但不限于功能性(即靶结合，特别是特异性靶结合)抗体片段或其组合。它还涉及添加了其他抗体结构域，例如其他可变结构域的抗体。因此，术语抗体衍生物还包括多特异性(双特异性、三特异性、四特异性、五特异性、六特异性等)和多价(二价、三价、四价等)抗体。

双特异性抗体以多种形式出现(Brinkmann和Kontermann，Mabs 2017，Vol.9，No.2，182-212)。仅由抗原结合结构域组成的双特异性抗体的实例是二价的Fab(bi-Fab)。另一实例是仅包含可变结构域(Fv)而不包含恒定结构域的形式。仅包含可变结构域的形式具有分子量非常低的优点，导致良好的肿瘤外显率，这对于肿瘤学应用是重要的。由于缺乏介导与FcRn结合的恒定结构域，这种形式具有缩短的血浆半衰期。

术语“表位”，也称为抗原决定簇，在本发明的上下文中用于指抗原的片段，优选由免疫系统的分子(例如B细胞受体、T细胞受体或抗体)结合的肽。与抗体或B细胞结合的表位称为“B细胞表位”，与T细胞结合的表位称为“T细胞表位”。在本文中，术语“结合”优选地涉及特异性结合，其被定义为抗体或T细胞受体(TCR)和相应表位之间的结合常数，该结合常数为1×10⁵M-1或高于1×10⁵M-1，优选为1×10⁶M-1、1×10⁷M-1、1×10⁸M-1或高于1×10⁸M-1。本领域技术人员非常了解如何确定关联常数(参见例如Caoili，S.E.(2012)Advances inBioinformatics Vol.2012)。优选地，抗体与表位的特异性结合是由抗体的Fab(片段，抗原结合)区介导的，B细胞的特异性结合是由B细胞受体所包含的抗体的Fab区介导的，并且T细胞的特异性结合是由T细胞受体的可变(V)区介导的。T细胞表位存在于抗原呈递细胞的表面，并与主要组织相容性(MHC)分子结合。至少有两种不同的MHC分子，分别称为MHC I类和MHC II类。通过MHC-I途径呈递的表位引起细胞毒性T淋巴细胞(CD8+细胞)应答，而通过MHC-II途径呈递的表位引起T辅助细胞(CD4+细胞)应答。由I类MHC分子呈递的T细胞表位通常是长度为8个至12个氨基酸的肽，而由II类MHC分子呈递的T细胞表位通常是长度为13个至17个氨基酸的肽。MHC III类分子也以糖脂的形式呈现非肽表位。因此，术语“T细胞表位”优选是指可以由I类MHC或II类MHC分子呈递的8个至11个或13个至17个氨基酸长的肽。表位通常由具有化学活性的氨基酸表面基团组成，该基团可以携带或不携带糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下失去与前者的结合而非失去与后者的结合。

在本发明的上下文中，术语“CTLA4特异性抗体”和“抗CTLA4抗体”可互换使用。

在本发明的上下文中，术语“拮抗性抗体”是指能够抑制其结合分子的生物活性的抗体。如果拮抗性抗体与某种受体结合，它能够阻断或抑制受体下游的信号通路或与受体配体竞争。技术人员很清楚拮抗活性的确定取决于多于一个参数，例如所用的分析或细胞类型。在本发明的上下文中，对CTLA-4特异的拮抗抗体的特征在于以下活性：去除由CTIA4介导的T细胞应答的负信号传导，即去除CTLA4信号传导对T细胞活化的抑制作用，因此导致增强的免疫应答。

在本发明的上下文中，术语“激动性抗体”是指与受体结合并以与受体配体相当的方式激活受体下游信号传导途径的抗体。激动性抗体的一个实例是CP-870893，它结合并激活受体CD40。技术人员很清楚激动活性的确定取决于多于一个参数，例如所用的分析或细胞类型。

在本发明的上下文中，术语“激动剂配体”是指与受体结合并激活受体下游信号通路的可溶性配体。激动剂配体的一个实例是OX40L，它结合并激活受体OX40。

术语“肿瘤相关抗原(TAA)”在本发明的上下文中用于指来源于在肿瘤中过表达的自身蛋白的抗原，即在健康组织中完全不表达或仅低水平表达且在肿瘤组织中水平增加的蛋白。TAA可以是全长蛋白质或其片段。

术语癌睾丸(CT)抗原是指一组因其在发育和癌症免疫治疗中的重要性而结合在一起的蛋白质。通常，这些蛋白质的表达仅限于成年动物的雄性生殖细胞。然而，在癌症中，这些发育抗原经常被重新表达。因此，它们代表了一类肿瘤相关抗原。CT抗原已在几种肿瘤中被描述，包括黑色素瘤、肝癌、肺癌、膀胱癌和小儿肿瘤如神经母细胞瘤。定期更新的CT抗原列表可以在http：//www.cta.lncc.br/index.php找到。癌症治疗中重要的CT抗原包括MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、NY-ESO-1、PRAME、CT83和SSX2。

术语“新抗原”在本发明的上下文中用于指不存在于正常/生殖细胞中，但它发生在转化的细胞中，尤其是癌细胞。新抗原可以包含一种或多于一种，例如2种、3种、4种、5种或多于5种新表位。优选地，包括在本发明抗原中的每种新抗原的长度以确定包含正常/生殖系细胞中出现的表位的可能性低的方式进行选择。通常，这可以通过新抗原在产生新表位的氨基酸变化的C-末端和/或N-末端包含12个或少于12个的氨基酸来确定。

包含新抗原的突变的癌蛋白是通过在DNA水平发生的突变产生的，其中突变的蛋白可以包括

a)由代表非同义单核苷酸变异(SNV)的一种或多于一种点突变引起的一种或多于一种单个氨基酸改变；和/或

b)由插入/缺失引起的非野生型氨基酸序列，导致移码肽或一种或多于一种非野生型氨基酸的框内插入或一种或多于一种野生型氨基酸的缺失；和/或

c)由外显子边界改变或产生内含子保留的突变引起的非野生型氨基酸序列；和/或

d)由基因融合事件产生的突变癌蛋白。

在本发明的上下文中，由基因组非同义SNV点突变引起的一种或多于一种单个氨基酸改变导致的新抗原被称为氨基酸单点突变肽。

术语“移码肽”在本发明的上下文中用于指核酸的蛋白质编码区段的完整非野生型翻译产物，其包含导致开放阅读框(ORF)移位的插入或缺失突变。

在本发明的上下文中使用的术语“开放阅读框”(缩写为“ORF”)是指可以翻译成连续的氨基酸串的核苷酸序列。通常，ORF在给定的阅读框中包含起始密码子、后续区域(其长度通常是3个核苷酸的倍数)，但不包含终止密码子(TAG、TAA、TGA、UAG、UAA或UGA)。ORF编码蛋白质，其中可以将其翻译成的氨基酸形成肽连接的链。

由外显子边界改变或产生内含子保留的突变引起的非野生型氨基酸序列产生的新抗原在本发明的上下文中被称为剪接位点突变肽。

由基因融合事件产生的突变癌蛋白产生的新抗原在本发明的上下文中被称为通读突变肽。

术语“细胞因子类似物”在本发明的上下文中是指细胞因子，该细胞因子已经被修饰以显示出改善的物理化学特性，例如更稳固、具有有利的药物代谢动力学特性、具有延长的半衰期、更适合某些递送系统和制剂或具有增强的或更具选择性的生物活性。细胞因子类似物可以包括与未修饰的细胞因子相比的氨基酸变化，或者可以包括翻译后修饰，例如PEG化。

在本发明的上下文中使用的术语“表达盒”指包含至少一个待表达的核酸序列的核酸分子，例如编码本发明CVP或其一部分的核酸，其可操作地连接到转录和翻译控制序列。优选地，表达盒包括用于有效表达给定基因例如启动子、起始位点和/或聚腺苷酸化位点的顺式调节元件。优选地，表达盒包含患者细胞中表达核酸所需的所有其他元件。因此，典型的表达盒包含与待表达的核酸序列有效连接的启动子，以及转录物、核糖体结合位点和翻译终止的有效多聚腺苷酸化所需的信号。表达盒的附加元件可包括例如增强子或内含子元件。表达盒优选还包含编码抗原下游的转录终止区，以提供有效终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或者也可以从不同的基因获得。

在本发明的上下文中使用的“可操作地连接”是指元件的布置，其中如此描述的部件被配置为执行其通常的功能。当核酸与另一个核酸序列处于功能关系中时，它是“可操作地连接的”。例如，如果启动子影响一种或多于一种转基因的转录，则其可操作地连接至一种或多于一种转基因。此外，可操作地连接至编码序列的控制元件能够实现编码序列的表达。控制元件不必与编码序列邻接，只要它们起到指导其表达的作用即可。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在介于中间的未翻译但仍被转录的序列，并且仍然可以认为该启动子序列与编码序列“可操作地连接”。

