CN117897165A - 用于治疗特应性皮炎的间充质干细胞 - Google Patents
用于治疗特应性皮炎的间充质干细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117897165A CN117897165A CN202280057627.3A CN202280057627A CN117897165A CN 117897165 A CN117897165 A CN 117897165A CN 202280057627 A CN202280057627 A CN 202280057627A CN 117897165 A CN117897165 A CN 117897165A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- msc
- pharmaceutical composition
- mscs
- therapeutically effective
- effective amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 172
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 title claims abstract description 89
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 title claims abstract description 86
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims abstract description 70
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 70
- 241000282324 Felis Species 0.000 claims abstract description 63
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 17
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims abstract description 4
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 claims description 194
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 100
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 55
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 38
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 38
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 claims description 31
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 31
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 22
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 20
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 20
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 17
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 claims description 17
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 claims description 17
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 14
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 12
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 12
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 12
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 11
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 10
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 6
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 6
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 6
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 6
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 claims description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 5
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 5
- 206010064986 Perivascular dermatitis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 5
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 5
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 4
- -1 TGF- β Proteins 0.000 claims description 4
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 claims description 4
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 claims description 2
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 claims 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 49
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 21
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 19
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 15
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 13
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 12
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 11
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 10
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 10
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 9
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 9
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 9
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 7
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 7
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 7
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 7
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 7
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 5
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 5
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 5
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 4
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 4
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000282373 Panthera pardus Species 0.000 description 3
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 3
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 3
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000001823 pruritic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 2
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 206010024438 Lichenification Diseases 0.000 description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 2
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 2
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 2
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001455214 Acinonyx jubatus Species 0.000 description 1
- 206010003399 Arthropod bite Diseases 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000027791 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000212000 Caniformia Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000016216 Choristoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 241000193880 Demodex folliculorum Species 0.000 description 1
- 206010012504 Dermatophytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 206010053177 Epidermolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000701081 Equid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701089 Equid alphaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000282323 Felidae Species 0.000 description 1
- 241000212015 Feliformia Species 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101001054921 Homo sapiens Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 206010069698 Langerhans' cell histiocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- 108010013709 Leukocyte Common Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000017095 Leukocyte Common Antigens Human genes 0.000 description 1
- 102100026849 Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000721701 Lynx Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001460074 Microsporum distortum Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000880305 Neofelis Species 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 1
- 241000601288 Panthera leo atrox Species 0.000 description 1
- 208000010067 Pituitary ACTH Hypersecretion Diseases 0.000 description 1
- 208000020627 Pituitary-dependent Cushing syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 1
- 206010037888 Rash pustular Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 1
- 206010043458 Thirst Diseases 0.000 description 1
