CN117903249A - 一种具有降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于活性肽制备技术领域，具体涉及一种具有降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法和应用。本发明对具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的茶蛋白水解物进行分离和表征，利用分子对接技术筛选出具有良好XO抑制作用的黄嘌呤氧化酶抑制肽，其氨基酸序列为PDEAVAYG。本发明为开发具有天然降尿酸活性的功能食品或营养补充剂、黄嘌呤氧化酶抑制剂等产品提供原料，为实现茶蛋白的高值化利用提供新的途径。

Description

一种具有降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于活性肽制备技术领域，具体涉及一种具有降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法和应用。
背景技术
高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)是一种嘌呤代谢紊乱疾病，主要是体内尿酸生成量增加或尿酸排泄不足而引起的血液中尿酸浓度过高。人体血液中过多的尿酸会导致尿酸钠结晶盐在关节的沉积，从而诱发痛风。此外，大量流行病学与临床研究表明，高尿酸血症还极易引发糖尿病、心血管疾病、慢性肾脏疾病和高血压等其他并发症，已是继高血压、高血脂和高血糖的第四“高”。所以，及时预防和治疗高尿酸血症至关重要。尿酸(Uricacid，UA)是由黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XO)催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化形成的，是人体内嘌呤代谢的产物，其中XO是嘌呤代谢途径的关键酶。目前，临床医学主要通过控制尿酸合成与促进尿酸排泄来治疗高尿酸血症，其中抑制尿酸合成的作用靶点大多数是降低XO的活性。抑制XO活性可有效减少体内尿酸的生成量，降低高尿酸血症和痛风的风险。非不索坦和别嘌呤醇是常见的XO抑制剂药物，在临床上表现出较好的降尿酸活性。但是，这些化学合成类药物会给人体带来头晕、呕吐和肝脏损伤等毒副作用。所以，寻求安全、有效、天然的XO抑制剂对治疗高尿酸血症具有重要意义。
食物来源的生物活性肽因其生物活性高、无毒副作用的特点，在预防和改善慢性病的药物研究和功能食品开发领域备受关注。近年来，从植物蛋白中发现了具有较高XO抑制活性的肽，如大米(氨基酸序列：AAAAGAKAR)、核桃粕(氨基酸序列：WPPKN和ADIYTE)和辣木叶(氨基酸序列：TSIVGNV)等。此外，从鲣鱼(氨基酸序列：ACECD)、牛乳(氨基酸序列：ALPM和LWM)、多宝鱼(氨基酸序列：WDDMEKIWHH)和金枪鱼(氨基酸序列：FH)等动物蛋白中获得的肽段也具有较好的XO抑制活性。
中国是世界上最大的茶叶生产国。随着茶饮料市场规模的不断扩大，作为加工副产物的茶渣，其生成量也出现逐年剧增趋势，但目前茶渣主要作为废弃物丢弃，并未得到有效利用。据不完全统计，中国茶加工行业每年的湿茶渣产量高达2-3亿公斤，可作为一个良好的再利用资源。茶渣中含有18-20％的粗蛋白，其氨基酸组成丰富，是优质的植物蛋白。目前，关于茶叶中活性成分的研究大多集中于水溶性活性成分的研究，而对于茶渣中茶蛋白的高值化应用研究还较少。近年来，已有关于茶蛋白生物活性肽的报道，如降压肽、降血脂肽、抗氧化肽和降血糖肽。然而，关于茶蛋白来源的降尿酸肽还未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种具备降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽。
本发明的另一目的在于提供上述黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备降尿酸产品中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具备降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽，其氨基酸序列为PDEAVAYG；
所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，包含如下步骤；
直接采用体外固相合成上述黄嘌呤氧化酶抑制肽或者以茶渣为原料，通过碱提酸沉提取、中性蛋白酶水解、纯化得到具备降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽；
所述的中性蛋白酶水解的条件优选为：在39℃、pH 7.5条件下水解3.4h；
所述的中性蛋白酶水解的底物浓度优选为2％(m/V)、酶底比优选为0.3％(m/m)；
所述的纯化包含超滤分离和液相色谱分离等步骤；
所述的超滤分离的具体操作为：
采用超滤管对茶蛋白酶解液进行分离，收集分子量<3kDa组分；
所述的液相色谱分离的具体操作为：
采用制备型反相C18玻璃柱对茶蛋白酶解液<3kDa的超滤组分进行高效液相色谱分离纯化；收集活性组分，旋转蒸发浓缩并进行冷冻干燥，得到具备降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽；
所述的液相色谱的条件优选为：流动相A：超纯水+0.1％TFA；流动相B：甲醇+0.1％TFA；进样量5mL；洗脱流速10mL/min；检测波长214nm和280nm；时间程序：0～20min 6％～25％B，20～40.00min 25％～70％ B，40～60min 70％～90％ B，以上百分比均为体积百分比；
所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备抑制黄嘌呤氧化酶产品中的应用；
所述的抑制黄嘌呤氧化酶产品可以为具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的食品或营养补充剂；
所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备降尿酸产品中的应用；
所述的降尿酸产品可以为具有降尿酸活性的药物、食品或营养补充剂；