本发明上下文中使用的术语“药物制剂”或“药物组合物”旨在包括根据本发明的疫苗组合物，即抗原或抗原的组合(蛋白质或编码)、一种或多于一种佐剂(蛋白质或编码)、任选的免疫调节剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在本发明的上下文中使用的“药学上可接受的”指由美国联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，更特别是人类的药物。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指药学上无活性的物质，例如但不限于稀释剂、赋形剂、表面活性剂、稳定剂、生理缓冲溶液或与其一起施用治疗性活性成分的载剂。这些药物载体可以是液体或固体。液体药物载体包括但不限于无菌液体，例如水和油中的盐溶液，包括但不限于石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。也可以将盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液用作液体载剂，特别是用于可注射溶液。当静脉内施用药物组合物时，盐溶液是优选的载体。合适的载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中。

合适的药物“赋形剂”包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

“表面活性剂”包括阴离子、阳离子和非离子表面活性剂，例如但不限于脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、Triton X-100、和聚山梨酯例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65和聚山梨酯80。

“稳定剂”包括但不限于甘露醇、蔗糖、海藻糖、白蛋白以及蛋白酶和/或核酸酶拮抗剂。

可以在本发明的上下文中使用的“生理缓冲溶液”包括但不限于氯化钠溶液、去矿化水、以及合适的有机或无机缓冲溶液，例如但不限于磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4(2羟乙基)哌嗪基]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。相应缓冲液的选择通常取决于期望的缓冲剂摩尔浓度。磷酸盐缓冲液适用于例如注射液和输注溶液。

“有效量”或“治疗有效量”是足以达到预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量将随例如药剂的性质、施用途径、接受治疗剂的动物的大小和种类以及施用目的等因素而变化。每种个体情况下的有效量可以由技术人员根据本领域已建立的方法凭经验确定。

本文所用的疾病或病症的“治疗”、“处理”、或“疗法”是指实现以下一项或多于一项：(a)减轻病症的严重程度；(b)限制或预防所治疗病症的症状发展；(c)抑制所治疗疾病的症状恶化；(d)限制或预防先前患有该病症的个体的病症复发；(e)限制或预防先前有症状的个体的症状复发。

本发明的方面及优选实施方案

在第一方面，本发明涉及疫苗组合物，其包含(1)第一组一种或多于一种载体，其中第一组一种或多于一种载体包含编码一种或多于一种佐剂的核酸，其中第一组一种或多于一种载体是腺病毒载体，以及(2)抗原或抗原的组合或编码所述抗原或抗原的组合的核酸或包含所述核酸的第二组一种或多于一种载体。

载体

第一组载体优选是人腺病毒载体，更优选复制缺陷型人腺病毒载体。优选第一组载体是C组人腺病毒载体。人类腺病毒的C组(也称为C种)包括hAd1、hAd2、hAd5、hAd6和hAd57。在优选实施方案中，第一组载体选自hAd6、hAd57和hAd5。在一些实施方案中，第一组载体选自hAd6和hAd5。优选地，第一组载体选自hAd6和hAd57，更优选hAd6。

在编码抗原或抗原的组合的情况下，抗原或抗原的组合由不包含在第一组一种或多于一种载体中的核酸编码。

优选地，疫苗组合物包含第二组一种或多于一种载体，其包含编码抗原或抗原的组合的核酸。可以预见，第二组载体是腺病毒或腺相关病毒(AAV)载体。

一种或多于一种佐剂由包含在第一组一种或多于一种载体中的核酸编码，其中抗原或抗原的组合(如果由包含在载体中的核酸编码)包含在第二组一种或多于一种载体中。换句话说，抗原不是由包含在第一组一种或多于一种载体中的核酸编码的。

优选地，第二组载体是可复制型或不可复制型腺病毒载体，优选不可复制型。优选腺病毒载体来源于类人猿，优选非人类人猿。优选地源自腺病毒的非人类人猿是黑猩猩(Pan)，优选倭黑猩猩(Pan paniscus)和普通黑猩猩(Pan troglodytes)、大猩猩(Gorilla)和红毛猩猩(Pongo)。在优选实施方案中，第二组载体是源自黑猩猩或倭黑猩猩或大猩猩的腺病毒载体，最优选地源自大猩猩。通常，从相应类人猿的粪便样本中分离天然存在的非人类人猿腺病毒。

最优选的载体是基于大猩猩腺病毒载体的非复制型腺病毒载体。

其它合适的载体是基于hAd4、hAd5、hAd6、hAd7、hAd11、hAd26、hAd35、hAd49、hAd57、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3载体的非复制型腺病毒载体或复制型Ad4和Ad7载体。人腺病毒hAd4、hAd5、hAd6、hAd7、hAd11、hAd26、hAd35、hAd49和hAd57是本领域众所周知的。基于天然存在的ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的载体在WO 2005/071093中详细描述。在WO 2010/086189中详细描述了基于天然存在的PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147的载体。

优选的AAV载体基于选自AAV-1、AAV-2、AAV-2-AAV-3杂交、AAV-3a、AAV-3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-6.2、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAVrh.10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAVrh32.33的AAV血清型。

抗原

抗原或抗原的组合可以以蛋白质的形式递送，或者可以由核酸编码。核酸可以包含或不包含在载体中。在一些实施方案中，抗原或抗原的组合由RNA编码，并由脂质纳米颗粒或脂质-聚合物混合纳米颗粒递送。优选地，抗原或抗原的组合由包含在第二组载体中的核酸编码。

在本发明所有方面的优选实施方案中，抗原或抗原的组合选自癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原和真菌抗原，或者抗原的组合包含一种或多于一种选自癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原和真菌抗原的抗原。

在本发明所有方面的优选实施方案中，抗原或抗原的组合在缺乏由第一组载体的人腺病毒载体编码的一种或多于一种佐剂的情况下，在对象中不引起免疫应答或仅引起次优免疫应答。换句话说，在优选的实施方案中，抗原或抗原的组合是弱抗原，即具有低免疫原性的抗原。影响抗原免疫原性的因素是它的外源性(它必须被识别为非自身)、它的分子大小、它的化学组成和异质性以及它在细胞表面与MHC分子复合物中呈递的能力。如上所述，肿瘤相关抗原和肿瘤新抗原通常是弱抗原。次优免疫应答也可称为“弱免疫应答”。技术人员很清楚量化免疫应答和决定免疫应答是否被归类为“次优”或甚至“缺乏”的方法。特别是，通过分析T细胞对抗原或抗原的组合的反应来定量免疫应答。通过测定细胞因子分泌，特别是IFNγ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5和/或IL-13的分泌，可以分析T细胞对抗原或抗原的组合的激活。在优选的实施方案中，通过测定每10⁶个脾细胞对抗原或抗原的组合的应答中产生IFNγ的T细胞数目来量化免疫应答。可用于确定免疫应答的示例性分析是实施例11中描述的IFN-γELISpot分析。体液免疫应答可以通过测量针对抗原的血清抗体水平来分析。

“次优”免疫应答优选定义为每10⁶个脾细胞中产生IFNγ的T细胞少于600个、少于500个、少于400个、少于300个、少于200个，最优选少于150个。

“不存在”免疫应答优选定义为每10⁶个脾细胞中产生IFNγ的T细胞少于100个、少于60个、少于40个、更优选少于30个。

本发明人发现，在施用抗原或抗原的组合(单独或与全身施用的非编码佐剂，即蛋白质佐剂一起)导致“次优的”免疫应答的情况下，一种或多于一种腺病毒载体编码的佐剂与相同抗原或相同抗原的组合一起的共同施用导致免疫应答的显著增加，特别是增加不再被归类为“次优”的应答(图3、图8、图9)。

此外，本发明人发现，在施用抗原或抗原的组合(单独或与全身施用的非编码佐剂一起)基本上不产生免疫应答(即“缺乏”免疫应答)的情况下，一种或多于一种腺病毒载体编码的佐剂与相同抗原或相同抗原的组合的共同施用导致免疫应答的产生(图4、图6、图7)。

本发明人进一步发现，在施用抗原或抗原的组合(单独或与全身施用的非编码佐剂一起)导致足够的免疫应答(即，比被分类为“次优”的免疫应答更强的免疫应答)的情况下，一种或多于一种腺病毒载体编码的佐剂与相同抗原或相同抗原的组合的共同施用导致甚至更强的免疫应答。

出乎意料地是，本发明人发现所描述的效果随用于编码佐剂的腺病毒类型而变化。人腺病毒载体，特别是人C组腺病毒载体导致更高水平的佐剂(图1A)和增强的免疫应答(图1B)。发现腺病毒载体hAd5、hAd6和hAd57(与hAd6具有非常高的序列相似性)特别有利。

本发明人还表明，与作为蛋白质施用的相同佐剂相比，提供经编码的佐剂，优选在人腺病毒载体中，导致全身暴露减少(图5)。这表明经编码的佐剂，特别是腺病毒载体中经编码的佐剂的安全性增加。不希望受理论的束缚，本发明人提出腺病毒载体，特别是人腺病毒载体，更特别是人C组腺病毒载体，更特别是hAd5、hAd6和hAd57，甚至更特别是hAd6和hAd57，最特别是hAd6，产生足够高的佐剂的局部水平，使得免疫应答增强，而不伴随佐剂的高全身性水平。