- 108010031650 Thy-1 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001139 anti-pruritic effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 230000007234 antiinflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229940009192 apoquel Drugs 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000010366 cell biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- VQIGDTLRBSNOBV-VQIYXBGXSA-N chembl2105739 Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C1C[C@@H](CS(=O)(=O)NC)CC[C@@H]1N(C)C1=NC=NC2=C1C=CN2 VQIGDTLRBSNOBV-VQIYXBGXSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000037336 dry skin Effects 0.000 description 1
- 210000001513 elbow Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 208000003401 eosinophilic granuloma Diseases 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 208000000069 hyperpigmentation Diseases 0.000 description 1
- 230000003810 hyperpigmentation Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000004179 hypothalamic–pituitary–adrenal axis Effects 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 102000027411 intracellular receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008582 intracellular receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 230000005722 itchiness Effects 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010033072 otitis externa Diseases 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000002640 perineum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 206010036067 polydipsia Diseases 0.000 description 1
- 208000022530 polyphagia Diseases 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- YIBNHAJFJUQSRA-YNNPMVKQSA-N prostaglandin H2 Chemical compound C1[C@@H]2OO[C@H]1[C@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H]2C\C=C/CCCC(O)=O YIBNHAJFJUQSRA-YNNPMVKQSA-N 0.000 description 1
- 208000029561 pustule Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 210000004341 tarsal joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 201000002311 trypanosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 239000000717 tumor promoter Substances 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 101150054071 vas2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/04—Antipruritics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及用于治疗犬科动物和猫科动物的特应性皮炎(AD)的间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物。在第二方面,本发明涉及MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其在诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物和猫科动物的AD炎症反应的急性和/或慢性期期间用作免疫调节剂。在最后一个方面,本发明涉及包含外周血来源的MSC的药物组合物。
Description
发明领域
本发明涉及用于治疗犬和猫特应性皮炎的间充质干细胞。
背景技术
狗或猫的特应性皮炎(AD)被定义为“一种具有特征性临床特征的遗传易感炎症和瘙痒性过敏性皮肤病”。它最常见地与免疫球蛋白E(IgE)抗体有关,该抗体对常见的环境变应原(如房屋尘螨、草和植物花粉)具有特异性。由于狗最常作为室内宠物饲养,暴露于室内变应原的增加可能导致犬特应性皮炎(cAD)的患病率增加,目前估计为10-15%。
在AD中,免疫反应会加剧。在急性期,辅助性T细胞2(Th2)淋巴细胞占优势,释放促炎细胞因子、嗜酸性粒细胞、肥大细胞脱粒和IgE。在慢性期,观察到主要的辅助性T淋巴细胞细胞1(Th1)应答和Th2应答。通常,患有AD的非人类动物会表现出面部、耳朵、爪子、四肢和/或腹部瘙痒。
目前推荐的AD治疗方法是口服全身使用免疫抑制剂,如皮质类固醇、环孢菌素和奥拉替尼(oclacitinib),与乳液、吸液管和由保湿剂、润肤剂和保湿剂组成的乳膏相结合,以恢复皮肤屏障。例如,口服糖皮质激素,如泼尼松,通常用于治疗AD。然而,使用类固醇可能会有许多副作用,如增加的口渴、排尿、饥饿和体重增加。此外,长期高剂量使用类固醇会导致肝脏肿大和肝酶增加,会导致高血压和肾脏疾病,肌肉和韧带衰弱,皮肤和膀胱感染,皮肤变薄和脱发。由于传统的免疫调节药物疗法(如糖皮质激素)或其他新疗法(如环孢菌素或单克隆抗体)与许多限制其长期使用的副作用有关,因此需要开发更有效和安全的治疗策略。
间充质干细胞(MSC)是可从多种组织中收集和分离的多能成体干细胞。MSC可以降低几种变应性疾病的侵袭性。众所周知,MSC与先天免疫系统和适应性免疫系统相互作用,从而导致对免疫细胞的增殖、分化和激活的抑制作用。
因此,间充质干细胞(MSC)被认为是AD治疗的潜在替代品,因为它们具有免疫调节特性,可以抑制AD的炎症过程,在很短的时间内减缓其进展,甚至导致持续损伤的逆转。几项研究已经调查了它们治疗特应性皮炎的安全性和有效性,并显示出非常有趣的结果。
这些研究大多使用来源于脂肪组织或骨髓(BM)的自体MSC。然而,在某些情况下,使用同种异体或异种MSC是更有利的选择,因为它们提供了健康和高质量干细胞供体的严格选择。它们允许生产现成的产品,避免了从每个患者身上侵入性地采集和耗时地培养MSC。由于犬和猫MSC的培养能力相对较低,异种(例如人或马)MSC可以有利地使用,特别是用于商业应用,例如用于治疗犬和猫的特应性皮炎(AD)。此外,异种MSC不含可传播的物种特异性病原体。
