CN117899950A - 一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片及其制备方法，属于分析仪器和自动控制领域，包括层叠设置的第一基底层和第二基底层；第一基底层朝向第二基底层的面上设置有微流控通道，微流控通道用于聚焦并分选目标细胞；第二基底层上设置有多个开孔和压电换能器；其中，第一基底层和第二基底层的材料为刚性环氧树脂，第一基底层和第二基底层之间通过环氧‑多氨基‑环氧化学键键合连接。本申请公开的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，可以耐受高压，消除高流速下的通道变形，并维持管道结构的完整性和稳定性，以增强细胞聚焦性能，提升细胞检测灵敏度和分选通量。

Description

一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片及其制备方法

技术领域

本申请实施例涉及分析仪器和自动控制技术领域，涉及微流控芯片内的高压、高流速应用，具体而言，涉及一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片及其制备方法。

背景技术

高通量的单细胞多参数分析和分选是免疫学、细菌学、癌症和分子生物学领域的重要研究工具。它不仅对疾病诊断和监测具有重要意义，也对干细胞、单个B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、基因编辑免疫细胞的高纯度分选至关重要。在过去几十年中，基于流式细胞术的荧光激发细胞分选(FACS)已得到迅速发展和广泛应用，然而台式FACS系统中气溶胶所带来的交叉污染(尤其是在处理感染性生物样本或出于治疗目的进行分选时)，以及潜在的生物危害，使得商业化流式细胞分选仪需要严格的操作培训、甚至配备专职操作员。因此，开发管路封闭、一次性使用的细胞分选芯片，有望替代可重复使用的流式细胞流动池。

最近的研究者采用微流控FACS(μ-FACS)技术，来实现可抛弃和无菌化设计，并自动化、集成化和试剂消耗量小方面具有新的优势。其中包括介电电泳(需使用专利表面活性剂)、电渗流、表面声波(SAW)、脉冲激光触发的流体动力、热可逆凝胶聚合物、蒸汽泡，气动或芯片外电磁阀等方法。尽管这些相关研究有效，但在细胞存活率、分析流速和分选通量方面也存在局限性。此外的被动高通量方法，例如物理过滤、离心淘洗、惯性力和声电泳，不可避免地取决于不同细胞群的物理特性(例如大小、密度、变形性、声学对比度)，在结合抗体或表达蛋白等细胞的筛选上不够适用。

相比之下，压电式驱动已广泛用于喷墨打印的按需驱动，并逐渐应用于生物打印和荧光激发细胞分选(FACS)。尽管如此，目前的压电式细胞分选的通量通常为每秒1000个颗粒/细胞，这是由于目前大多数压电式荧光激发细胞分选研究都是在弹性芯片上开展的，主要包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料，在这类弹性材料上由于弹性模量较低容易导致管道变形，同时其封装强度较低导致能承受的压力和流速较低。

发明内容

本申请实施例在于提供一种基于环氧树脂的压电式荧光激发细胞分选芯片及其制备方法，旨在消除高流速下的通道变形，并能耐受高压、维持管道结构的完整和稳定性，以增强细胞聚焦性能，并最终在可抛弃芯片上实现高通量的流式细胞检测与分选。

本申请实施例第一方面提供一种基于环氧树脂的压电式荧光激发细胞分选芯片的制备方法，所述分选芯片包括第一基底层、第二基底层和压电换能器，所述制备方法包括：

提供微管道母模和基底层母板，所述微管道母模上形成有微流控通道，所述基底层母板上设置有与所述微流控通道对应的多个开孔；

利用浇注模具和所述微管道母模制备第一软材料子模，利用浇注模具和所述基底层母板制备第二软材料子模，所述第一软材料子模和所述第二软材料子模分别具有所述第一基底层形状和所述第二基底层形状的空腔；

利用所述浇注模具和第一软材料子模制备所述第一基底层，利用所述浇注模具和所述第二软材料子模制备所述第二基底层，烘干后脱模，其中，第一基底层和第二基底层的材料包括刚性环氧树脂；

将第二基底层脱模后置于壳聚糖盐酸溶液中进行表面改性，随后将脱模后处于临界状态的所述第一基底层和改性后的所述第二基底层对齐叠放，以使所述第一基底层与所述第二基底层之间形成化学键键合连接，并烘干；

将所述压电换能器置于所述第二基底层上的驱动室圆孔内。

可选地，在提供微管道母模的步骤之中，所述制备方法包括：

将软材料预聚物浇注至具有所述微流控通道的硅片晶圆上形成所述微管道母模，烘干后剥离；

将剥离后的所述微管道母模置于乙醇中进行超声波清洗，并通过氧等离子体机照射以获得亲水性；

将所述微管道母模在聚乙烯醇水溶液中钝化，利用氮气干燥并烘干。

可选地，所述化学键包括环氧-氨基-环氧键。

可选地，所述浇注模具包括不锈钢夹具、橡胶密封条、玻璃盖板、覆膜玻璃盖板、浇注口、微柱和紧固夹；

其中，所述不锈钢夹具为上部及一侧开口的长方体结构，在侧向开口内设置有盖板凹陷，所述盖板凹陷内侧设置有浇注内腔，所述盖板凹陷大于浇注内腔，并在所述盖板凹陷和所述浇筑内腔的台阶处设置有密封凹槽；所述盖板凹陷用于插入所述玻璃盖板，所述密封凹槽用于预固定橡胶密封条，并提供密封膨胀区域。