一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，包含上述黄嘌呤氧化酶抑制肽、含有上述黄嘌呤氧化酶抑制肽的茶蛋白中性蛋白酶水解物和含有上述黄嘌呤氧化酶抑制肽的水解物中的至少一种作为活性成分；
所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂中还包含药物学上可接受的载体或辅料；
所述药学上可接受的载体或辅料包括助溶剂、保湿剂、表面活性剂、基质、乳化剂、防腐剂和溶剂等中的至少一种；
一种降尿酸药物，包含上述黄嘌呤氧化酶抑制肽、含有上述黄嘌呤氧化酶抑制肽的茶蛋白中性蛋白酶水解物和含有上述黄嘌呤氧化酶抑制肽的水解物中的至少一种作为活性成分；
所述的降尿酸药物中还包含药物学上可接受的载体或辅料；
所述药学上可接受的载体或辅料包括助溶剂、保湿剂、表面活性剂、基质、乳化剂、防腐剂和溶剂等中的至少一种；
一种营养补充剂，包含上述黄嘌呤氧化酶抑制肽、含有上述黄嘌呤氧化酶抑制肽的茶蛋白中性蛋白酶水解物和含有上述黄嘌呤氧化酶抑制肽的水解物中的至少一种作为活性组分；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明对具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的茶蛋白水解物进行分离和表征，利用分子对接技术筛选出具有良好XO抑制作用的活性肽，结合体外胃肠模拟消化研究茶蛋白XO抑制肽的生物稳定性。基于HK-2高尿酸血症细胞模型评价活性肽的降尿酸活性，并通过转录组生物技术研究活性肽在基因水平的作用机制。通过以上研究，筛选出高活性XO抑制肽。
(2)本研究基于前期工艺参数酶解制备茶蛋白水解物，随后采用超滤、RP-HPLC和HPLC-MS/MS技术对具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的茶蛋白水解物进行分离、纯化、表征鉴定，同时利用分子对接技术筛选出具有良好XO抑制作用的活性肽，并结合体外胃肠模拟消化研究茶蛋白XO抑制肽的生物稳定性；基于HK-2高尿酸血症细胞模型评价目标肽段的降尿酸活性，并通过转录组生物技术对目标肽段的降尿酸活性和作用机制进行了深入研究。结果表明，本发明获得的一个新肽段PDEAVAYG(820.3602Da)具有良好的黄嘌呤氧化酶(Xanthineoxidase，XO)抑制活性，其抑制率IC50值分别为0.09mg/mL。经过胃肠模拟消化后，PDEAVAYG被分解成新的肽段，其消化产物XO抑制活性得到增强。分子对接结果显示，传统的氢键、π-π堆积和疏水相互作用对活性肽与XO的相互作用具有重要影响。此外，在HK-2高尿酸血症细胞模型中，与模型组相比，1.0mg/mL的PDEAVAYG显著降低了40.80％的细胞尿酸水平。RNA-seq实验结果表明，PDEAVAYG可通过调控细胞NF-kappa B信号通路、PI3K-Akt信号通路和P53信号通路上的促炎因子、心血管疾病相关生长因子和尿酸排泄转运蛋白的mRNA表达，从而发挥减轻高尿酸血症的作用。
(3)本发明为开发具有天然降尿酸活性的功能食品或营养补充剂、黄嘌呤氧化酶抑制剂等产品提供原料，为实现茶蛋白的高值化利用提供新的途径。
附图说明
图1是实施例1制得的茶蛋白酶解液及超滤组分的黄嘌呤氧化酶抑制率结果分析图，其中，不同字母表示显著差异(p<0.05)。
图2是超滤组分(MW<3kDa)的高效液相色谱分离及各组分的黄嘌呤氧化酶抑制率结果分析图，其中，不同字母表示显著差异(p<0.05)。
图3是液相纯化组分的LC-MS/MS总离子电流图。
图4是实施例2中茶蛋白XO抑制肽的肽谱表征和分子对接分析图，其中，(A)：PDEAVAYG的二级质谱图；(B)：PDEAVAYG与XO(1N5X)分子对接后得到的最佳构象3D图和相互作用2D图。
图5是活性肽PDEAVAYG在体外胃肠模拟消化的稳定性和活性变化特性结果分析图，其中，(A)：PDEAVAYG经模拟胃液消化后的色谱图；(B)：PDEAVAYG经模拟胃肠液消化后的色谱图；(C)：PDEAVAYG消化前后相对黄嘌呤氧化酶抑制率；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6是活性肽PDEAVAYG的细胞毒性以及降尿酸活性结果分析图，其中，(A)：PDEAVAYG、非布索坦和别嘌呤醇对HK-2细胞的毒性作用；(B)高效液相色谱图(从上到下分别为：5种标准物质的谱图、最优模型组细胞样品的谱图、1.0mg/mL的PDEAVAYG处理组细胞样品的谱图、别嘌呤醇处理组细胞样品的谱图、非不索坦处理组细胞样品的谱图)；(C)：高尿酸血症细胞模型建立实验中不同XO添加量和酶催化反应时间对细胞尿酸含量的影响；(D)：PDEAVAYG、非布索坦和别嘌呤醇在高尿酸血症细胞模型中的降尿酸活性，不同字母表示显著差异(p<0.05)。
图7是转录组学技术分析活性肽PDEAVAYG缓解细胞高尿酸血症在基因水平的作用机制结果分析图，其中，(A)：样本相关性热图；(B)：火山图，图中右边深灰色部分代表显著上调基因，左边浅灰色部分代表显著下调基因，中间黑色部分代表无显著差异的基因。
图8是GO富集和KEGG路径富集结果分析图，其中，(A)、(B)、(C)：BP、CC、MF中排名前10位的GO项富集条状图，纵轴为GO项，横轴为基因数；(D)：差异表达基因KEGG富集通路排名前20位的气泡图，纵坐标表示通路名称，横坐标为富集因子，圆点大小表示KEGG通路中差异基因的数量。
图9是qRT-PCR验证差异基因的相对表达量结果分析图，其中，(A)：SGK2；(B)：THBS1；(C)：CXCL2；(D)：IL-6；(E)：VEGFA；(F)：PDGFA；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中涉及的生物材料与化学试剂：中性蛋白酶(1×105U/g)，南宁庞博生物工程有限公司；黄嘌呤氧化酶(XO)，北京索莱宝科技有限公司；非布索坦、别嘌呤醇、黄嘌呤、尿酸、腺苷、次黄嘌呤、肌苷、噻唑兰(MTT)、DMSO，上海麦克林生化科技有限公司；HK-2细胞，购自中国科学院细胞库；RPMI 1640培养基、胎牛血清、双抗(青霉素/链霉素)，美国Gibco公司；乙腈(色谱级)和磷酸二氢钾(色谱级)，天津市科密欧化学试剂有限公司；戊烷磺酸钠，上海瑞昂生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