同样,从骨髓中提取骨髓MSC是一种侵入性和高风险的方法。脂肪组织作为MSC的来源是一种更安全但仍具有侵袭性的替代方案。
在某些情况下,使用天然MSC是一个有利的选择,因为它们允许生产即用型产品,只需最少的制造和处理,从而降低生产成本。
本领域仍然需要改进MSC的使用,以减缓狗和猫家庭中AD的疾病进展和/或甚至逆转AD的病理状况。本发明旨在解决上述缺点中的至少一个。
发明内容
本发明及其实施方案用于提供对上述缺点中的一个或多个缺点的解决方案。为此,本发明涉及根据权利要求1所述的用于治疗犬科动物和猫科动物特应性皮炎(AD)的间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物。在实施方案中,所述MSC来源于血液,优选外周血。在实施方案中,所述MSC是静脉内施用的。在实施方案中,所述MSC是天然MSC。在实施方案中,所述MSC是异种MSC。用于本发明的MSC的优选实施方案显示在权利要求2-23中的任一项中。
在第二方面,本发明涉及MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其在如权利要求24所述的被诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物和猫科动物的AD炎症反应的急性和/或慢性期期间用作免疫调节剂。
在最后一个方面,本发明涉及包含外周血来源的MSC的药物组合物,所述MSC是动物来源的,并且存在于根据权利要求25所述的无菌液体中。
附图说明
图1显示了阴性对照、阳性对照和共培养样品的MLR试验中增殖的PBMC群体中CD4+T淋巴细胞以及Th1和Th2亚群的相对(图1A)和绝对(图1B)表达的概述。
图2显示了阳性对照和与ePB-MSC共培养样品的MLR试验上清液中IFN-γ的浓度。
图3显示了阳性对照和与ePB-MSC共培养样品的MLR试验的上清液中IL-13的浓度。
发明详述
本发明涉及用于治疗犬科动物和猫科动物的特应性皮炎的天然MSC,其中所述MSC可以源自血液,优选地外周血。血液不仅是一种非侵入性无痛的来源,而且采集简单、安全,因此易于获取。特别地,MSC可以源自外周血,优选地马外周血,其允许每年多次采集MSC,并且对供体动物的不适或发病率最小。
定义
除非另有定义,否则用于公开本发明的所有术语,包括技术术语和科学术语,具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导,包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
如本文所用,以下术语具有以下含义:
除非上下文另有明确规定,否则本文中使用的“a”、“an”和“the”既指单数也指复数。例如,“a compartment”是指一个或多个区室。
此处所用的“约”指的是可测量值,如参数、量、持续时间等,是指包含特定值的+/-20%或更小,优选+/-10%或更小,更优选+/-5%或更小,甚至更优选+/-1%或更小,还更优选+/-0.1%或更小的变化,到目前为止,这样的变化适合于在所公开的发明中执行。然而,应当理解,修饰语“约”所指的值本身也被具体公开。
此处使用的“包含”(“Comprise”、“comprising”、“comprises”和“comprised of”)和与“包括”(“include”、“including”、“includes”)或“含有”(“contain”、“containing”、“contains”)同义,并且是包括性或开放式术语,其规定了所跟随的内容的存在,例如组分,并且不排除或避免本领域已知或其中公开的附加的、未列举的组件、特征、元件、构件、步骤的存在。
此外,说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似元件,而不一定用于描述先后顺序或时间顺序,除非另有说明。应当理解,如此使用的术语在适当的情况下是可互换的,并且本文所描述的本发明的实施方案能够以除本文所描述或图示之外的其他顺序操作。
通过端点对数值范围的引用包括该范围内包含的所有数字和分数,以及所引用的端点。
尽管术语“一个或多个”或“至少一个”,例如一组成员中的一个或更多或至少一个成员,本身是明确的,但通过进一步的例证,该术语包括对所述成员中的任何一个或所述成员的任何两个或更多个的引用,例如,所述成员的≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等,直至所有所述成员。
除非另有定义,否则用于公开本发明的所有术语,包括技术术语和科学术语,具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导,包括说明书中使用的术语的定义,以更好地理解本发明的教导。此处使用的术语或定义仅用于帮助理解本发明。
在整个说明书中,对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着结合实施方案描述的特定特点、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此,短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在本说明书的各个地方的出现不一定都指同一实施方案,而是可以指同一实施方案。此外,特定的特点、结构或特性可以以任何合适的方式组合,如本领域技术人员从本公开中,在一个或多个实施方案中显而易见的。此外,虽然本文所述的一些实施方案包括一些但不包括其他实施方案中包括的其他特征,但不同实施方案的特征的组合应在本发明的范围内,并形成不同的实施方案,如本领域技术人员所理解的。例如,在以下权利要求中,任何要求保护的实施方案都可以以任何组合使用。
术语“间充质干细胞”或“MSC”是指表达一组特定表面抗原并可分化为各种细胞类型的多能自我更新细胞,包括但不限于体外培养或体内存在的脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。
术语“分离的”是指从细胞培养物或生物样品(如血液)中对细胞进行物理鉴定和分离,这可以通过应用适当的细胞生物学技术来进行,这些技术要么基于对细胞培养物的检查,要么基于与标准品相对应的细胞的表征(以及在可能和需要的情况下进行物理分离),或根据抗原的存在/不存在和/或细胞大小对细胞进行自动分选(例如通过FACS)。在一些实施方案中,术语“分离”("isolating")或“分离”("isolation")可包括进一步的细胞物理分离和/或定量步骤,特别是通过进行流式细胞术。
本文中使用的术语“体外”表示身体以外或身体的外部。此处使用的术语“体外”应理解为包括“离体”("ex vivo")。术语“离体”通常指从体内移除并在体外(例如,在培养容器或生物反应器中)维持或繁殖的组织或细胞。
术语“传代”(passage)或“传代”(passaging)在本领域中是常见的,指的是将培养的(间充质干)细胞从培养底物上分离和解离以及培养的(间充质干)细胞彼此分离和解离。为了简单起见,在贴壁培养条件下第一次生长细胞后进行的传代通常称为“第一次传代”(或传代1,P1)。细胞可以传代至少一次,优选地两次或多次。传代1之后的每个传代都用增加1的数字表示,例如传代2、3、4、5或P1、P2、P3、P4、P5等。
术语“细胞培养基”或“细胞培养基质”或“培养基”是指包含可用于细胞的维持或生长的营养物质的含水液体或凝胶状物质。细胞培养基可以含有血清或无血清。细胞培养基可以包含生长因子或补充生长因子。
本文所用的术语“生长因子”是指一种生物活性物质,其影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移,并可能单独或在被其他物质调节时影响生物体的发育、形态和功能变化。生长因子通常可以通过作为配体与细胞中存在的受体(例如,表面或细胞内受体)结合而起作用。