本申请实施例第二方面提供一种基于环氧树脂的压电式荧光激发细胞分选芯片，包括层叠设置的第一基底层和第二基底层；

所述第一基底层朝向所述第二基底层的面上设置有微流控通道，所述微流控通道用于分选目标细胞，所述微流控通道包括细胞聚焦区域、光学检测区域和细胞分选区域；

所述第二基底层上设置有多个开孔，多个所述开孔分别与所述微流控通道的不同区域连通，以形成密闭微管道；

所述第二基底层上设置有压电换能器，且所述压电换能器位于所述细胞分选区域；

其中，所述第一基底层和所述第二基底层之间通过化学键键合连接，所述第一基底层和所述第二基底层的材料包括刚性环氧树脂。

可选地，所述细胞聚焦区域包括样本入口、鞘液入口、样本通道和鞘液通道；其中，所述样本入口与所述样本通道连通，所述鞘液入口与所述鞘液通道连通；

所述光学检测区域包括直主通道，所述直主通道同时与所述样本通道和所述鞘液通道连通；

所述细胞分选区域包括分选腔室、废液出口和分选出口；其中，所述废液出口和分选出口与所述直主通道连通，所述分选腔室通过分选驱动口与所述直主通道连通，且所述分选驱动口位于所述废液出口与所述直主通道连通的位置。

可选地，所述光学检测区域还包括多个管道标尺，多个所述管道标尺沿着所述直主通道的长度方向均匀间隔设置。

可选地，所述细胞分选区域还包括排气入口和排气出口，所述排气入口和所述排气出口分别位于所述分选腔室的两侧，且所述排气入口和所述排气出口均与所述分选腔室连通。

可选地，所述多个开孔包括鞘液孔、样品孔、分选孔、废液孔、排气入孔、排气出孔和驱动室圆孔；

其中，所述鞘液孔与所述鞘液入口对应，所述样品孔与所述样品入口对应，所述分选孔与所述分选出口对应，所述废液孔与所述废液出口对应，所述排气入孔与所述排气入口对应，所述排气出孔与所述排气出口对应，所述驱动室圆孔与所述分选腔室对应。

可选地，所述分选芯片还包括：四个鲁尔椎体接头，四个所述鲁尔椎体接头分别连接在所述鞘液孔、所述样品孔、所述分选孔和所述废液孔。

有益效果：

本申请提供一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片及其制备方法，通过设置包括第一基底层、第二基底层和压电换能器的细胞分选芯片，并且通过微管道母模和基底层母板制备第一软材料子模和第二软材料子模，再利用第一软材料子模和第二软材料子模制备第一基底层和第二基底层，第一基底层和第二基底层的材料为刚性环氧树脂，同时，在制备完成后，对第二基底层进行表面改性，再将改性后的第二基底层与处于临界状态的第一基底层对齐叠放，使第一基底层和第二基底层之间可以形成化学键键合连接，最后再将压电换能器安装至第二基底层上完成压电式细胞分选芯片的制备；这样，通过竖直全封闭浇注制造刚性的环氧树脂材料的第一基底层和第二基底层，并通过化学键键合以实现第一基底层和第二基底层的高强度键合，最终形成一次性、低成本的硬质荧光激发细胞分选芯片，以消除高通量细胞检测时的通道变形(减少十倍)，进而维持管道结构的完整和稳定性，以增强细胞聚焦性能，提升流式细胞检测灵敏度和分选通量。

本申请的一种基于刚性环氧树脂的压电式细胞分选芯片及其制备方法，能够取代广泛应用的弹性聚二甲基硅氧烷(PDMS)，快速制造并不可逆地封装硬质细胞分选芯片，以保障对高压力、高流速的耐受，并最终实现高通量的微流控荧光激发细胞分选(μFACS)。所采用的竖直全封闭浇注模具，避免了芯片制备中的气泡缺陷，降低了浇注及固化中排气泡过程中的制造成本；以软材料作为子模具可批量制造刚性的环氧树脂芯片，提高了芯片制备的精度。环氧-氨基-环氧间的化学键可以实现高强度的键合封装，并最终形成一次性、低成本的硬质细胞分选芯片，能够满足高压(>689.5kPa)和高流速(>2m/s)要求。整个环氧树脂细胞分选芯片可一次性使用后丢弃，芯片即插即用，体系密封无菌，满足医疗及生物应用场景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的结构示意图；

图2是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的第一基底层上微流控通道的结构示意图；

图3是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的光学检测区域的结构示意图；

图4是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的细胞分选原理示意图；

图5本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的制备方法的步骤流程图；

图6是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的基底层母板的结构示意图；

图7是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的分选芯片安装接头前半成品示意图；

图8是本申请一实施例提出的一种浇注模具的结构示意图；(A)浇注模具浇注软材料前的状态示意图；(B)不锈钢夹具剖视图：(C)不锈钢夹具侧视图；

图9A-图9D是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片在高压高流速下测试及对比结果图；

图10A-图10B是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的强制失效模式测试结果图；

图11A-图11B是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的极限耐压测试图；

图12A-图12B是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的细胞荧光检测结果图；

图13A-图13F是本申请一实施例提出的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的细胞分选结果图。

附图标记说明：1、第一基底层；10、样本入口；11、鞘液入口；12、废液出口；13、分选腔室；131、分选喇叭口；132、分选驱动口；15、分选出口；17、直主通道；171、管道标尺；181、排气入口；182、排气出口；19光学检测区域；2、第二基底层；23、驱动室圆孔；20、样本孔；21、鞘液孔；24、驱动室圆台；22、废液孔；25、分选孔；3、压电换能器；4、鲁尔锥体接头；5、微管道母模；6、基底层母板；65、侧向浇注口；67、断裂凹线；8、浇注模具；80、不锈钢夹具；82、橡胶密封条；83、玻璃盖板覆膜；84、玻璃盖板；85、浇注口；86、微柱；87、紧固夹；90、光学检测点。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