在优选的实施方案中，抗原或抗原的组合包含或由一种或多于一种选自肿瘤相关抗原(TAA)和/或癌症新抗原的癌症抗原组成。

在优选的实施方案中，TA对确定的肿瘤类型是特异性的，特别是膀胱癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、胸腺瘤、结肠癌；乳腺癌、卵巢癌、肝癌；或者肾癌。在一些实施方案中，TAA的特征在于，即在健康组织中根本不表达或仅低水平表达而在肿瘤组织中水平增加的蛋白质。一类常见的TAA是例如睾丸癌(CT)抗原。通常，这些蛋白质的表达仅限于成年动物的雄性生殖细胞。然而，在癌症中，这些发育抗原经常被重新表达。

在优选的实施方案中，癌症新抗原选自氨基酸单点突变肽、移码肽、内含子通读突变肽和剪接位点突变肽。在一些实施方案中，癌症新抗原是表达突变蛋白的癌症组织的片段，其中该片段包含由突变引起的中心非-wt氨基酸(一种或多于一种非同义单核苷酸变体)，其两侧是各自的野生型氨基酸序列，优选两侧12个氨基酸。在一些实施方案中，癌症新抗原可以包含多于一个非野生型氨基酸。

类似地，编码抗原的组合的核酸可以存在于单个载体中，或者可以分布在第二组载体的多于一个载体中。单一抗原可以用或不用接头头尾相连。如果存在，抗原之间或抗原组之间的接头可以来自天然存在的多结构域蛋白质或可以通过设计产生。接头包括可被细胞蛋白酶加工的柔性接头和/或体内可切割接头。合适的接头序列是本领域众所周知的，优选包含1个至10个氨基酸或由1个至10个氨基酸组成。接头优选组成为或包含小氨基酸如Ser和Gly。

在本发明所有方面的优选实施方案中，第二组载体包含编码至少1个、至少3个、至少5个、至少8个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个TAA的核酸。

在本发明各方面的优选实施方案中，第二组载体包含编码至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个癌症新抗原的核酸。

通常，针对病毒、细菌或真菌感染的预防性或治疗性疫苗接种不需要与增殖性疾病治疗中的疫苗接种一样多的不同抗原就能有效。然而，有一些病毒，例如HIV，具有很大的表位多样性，特别是在衣壳蛋白中。为了引发广泛的免疫应答，可以包括多于一种抗原。在本发明所有方面的优选实施方案中，第二组载体包含编码至少1个、至少3个、至少5个、至少8个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个病毒、细菌或真菌抗原的核酸。

包含更多抗原的疫苗组合物通常比仅包含少量抗原的疫苗组合物引发更强的免疫应答，其中“少量抗原”是指10个或少于10个的抗原，特别是5个或少于5个的抗原。

佐剂

根据本发明第一方面的疫苗组合物可以包含一种经编码的佐剂或几种经编码的佐剂。编码一种或多于一种佐剂的核酸可以存在于单个载体中，或者可以分布在第一组载体的多于一个载体之间。例如，如果佐剂是抗体，重链可以在一个载体中编码，轻链可以在另一个载体中编码，或者重链和轻链可以在同一载体中编码。如果存在多于一种经编码的佐剂，它们可以包含在单个载体或一组载体中。

在本发明的所有方面，一种或多于一种经编码的佐剂可以是膜结合的或可溶的。技术人员知道膜结合佐剂由包含跨膜结构域和ER分选信号的核酸编码。在本发明所有方面的优选实施方案中，一种或多于一种佐剂选自检查点分子的调节剂，细胞因子，优选选自IL-2、IL-1β、IL-7、IL-15、IL-18、GM-CFS和INF-γ，或细胞因子类似物，细胞因子受体，优选CD25(IL-2α受体)，合成多核苷酸佐剂，多氨基酸佐剂，优选聚精氨酸或聚赖氨酸，干扰素基因的激活剂，优选STING(干扰素基因的刺激剂；也称为MITA和MPYS)、腺苷脱氨酶(ADA)或增殖物激活受体γ辅激活因子1-α(PGC-1α)。在优选的实施方案中，检查点分子的调节剂选自肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员的激动剂或B7-CD28超家族成员的激动剂，其中优选激动剂是(可溶性)配体或激动性抗体或抗体样蛋白(例如CD40的CP-870893)；和PD-1、PD-L1、A2AR、B7-H3(例如MGA271)、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT或VISTA的拮抗剂，其中优选拮抗剂是拮抗性抗体或抗体样蛋白。在优选的实施方案中，TNF受体超家族成员的激动剂是CD27、CD40(例如CP-870893)、OX40、GITR或CD137。在优选的实施方案中，B7-CD28超家族成员的激动剂是CD28或ICOS。

在本发明所有方面的优选实施方案中，一种或多于一种佐剂选自OX40的激动剂，优选OX40L，ICOS的激动剂，优选ICOSL，CD40的激动剂，优选CD40L，和拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白，其中拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白可以是可溶的或可以包含跨膜区和ER分选信号，即膜结合抗体。在一些实施方案中，根据SEQ ID NO：4，跨膜结构域是鼠跨膜结构域。在优选的实施方案中，跨膜结构域是根据SEQ ID NO：5的人跨膜结构域。

在本发明所有方面的优选实施方案中，一种或多于一种佐剂是

(1)拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白；

(2)OX40的激动剂，优选OX40L；

(3)ICOS的激动剂，优选ICOSL；

(4)CD40的激动剂，优选CD40L；

(5)拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白和OX40的激动剂，优选OX40L；

(6)拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白和ICOS的激动剂，优选ICOSL；

(7)拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白和CD40的激动剂，优选CD40L；

(8)OX40的激动剂，优选OX40L，和ICOS的激动剂，优选ICOSL；

(9)OX40的激动剂，优选OX40L，和CD40的激动剂，优选CD40L；或者

(10)ICOS的激动剂，优选ICOSL，和CD40的激动剂，优选CD40L。

在本发明各方面的优选实施方案中，拮抗的CTLA-4特异性抗体是易普利姆玛。

在本发明各方面的优选实施方案中，一种或多于一种佐剂包含跨膜结构域和ER分选信号。换句话说，当编码的佐剂被表达时，它是膜结合蛋白。

CTLA-4受体分子的表达和功能与T细胞活化有内在联系。CTLA4在T细胞受体(TCR)参与后立即上调(信号1)，其表达在激活后2天至3天达到高峰。CTLA4抑制TCR信号与共刺激分子CD28竞争与B7配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的结合，CTLA4对这些配体具有更高的亲和力和亲和性。因为B7-1和B7-2都通过CD28(信号2)向与TCR(信号1)结合的T细胞提供阳性共刺激信号，因此抑制这两种分子与CTLA4的相互作用是必要的。因此，阻断CTLA-4抑制活性的抗CTLA-4抗体增强了T细胞的激活。基于对一些黑色素瘤患者的长效保护的诱导，抗CTLA4抗体(易普利姆玛；BMS)已被成功开发用于癌症免疫疗法。然而，全身递送抗CTLA-4抗体的治疗潜力受到显著的免疫治疗相关副作用的限制。

本发明上下文中的OX40L指OX40配体(人OX40：NP_003317，鼠OX40L：NP_033478)。OX40L是OX40(也称为CD134或TNFRSF4)的配体，并在许多抗原呈递细胞上稳定表达，如DC2s(树突细胞的一种亚型)、巨噬细胞和活化的B淋巴细胞。OX40L与OX40的结合是T细胞存活信号的来源，并使记忆T细胞能够发育。

本发明上下文中的ICOSL指ICOS配体(人ICOSL：NP_056074，鼠ICOSL：NP_056605)。

本发明上下文中的CD40L指CD40配体(人CD40L：NP_000065，鼠CD40L：NP_035746)。

在实施例中，使用了ICOSL、CD40L和OX40L的鼠版本。

在一些实施方案中，佐剂是编码为包含2A序列的一个连续氨基酸序列的抗体，其允许产生分开的重链和轻链。在一些实施方案中，佐剂是编码为一个连续氨基酸序列的抗体，该序列包含第一信号肽、重链、弗林蛋白酶位点、2A序列、第二信号肽和轻链。此类构建体用于实施例部分中的易普利姆玛和9D9。

本发明人证明了编码佐剂的佐剂活性明显优于通过腹腔内注射全身递送的蛋白佐剂的活性(图3)。不希望受任何理论的束缚，这些结果表明腺病毒载体编码的佐剂的共同施用确保了抗原和佐剂的及时共同定位以获得有效的佐剂性。此外，本发明人证明，与皮下或腹腔内注射的蛋白佐剂相比，经编码的佐剂在血清中的浓度显著降低(图5)。因此，编码佐剂的佐剂效应是通过非常有限的系统暴露来实现的。

关于本发明的以下方面使用的所有术语具有关于本发明的第一方面定义的含义，除非另有明确定义。此外，适用于其它方面的为第一方面指定的所有实施例也设想用于那些方面，除非另外具体定义。

在第二方面，本发明涉及根据本发明第一方面的用于治疗疾病或预防疾病的疫苗组合物。

在优选的实施方案中，疫苗组合物用于治疗对象的增殖性疾病。优选地，增殖性疾病是癌症和/或肿瘤。

通常优选肿瘤至少为Tis或T1期(不包括Tx期和T0期)，优选至少为T2期、T3期或T4期。它可以同时是所有级N(例如Nx或N0)和M(例如M0)，并且在优选实施例中至少是级N1、N2或N3和/或M1)。这指的是TNM分类，其将肿瘤分期定义如下：