统计分析：所有实验数据均以平均值±标准差表示。Origin 2018用于绘制数据图形。使用SPSS26.0软件计算IC50值，并通过方差分析法(ANOVA)和Duncan法分析数据之间的差异。P<0.05，差异具有统计学意义。
实施例1茶蛋白黄嘌呤氧化酶(XO)抑制肽的分离纯化
一、实验方法
1.茶蛋白酶解液的制备
以英红九号红茶渣为原料，参照参考文献(叶灏铎,管晓盛,马凤,等.英红九号茶蛋白降尿酸肽的酶解制备及不同分子量组分的活性对比[J].现代食品科技,2023,39(3):147-155.10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.3.0401.)制备茶蛋白粗提物和茶蛋白酶解液，其中，酶解工艺为：利用中性蛋白酶在底物浓度2％(m/V)、酶底比0.3％(m/m)、39℃、pH7.5、3.4h的条件下对蛋白粗提物进行水解；水解结束后，95℃加热10min，冷却至室温，4000r/min离心20min，收集上清液(即为茶蛋白酶解液)，并取部分上清液冻干；上清液和冻干粉均保存在-20℃条件下备用。
2.茶蛋白XO抑制肽的纯化富集
(1)超滤分离
超滤是一种在实验室和商业规模上普遍用于分离、纯化和浓缩蛋白或肽的膜分离技术。将步骤1制得的茶蛋白酶解液经3kDa超滤管(Merck Millipore,Billerica，MA，USA)分离，得到>3kDa和<3kDa两个超滤组分。冷冻干燥后测定其黄嘌呤氧化酶抑制率。
(2)RP-HPLC分离
采用制备型反相C18玻璃柱(30mm×250mm，15μm)对茶蛋白酶解液<3kDa超滤组分进行高效液相色谱分离；其中，流动相A：超纯水+0.1％TFA；流动相B：甲醇+0.1％TFA；进样量5mL；洗脱流速10mL/min；检测波长214nm和280nm；时间程序：0～20min(6％～25％B)，20～40.00min(25％～70％ B)，40～60min(70％～90％ B)，以上百分比均为体积百分比。洗脱结束后，收集每个吸收峰组分，蒸发浓缩，冷冻干燥。测定每个组分(1mg/mL)的XO抑制率，筛选出活性最强的组分进行质谱结构鉴定。
3.XO抑制活性的测定
参照团队前期的研究方法(Chen Binbin,Xia Zhen,Ye Haoduo,et al.Responsesurface optimization of selenium-enriched Moringa oleifera seed peptides withantioxidant,ACEI and XOI activities[J].Journal of Food Measurement andCharacterization,2023,17(2):1289-1299.https://doi.org/10.1007/s11694-022-01690-x.)，通过测定酶促反应中尿酸的生成率，分析样品对XO的抑制活性，并略有修改。具体方法为：所有试剂和样品溶液均采用pH 7.4的磷酸盐缓冲液制备。将50μL待测样品及50μL浓度为0.02U/mL的XO依次加入96孔板中，再加入50μL0.48mmol/L的黄嘌呤溶液。利用缓冲液代替样品作为空白对照组。加样结束，将96孔板振荡30s，25℃反应25min后，测定溶液290nm处的吸光值。
式中：A1为添加样品溶液的吸光值；A2是样品溶液不加XO的吸光值；A3为用缓冲液代替样品溶液的吸光值；A4为用缓冲液代替XO和样品溶液的吸光值。
将活性肽冻干粉配制成浓度梯度溶液，测定其XO抑制率，利用SPSS26.0软件对数据进行拟合，通过回归方程求出XO抑制肽的半抑制浓度(IC50)。
二、结果分析
前期的研究已确定了制备茶蛋白酶解液的工艺条件(叶灏铎,管晓盛,马凤,等.英红九号茶蛋白降尿酸肽的酶解制备及不同分子量组分的活性对比[J].现代食品科技,2023,39(3):147-155.10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.3.0401.)。肽段的分子量大小对其生物活性至关重要。茶蛋白酶解液不同超滤组分的XO抑制活性结果见图1。在1mg/mL的质量浓度下，<3kDa(60.56％)超滤组分比茶蛋白酶解液(54.24％)和>3kDa(45.89％)超滤组分表现出更好的黄嘌呤氧化酶抑制活性。因此，选择<3kDa组分进行下一步纯化。
利用反相C18柱对<3kDa超滤组分进行RP-HPLC色谱分离，得到四个纯化组分，分别被命名为F1、F2、F3、F4(图2)。经浓缩和冷冻干燥后，在1.0mg/mL的浓度下测定各组分的黄嘌呤氧化酶抑制率。如图2所示，F2(88.71％)和F4(89.4％)的XO抑制率显著高于F1(18.96％)和F3(36.28％)，但F2和F4两个组分的活性无显著性差异。为了不错过可能存在的高活性肽组分，本发明将F2和F4进行混合。由表1可知，与茶蛋白酶解液(IC50＝0.72mg/mL)和<3kDa超滤组分(IC50＝0.41mg/mL)相比，该混合物F2+F4(IC50＝0.29mg/mL)表现出更强的XO抑制活性。因此，后续本发明将对F2+F4混合组分的活性肽组成进行鉴定。
表1不同组分黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值
实施例2茶蛋白XO抑制肽的肽谱表征及分子对接模拟
一、实验方法
1.茶蛋白XO抑制肽结构鉴定
茶蛋白XO抑制肽纯化高活性组分(混合物F2+F4)经C18除盐柱(Acclaim PepMap100，75μm×2cm)除盐后，利用配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS进行活性肽氨基酸序列的分析。整套系统为串联EASY-nanoLC1200的Q ExactiveTMPlus质谱仪(Thermo FisherScientific，MA，USA)。共上样5μL(分析柱：Acclaim PepMap C18，75μm×25cm)，以60min的梯度分离样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从2％的B相(80％乙腈+0.1％甲酸)开始，在47min以非线性梯度升高到35％，1min内升高到100％，维持12min，以上百分比均为体积百分比。质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：(1)MS：扫描范围(m/z)：200-1800；分辨率：70,000；AGCtarget：3e6；最大注入时间：50ms；(2)HCD-MS/MS：分辨率：17,500；AGC target：1e5；最大注入时间：45ms；碰撞能量：28；动态排除时间：30s。串联质谱图经过PEAKS Studio version10.6(Bioinformatics Solutions Inc.,Waterloo,Canada)分析。PEAKSDB对uniprot-Camellia_sinensis(version 202012,30052entries)数据库搜库，设置none酶解。蛋白卡值为：-10lgP≥0，至少含1unique peptide；肽段卡值为：-10lgP≥20。