相关技术中，高通量荧光激发细胞分选(FACS)方案主要是基于静电偏转液滴分选的流式细胞分选，以及采用不同主动式按需驱动的微流控FACS(μ-FACS)技术方案。其中前者通量较高，但采用重复使用的石英流动室可能导致交叉污染(尤其是在处理感染性生物样本或出于治疗目的进行分选时)，并且液滴分选时会产生存在潜在生物危害性的气溶胶。

而后者多类微流控方案均涉及微纳米量级管道的制备与封装，绝大多数是基于低弹性模量的弹性聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料，而该材料在高流速下由于微管道流阻较大、进而需承受高压并产生变形，因此限制了现有微流控荧光细胞分选技术所能达到的最高流速，并最终影响了荧光检测和细胞分选的速度和通量。

有鉴于此，本申请实施例提出一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片及其制备方法，通过设置包括第一基底层、第二基底层和压电换能器的分选芯片，并且通过微管道母模和基底层母板制备第一软材料子模和第二软材料子模，再利用第一软材料子模和第二软材料子模制备第一基底层和第二基底层，第一基底层和第二基底层的材料为刚性的环氧树脂，同时，在制备完成后，对第二基底层进行表面改性，再将改性后的第二基底层与处于临界状态的第一基底层对齐叠放，使第一基底层和第二基底层之间可以形成化学键键合连接，最后再将压电换能器安装至第二基底层上完成基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的制备；这样，通过竖直全封闭浇注制造刚性的环氧树脂材料的第一基底层和第二基底层，并通过化学键键合以实现第一基底层和第二基底层的高强度键合，最终形成一次性、低成本的硬质荧光激发细胞分选芯片，以消除高通量细胞检测时的通道变形，进而维持管道结构的完整和稳定性，以增强细胞聚焦性能，提升流式细胞检测灵敏度和分选通量。

下面，本申请将结合具体实施例对本申请所公开的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片及其制备方法进行详细说明。

参照图1所示，为本申请实施例公开的一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，该分选芯片包括层叠设置的第一基底层1和第二基底层2以及设置在第二基底层2上的压电换能器3。

具体地，第一基底层1朝向第二基底层2的面上设置有微流控通道，微流控通道为凹陷的微米尺寸的通道，微流控通道用于聚焦并分选目标细胞，并且在本申请实施例中，微流控通道包括细胞聚焦区域、光学检测区域和细胞分选区域。同时，第二基底层2上设置有多个开孔，多个开孔分别与微流控通道的不同区域连通，以在第一基底层1和第二基底层2内部形成密闭微管道。也即是，在通过开孔朝向微流控通道注入液体时，液体可以在微流控通道内沿一定方向流动。压电换能器3设置在第二基底层2上，且压电换能器3位于细胞分选区域，在分选目标细胞的过程中，压电换能器3可以起到将目标细胞分选出来的作用。

进一步地，参照图2所示，该分选芯片的微流控通道的细胞聚焦区域包括样本入口10、鞘液入口11、样本通道和鞘液通道。其中，样本入口10与样本通道连通，鞘液入口11与鞘液通道连通，样本通道和鞘液通道均朝向光学检测区域延伸。并且，在本申请实施例中，细胞聚焦区域采用十字形结构的流体动力聚焦，以将样品流限制在通道中间。

具体地，鞘液入口11相比样本入口10可以更靠近第一基底层1的边缘，也即是，鞘液入口11相比于样本入口10处于外侧。并且鞘液通道在样本入口10和鞘液入口11之间的位置一分为二，形成两个对称的子通道朝向光学检测区域延伸，两个子通道逐渐收窄至最终宽度为30μm。

同时，样本通道的宽度由样本入口10朝向光学检测区域逐渐变小。具体地，样本通道的宽度由1mm-3mm逐渐变窄为40μm宽，并且两个子通道以35度左右的倾斜角与样本通道连通，实现汇合。

在进行细胞分选时，含有细胞的样本液从样本入口10注入，鞘液从鞘液入口11注入，然后以35度对称分为两个分支，并挤压中央注入的样品液体，以形成样本流处于流体中央的流动聚焦模式，确保液体动力聚焦。

进一步地，参照图3所示，该分选芯片的微流控通道的光学检测区域包括直主通道17，直主通道17同时与样本通道和鞘液通道连通。

具体地，直主通道17可以设置为长度为800μm，宽度为80μm的通道，且直主通道17呈直线方向设置在光学检测区域内。在分选细胞时，光学检测点90对直主通道17上的某一位置(可调整)进行照射，以实现目标细胞的荧光激发。参照图3所示，在一种可选的实施方式中，在光学检测区域内还包括多个管道标尺171，多个管道标尺171位于直主通道的一侧，且多个管道标尺171沿着直主通道17的长度方向均匀间隔设置，管道标尺171的设置可以有助于光学检测点90的定位和测量。

进一步地，参照图2所示，该分选芯片的微流控通道的细胞分选区域包括分选腔室13、废液出口12和分选出口15。

具体地，废液出口12和分选出口15均与直主通道连通，可以理解的是，废液出口12和分选出口15为直主通道17的两个分支，并采用不对称设置，其中废液出口12为非目标细胞的出口，分选出口15为目标细胞的出口。废液出口12比分选出口15宽20μm，也即是，废液出口12的宽度为50μm，分选出口15的宽度为30μm。在无外力的层流左右下，聚焦细胞会自发地进入废液出口12。

分选腔室13位于直主通道的一侧，压电换能器3的位置与分选腔室13的位置相对应，并且分选腔室13通过分选驱动口132与直主通道连通，分选驱动口132位于废液出口12与直主通道连通的位置。分选腔室13可以为圆形腔室，且分选腔室13的直径可以为25mm。且由于分选驱动口132的大小与分选腔室13的大小相差较大，在分选腔室13与分选驱动口132之间设置有宽度逐渐收缩的分选喇叭口131。同时，分选驱动口132设计为具有30μm输出宽度的逐渐收缩的“喇叭”结构，通过分选喇叭口131与分选腔室13过渡相连，从而加速偏转液体以增强偏转力。