T：原发肿瘤的大小或直接范围

Tx：无法评估肿瘤

Tis：原位癌

T0：无原发性肿瘤证据

T1、T2、T3、T4：原发性肿瘤的证据，大小和/或扩展随着阶段而增加

N：扩散到区域淋巴结的程度

Nx：区域淋巴结无法评估

N0：无区域淋巴结转移

N1：区域淋巴结转移存在；在一些部位，肿瘤扩散到最近的或少量的区域淋巴结

N2：肿瘤扩散到N1和N3之间的某一程度(N2并非在所有部位都使用)

N3：肿瘤扩散到更远或更多的区域淋巴结(N3并非在所有部位使用)

M：存在远端转移

M0：没有远端转移

M1：转移到远端器官(超出区域淋巴结)

设想特别受益于本发明的示例性阶段是Tis和N中的任何一个(优选N1或N2或N3)和M任何一个(优选M1)，T1和N中的任何一个(优选N1或N2或N3)和M任何一个(优选M1)，T2和N中的任何一个(优选N1或N2或N3)和M任何一个(优选M1)，T3和N中的任何一个(优选N1或N2或N3)和M任何一个(优选M1)，以及T4和N中的任何一个(优选N1或N2或N3)和M任何一个(优选M1)。肿瘤的存在及其在患者体内的扩散可以使用成像方法来检测，例如计算机断层扫描(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、使用通过正电子发射断层扫描(PET)中的闪烁照相术检测的放射性示踪剂的同位素诊断或其组合。成像方法也可以与其他方法结合，例如超声波检查、内窥镜检查、乳房X线照相术、血液中的生物标记检测、细针活检或其组合。通过成像方法可检测到的肿瘤大小取决于所使用的方法，同位素成像的直径约为1.5cm，CT和MRI的直径约为3mm，基于PET的方法的直径约为7mm(Erdi.(2012)Molecular Imaging andRadionuclide Therapy 21(1)：23)。

优选地，用选自循环肿瘤细胞游离DNA的检测、计算机断层扫描(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、用通过正电子发射断层扫描(PET)中的闪烁照相术检测的放射性示踪剂的同位素诊断、以及前述的任何组合的方法来确定肿瘤的存在(“证据”)。在一个实施方案中，一种或多于一种前述方法或其组合与由超声波检查、内窥镜检查、乳房X线照相术、血液中的生物标记检测、细针活检和前述方法的任何组合组成的组中的方法组合。

在第二方面的优选实施方案中，癌症选自唇、口腔、咽、消化器官、呼吸器官、胸内器官、骨、关节软骨、皮肤、间皮组织、软组织、乳房、女性生殖器官、男性生殖器官、泌尿道、脑和中枢神经系统其他部分、甲状腺、内分泌腺、淋巴组织和造血组织的恶性肿瘤。

通常，优选对象具有如上所述的TNM阶段的肿瘤。

在一个实施方案中，肿瘤的特征在于病变直径至少约3mm，优选直径至少7mm，更优选直径至少1.5cm。

在优选的实施方案中，疫苗组合物与一种或多于一种免疫调节剂，更特别地与抗-PD1联合施用。一种或多于一种免疫调节剂，特别是抗-PD1优选作为蛋白质施用。

可以设想，一种或多于一种免疫调节剂的施用在疫苗组合物施用开始前开始，或在疫苗组合物施用开始后开始，或一种或多于一种免疫调节剂的施用在疫苗组合物施用开始的同时开始。

在本发明第二方面的另一个实施方案中，提供疫苗组合物用于治疗感染性疾病，例如病毒、细菌或真菌感染。

在第三方面，本发明涉及用于诱导针对抗原或抗原的组合的免疫应答的疫苗组合物或疫苗试剂盒，其包含(1)包含编码一种或多于一种佐剂的核酸的第一组合物或包含所述核酸的第一组一种或多于一种载体，和(2)包含抗原或抗原的组合或编码抗原或抗原的组合的核酸或包含所述核酸的第二组一种或多于一种载体的第二组合物，其中(1)在第一位置向患者施用，和(2)在第二位置向患者施用，其中第一位置在第二位置的20cm以内，并且第一位置的淋巴系统与第二位置的淋巴系统引流至相同的淋巴结，或者其中第一位置与第二位置相同。

在本发明的上下文中，表述“诱导免疫应答”是指如本文所述的细胞免疫应答和/或体液免疫应答。在一些实施方案中，提供的疫苗组合物或疫苗试剂盒用于治疗或预防疾病，优选用于治疗或预防增殖性疾病或感染性疾病，更优选用于治疗或预防癌症。

抗原或抗原的组合可以以蛋白质的形式递送，或者可以被编码，其中编码抗原或抗原的组合的核酸可以包含或不包含在载体中。经编码的一种或多于一种佐剂，其中编码一种或多于一种佐剂的核酸(即第一核酸)可以包含或不包含在载体中。编码一种或多于一种佐剂的核酸(即第一核酸)可以是一个分子或多于一个分子，例如两个或多于两个核酸分子。技术人员知道术语“一个核酸分子”、“两个核酸分子”等。术语“数目”并不表示核酸分子的绝对数目，而是表示不同核酸分子的数目，即具有不同序列的核酸分子。在佐剂是抗体的情况下，重链可以由一个核酸分子编码，轻链可以由另一个核酸分子编码，或者重链和轻链可以由一个核酸分子编码。如果存在多于一种经编码的佐剂，它们可以由一个核酸分子或几个核酸分子编码。类似地，编码一种或多于一种佐剂的核酸(即第一核酸)可以存在于单个载体中，或者可以分布在第一组载体的多于一个载体之间。例如，如果佐剂是抗体，重链可以在一个载体中编码，轻链可以在另一个载体中编码，或者重链和轻链可以在同一载体中编码。如果存在多于一种编码佐剂，它们可以包含在单个载体或一组载体中。在本发明第三方面的一些实施方案中，一种或多于一种佐剂和/或抗原或抗原的组合由RNA编码，并由脂质纳米颗粒或脂质-聚合物混合纳米颗粒递送。在本发明第三方面的优选实施方案中，一种或多于一种佐剂和/或抗原或抗原的组合分别由包含在第一组载体和第二组载体中的核酸编码。最优选地，载体是本发明第一方面所述的载体。

出乎意料地是，本发明人发现，如果抗原和佐剂在较远的位置施用，其中两个位置的淋巴系统不会引流至相同的淋巴结，例如对侧肢体，则径编码的佐剂的效果会丧失(图2)。不希望被理论所束缚，本发明人假设，对于有效的佐剂性，抗原和佐剂同时且非常接近地起作用是重要的，特别是在一个淋巴结内。这可以通过使用编码的佐剂来实现，优选腺病毒载体编码的佐剂，更优选人腺病毒载体编码的佐剂。此外，如果抗原，优选编码的抗原和编码的佐剂以混合物的形式施用，或者在很短的时间间隔内在很近的位置(引流到相同的淋巴结)施用，那么在很近的地方的同时作用会增强。如果抗原和佐剂都被编码，则编码抗原和佐剂的核酸序列不包含在同一分子中，例如不在同一载体中或同一RNA分子上。本发明第三方面的疫苗组合物或疫苗试剂盒可包含作为混合物或作为两种单独组分的第一组合物和第二组合物。换句话说，疫苗组合物或疫苗试剂盒可以被配制成同时或分别施用第一组合物和第二组合物。第一组合物和第二组合物的组分可以包含在一种组合物中，但是是独立的分子。第一和第二核酸不包含在同一核酸分子中。第一组一种或多于一种载体和第二组一种或多于一种载体是不同的载体组。因此，抗原和佐剂作为独立的分子被递送，但是这些独立的分子在时间和空间上是邻近的。

在优选实施方案中，第一位置在第二位置的17.5cm、15cm、12.5cm、10cm、7.5cm、5cm、2.5cm、1cm、0.5cm、0.25cm或0.1cm以内。在最优选的实施方案中，第一位置和第二位置是相同的。技术人员知道，在(1)和(2)作为混合物施用的情况下，第一个位置和第二个位置是相同的，并且在(1)和(2)的施用之间没有时间间隔。

可以设想(1)和(2)通过肌内、皮下、皮内、腹腔内或胸膜内注射施用。在优选的实施方案中，(1)和(2)通过相同的途径施用，例如两者都通过肌内注射施用。然而，只要(1)对第一和第二组织施用，其中第一和第二组织的淋巴系统流向相同的淋巴结，施用不一定必须通过相同的途径。

在本发明第三方面的优选实施方案中，(1)和(2)，即编码的佐剂和抗原(蛋白质或编码的)在30分钟或短于30分钟、20分钟或短于20分钟、15分钟或短于15分钟、10分钟或短于10分钟、5分钟或短于5分钟、3分钟或短于3分钟或1分钟或短于1分钟的时间间隔内施用。在本发明第三方面的最优选实施方案中，将(1)和(2)作为混合物施用于患者，即(1)和(2)在相同的位置同时施用。