2.茶蛋白XO抑制肽分子对接模拟分析
参照Zhao等人的方法(Zhao Qiang,Meng Ying,Liu Juncai,et al.Separation,identification and docking analysis of xanthine oxidase inhibitory peptidesfrom pacific cod bone-flesh mixture[J].LWT,2022,167:113862.https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.113862.)，利用分子对接技术研究XO受体蛋白与活性肽的相互作用。在RCSB蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)中下载XO(PDBID:1N5X)的X射线晶体结构，并在Pymol中去掉1N5X中的抑制配体TEI-6720和对称性B链，保存为PDB格式。活性肽配体通过Marvinsketch软件绘制，并以最低能量构象保存PDB格式。随后利用Autodock Tools 1.5.6软件打开处理后的PDB受体蛋白和配体，完成去水加氢修饰，并对配体进行gasteiger电荷的计算和旋转键的设置，最后均保存为PDBQT格式。在AutoDock Vina软件中进行受体与配体的对接，对接中心坐标为96,54,39(x,y,z)，盒子大小为40×40×40，网格间距为其他参数选择软件默认值。最后，对接的结合能可作为活性肽与受体蛋白结构结合的预测亲和力(以KJ/mol计算)，选取结合能最小的构象作为最佳结合位点，并用Discovery Studio 2017进行对接结果的可视化分析。
二、结果分析
1.茶蛋白XO抑制肽的肽谱表征
通过LC-MS/MS鉴定高活性组分(F2+F4)的活性肽组成和氨基酸序列，总离子流图见图3。以-10lg P＞35.0和肽链长度≤10为筛选标准，共得到多个肽段。其中，肽段PDEAVAYG的二级质谱图见图4(A)。利用在线工具Toxinpred(http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/和AllerTOP(https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/)对该活性肽分别进行毒性和致敏性预测，发现该肽段没有毒性和致敏性(表2)。分子对接可以用来预测结构配体和受体之间的相互作用，对接结合能值较低的活性肽更有可能与XO对接，所形成的结合物结构更稳定。使用Autodock vina软件将肽段与受体蛋白进行分子对接。由表2可知，该肽的对接结合能较低，说明其能较好地与XO进行对接结合。
由表1可知，肽PDEAVAYG(820.3602Da，IC50＝0.09mg/mL)的IC50值低于茶蛋白酶解液(IC50＝0.72mg/mL)、＞3kDa(IC50＝1.79mg/mL)、＜3kDa(IC50＝0.41mg/mL)和液相纯化组分F2+F4(IC50＝0.29mg/mL)。这说明利用分子对接技术筛选高活性XO抑制肽是可行的。经文献检索，我们发现PDEAVAYG的肽序列未被研究报道，是首次被发现并证明具有生物活性的新型肽段。值得注意的是，肽PDEAVAYG在N端具有疏水性氨基酸，证实了疏水性氨基酸在XO抑制肽中起着重要作用。同时，与来自核桃粕蛋白的WPPKN(IC50＝17.75mg/mL)和ADIYTE(IC50＝19.01mg/mL)相比，肽PDEAVAYG表现出更强的XO抑制活性。经在线计算机工具预测后，肽PDEAVAYG为无毒、无致敏性，这可能意味着生物活性肽比药物别嘌呤醇更安全。
表2肽PDEAVAYG的对接结合能及活性肽特性
2.茶蛋白XO抑制肽的分子对接模拟
分子对接可以用于预测底物和靶蛋白质之间的相互作用，以及确定小化合物和生物靶分子之间的结合亲和力。据报道，XO是嘌呤代谢的关键酶，其钼酸盐结构域是催化的关键活性位点，含有13个影响活性的关键氨基酸残基(G1u1261、Phe649、Thr1010、Arg880、Phe914、Phe1009、Asn768、Lys771、Val1011、Glu802、Ser876、Leu783、Leu1014)。为了预测活性肽对XO的抑制机制，通过分子对接和可视化分析活性肽与XO之间的相互作用。分子对接结果(图4(B))表明，PDEAVAYG的N端、C端均在XO疏水通道的表面入口处，可阻止底物进入XO的活性中心，从而有效发挥XO抑制活性。如图4(B)所示，肽PDEAVAYG与XO的Glu879、Ser876和Thr1010形成了6个常规氢键，与Ala1149通过碳-氢键结合。此外，Leu648和Phe649与肽PDEAVAYG形成了Alkyl、Pi-Alkyl和Pi-sigma等疏水相互作用。值得注意的是，在PDEAVAYG与XO的Phe914、Phe1009之间观察到了π-π堆积。据报道，许多配体抑制剂(槲皮素、非不司他、别嘌呤醇)均在XO晶体结构中与Phe914形成π-π堆积，且此作用力已被认为是黄酮类化合物表现出XO抑制活性的必需特性。这可能是肽PDEAVAYG具有更好的XO抑制活性的原因。根据以上结果，我们认为氢键、π-π堆积和疏水相互作用对活性肽和XO的结合至关重要。
实施例3
一、实验方法
1.固相合成
经分子对接筛选出的黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG由南京杰肽生物科技有限公司合成，经高效液相色谱(HPLC)分析，纯度大于98％。
2.单体肽的胃肠道稳定性