参照图4所示，在本申请实施例中，细胞分选的原理是基于压电效应的响应性机械变形。当未施加电压时，压电换能器3无驱动力，此时由于分选出口15和废液出口12的不对称设计，悬浮在层流中间的细胞(直径约为10μm)将作为优先行动自发流入废液出口12；施加正电压后，压电换能器3将朝向分选腔室13弯曲，从而挤出分选腔室13内的部分液体，形成切换流，推动所需的目标细胞偏转到分选出口15。

参照图2所示，由于气体的可压缩性，困在分选腔室13中的气泡将极大地影响驱动效果。因此，在一种可选的实施方式中，细胞分选区域还包括排气入口181和排气出口182，排气入口181和所述排气出口182分别位于分选腔室13的两侧，且排气入口181和排气出口182均与分选腔室13连通。

在使用分选芯片前，先将鞘液从排气入口181通入分选腔室13，并从排气出口182排出空气，以排出分选腔室13中的残留空气，并且待气体排净后可封闭排气入口181和排气出口182。

进一步地，参照图7所示，第二基底层2上的多个开孔包括鞘液孔21、样品孔20、分选孔25、废液孔22、排气入孔281、排气出孔282和驱动室圆孔23。鞘液孔21与鞘液入口11对应，样品孔与样品入口对应，分选孔25与分选出口15对应，废液孔22与废液出口12对应，排气入孔与排气入口对应，排气出孔与排气出口对应，驱动室圆孔23与分选腔室13对应。以在上述开孔外的位置构成完整的、密闭的微流控管道。

进一步地，参照图1所示，分选芯片还包括四个鲁尔椎体接头4，四个鲁尔椎体接头为毫米级尺寸，四个鲁尔椎体接头4可以通过高强度结构胶(例如UV胶)与第二基底层2固定连接。四个鲁尔椎体接头4分别连接在鞘液孔21、样品孔20、分选孔25和废液孔22上。

压电换能器3嵌入式地设置在驱动室圆孔23内，并且驱动室圆孔23上部设置直径更大的驱动室圆台24，压电换能器3外径大于驱动室圆孔23直径、但略小于驱动室圆台24的直径，以稳固放入驱动室圆孔23内，并保持位置一致性。压电换能器3与第二基底层2可以通过高强度结构胶进行固定和连接。

同时，在本申请实施例中，上述基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的第一基底层1和第二基底层2均为刚性环氧树脂材料，采用竖直全封闭浇注模具进行制造，并由化学键键合以实现高强度封装，这样，可以整体耐受高压、消除高通量细胞检测时的通道变形，进而维持管道结构的完整和稳定性，以增强细胞聚焦性能，提升流式细胞检测的灵敏度和分选通量。

图5示出了一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的制备方法的步骤流程图。参照图5所示，本申请实施例公开了一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的制备方法，所述制备方法包括：

步骤101：提供微管道母模5和基底层母板6，微管道母模5上形成有与第一基底层1相同的微流控通道，基底层母板6上设置有与所述微流控通道对应的多个开孔。

具体地，微管道母模5上的微流控通道可以是通过光刻技术在硅片上制造的凸结构，通过软材料制备以形成多块微管道母模5；在另一种可选的实施方式中，微管道母模5上的微流控通道可以是通过半导体光刻技术在硅片上制造的凹结构，并且与第一基底层上的微流控通道完全相同，至于微管道母模5则可以通过硅片切割机切割出与第一基底层1相同的外形尺寸。

参照图6所示，基底层母板可以由计算机数控(CNC)制作和抛光，并且基底层母板上设置有多个开孔，多个开孔可以包括与第二基底层上相同的开孔，同时基底层母板上还可以包括驱动室圆台64、侧向浇注口65、断裂凹线67；其中侧向浇注口65通过断裂凹线67与其他部分相连，侧向浇注口65的设计用于浇注刚性环氧树脂混合物，而树脂固化和脱模后的第二基底层2可在断裂凹线67处折断，以去除飞边或毛刺。

步骤102：利用浇注模具和微管道母模制备第一软材料子模，利用浇注模具和基底层母板制备第二软材料子模，第一软材料子模和第二软材料子模分别具有第一基底层形状和第二基底层形状的空腔。

具体地，参照图8所示，浇注模具为全封闭浇注模具，浇注模具8可以包括不锈钢夹具80、橡胶密封条82、玻璃盖板83、覆膜玻璃盖板84、浇注口85、微柱86、紧固夹87等部件。

其中不锈钢夹具80为上部及一侧开口的长方体结构，在侧向开口内设置盖板凹陷803，盖板凹陷803内侧再设置浇注内腔801，盖板凹陷803大于浇注内腔801，并在两者间台阶处设置密封凹槽802。其中盖板凹陷803用于插入玻璃盖板83，盖板凹陷803宽度略大于玻璃盖板83，密封凹槽802用于预固定橡胶密封条82，并提供密封膨胀区域。

不锈钢夹具80、橡胶密封条82与玻璃盖板83/覆膜玻璃盖板84(二选一)可以组合，并用紧固夹87固定两侧，以形成顶部开口的竖直全封闭浇注模具8。该竖直全封闭浇注模具8，配合玻璃盖板83可固定微管道母模5、基底层母板6并浇注软材料，以制备第一软材料子模具和第二软材料模具；也可以配合覆膜玻璃盖板84固定第一软材料子模具和第二软材料模具并浇注硬材料，以制备树脂芯片。