此外，通过使用包含跨膜结构域和ER分选信号的编码佐剂，可以增强非常接近的同时作用。当表达时，这种佐剂是膜结合的。与可溶性佐剂不同，它们不能扩散，而是与表达它们的细胞相连，从而促进近距离的作用。此外，膜结合佐剂仅发挥局部作用，因此限制了由于可溶性佐剂的全身性暴露而产生的不良作用。因此，在优选的实施方案中，佐剂包含跨膜结构域和ER分选信号。膜结合佐剂的实例是OX40L、CD40L、ICOSL或抗CTLA4的膜结合形式。

用于诱导针对抗原或抗原的组合的免疫应答的疫苗组合物或疫苗试剂盒优选用于治疗对象的疾病。疾病可以是传染性疾病或增殖性疾病，优选增殖性疾病。优选地，增殖性疾病是癌症和/或肿瘤。

在第二方面和第三方面的优选实施方案中，将病毒载体，特别是包含编码一种或多于一种佐剂的核酸的腺病毒载体施用给对象，特别是人类对象，优选通过肌内施用，其病毒颗粒载量(vp)为10^10vp或高于10^10vp、2×10^10vp或高于2×10^10vp、4×10^10vp或高于4×10^10vp、10^11vp或小于10^1vp、8×10^10vp或小于8×10^10vp、6×10^10vp或小于6×10^10vp，和编码抗原或抗原的组合的腺病毒载体，以5×10^10vp或高于5×10^10vp、6×10^10vp或高于6×10^10vp、7×10^10vp或高于7×10^10vp、8×10^10vp或高于8×10^10vp、2×10^11vp或小于2×10^11vp、10^10vp或小于10^10vp、9×10^10vp或小于9×10^10vp的病毒颗粒载量(vp)施用给对象，特别是人类对象，优选通过肌内施用。

在第四方面，本发明涉及包括第一和第二施用步骤的疫苗接种方案，其中(a)第一施用步骤包括施用根据本发明第一、第二或第三方面的疫苗组合物，和(b)第二施用步骤包括施用(1)包含编码一种或多于一种佐剂的核酸的第一组合物，或包含所述核酸的第一组一种或多于一种载体；和/或(2)包含抗原或抗原的组合、或编码所述抗原或抗原的组合的核酸、或包含所述核酸的第二组一种或多于一种载体的第二种组合物。

在第一施用步骤中施用的疫苗组合物可以是由本发明第一方面提供的疫苗组合物。在第一施用步骤中施用的疫苗组合物也可以是本发明第二或第三方面提供使用的疫苗组合物。

在第一和第二施用步骤施用施用的一种或多于一种编码佐剂可以相同或不同，优选相同的。它们可以选自本发明第一方面描述的佐剂。在优选的实施方案中，包含在第一和第二疫苗组合物中的一种或多于一种佐剂选自OX40的激动剂，优选OX40L，ICOS的激动剂，优选ICOSL，CD40的激动剂，优选CD40L，和拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白，其中拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白可以是可溶的或可以包含跨膜结构域和ER分选信号，即膜结合抗体。

如果在第二次施用步骤中施用抗原或抗原的组合(蛋白质或编码的)，则该抗原或抗原的组合与第一次施用步骤中的相同。

在第二次施用步骤包括施用抗原(蛋白质或编码抗原)的情况下，施用可以被描述为初次加强方案。

在一些实施方案中，疫苗接种方案是具有两种不同病毒载体的异源初次加强方案。在这样的实施方案中，第一次和第二次施用优选间隔至少1周，优选6周。

优选地，第一和第二施用步骤都包括施用第一组一种或多于一种载体，该载体包含编码一种或多于一种佐剂的核酸。换句话说，第一和第二施用步骤都包括施用一种或多于一种编码的佐剂，其中编码的佐剂包含在载体中。此外，优选地，第一和第二施用步骤包括施用第二组一种或多于一种载体，该载体包括编码抗原或抗原的组合的核酸。换句话说，第一和第二施用步骤都包括施用编码的抗原或抗原的组合，其中编码的抗原或抗原的组合包含在载体中。

第二施用步骤的第一和第二组载体可以是选自甲病毒载体、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒载体、辛德比斯(SIN)病毒载体、塞姆利基森林病毒(SFV)病毒载体、猿猴或人巨细胞病毒(CMV)载体、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体、逆转录病毒或慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体、痘病毒载体、痘苗病毒载体或改良的痘苗安卡拉病毒(MVA)载体的病毒载体。

优选地，第一和第二施用步骤的第一组载体(“佐剂载体”)是腺病毒载体。更优选地，它们是人腺病毒载体，优选选自本发明第一方面的第一组载体。在优选的实施方案中，第一次施用步骤的第一组载体是与第二次施用步骤的第一组载体不同的腺病毒载体，优选不同的人腺病毒载体。

进一步优选的是，第一和第二施用步骤的第二组载体(“抗原载体”)从本发明第一个方面的第二组载体所描述的载体中选择。然而，第一施用步骤的第二组载体不同于第一施用步骤的第二组载体。换句话说，第一和第二施用步骤的第二组载体(“抗原载体”)是不同的载体，但包含相同的抗原或抗原的组合。

在第一个施用步骤的优选实施方案中，第一组载体(“佐剂载体”)是人腺病毒载体，第二组载体(“抗原载体”)是腺病毒载体。

在第二个施用步骤的优选实施方案中，第一组载体(“佐剂载体”)是腺病毒载体、AAV载体或MVA载体，优选腺病毒载体，第二组载体(“抗原载体”)是MVA载体。

出乎意料地是，发明人发现单独重新施用佐剂，最好是腺病毒载体编码的佐剂，增强了新抗原疫苗的抗肿瘤功效(图10)。因此，在一些实施方案中，第二次施用步骤包括施用佐剂，优选腺病毒载体编码的佐剂，更优选人腺病毒载体编码的佐剂，但不施用抗原。在这样的实施方案中，第一组载体优选在第一和第二施用步骤中是相同的(即，相同载体中的相同佐剂)。此外，在这样的实施方案中，第一次和第二次施用步骤优选间隔约1天。优选地，第一次和第二次施用通过相同的途径。

在疫苗接种方案的优选实施方案中，第一和/或第二施用步骤还包括施用至少一种免疫调节剂。

另一方面，本发明涉及药物制剂或药物组合物，其包含根据第一方面的疫苗组合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。药物制剂或组合物可进一步包含至少一种免疫调节剂。本发明还涉及用于预防或治疗，特别是治疗对象的增殖性疾病的所述药物制剂或组合物。

为了制备本发明的药物组合物，药学上可接受的药物载体可以是固体或液体。固体形式的组合物包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂、扁囊剂、栓剂和可分散的颗粒剂。固体赋形剂可以是一种或多于一种物质，其也可以用作稀释剂、调味剂、黏合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。在散剂中，赋形剂优选是细碎的固体，其与本发明的细碎抑制剂混合。在片剂中，将活性成分与具有必要黏合性能的药物载体以合适的比例混合，并压制成所需的形状和大小。合适的赋形剂是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。为了制备栓剂，首先熔化低熔点蜡例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，并通过搅拌将活性组分均匀地分散在其中。然后将熔融的均匀混合物倒入适当大小的模具中，使其冷却，从而固化。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适于口服施用的固体剂型。

液体形式的组合物包括溶液、混悬剂和乳剂，例如水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射(例如静脉内输液、动脉内输液、骨内输液、肌肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、皮内注射和鞘内注射)，液体制剂可以配制成溶液例如聚乙二醇水溶液。当静脉内施用药物组合物时，盐溶液是优选的药物载体。

优选地，药物组合物为单位剂型。在这种形式中，组合物可以细分为含有适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的组合物，包装含有离散量的组合物，例如包装的片剂、胶囊剂、和小瓶或安瓿中的散剂。此外，单位剂型可以是胶囊剂、注射小瓶、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以是包装形式中的任何这些的适当数量。

如果需要，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。

此外，这种药物组合物还可以包含其它药理活性物质。

在另一方面，本发明涉及疫苗接种试剂盒，其在单独的包装中包含(i)根据第一方面的疫苗组合物；和(ii)至少一种免疫调节剂。

在本说明书的上下文中，佐剂是编码的佐剂，其中免疫调节剂优选是蛋白质。

在另一方面，本发明涉及治疗或预防增殖性或感染性疾病，优选增殖性疾病的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本发明第一方面的疫苗组合物或如本发明第三方面所述的疫苗组合物。

在上述任何方面的优选实施方案中，一种或多于一种免疫调节剂是选自IL-2、IL-1β、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、GM-CFS和INF-γ的细胞因子，选自IL-2、IL-1β、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、GM-CFS和INF-γ的类似物的细胞因子类似物，或选自肿瘤坏死因子激动剂(例如以及PD-1、PD-L1、A2AR、B7-H3(例如MGA271)、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA的拮抗剂。

在上述任何方面的优选实施方案中，至少一种免疫调节剂选自拮抗CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白、拮抗PD-1特异性抗体或抗体样蛋白和/或IL-2或其类似物。一种或多于一种免疫调节剂优选作为蛋白质施用。