体外胃肠消化模拟研究参照团队前期的实验方法(Liao W,Chen H,Jin W,etal.Three Newly Isolated Calcium-Chelating Peptides from Tilapia Bone CollagenHydrolysate Enhance Calcium Absorption Activity in Intestinal Caco-2 Cells[J].Journal of agricultural and food chemistry,2020,68(7):2091-2098.https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b07602.)，并略作修改。具体方法如下：
将40mg胃蛋白酶溶于1mL 0.1mol/L HCl中，调节pH为2.0，制备模拟胃液；将60mg胆盐和10mg胰酶加入5mL 0.1mol/L NaHCO3中，调节pH为7.5，制备模拟肠液。将黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG以1.0mg/mL的浓度溶解于模拟胃液中，37℃孵育1h，反应结束后在沸水浴中加热10min终止反应，即为黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG经单一模拟胃液消化后的产物。之后，在经模拟胃液消化后的溶液中加入3倍体积的模拟肠液，用1mol/LNaOH调pH至7.5，37℃孵育2h，反应结束后在沸水浴中加热10min终止反应，即为黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG经完整胃肠模拟消化后的产物。同时，以溶解于超纯水的黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG作为阳性对照，模拟胃液和模拟肠液作为阴性对照。消化结束后，对黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG的生物稳定性和消化前后的活性变化进行评价。
采用Ultimate LP-C18色谱柱(4.6×250mm)对消化样品进行HPLC分析。色谱条件：流动相A为超纯水+0.1％TFA；流动相B为乙腈+0.1％TFA；洗脱流速为1mL/min；检测波长为214nm和280nm；时间程序为0～20min(5％～25％ B)，20～40min(25％～70％ B)，40～60min(70％～90％ B)，以上百分比均为体积百分比。
3.细胞实验
3.1HK-2细胞培养和活力测定
HK-2细胞培养参考HOU等人(Hou Chuanli,Sha Wangqian,Li Yujuan,etal.Amodified xanthine oxidase cell model for screening of antihyperuricemicfunctional compounds[J].Food&Function,2022,13(20):10546-10557.https://doi.org/10.1039/D2FO00297C.)的方法并略作修改。具体方法如下：
(1)将HK-2细胞接种于添加10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640完全培养基中，置于含5％ CO2和37℃培养箱中培养，每2d换一次液，当细胞生长密度达80％时进行传代培养。
(2)将100μL细胞悬液(5×104cells/mL)接种于96孔板中，贴壁培养24h后弃去培养液。空白对照组加入100μLRPMI 1640完全培养基，黄嘌呤氧化酶抑制肽组加入100μL样品溶液(样品浓度为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5和1.0mg/mL)，阳性药物组加入100μL非布索坦和别嘌呤醇(样品浓度为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5和1.0mg/mL)。细胞继续培养24h后，弃去培养液，用PBS清洗两次，每孔加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液，避光孵育4h。弃去MTT溶液，加入100μL DMSO，震荡10min使蓝紫色结晶全部溶解后，酶标仪检测490nm处的吸光度值。
式中，At为试验组的吸光度值，A0为空白对照组的吸光度值。
3.2高尿酸血症细胞模型的建立
基于HOU(Hou Chuanli,Sha Wangqian,Li Yujuan,et al.Amodified xanthineoxidase cell model for screening of antihyperuricemic functional compounds[J].Food&Function,2022,13(20):10546-10557.https://doi.org/10.1039/D2FO00297C.)等人的构建方法并进行优化。选择腺苷作为刺激细胞合成尿酸前体物质的诱导物，进一步结合外源性添加的XO进行酶催化反应，构建HK-2高尿酸血症细胞模型，并对XO的添加量和酶催化反应时间进行优化。因为胎牛血清成分复杂，其中可能含有一些可以将腺苷氧化为肌苷和次黄嘌呤的酶，所以将腺苷溶解在不添加胎牛血清的RPMI 1640基础培养基中，用于细胞模型的构建。具体方法如下：
将1.0mL HK-2细胞悬液(1×105cells/mL)接种于24孔板中，培养48h后，经PBS清洗后随机分成空白组和模型组：(1)空白组：细胞在RPMI 1640基础培养基中继续培养；(2)模型组：细胞在含有2.5mmol/L腺苷的RPMI 1640基础培养基中培养30h，之后向孔中加入XO，使其最终添加量为0.005U/mL和0.01U/mL。接着，继续培养，待XO反应一定时间(10h、12h、14h和16h)后，用HPLC法对细胞上清液中的尿酸含量进行测定。定量高效液相色谱分离采用Ultimate LP-C18色谱柱(4.6×250mm)，光电二极管阵列检测器(PDA)检测，波长为254nm。流动相A：0.2mol/L KH2PO4、0.52mmol/L戊烷磺酸钠，pH4.0；流动相B：0.2mol/LKH2PO4、0.52mmol/L戊烷磺酸钠、10％乙腈，pH3.7；流速1mL/min，检测波长254nm；洗脱梯度为0-6min(0％ B)，6-14min(0％-70％ B)，14-17.4min(70％ B)，17.4-17.5min(70％-0％B)，17.5-25min(0％ B)；以上百分比均为体积百分比。将尿酸标准品配成梯度溶液，利用HPLC法制作尿酸含量相关的标准曲线：Y＝0.039X+0.2528，R2＝0.9996。