在制备时，将提前加工的微管道母模5和基底层母板6分别粘贴至玻璃盖板83，并与不锈钢夹具80、橡胶密封条82组合固定，竖直放置，从顶部一侧向浇注内腔801浇注软材料预聚物；然后将浇注软材料的全封闭浇注模具8，放置于烘箱加热1-2h后，脱模去除微管道母模5或基底层母板6，保留软材料子模88，以分别形成含有第一基底层1和第二基底层2的空腔。

其中，软材料预聚物可以包括体积比为10:1的硅弹性体混合预聚物或PDMS材料。

步骤103：利用浇注模具8和第一软材料子模制备第一基底层1，利用浇注模具8和第二软材料子模制备第二基底层2，烘干后脱模，其中，第一基底层1和第二基底层2的材料包括刚性环氧树脂。

具体地，将步骤102的中玻璃盖板83替换为覆膜玻璃盖板84，并用紧固夹87固定后竖直放置，分别形成被软材料包裹的第一基底层1和第二基底层2的完整空腔，将刚性环氧树脂硬材料预聚物72从顶部一侧浇注至软材料空腔；接着，将浇注硬材料的全封闭浇注模具8，放置于烘箱加热0.5-2h后，分别脱模取出第一基底层1或者第二基底层2。

步骤104：将第二基底层2脱模后置于壳聚糖盐酸溶液中进行表面改性，随后将脱模后处于临界状态的第一基底层1和改性后的第二基底层2对齐叠放，以使第一基底层1与所述第二基底层2之间形成化学键键合连接，并烘干。

具体地，第一基底层1取出时位于临界状态，此时硬质环氧树脂的固化已达到凝胶点，但尚未完全固化达到最大硬度，此时第一基底层1已将第一软材料子模上的微米尺寸的微流体结构转印下来，但仍然具备一定的形变能力，因此能与第二基底层2密切贴合，以充分地实现两固体界面的分子间接触、并提供化学键键合的物理环境。

环氧树脂芯片之间高强度封装的原理是利用了环氧-氨基化学键合，露在第二基底层2表面的环氧官能团被用作粘接的目标基团。简而言之，环氧-氨基键的共价键是通过两者开环反应形成“化学粘合”实现的，可通过对环氧树脂第二基底层2的表面进行氨基改性。该表面氨基改性是由多胺分子完成的，这些分子在环氧树脂的两个表面上形成了环氧-多氨基-环氧键的网络。为了实现这种化学键键合过程，将刚取出的第二基底层2浸入1％w/v壳聚糖盐酸溶液中，并在室温下进行30分钟的改性。再用去离子水清洗，并用N²干燥第二基底层2后备用。表面改性后的第二基底层2可通过双“化学粘合”层，将壳聚糖锚固后的树脂第二基底层2密封到处于临界状态的第一基底层1，并由氨基-环氧化学键的开环反应完成封装。该封装在室温下自发完成，无需专用压制设备，可用手指施加压力加速键合。

步骤105：将压电换能器3置于第二基底层2上的驱动室圆孔23内；将鲁尔锥体接头4分别置于第二基底层2上的鞘液孔21、样品孔20，分选孔25和废液孔22内。

具体地，压电换能器3、鲁尔锥体接头4可以通过高强度结构胶(例如UV胶)与第二基底层2实现固定连接。并且，在完成制备后，可以通过UV臭氧清洁仪对荧光激发细胞分选芯片进行30mW/cm²和5分钟的灭菌消毒。

根据软材料的特性，封闭浇注模具8内的软材料子模88可重复使用二十次，也就是说上述步骤101至103完成一次后，可以重复步骤104至105二十次。

通过上述步骤制备的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，第一基底层1和第二基底层2均为刚性环氧树脂材料，采用竖直全封闭浇注模具8进行制造，并由环氧-多氨基-环氧化学键键合以实现高强度封装，这样可以消除高通量细胞检测时的通道变形，进而维持管道结构的完整和稳定性，以增强细胞聚焦性能，提升流式细胞检测的灵敏度。

本芯片的细胞分选是基于荧光激发原理，从细胞样本入口10流入的细胞样本，在鞘液入口11流入的鞘液对称约束下；经过流动聚焦在直主通道17内形成单细胞流，使得待测细胞逐一经过光学检测区域。细胞依次通过光学检测点90，并在激发光的激发下产生对应的散射光和荧光，一旦这些信号检测值，超过了预设的逻辑触发阈值，将施加脉冲电压至压电换能器3，并将目标细胞分选到分选孔25；而非目标细胞在层流作用下，将优先直接流入废液孔22。

上述过程中，采用刚性环氧树脂材料替代弹性PDMS制备硬质芯片，需设置软材料子模具(图案相反)，是由于环氧树脂会粘附在绝大多数模具(包括玻璃)上，难以脱模；采用脱模剂，难以保证微米量级的微管道精度。因此先用软材料从微管道母模5和基底层母板6上翻模，形成钝化的全封闭浇注模具8作为中间模具。优选的，软材料预聚物可以包括硅弹性体混合预聚物或PDMS材料(Sylgard-184，Dow Corning，Midland，MI)。

优选的，本申请环氧树脂可采用高弹性模量(1.1GPa)、低粘度的双酚A型环氧树脂，易于使用和快速成型。以快速批量制备硬质的微流控管道，可缩短芯片制备时间至2h，便于批量化生产。并且，采用竖直全封闭浇注模具，避免了芯片制备中的气泡缺陷，降低了浇注及固化中排气泡过程中的制造成本；以软材料作为子模具批量制造刚性的环氧树脂芯片，提高了芯片制备的精度，并实现了硬质芯片的低成本批量制备。利用环氧树脂表面的环氧基团活性，在微流控层和基底层之间通过环氧-氨基-环氧“化学胶”封装以实现高强度键合，并最终形成一次性、低成本的硬质荧光激发细胞分选芯片，以消除高通量细胞检测时的通道变形(减少十倍)，能够满足高压(>689.5kPa)和高流速(>2m/s)应用场景，达到高通量分析和分选的要求。该封装过程在两平面接触后能自发结合，不依赖外部高温高压环境，封装强度度高。本申请上述芯片制备与封装过程是在不使用洁净室或涉及昂贵设备和苛刻化学品的情况下完成的。