附图说明

图1 A)在注射后7天测量接受编码9D9抗mCTLA4(10^8病毒颗粒，vp)的Ad6、Ad5、GAd20和ChAd68载体的小鼠中抗mCTLA4(克隆9d9)的血清浓度。B)经编码的抗CTLA4对疫苗诱导的T细胞应答的影响。用编码选自MC38肿瘤模型的七种CD8T细胞新抗原的GAd疫苗(疫苗，剂量为2x10^7vp)im接种C57Bl6小鼠，其单独施用或与编码抗mCTLA4的Ads(编码9D9抗mCTLA4的Ad6、Ad5、GAd20和ChAd68载体；每个10^8vp)组合施用，所示为通过IFN-γELISpot试验在5个实验组中测量的对疫苗中编码的CD8表位的总应答(每百万个脾细胞中产生IFNγ的T细胞的数目)。

图2显示了经编码的抗mCTLA4抗体(Ad-9d9)与疫苗在一个解剖部位(混合)作为混合物共同施用时，在与混合物相同的解剖部位(单独)或在两个相距较远的部位(对侧)分别进行邻近施用(5分钟时间差)时，对疫苗诱导的T细胞应答的影响。用编码选自MC38肿瘤模型的七种CD8T细胞新抗原的GAd疫苗(疫苗，剂量为2x10^7vp)im接种C57Bl6小鼠，施用与疫苗混合的Ad6-9d9(10^8vp)，并注射入小鼠股四头肌，在相同的解剖部位以单独施用的方式递送或在两个不同的解剖部位施用(GAd疫苗在左侧部位，Ad-9d9在右侧部位，对侧)。所有三种方案使用相同的疫苗剂量。作为对照，一组小鼠只接受不含Ad-9d9的疫苗。所示为通过IFN-γELISpot试验测量的免疫应答(每百万个脾细胞中产生IFNγ的T细胞数目)。

图3显示了经编码的抗mCTLA4抗体(Ad-9d9)对疫苗诱导的T细胞应答的影响。A)用编码31种CT26新抗原(疫苗)的GAd疫苗经肌内(im)接种BalBC小鼠，所述GAd疫苗单独施用或与编码抗mCTLA4的Ad6(Ad-9d9剂量为10^8vp)组合(混合物)施用，或与经腹膜内(ip)递送的抗mCTLA4抗体蛋白(9d9Ab，100μg)组合施用。所示为在3个实验组(疫苗；疫苗+9d9Ab；疫苗+Ad-9d9)中通过IFN-γELISpot试验测量对疫苗中编码的CD8表位(浅灰色)和CD4(深灰色)的应答(每百万个脾细胞产生IFN-γ的T细胞数目)。

图4显示了当与疫苗共同施用时，经编码的抗mCTLA4抗体(Ad6-9d9)对疫苗诱导的T细胞应答的影响，以及经编码的抗mCTLA4对疫苗抗肿瘤功效的影响。A)用编码62种CT26新抗原(疫苗)的GAd疫苗肌肉内(im)接种BalBC小鼠，其单独施用或与编码抗mCTLA4的Ad6(Ad-9d9剂量为10^8vp)组合(混合物)施用。所示为通过IFN-γELISpot试验测量的免疫应答(每百万个脾细胞中产生IFNγ的T细胞数目)。B)GAd-CT26-62与抗mPD1的组合相对于GAd-CT26-62与Ad6-9d9与抗mPD1的组合共同施用的抗肿瘤功效。治疗从第0天开始，根据肿瘤体积对小鼠进行随机分组。所示为属于2个不同治疗组的单个小鼠随时间的肿瘤生长。抗肿瘤反应被评估为完全和部分反应之和(肿瘤缩小≥40％)。

图5显示了注射小鼠血清中抗mCTLA4抗体的浓度。所示为小鼠在用编码抗mCTLA4的Ad6载体注射(Ad-9d9，黑色)或皮下注射(9d9Ab sc，白色)或ip(9d9Ab ip，深灰色)单剂量抗-mCTLA4抗体蛋白(9d9Ab，100μg)后7天的抗-mCTLA4抗体浓度。

图6显示了经编码的抗CTLA4增强基于TAA的GAd疫苗的免疫原性的效果。用编码选自CT26肿瘤的4种TAA的GAd疫苗(疫苗，剂量为5×10^8vp)接种BalBC小鼠，其单独施用或与编码抗mCTLA4的Ad6(疫苗+Ad-9d9)组合(混合物)施用。所示为通过使用一组覆盖疫苗序列的肽测量的对编码抗原(1至4)的应答(每百万个脾细胞中产生IFNγ的T细胞的数目)。

图7显示了经编码的抗mCTLA4增强针对TAA的抗体应答的效果。用编码hHer2的GAd疫苗(Ad-hHer2，剂量为5×10^8vp)im接种hHer2转基因(Tg)小鼠，其单独施用或与编码抗mCTLA4的Ad6(Ad-hHer2+Ad-9d9)组合(混合物)施用。免疫后2周，从免疫小鼠制备血清，并分析是否存在识别TAA hHER2/neu的抗体。来自wt小鼠的血清用作阳性对照，预期对hHer2的应答为阳性。

图8显示了经编码的OX40L对疫苗诱导的T细胞应答的影响。用编码选自MC38肿瘤模型的七种CD8T细胞新抗原的GAd疫苗(疫苗，剂量为2×10^7vp)im接种C57Bl6小鼠，其单独施用或与编码OX40L的Ad(Ad-OX40L，10^8vp)组合(作为混合物)施用。作为阳性对照，一组小鼠接受与Ad-9d9共同施用的疫苗。所示为通过IFN-γELISpot试验测量的对疫苗中经编码的CD8表位的总应答(每百万个脾细胞中产生IFNγ的T细胞数目)。

图9显示了经编码的9d9和OX40L在hHer2Tg小鼠中打破T细胞对人Her2耐受性的效果。将编码h-Her2的GAd疫苗单独施用或与编码9D9(Ad-9D9)或OX40L(Ad-OX40L)的腺病毒组合施用或与等量混合的Ad-9D9和Ad-OX40L组合施用对小鼠进行im接种。所示为通过IFN-γELISpot试验测量的对hHer2的T细胞应答(每百万脾细胞中产生IFNγ的T细胞数)。

图10显示了经编码的ICOSL对疫苗诱导的T细胞应答的影响。C57Bl6小鼠用GAd疫苗进行im接种，所述GAd疫苗编码选自MC38肿瘤模型的七种CD8T细胞新抗原(疫苗，剂量为2x10^7vp)，所述疫苗单独施用或与编码ICOSL的Ad(Ad-ICOSL，10^8vp)组合(作为混合物)施用。所示为通过IFN-γELISpot试验测量的对疫苗中经编码的CD8表位的总应答(每百万个脾细胞中产生IFNγ的T细胞数目)。

图11显示了经编码的Ad6抗-mCTLA4在佐剂的单次与双次施用方案中对疫苗抗肿瘤效力的影响。小鼠皮下接种CT26细胞。一周后，根据肿瘤体积对动物进行随机分组，并在第0天用无佐剂疫苗GAd-CT26-62联合抗-PD1(疫苗+抗-PD1)与佐剂疫苗进行治疗，治疗方案为单次施用经编码的抗-CTLA4(疫苗+Ad6-9d9+抗-PD1)或双次施用(疫苗+Ad6-9d9 2×+抗-PD1)，Ad6-9d9的第一剂量在第0天与疫苗共同施用，而第二剂量在第1天施用。肿瘤随时间生长如图所示。抗肿瘤反应被评估为完全和部分反应之和(肿瘤缩小≥40％)。

图12显示了通过ELISA测定随时间测量的接受Ad6-Ipi(10^8病毒颗粒，vp)的小鼠中抗-hCTLA4(易普利姆玛)的血清浓度。

图13显示了Ad6中经编码的抗mCTLA4的膜结合形式(Ad6-9d9TM)对疫苗抗肿瘤功效的影响。所示为通过IFN-γELISpot试验测量的对疫苗中经编码的CD8表位的总应答(每百万个脾细胞中产生IFNγ的T细胞的数目)，包括单独的疫苗(疫苗)、与疫苗共同施用的Ad6-9d9或与疫苗共同施用的Ad6-9d9TM。

实施例

实施例1：Ad编码的α-mCTLA4与编码肿瘤新抗原的腺病毒疫苗共同肌内施用增强了疫苗诱导的T细胞应答，但效率差异很大(Ad6、Ad5＞＞GAd20和ChAd68)(图1)。