3.3黄嘌呤氧化酶抑制肽在细胞水平上的活性评价
将1mL HK-2细胞(1×105cells/mL)接种到24孔板中，培养24h，经PBS清洗后随机分成4组：(1)空白组：细胞在RPMI 1640完全培养基中继续培养；(2)模型组：细胞在RPMI1640完全培养基中继续培养；(3)阳性药物组：细胞分别在含有0.05mg/mL非布索坦和别嘌呤醇的完全培养基中继续培养；(4)PDEAVAYG组：细胞分别在含有低剂量(0.25mg/mL)、中剂量(0.5mg/mL)和高剂量(1.0mg/mL)PDEAVAYG的完全培养基中继续培养；所有组别的细胞培养24h后，弃去上清液。除空白组细胞在RPMI 1640基础培养基中继续培养外，其他组均在含有腺苷(2.5mmol/L)的RPMI 1640基础培养基中继续培养30h，之后均加入外源性XO进行酶催化反应，反应一定时间后收集各组别细胞上清液。细胞尿酸水平利用HPLC法进行检测，并从细胞裂解物中提取总RNA。
4.黄嘌呤氧化酶抑制肽的降尿酸活性机制研究
4.1RNA-seq与数据分析
为探究活性肽在HK-2细胞水平上的降尿酸机制，我们对模型组和高浓度PDEAVAYG处理组细胞的基因表达差异进行分析。待外源性添加的XO酶反应一定时间后，利用TRIzol试剂盒提取总RNA。使用Nanodrop2000(赛默飞，美国)对RNA进行浓度检测，并用Agient2100，LabChip GX生物分析仪(铂金埃尔默，美国)对RNA完整性进行检测。然后根据制造商的说明使用VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit，NR604-02构建文库。转录组的测序分析由擎科生物科技有限公司(北京，中国)进行。
对于构建好的文库使用illumina novaseq6000平台(San Diego，美国)进行上机测序。差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)分析使用DESeq R包(RNA-Seq数据在基因水平上的差异表达-DESeq包)，P值<0.05和差异倍数(Fold Change)≥2作为筛选标准。采用聚类分析方法，将具有相同或相似表达模式的基因进行聚类分析。利用基于超几何检验，分别对DEGs进行GO富集和KEGG路径富集分析。
4.2qRT-PCR验证
提取细胞总RNA，并测定浓度，按照生产厂家的说明，用反转录试剂盒(TransGenBiotech,China)将mRNA反转录成cDNA。按照通用荧光定量PCR试剂盒(Biosharp，China)提供的方法，以GAPDH作为内部参照，对CXCL2、IL-6、VEGFA、PDGFA、SGK2、THBS1基因的mRNA表达水平进行定量。通过2-ΔΔCT方法计算验证基因的归一化表达。
二、结果分析
1.体外模拟胃肠消化
为了探究单体肽在胃环境和肠环境中消化前后的稳定性和活性变化特性，我们利用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行了体外模拟消化，肽的稳定性和消化前后活性变化结果见图5。PDEAVAYG在经单一胃液消化后的稳定性为零，并在5.15min、6.24min、13.45min和14.54min处出现了四个新的吸收峰，但这些新的吸收峰在经进一步的肠液消化后消失，继而又在9.2min和17.2min处出现了两个新的吸收峰(图5(A)和5(B))。这说明该活性肽的肽键很容易受到胃肠消化的影响，发生肽段的分解。
由图5(C)可知，虽然PDEAVAYG稳定性差，但经单一胃消化和完整胃肠消化后，其相对XO抑制率均增强，这可能是因为PDEAVAYG在消化过程中被分解成活性更高的短肽或分解产物间发生了活性协同作用。因此，在之后的研究中，我们将进一步研究PDEAVAYG在体内转运吸收的机制，探究其活性与肽段变化之间的关系。
2.黄嘌呤氧化酶抑制肽对HK-2细胞的影响
2.1黄嘌呤氧化酶抑制肽的细胞毒性
为了探究不同浓度黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG对HK-2细胞活力的影响，以非布索坦和别嘌呤醇为阳性药物，利用MTT法测定HK-2细胞活力。如图6(A)所示，在0.025-1.0mg/mL的浓度范围内，经PDEAVAYG处理后的HK-2细胞活力均超过100％，表明该黄嘌呤氧化酶抑制肽对HK-2细胞没有产生毒副作用。在0.025-0.1mg/mL浓度范围内，经非布索坦和别嘌呤醇处理后的HK-2细胞活性均高于98％。然而，当浓度升高至0.25-1.0mg/mL时，HK-2细胞活性下降至低于60％，这表明在此浓度范围内阳性药物对细胞产生了有害副作用。根据以上结果，黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG分为低剂量(0.25mg/mL)、中剂量(0.5mg/mL)和高剂量(1.0mg/mL)组进行后续实验，而阳性药物组的非布索坦和别嘌呤醇则均选用0.05mg/mL作为最适样品浓度。
2.2利用高尿酸血症细胞模型评价活性肽的降尿酸活性
据报道，高尿酸血症成年男性血尿酸水平≥420μmol/L，女性≥360μmol/L(SheDunmin,Wang Yongliang,Liu Jing,et al.Changes in the prevalence ofhyperuricemia in clients of health examination in Eastern China,2009to 2019[J].BMC Endocrine Disorders,2022,22(1):1-11.https://doi.org/10.1186/s12902-022-01118-Z.)，故以细胞中尿酸水平≥420μmol/L为建模标准，用HPLC法测定细胞样品的尿酸含量。