同时，本申请实施例中在一次性高强度封装的硬质树脂芯片上，设计了流动聚焦、光学检测并集成了压电换能器，由集成式压电换能器来快速驱动流体运动，喇叭口结构收缩加快流体运动，可将细胞分离到分选出口，可实现不依赖细胞物理特性的高通量分选。整个芯片可一次性使用后丢弃，芯片即插即用，体系密封无菌，满足医疗及生物应用场景。

在一种可选的实施方式中，制备微管道母模5的步骤还可以包括：

步骤201：将软材料预聚物浇注至具有凸结构微流控通道的硅片晶圆上形成镜像凹结构的微管道母模5，烘干后剥离。

具体地，将软材料预聚物浇注至加工有的SU-8微流控通道(凸管道)的硅片晶圆上，并在80℃干燥箱中固化1小时，然后剥离微管道母模5。

步骤202：将剥离后的微管道母模5置于乙醇中进行超声波清洗，并通过氧等离子体机照射以获得亲水性。

具体地，在乙醇中对微管道母模5进行超声波清洗，然后在氧等离子体机内照射30秒以获得亲水性。

步骤203：将所述微管道母模5在聚乙烯醇水溶液中钝化，利用氮气干燥并烘干。

具体地，将微管道母模5在1％w/v聚乙烯醇水溶液中钝化5分钟，用N2干燥，并在80℃下烘烤10分钟，以完成表面改性，形成待用的微管道母模5。

此外，为了验证本申请基于硬质环氧树脂的荧光激发细胞分选芯片能消除高流速检测时的通道变形，我们同时加工制备了基于硬质环氧树脂的荧光激发细胞分选芯片，和弹性PDMS材料的荧光激发细胞分选芯片(采用传统PDMS材料和玻璃基底键合方法)。并将罗丹明B荧光素溶液分别注入封装后的芯片中，并在注射器系统的入口处安装压力计，以评估不同压力和流速下的管道变形情况，结果如图9所示。

如图9A所示，环氧树脂材料的荧光激发细胞分选芯片中测量压力呈线性比例(Adj.R2＝0.9996，实线红线)，并与根据初始通道尺寸计算的流体动力学模拟结果(蓝色三角形)相匹配。相反，PDMS材料的荧光激发细胞分选芯片中通道的流速梯度随着施加压力的增加而逐渐增大，即流动阻力逐渐减小。不难想象PDMS材料的管道横截面会像橡胶一样膨胀。我们根据荧光图片绘制了PDMS芯片的横截面轮廓，并验证了随着施加压力的增加而膨胀，如图9B所示。由于PDMS通道的高弹性(1.9～2.5Mpa)，随着压力的增加，其外形逐渐从方形扩展到梯形，甚至是塔形。但不出所料，环氧树脂通道的横截面轮廓几乎相同，如图9D所示，因为其杨氏模量较高，测量值为1.1GPa。

通过不同压力下的多组统计(N＝3)，实验获得PDMS和环氧树脂芯片中流量与通道变形之间的关系，如图9C所示。环氧树脂材料的荧光激发细胞分选芯片在高度和宽度方向的变形几乎没有变化。即使流速和施加压力分别达到1.6mL/min和634.3kPa，平均膨胀率也小于5％，具有良好的复现性。相比之下，PDMS芯片的变形程度随着流量的增加而增加十倍，并显示出显著的变化(20％偏差)，这表明PDMS材料芯片的几何形状具有不确定性。当外加压力降至350kPa时，PDMS微管道在高度和宽度方向的平均变形分别达到57％和37％。其中水平基线显示的是基片产生的自荧光，可作为零位移边界。因此，微管道底部在所有方向上都受到约束，而顶部仍然可以垂直延伸，从而减少了44％的侧向扩展。这也解释了为什么PDMS材料在高度方向上明显膨胀。这种变形和偏差使得PDMS材料难以准确预测流量和聚焦位置，而精确对准和光学检测在荧光激发细胞分选中至关重要。此外，当施加压力高于400～480kPa时，即使添加了胶水来加强键合粘合和连接，PDMS芯片上也观察到染料溶液泄漏或层分层。

因此，实验中在高压和高流速下，环氧树脂材料的荧光激发细胞分选芯片的高弹性模量能确保微通道的固定几何形状，如图9D所示。当注入流速达到1.8mL/min(超出压力表范围)时，树脂芯片完好无损，未观察到泄漏。

如图10所示的强制失效模式测试实验所示，我们采用机械剥离的方式强制将图10A所示的原完整的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片进行分层，得到强制剥离后的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片部件图10B，可以看到剥离后的树脂第一基底层1表面含有突出的碎屑，但另一侧基底层2表面变得凹陷，说明材料内部还有断裂点，这再次验证了键合平面间的高粘合强度。

如图11所示，我们设计了基于刚性环氧树脂的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的极限耐压测试，我们将压缩空气直接注入出口阻塞的芯片微通道中，改变气压来测试粘结芯片的爆裂压力。以检查封装后的微器件能够承受的爆破压力，确定分选芯片的分层和气体泄漏的阈值，其极限耐压测试方法如图11A所述。极限耐压测试现场结果如图11B所示，表明环氧树脂芯片能够承受700kPa以上的压力，整个气体压力增加过程中未观察到气体泄漏且无明显分层。