对于该实施例，用编码选自MC38肿瘤模型的七种CD8T细胞新抗原的GAd疫苗接种小鼠(Yadav等人，Nature.2014 Nov 27；515(7528)：572-6；D‘Alise et al，Nat.Commun.2019 Jun 19；10(1)：2688)，其单独注射或与编码抗mCTLA4的不同腺病毒载体(克隆9d9，SEQ ID NO：1)一起混合(Ad6-9d9；Ad5-9d9；GAd 20-9d9；ChAd68-9d9)注射。以10^8vp(10⁸个病毒颗粒)的剂量施用编码抗-mCTLA4的腺病毒载体，该剂量相当于在临床环境中施用给人类患者的剂量。在不同组中，在Ad注射后(第7天)测量循环中经编码的抗-mCTLA4的水平，显示与GAd20和ChAd68相比，Ad6和Ad5中经编码的抗-mCTLA4的水平更高(图1A)。免疫接种后两周，使用对应于疫苗载体中存在的每种新抗原序列的肽的池作为抗原，通过体外IFN-γELISpot试验测量免疫应答。在Ad6和Ad5中表达的经编码的抗mCTL4存在时，疫苗免疫原性增强，但在GAd20和ChAd68中不表达(图1B)。

实施例2：Ad编码的α-mCTLA4对增强疫苗诱导的T细胞应答的作用需要与疫苗共同施用(图2)。

为了了解Ad编码的α-mCTLA4的作用是否需要与疫苗以混合物形式共同施用，C57Bl6小鼠接种了编码7种CD8新抗原的GAd疫苗，所述新抗原选自以3种不同的方案形式与Ad6-α-mCTLA4一起施用的MC38肿瘤模型：i)在一个解剖部位(股四头肌)作为混合物共同施用，ii)在5分钟以内在与i)相同的解剖部位分别进行两次邻近施用，以及iii)在两个对侧相距较远处部位单独施用。通过体外IFN-γELISpot试验在接种后两周测量免疫应答，显示当疫苗和Ad6-α-mCTLA4作为单独的组分施用时佐剂效应丧失(图2)。以10^8vp的剂量施用编码佐剂α-mCTLA4的腺病毒载体。当疫苗和佐剂Ad6-9d9作为混合物共同施用时，获得了增强免疫应答的最佳效果。

实施例3：与编码小鼠肿瘤新抗原的腺病毒载体共同肌内施用的编码抗mCTLA4的腺病毒载体增强了疫苗诱导的T细胞应答(CD8和CD4)，并且比作为蛋白系统递送的相同抗体表现更好(图3)。

对于该实施例，用编码选自CT26鼠肿瘤的31种新抗原的多抗原GAd疫苗接种小鼠(D′Alise等人，Nat.Commun.2019 Jun 19；10(1)：2688)。该疫苗以10^8vp的剂量单独肌内施用(10^8vp)或与编码抗小鼠CTLA4(克隆9d9)的ad6-抗mCTLA4共同施用用同样的疫苗与抗mCTLA4(克隆9d9)蛋白(BioXcell)联合ip治疗平行组小鼠。两周后，通过体外IFN-γELISpot试验测量免疫应答，使用一组对应于疫苗载体中存在的每种新抗原序列的肽作为抗原。Ad编码的抗mCTLA4抗体与GAd新抗原疫苗共同施用增加了疫苗诱导的CD8+和CD4+T细胞针对肿瘤新抗原的应答(图3)。这种效果比在作为蛋白质递送的抗m-CTLA4存在下观察到的效果更强。

实施例4：腺病毒载体编码的抗CTLA4增强了编码62种新抗原的基因疫苗对两个独立表达盒的免疫应答，并具有更强的抗肿瘤活性(图4)。

经编码的佐剂的性能也在编码大量新抗原的更复杂的构建体上进行了测试(图4A)。为此目的，使用了(WO2020/099614 A1)中公开的编码在鼠结肠癌细胞系CT26(命名为GAd-CT26-62)中鉴定的62种新抗原的GAd疫苗载体。小鼠用低剂量的GAd-CT26-62(2×10^7vp)进行肌内接种，单独施用或与编码抗小鼠抗CTLA4(克隆9D9)的Ad6-抗CTLA4以10^8vp的剂量共同施用。两周后，通过体外IFN-γELISpot试验评估免疫应答，使用一组对应于载体中存在的每种新抗原序列的肽作为抗原。腺载体编码的抗mCTLA4抗体与GAd-CT26-62的共同施用增加了针对肿瘤新抗原的疫苗诱导的T细胞应答(图4A)。还在CT26癌症小鼠模型中测试了相同的组合，以评价在抗mPD1治疗(克隆RMP1-14BioXcell)存在下，腺病毒载体编码的抗CTLA4与GAd疫苗共同施用对抗肿瘤活性的影响，并与抗mPD1存在下单独施用疫苗(无佐剂)的效果进行比较。结果显示，当疫苗加入经编码的Ad6-9d9时，疫苗和抗mPD1的抗肿瘤活性增强(图4B)。

实施例5：与抗体药物的全身和局部递送相比，当通过腺病毒载体递送时，抗CTLA4的全身暴露有限(图5)。

在本实施例中，给小鼠注射编码抗mCTLA4(Ad-9d9)的Ad6载体，注射剂量为10^8vp或单剂量的相同抗mCTLA4抗体，ip或sc(9d9Ab，100μg)。在施用Ad6后对循环抗-mCTLA4的血清水平的测量表明，与注射作为蛋白质的抗-mCTLA4(克隆9D9 BioXcell)相比，全身暴露非常有限，这支持了编码抗体的生物安全性提高(图5)。

实施例6：与编码小鼠替代肿瘤相关抗原(TAA)的腺病毒载体一起肌内共同施用的腺病毒载体编码的抗CTLA4破坏了免疫耐受(图6)。

为了研究腺病毒载体编码的抗mCTLA4在绕过肿瘤相关抗原(TAA)的免疫耐受中的作用，发明人选择了属于在小鼠CT26肿瘤中表达但在健康组织中不表达的抗原家族的替代TAA基因。产生编码4种鼠TAA(Slc9b1，Psg17，Gm773，Tcp11x2)的载体，其前面是人组织纤溶酶原激活剂(TPA)信号肽，将其单独或与Ad6编码的抗-mCTLA4以10^8vp的剂量共混合体内注射。免疫接种后两周，通过体外IFN-γELISpot试验，使用一组对应于疫苗载体中编码的TAA序列的肽作为抗原，测量免疫应答。结果显示，当共同注射Ad-9D9和疫苗TAA时，免疫应答显著增强(图6)。

实施例7：与编码肿瘤相关抗原的腺病毒载体疫苗一起肌肉内共同施用的腺病毒载体编码的抗CTLA4也增加了相对于自身抗原的抗体应答(图7)。

在本实施例中，研究了腺病毒载体编码的抗mCTLA4在增加疫苗诱导的抗体应答中的作用。hHer2转基因(Tg)小鼠，一种已知的对hHer2耐受的小鼠模型，广泛用于测试Her2疫苗，用编码hHer2的GAd疫苗免疫，单独注射或与Ad6-9d9共混合注射，剂量为10^8vp。通过针对hHer2蛋白的ELISA分析从免疫小鼠制备的血清，以测量治疗后的抗体水平。结果显示，虽然单独的疫苗诱导了低水平的针对hHer2的抗体，但是在Ad6中表达的编码的抗mCTL4存在下，观察到了抗体应答的相关增加。

实施例8：腺病毒载体编码的mOX40L与基于Ad的新抗原疫苗共同施用增强了其免疫原性(图8)。

对于该实施例，用GAd疫苗接种小鼠，所述GAd疫苗编码选自MC38肿瘤模型的七种CD8T细胞新抗原，所述疫苗单独注射或与编码抗mCTLA4的腺病毒Ad6(Ad-9d9)和编码mOX40L的腺病毒Ad6(Ad-OX40L)混合注射。以10^8vp的剂量施用编码抗mCTLA4和mOX40L的腺病毒载体免疫接种后两周，在每个实验组中通过体外IFN-γELISpot试验测量免疫应答，使用对应于疫苗载体中存在的每个新抗原序列的肽库作为抗原。结果显示Ad6中编码的OX40L在增强疫苗免疫原性方面的有效作用，与Ad-9d9的水平相似。

实施例9：两种经编码的佐剂抗-mCTLA4和OX40L在T细胞耐受的严格小鼠模型中提高针对TAA的疫苗效力的用途(图9)。

在本实施例中，在针对人Her2的T细胞耐受的严格小鼠模型中研究了腺病毒载体编码的抗mCTLA4和Ad-OX40L的作用。对hHer2耐受的hHer2转基因(Tg)小鼠用单独注射的编码hHer2的GAd疫苗、与Ad6-9d9或Ad6OX40L以10^8vp剂量共混合的编码hHer2的GAd疫苗或与两种佐剂混合的编码hHer2的GAd疫苗进行免疫。在接种后两周，通过体外IFNγELISpot试验在每个实验组中测量免疫应答，显示了当两者与疫苗共同施用时，两种经编码的佐剂在破坏T细胞对人Her2的耐受性中的作用。

实施例10：腺病毒载体编码的ICOSL与基于Ad的新抗原疫苗共同施用增强了其免疫原性(图10)。

在该实施例中，小鼠接种了编码选自MC38肿瘤模型的7种CD8T细胞新抗原的GAd疫苗，以10^8vp的剂量单独注射或与编码小鼠ICOS-L(Ad-ICOSL)的腺病毒Ad6共混合注射。免疫接种后两周，在每个实验组中通过体外IFN-γELISpot试验测量免疫应答，使用对应于疫苗载体中存在的每个新抗原序列的肽的池作为抗原。结果显示，经编码的Ad-ICOSL增强了疫苗诱导的T细胞应答。