由图6(B)可知，该HPLC分离分析程序可以有效地将尿酸及其前体物质(腺苷、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤)进行分离，故该方法可以准确测定细胞中的尿酸含量。由图6(C)可知，外源性XO的添加量和酶催化反应时间会显著影响细胞中的尿酸浓度。当XO添加量为0.005U/mL时，酶催化反应时间从10h延长至16h，均未使细胞尿酸浓度超过420μmol/L。然而，当XO添加量增加至0.01U/mL时，在经过12h的酶催化反应后,细胞尿酸浓度达到422.36μmol/L；且继续反应至14h后，细胞尿酸浓度可达486.35μmol/L，并趋于稳定。因此，确定外源性XO的添加量为0.01U/mL，并以酶催化反应持续14h作为构建高尿酸血症细胞模型的诱导条件。
根据图6(D)的结果显示，在该诱导条件下，模型组细胞的尿酸浓度达到了486.35μmol/L，显著高于空白对照组的4.08μmol/L。这表明通过利用腺苷结合外源性XO构建高尿酸血症细胞模型是可行的。
不同浓度黄嘌呤氧化酶抑制肽处理后的高尿酸血症细胞尿酸水平变化趋势见图6(D)。阳性药物组的细胞尿酸水平均显著低于模型组，其中经非不索坦和别嘌呤醇处理后的细胞尿酸水平分别为4.29μmol/L和322.48μmol/L。这表明该高尿酸血症细胞模型可以用于有效筛选具有降尿酸活性的物质。经不同浓度的黄嘌呤氧化酶抑制肽PDEAVAYG处理后，细胞尿酸水平较模型组显著降低，并呈现出明显的剂量依赖性。在高剂量1.0mg/mL时，较模型组相比，PDEAVAYG处理组的细胞尿酸水平降低了40.8％。尽管活性肽的降尿酸活性不及阳性药物非不索坦显著，但低剂量组的PDEAVAYG表现出与阳性药物别嘌呤醇相当的降尿酸活性，这表明PDEAVAYG对细胞层面的高尿酸血症具有很好的活性功效。
3.基于RNA-Seq定量转录组技术研究降尿酸机制
经过体外化学评价和细胞实验活性评价分析，我们确定茶蛋白来源的黄嘌呤氧化酶抑制肽具有显著的降尿酸活性。在基于分子对接模拟分析降尿酸肽与受体蛋白作用力和作用位点的基础上，本部分将采用RNA-Seq定量转录组技术对其降尿酸活性机制做进一步深入研究。以肽PDEAVAYG(1mg/mL)为研究对象，研究其对HK-2细胞中相关基因表达和代谢通路的影响。
3.1DEGs分析
本研究中，样本相关性热图(图7(A))显示，组内样品间的相关系数的平方(R2)均接近1，表明样品之间表达模式的相似度较高，相似性较好。PDEAVAYG样品组与模型组相比，共筛选出712个差异表达基因，其中290个基因表达上调，422个基因表达下调。DEGs用火山图模式表现详见图7(B)。
3.2GO功能富集分析
GO主要是全面描述生物体中基因和基因产物的属性。涵盖三个方面，基因的生物过程(Biological Process，BP)、细胞成分(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)。其中，有132项显著富集在生物过程(包含87个差异基因富集)、13项显著富集在细胞成分(包含40个差异基因富集)、25项显著富集在分子功能(包含42个差异基因富集)。BP、CC和MF功能部分中显著性排名前10的GO项分别见图8(A)、图8(B)和图8(C)。通过比较，在生物过程中富集了较大比例的GO功能项和差异基因，其中细胞凋亡过程(apoptotic process)是最显著富集的生物过程。这表明活性肽PDEAVAYG对HK-2细胞的生物过程有着重要的影响。
3.3相关KEGG通路的差异表达基因
高尿酸血症可能引起炎症反应和肾小管细胞损伤，从而导致免疫细胞和相关细胞因子的调节出现异常。KEGG是整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库。为了确定差异性表达基因中参与的信号传导通路，在不同的KEGG通路中对差异表达基因进行富集。本研究共富集得到283条通路，显著性前20的通路见图8(D)。在前20个富集通路中，存在与人类疾病相关的途径，包括膀胱癌、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、NF-kappa B信号通路、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、色氨酸代谢等。
研究报道，NF-kappa B信号通路是一种典型的促炎信号通路，在免疫和应答中扮演重要角色，其中调节的促炎因子包括细胞因子、趋化因子和粘附分子。NF-kappa B信号通路已被证明与肾脏疾病的免疫炎症、凋亡和纤维化密切相关。在高血清尿酸水平下，肾脏细胞炎症反应的分子机制归因于NF-kappa B信号传导和NLRP3炎症小体激活。本实验中，PDEAVAYG显著下调了NF-kappa B信号通路上CXCL2基因的mRNA。CXCL2被称为巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)，是NF-kappa B信号通路上的特征促炎因子。
PI3K-Akt信号通路作为重要的细胞信号传导途径，富集了最多数量的差异表达基因，表明该信号通路对活性肽降低HK-2细胞尿酸水平的活性机制具有重要影响。此外，NF-kappa B是PI3K/AKT通路的下游信号，两个通路相互影响。研究表明，通过阻断PI3K/AKT/NF-kappa B信号通路，可以减少炎症因子的表达和细胞外基质的沉积。结果表明，经肽PDEAVAYG处理后，PI3K/Akt信号通路上IL6、VEGFA、PDGFA基因mRNA显著下调，SGK2和THBS1基因mRNA显著上调。研究表明，炎症和高尿酸血症可以通过抑制炎症因子的转录和抑制促炎细胞因子的激活来缓解。促炎介质IL-6常作为炎症指标，是高尿酸血症的病理特征。已有研究报道，活性肽AEAQMWR可通过抑制促炎因子(IL-6、TNF-α)的基因表达，从而在HK-2细胞模型中表现出降尿酸活性。VEGFA为血管内皮生长因子A，研究发现该生长因子的mRNA表达会在因高尿酸引起的急性肾损伤中显著增加，说明它可能是治疗高尿酸血症的核心基因。此外，尿酸可增强血小板衍生生长因子A链mRNA(PDGFA)的过度表达，促进血管平滑肌细胞的增殖，从而导致动脉粥硬化。这可能是高尿酸易引发血管动脉疾病的原因。所以，PDGFA基因mRNA显著下调可能是肽PDEAVAYG对HK-2细胞的积极影响。SGK2是血清和糖皮质激素诱导激酶(SGK)的一种亚型，具有调节膜蛋白的功能。OAT1是一种有机阴离子转运体，在人体中可起到尿酸排泄转运体的作用，促进血液中的尿酸向肾小管的转运。研究发现，SGK2可通过增强OAT1转运体的稳定性来刺激OAT1转运活性和总蛋白表达，进而有利于机体内尿酸的排泄。所以，上调机体内SGK2基因mRNA的表达可能提高OAT1转运体的活性，促进尿酸的排泄。