基于刚性环氧树脂的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片显示其容许压力超过了许多微流体应用所需的保持压力，例如惯性粒子聚焦和快速混合，其中硬质芯片的稳定几何形状非常重要。这些结果证实了环氧树脂是一种良好的刚性硬质材料，是热塑性塑料的良好替代品，与PDMS相比，其通道变形可以忽略不计。

为了评估本申请的基于刚性环氧树脂的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的细胞检测能力，我们将HeLa-GFP细胞和HeLa细胞以1:2的比例混合，并稀释至7*106细胞/ml的浓度。

该细胞分选芯片中检测到的散射光和荧光信号的典型原始数据如图12A所示。实验观察到部分细胞仅在散射光中产生脉冲，而没有相应的荧光脉冲，如虚线框所示，表明室HeLa细胞。相反，HeLa-GFP细胞同时产生的散射光SSC和荧光FL脉冲信号。低背景信号也显示出分选芯片95较低的自发荧光。图12B中的散点图表示了24192个计数事件的数据，显示了分选芯片对HeLa-GFP细胞和HeLa细胞的清晰两分类区分。分离指数计算为7.13，表明该系统具有良好的分离HeLa-GFP和HeLa细胞群体的能力。检测到的HeLa-GFP细胞比例为30.6％，与初始细胞比例一致。此外，在3秒钟的时间段内，我们对筛选通量进行了统计计算，得出平均细胞检测通量约为8000个细胞/秒，流速为1.2m/s。

为了测试本申请的基于刚性环氧树脂的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的细胞分选性能，我们同样从不同混合比例的HeLa-GFP细胞和非荧光HeLa细胞的混合物中，检测并鉴定出表达GFP的HeLa-GFP细胞。当目标细胞经过光学检测点时，检测到细胞样本发出的荧光并超过分选阈值时，驱动脉冲被触发，以产生具有适当延迟时间的弯曲变形，该延迟时间根据流速估计并写入程序，以使含有液体的单元从原始流动路径转向侧向分选出口。本申请中通过调整激光延迟的初步实验，首先确定了光学检测点与分选驱动口之间的延迟距离。考虑到相对较高的流速，实验覆盖整个驱动的600μm延迟范围，并记录了分选前原始样本、分选后分选出口样本及分选废液样本的HeLa-GFP细胞占比(纯度)。分别计算了不同激光延迟下的分选效率和富集因子，并发现200μm激光延迟下，分选效率最高达到94％，相应的富集因子为4.5，表明此时向PZT发送触发信号的延迟是匹配的。

在另一实施例中，我们将不同比例的细胞样本注入树脂芯片基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片中进行高通量分选，并由实时信号分析和自动化分选由嵌入式系统自动完成。图13A-图13C显示了分离前后样品中Hela-GFP细胞的比例，其纯度从22.2％提高到79.8％。分选后混合物纯度有限的原因是，当驱动脉冲被调低时，由于回流，随后的细胞进入分选收集管道。尽管如此，废物混合物中的Hela-GFP细胞纯度为3.82％，总分选效率为87％，这表明很少有细胞被漏送到废液出口。

图13A-图13C显示了另一组细胞分选芯片95对低原始纯度样品的分选性能，显示了分离前后样品中Hela-GFP细胞的比例，其纯度从5.41％提高到52.5％。分选效率取决于触发分选信号的准确性和在单个分选驱动中正确采集目标细胞的概率。考虑到细胞脉冲宽度的偏差，压电驱动的效率应该更高。图13D显示了分选后细胞存活率达到92％，表明细胞的高度完整性，因此细胞生物样本在分选后可进行下一步培养。这种温和的片上分选可以在不暴露于高压静电场的情况下，提高分选后的细胞存活率。同时，压电式分选机制与细胞的物理性质无关，如大小、密度和弹性模量。

我们使用COMSOL 6.0(COMSOL Inc.，Stockholm，SWE)和Fluent 19.2(ANSYS，Inc.，Southpointe，PA)软件模拟理想条件下的微流体流动。模拟参数设置如下：流体密度为1010kg/m3；流体动力粘度为1.003cP；出口压力为0Pa；层流粘性模型；流体是不可压缩流体，没有壁面滑移，忽略了壁面张力和壁面运动。解决方案使用了一个带有“基于最小二乘单元”梯度的SIMPLE方案。在压电换能器3变形和液体驱动的模拟中，使用单独的单向耦合，计算液体体积数据，然后输入到流体动力聚焦模型。考虑到多物理场的耦合，我们使用COMSOL软件结合分选芯片的三维几何结构，运行瞬态解。首先在频率为1kHz、宽度为0.3ms、振幅为80Vp-p的方形驱动电压的机电耦合下求解压电换能器3的三维变形，然后通过驱动端口流速的表面积分计算压缩体积，经过COMSOL中所模拟，产生了大约2μm的中心变形，导致大约1-2μL的排出液体，与实验测试结果基本吻合。

本发明的实验证据表明，基于硬质环氧树脂制备的细胞分选芯片，其管道在6个大气压下变形量<5％，因此几何形状稳定的，能够满足高通量分析和分选的要求。本申请可快速制造高强度封装的硬质环氧树脂芯片，可以消除通道变形量(从57％下降至5％减少十倍)，并增强细胞聚焦特性，同时满足高压(>689.5kPa)和高流速(>2m/s)应用场景。

其次，本申请基于硬质环氧树脂制备的细胞分选芯片，在该芯片上完成了单细胞聚焦、光学检测、细胞分选的功能。利用芯片上集成的压电换能器高速驱动挤压芯片微管道内的流体，形成流体驱动力，进而将细胞高速分离到分选出口，可以每秒8000events/s通量实时完成连续的细胞检测和分选。与传统的机械驱动不同，它不仅提供了一种快速响应和生物相容性的替代方案，而且还具有占地面积小、易于集成的前景。