实施例11：重新施用腺病毒载体编码的抗CTLA4增强了与抗PD1组合的GAd新抗原疫苗的抗肿瘤效力(图11)。

在已建立的CT26肿瘤小鼠模型上，采用单次施用(疫苗加Ad6-9d9，第0天)和双次施用(疫苗加Ad6-9d9，第0天；Ad6-9d9，第1天)的方案，检测了经编码的佐剂抗ctla4对GAd疫苗联合检查点抑制剂(抗PD1)抗肿瘤活性的影响。在存在抗mPD1(克隆RMP1-14BioXCell)的情况下，在第0天用编码62种CT26新抗原的GAd疫苗载体(GAd-CT26-62)治疗荷瘤小鼠，所述GAd疫苗载体单独施用或与编码抗mCTLA4的Ad6-抗CTLA4(克隆9D9 10^8vp)共同施用。第二天，一组平行的小鼠接受第二剂Ad6-抗CTLA4。结果显示，当疫苗加入编码的Ad6-9d9时，疫苗和抗PD1的抗肿瘤活性增强，在接受两剂Ad6-9d9的小鼠中观察到最佳的抗肿瘤应答率。

实施例12：在注射编码人抗CTLA4的Ad6后小鼠循环抗hCTLA4的测量(图12)。

抗-hCTLA4易普利姆玛(SEQ ID NO：2)的序列在Ad6中编码，并在体内测试以评估其在Ad6中的表达。C57Bl6小鼠以10^8vp的剂量注射Ad6-易普利姆玛。在Ad注射后随时间测量循环抗-hCTLA4的水平，显示编码的易普利姆玛的可检测和良好表达，并在Ad注射后7天观察到峰值。

实施例13：体外IFNγELISpot测定

IFN-γELISpot试验在脾的单细胞悬浮液上进行。MSIP S4510平板(Millipore，Billerica，MA)涂有10μg/ml的抗小鼠IFN-γ抗体(目录编号：CT317-C；U-CyTech)并在4℃下孵育过夜。在洗涤并用培养基封闭平板以避免背景后，将小鼠脾细胞以两种不同的细胞密度一式两份铺板，并用最终浓度为1μg/ml的单一25聚体肽或肽池刺激过夜。肽稀释剂二甲基亚砜(Sigma-Aldrich)和刀豆球蛋白A(Sigma-Aldrich)分别用作阴性和阳性对照。通过随后与生物素化的抗小鼠IFN-γ抗体(稀释：1/100；目录编号：CT 317-D；U-CyTech)，缀合的链霉亲和素-碱性磷酸酶(稀释度：1/2500；目录编号：554065；BD Biosciences)，最后用5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝1步溶液(Thermo Fisher Scientific)孵育使板显色。采用全自动酶联免疫吸附斑点分析视频分析系统，全自动板读卡器对板进行分析。ELISpot数据表示为每百万个脾细胞中的IFN-γ干细胞。如果出现以下所有情况，则认为ELISpot反应是阳性的：(i)在ConA刺激的孔中存在IFN-γ产生，(ii)在阳性孔中看到的斑点数是在空白对照孔(二甲基亚砜)中检测到的数的三倍，(iii)至少30个特异性斑点/百万个脾细胞。

实施例14：与基于腺病毒的新抗原疫苗共同施用的腺病毒载体编码的膜结合抗CTLA4增强疫苗的免疫原性。

用编码选自MC38肿瘤模型的七种CD8 T细胞新抗原的GAd疫苗(疫苗，剂量为2×10^7vp)与编码9d9抗-mCTLA4(Ad-9d9TM)，10^8vp剂量(SEQ ID NO：3)的膜结合形式的Ad6一起施用肌内接种C57Bl6小鼠。通过在SEQ ID NO：2中的9d9重链的C-末端添加跨膜结构域片段来实现膜束缚。作为阳性对照，一组小鼠接受与Ad-9d9共同施用的疫苗。如同9d9的可溶形式一样，膜结合形式也增强了疫苗免疫原性，如通过IFN-γELISpot试验所测量的(图13)。

Claims (15)

1.一种疫苗组合物，其包含：

(1)第一组一种或多于一种载体，其包含编码一种或多于一种佐剂的核酸，其中第一组一种或多于一种载体是腺病毒载体，和

(2)抗原或抗原的组合或编码所述抗原或抗原的组合的核酸或包含所述核酸的第二组一种或多于一种载体。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中第一组一种或多于一种载体是人腺病毒载体。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中人腺病毒载体选自hAd6、hAd5和hAd57，优选选自hAd6和hAd57，更优选选自hAd6。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的疫苗组合物，其中抗原或抗原的组合由不包含在第一组一种或多于一种载体中的核酸编码。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗组合物，其包含含有编码抗原或抗原的组合的核酸的第二组一种或多于一种载体，优选地其中，第二组一种或多于一种载体为腺病毒载体，优选源自非人类人猿，更优选源自黑猩猩或倭黑猩猩或大猩猩，最优选源自大猩猩。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的疫苗组合物，其中一种或多于一种佐剂选自：

a.免疫检查点分子的调节剂，优选地选自：

-肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员或B7-CD28超家族成员的激动剂，优选为CD27、CD40、OX40、GITR、CD137、CD28或ICOS的激动剂，其中优选地，激动剂是配体或激动性抗体或抗体样蛋白(例如CD40的CP-870893)；

-PD-1、PD-L1、A2AR、B7-H3(例如MGA271)、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT或VISTA的拮抗剂，其中优选地，拮抗剂是(拮抗性)抗体或抗体样蛋白；

b.细胞因子，优选IL-2、IL-1β、IL-7、IL-15、IL-18、GM-CFS或INF-γ，和/或细胞因子类似物；

c.细胞因子受体，优选CD25(IL-2α受体)；

d.干扰素(IFN)基因的激活剂，优选STING；

e.腺苷脱氨酶(ADA)或增殖物激活受体γ辅激活因子1-α(PGC-1α)；

f.多核苷酸佐剂。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗组合物，其中一种或多于一种佐剂选自OX40的激动剂、优选OX40L，ICOS的激动剂、优选ICOSL，CD40的激动剂、优选CD40L，和拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白，其中拮抗性CTLA-4特异性抗体或抗体样蛋白能够是可溶性的或能够包含跨膜结构域和ER分选信号。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的疫苗组合物，其中一种或多于一种佐剂包括跨膜结构域和ER分选信号。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的疫苗组合物，其中抗原或抗原的组合在不存在佐剂的情况下在对象中不引发免疫应答或仅引发次优的免疫应答。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的疫苗组合物，其中抗原或抗原的组合包含或组成为选自以下的一种或多于一种癌症抗原：

a.肿瘤相关抗原(TAA)，优选对已定义的肿瘤类型特异的TAA，和/或

b.癌症新抗原，优选地癌症新抗原选自氨基酸单点突变肽、移码肽、通读突变肽和剪接位点突变肽。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的疫苗组合物用于治疗或预防对象的疾病的用途，优选用于治疗增生性疾病，更优选用于治疗癌症。

12.一种疫苗组合物或疫苗试剂盒，其用于诱导针对抗原或抗原的组合的免疫应答，包含：

(1)第一组合物，其包含

编码一种或多于一种佐剂的第一核酸，或

包含所述第一核酸的第一组一种或多于一种载体，和

(2)第二组合物，其包含

抗原或抗原的组合，或

编码抗原或抗原的组合的第二核酸，或

包含所述第二核酸的第二组一种或多于一种载体；

其中

a.(1)在第一位置处对患者施用，和(2)在第二位置处对患者施用，其中第一位置在第二位置的20cm、17.5cm、15cm、12.5cm、10cm、7.5cm、5cm、2.5cm、1cm、0.5cm、0.25cm或0.1cm以内，并且第一位置的淋巴系统与第二位置的淋巴系统引流至相同的淋巴结或者其中第一位置与第二位置相同；和任选地

b.佐剂包括跨膜结构域和ER分选信号。

13.根据权利要求12所述的疫苗组合物或疫苗试剂盒，其中(1)和(2)通过肌内、皮下、皮内、腹腔内或胸膜内注射施用，其中优选地，(1)和(2)通过相同途径施用。

14.根据权利要求12和13所述的疫苗组合物或疫苗试剂盒，其中(1)和(2)在30分钟或短于30分钟、20分钟或短于20分钟、15分钟或短于15分钟、10分钟或短于10分钟、5分钟或短于5分钟、3分钟或短于3分钟或1分钟或短于1分钟的时间间隔以内施用。

15.一种疫苗接种方案，其包括第一施用步骤和第二施用步骤，其中

a.第一施用步骤包括施用根据权利要求1至14中任一项所述的疫苗组合物，和

b.第二施用步骤包括施用

(1)第一组合物，其包含

编码一种或多于一种佐剂的第一核酸，或

包含所述第一核酸的第一组一种或多于一种载体；和/或

(2)第二组合物，其包含

抗原或抗原的组合，或

编码抗原或抗原的组合的第二核酸，或

包含所述第二核酸的第二组一种或多于一种载体。