此外，p53信号通路是一个与细胞凋亡、细胞周期调控和DNA修复等密切相关的关键通路。结果发现，活性肽PDEAVAYG可以上调p53信号通路和PI3K/Akt信号通路上THBS1基因的mRNA。THBS1是血栓反应蛋白-1，是一种存在于细胞外基质中的糖蛋白，它能够桥接细胞相互作用并影响炎症反应。THBS1稳定表达所引起的炎症消退有利于急性痛风患者的治疗。
4.qRT-PCR验证DEGs分析
根据KEGG通路分析，我们发现PDEAVAYG可能通过调控NF-kappa B信号通路、PI3K-Akt信号通路和P53信号通路上相关基因的mRNA表达，从而发挥生物活性。利用qRT-PCR技术对DEGs的mRNA表达进行验证，包括4个下调基因(CXCL2、IL6、VEGFA、PDGFA)和2个上调基因(SGK2和THBS1)。差异基因mRNA的相对表达量见图9。结果表明，qRT-PCR与RNA-seq分析结果一致。与模型组相比，活性肽PDEAVAYG可下调基因CXCL2、IL6、VEGFA、PDGFA的mRNA表达量，分别降低了4.98、2.19、4.38、4.37倍。同时，可上调基因SGK2、THBS1的mRNA表达量，分别较模型组提高了2.72和1.16倍。DEGs的验证结果表明，PDEAVAYG可能通过调控促炎因子、心血管疾病相关生长因子和尿酸排泄转运蛋白的表达，从而在高尿酸血症细胞模型中发挥降低细胞尿酸水平和细胞炎症反应的作用。这意味着肽PDEAVAYG可能通过降低细胞促炎因子的水平来抑制XO的酶活性。
本发明分离鉴定了具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的茶蛋白水解物，并通过分子对接技术筛选出了一种新型高活性XO抑制肽PDEAVAYG，该活性肽均能进入XO的疏水通道，具有在分子水平上与XO活性位点结合的潜力，能有效阻止底物与XO的结合。体外模拟胃肠消化结果表明，经消化后，PDEAVAYG被完全分解，其消化产物XO抑制活性显著增强。同时，在HK-2高尿酸血症细胞模型中，该活性肽表现出良好的降尿酸活性。通过转录组学技术分析，我们发现活性肽PDEAVAYG可能通过调控HK-2细胞NF-kappa B信号通路、PI3K-Akt信号通路和P53信号通路上与高尿酸血症相关的基因mRNA表达，从而缓解细胞高尿酸血症。本发明的研究结果将为开发新型天然黄嘌呤氧化酶抑制剂和茶蛋白的高值利用提供新思路和理论参考。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具备降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽，其特征在于其氨基酸序列为PDEAVAYG。
2.权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的准备方法，其特征在于包含如下步骤：
直接采用体外固相合成权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽或者以茶渣为原料，通过碱提酸沉提取、中性蛋白酶水解、纯化得到权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽。
3.根据权利要求2所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的准备方法，其特征在于：
所述的纯化包含超滤分离和液相色谱分离步骤。
4.根据权利要求3所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的准备方法，其特征在于：
所述的超滤分离的具体操作为：
采用超滤管对茶蛋白酶解液进行分离，收集分子量<3kDa组分；
所述的液相色谱分离的具体操作为：
采用制备型反相C18玻璃柱对茶蛋白酶解液<3kDa的超滤组分进行高效液相色谱分离纯化；收集活性组分，旋转蒸发浓缩并进行冷冻干燥，得到具备降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽。
5.权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备抑制黄嘌呤氧化酶产品中的应用。
6.权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备降尿酸产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述的降尿酸产品为具有降尿酸活性的药物、食品或营养补充剂。
8.一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，其特征在于包含权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽、含有权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的茶蛋白中性蛋白酶水解物和含有权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的水解物中的至少一种作为活性成分。
9.一种降尿酸药物，其特征在于包含权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽、含有权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的茶蛋白中性蛋白酶水解物和含有权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的水解物中的至少一种作为活性成分。
10.一种营养补充剂，其特征在于包含权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽、含有权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的茶蛋白中性蛋白酶水解物和含有权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的水解物中的至少一种作为活性组分。
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