其核心功能均集中在一次性的环氧树脂微流体芯片内，该压电式片上分选提供温和但高通量的细胞分选，其分选不依赖细胞的物理特性，避免了细胞暴露于空气及高压静电场的环境中，减少了交叉污染和潜在危害，提高检测和分选通量、以及分选后的细胞存活率。它可用于微量样品中少量细胞的分离，且整体结构无菌密封，对存在生物危害的样品也能适用。因此，这种基于刚性环氧树脂的压电式荧光激发细胞分选芯片能实现高通量的细胞检测与分选。

需要说明的是，本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可。

还需要说明的是，在本文中，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，诸如“第一”和“第二”之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序，也不能理解为指示或暗示相对重要性。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的相同要素。

以上对本申请所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请，在具体实施方式及应用范围上均会有不同形式的改变之处，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本申请的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的制备方法，其特征在于，所述分选芯片包括第一基底层、第二基底层和压电换能器，所述制备方法包括：

提供微管道母模和基底层母板，所述微管道母模上形成有微流控通道，所述基底层母板上设置有与所述微流控通道对应的多个开孔；

利用浇注模具和所述微管道母模制备第一软材料子模，利用浇注模具和所述基底层母板制备第二软材料子模，所述第一软材料子模和所述第二软材料子模分别具有所述第一基底层形状和所述第二基底层形状的空腔；

利用所述浇注模具和第一软材料子模制备所述第一基底层，利用所述浇注模具和所述第二软材料子模制备所述第二基底层，烘干后脱模，其中，第一基底层和第二基底层的材料包括刚性环氧树脂；

将第二基底层脱模后置于壳聚糖盐酸溶液中进行表面改性，随后将脱模后处于临界状态的所述第一基底层和改性后的所述第二基底层对齐叠放，以使所述第一基底层与所述第二基底层之间形成化学键键合连接，并烘干；

将所述压电换能器置于所述第二基底层上的驱动室圆孔内。

2.根据权利要求1所述的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的制备方法，其特征在于，在提供微管道母模的步骤之中，所述制备方法包括：

将软材料预聚物浇注至具有所述微流控通道的硅片晶圆上，烘干后剥离，形成所述微管道母模；

将剥离后的所述微管道母模置于乙醇中进行超声波清洗，并通过氧等离子体机照射以获得亲水性；

将所述微管道母模在聚乙烯醇水溶液中钝化，利用氮气干燥并烘干。

3.根据权利要求1所述的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的制备方法，其特征在于：

所述化学键包括环氧-多氨基-环氧键，键合连接为氨基和环氧开环反应。

4.根据权利要求1所述的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片的制备方法，其特征在于：

所述浇注模具包括不锈钢夹具、橡胶密封条、玻璃盖板、覆膜玻璃盖板、浇注口、微柱和紧固夹；

其中，所述不锈钢夹具为上部及一侧开口的长方体结构，在侧向开口内设置有盖板凹陷，所述盖板凹陷内侧设置有浇注内腔，所述盖板凹陷大于浇注内腔，并在所述盖板凹陷和所述浇筑内腔的台阶处设置有密封凹槽；所述盖板凹陷用于插入所述玻璃盖板，所述密封凹槽用于预固定橡胶密封条，并提供密封膨胀区域。

5.一种基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，其特征在于，包括：

层叠设置的第一基底层和第二基底层；

所述第一基底层朝向所述第二基底层的面上设置有微流控通道，所述微流控通道用于聚焦并分选目标细胞，所述微流控通道包括细胞聚焦区域、光学检测区域和细胞分选区域；

所述第二基底层上设置有多个开孔，多个所述开孔分别与所述微流控通道的不同区域连通，以形成密闭微管道；

所述第二基底层上设置有压电换能器，且所述压电换能器位于所述细胞分选区域；

其中，所述第一基底层和所述第二基底层之间通过化学键键合连接，所述第一基底层和所述第二基底层的材料包括刚性环氧树脂。

6.根据权利要求5所述的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，其特征在于：

所述细胞聚焦区域包括样本入口、鞘液入口、样本通道和鞘液通道；其中，所述样本入口与所述样本通道连通，所述鞘液入口与所述鞘液通道连通，所述鞘液通道一分为二，并对称与样本通道汇合，以实现细胞聚焦；

所述光学检测区域包括直主通道，所述直主通道同时与所述样本通道和所述鞘液通道连通；

所述细胞分选区域包括分选腔室、废液出口和分选出口；其中，所述废液出口和分选出口与所述直主通道连通，所述分选腔室通过分选驱动口与所述直主通道连通，且所述分选驱动口位于所述废液出口与所述直主通道连通的位置。

7.根据权利要求6所述的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，其特征在于：

所述光学检测区域还包括多个管道标尺，多个所述管道标尺沿着所述直主通道的长度方向均匀间隔设置。

8.根据权利要求6所述的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，其特征在于：

所述细胞分选区域还包括排气入口和排气出口，所述排气入口和所述排气出口分别位于所述分选腔室的两侧，且所述排气入口和所述排气出口均与所述分选腔室连通。

9.根据权利要求8所述的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，其特征在于：

所述多个开孔包括鞘液孔、样品孔、分选孔、废液孔、排气入孔、排气出孔和驱动室圆孔；

其中，所述鞘液孔与所述鞘液入口对应，所述样品孔与所述样品入口对应，所述分选孔与所述分选出口对应，所述废液孔与所述废液出口对应，所述排气入孔与所述排气入口对应，所述排气出孔与所述排气出口对应，所述驱动室圆孔与所述分选腔室对应。

10.根据权利要求9所述的基于环氧树脂的压电式细胞分选芯片，其特征在于，所述分选芯片还包括：

四个鲁尔椎体接头，四个所述鲁尔椎体接头分别连接在所述鞘液孔、所述样品孔、所述分选孔和所述废液孔。