在本上下文中,MSC的“自体”施用是指来自供体的MSC被施用给受体,其中受体和供体都是相同的。
在本上下文中,MSC的“同种异体”施用是指将供体的MSC施用给受体,其中受体和供体都属于同一物种,但不是同一个。
本上下文中MSC的“异种”施用是指来自供体的MSC被施用给受体,其中受体和供体来自不同物种。
在本发明的上下文中,“天然MSC”(Native MSC)是指未暴露于刺激环境(如炎症介质)的MSC。如本文所用,“炎性环境”或“炎症状况”是指以(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子增加;和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的减少为特征的状态或状况。
术语“抗炎”、“抗炎症”和“免疫抑制”,“免疫抑制的”是指以局部炎症(如但不限于热、疼痛、肿胀、发红和功能丧失)的至少一种迹象减少和/或以全身状态变化为特征的任何状态或状况,所述全身状态变化的特征是(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子的减少;和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的增加。
本发明的“群体倍增时间”或“PDT”将通过以下公式计算:PDT=T/(ln(Nf/Ni)/ln(2)),其中T是达到80%汇合的细胞培养时间(以天为单位),Nf是细胞脱附后的最终细胞数,而Ni是时间点0时的初始细胞数。
术语“抗凝血剂”是指一种可以抑制血液凝固的组合物。本发明中使用的抗凝剂的实例包括EDTA或肝素。
本发明中的术语“血沉棕黄层”应理解为未凝固血液的级分,优选地通过密度梯度离心获得,而该级分富含白细胞和血小板。
术语“相间血液”(blood-inter-phase)应理解为血液的级分,优选地通过密度梯度获得,位于主要由红细胞和多形核细胞组成的底部级分和主要由血浆组成的上部级分之间。相间血液是血液单个核细胞(BMC)的来源,包含单核细胞、淋巴细胞和MSC。
本文中使用的术语“悬浮直径”被理解为细胞在悬浮液中的平均直径。测量直径的方法在本领域中是已知的。可能的方法是流式细胞术、共聚焦显微术、图像细胞仪或本领域中已知的其他方法。
术语“治疗有效量”是指对减轻症状或改善疾病状况有效的化合物或组合物的最小量或浓度。
术语“治疗”是指减少或防止病理状况或病症发展或进展的治疗、预防或防止性措施。
“犬特应性皮炎”(cAD)是犬类中的一种常见病症,患病率估计高达15%。AD最常见的临床症状是瘙痒(发痒),瘙痒可能是非季节性的、季节性的或非季节性但季节性恶化的。除了瘙痒之外,AD的特点是慢性皮肤炎症和复发性继发性皮肤感染。体检时,这些问题可表现为红斑(皮肤变红)、苔藓样变(皮肤增厚)、色素沉着过度(皮肤变黑)、结痂(结痂)、抓痕(抓伤引起的糜烂或溃疡)、自身诱发的脱发(脱发)、丘疹(小而隆起的皮肤区域)和脓疱(小而隆起的皮肤区域,充满脓液)。身体受影响最大的部位包括腹尾、会阴、腹侧腹部、爪子、腕关节、跗关节、肘部屈肌方面和头部。
“猫特应性皮炎”(fAD)是猫中的一种常见病症,患病率估计高达12.5%。由于IgE在猫体内的功能尚未完全阐明,因此通常也使用术语“猫特应性样皮炎”或“非跳蚤、非食物、过敏性皮炎(NFNFAD)”。AD最常见的临床症状是瘙痒症(发痒),然而,有些猫只默默地梳理毛发。瘙痒和/或皮肤损伤可以季节性或非季节性出现,具体取决于引起其的变应原。所表现的症状没有典型的模式,这使诊断变得复杂。可能的皮肤病变可表现为自我造成的创伤、自致脱发、抓痕、复发性外耳炎、小丘疹(小结痂丘疹)、头颈部搔抓和嗜酸性肉芽肿复合病变。已经报道了非皮肤症状,如打喷嚏、咳嗽、结膜炎、腹泻或呕吐等。身体受影响最严重的部位包括头部、口腔、颈部、腹部和躯干。
术语“患者”、“对象”、“动物”或“哺乳动物”可互换使用并且是指待治疗的哺乳动物对象。优选地,哺乳动物是犬科动物或猫科动物,例如狗或猫。
本发明中的“犬科(canine)”或“犬科动物(canines)”是指犬科(Canidae)的类狗食肉动物。这个家庭的成员被称为犬科的动物(canid)。犬科中有三个亚科,分别是已灭绝的Borophaginae亚科和Hesperocyoninae亚科,以及现存的犬亚科(Caninae)。犬亚科被称为犬科动物,包括家养狗、狼、狐狸、郊狼、豺狼和其他现存和已灭绝的物种。
本发明中的“猫科(feline)”或“猫科动物(felines)”是指猫科(Felidae)的猫。这个家族的成员也被称为猫科的动物(felid)。现存的猫科分为两个亚科:豹亚科(Pantherinae)和猫亚科(Felinae)。豹亚科包括五个豹属(Panthera)和两个云豹属(Neofelis)的种,而猫亚科包括10个属中的其他34个种,其中包括家猫、猎豹、薮猫(servals)、猞猁和美洲狮。
“混合淋巴细胞反应(MLR)”测定法传统上用于研究外部试剂是否刺激或抑制T细胞增殖。通过使用MLR测定,可以研究MSC的免疫调节特性。对于这种MLR测定,应答T细胞用荧光染料标记,当其暴露于特定的光频率时,荧光染料会亮起绿色。然后用植物促分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激这些应答T细胞以诱导或刺激增殖。ConA是一种不依赖抗原的促分裂原,可作为替代T细胞刺激物。这种凝集素经常在T细胞刺激实验中用作抗原呈递细胞的替代物。伴刀豆球蛋白A与细胞表面的糖蛋白不可逆地结合,使T细胞增殖。这是一种快速刺激转录因子和细胞因子产生的方法。当T细胞开始分裂时,染料会分布在其子细胞上,因此染料会随着每次细胞分裂而连续稀释。因此,可以通过观察颜色的减少来测量T细胞的增殖量。因此,为了研究MSC的免疫调节特性,将这些MSC添加到受刺激的应答T细胞中,并共同孵育几天。包括适当的阳性和阴性对照,以查看测试是否成功进行。在孵育期结束时,使用流式细胞术测量T细胞增殖量,从而能够观察MSC是否抑制T细胞增殖。
发明描述
皮质类固醇用于犬和猫AD的对症治疗。它们具有强大的抗炎和止痒活性。然而,他们的活性差异很大。个体反应存在不一致性,不仅与所使用的皮质类固醇有关,而且对同一种皮质类固醇也存在不一致性。随着时间的推移,效果会减弱,所需的剂量会增加。它们可局部或全身性使用。由于狗或猫身上有毛发,局部使用的价值有限(除了可能作为洗发水以外)。如上所述,全身性皮质类固醇具有显著的副作用。最常见的是多尿-多饮、多食、肝肿大、下丘脑-垂体-肾上腺轴抑制、皮肤和皮毛干燥以及脱发(医源性库欣病,通常是由于重复注射长效制剂所致)。此外,局部免疫抑制可能引起感染(脓皮病)、犬毛囊蠕形螨病和皮肤癣菌病。
间充质干细胞(MSC)因其免疫调节特性而被提议用于治疗炎症相关疾病。这些免疫调节特性可以抑制特应性皮炎(AD)等过度的炎症过程,在很短的时间内减缓其进展,甚至导致持续损伤的逆转。之前的(犬类)研究调查了它们治疗AD的安全性和有效性,并显示出非常有趣的结果。
在一个方面,本发明涉及MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其用于治疗犬科动物和猫科动物的AD或作为治疗犬科动物和猫科动物的AD的方法或用于制备用于治疗犬科动物和猫科动物的AD的药物。
所述犬科动物可以是犬科的任何类狗食肉动物,优选地犬亚科,更优选地家犬(Canis familyaris)。所述猫科动物可以是猫科的任何猫样食肉动物,优选地猫亚科的猫,更优选家猫(Felis catus)。
在一个实施方案中,用于所述用途的MSC是天然的。这种天然MSC尚未首先在体外暴露于刺激剂,例如炎性介质或炎性环境。这种炎性环境是指以(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子的增加;和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的减少为特征的状态或病况。使用天然MSC有时是一个有利的选择,因为它们允许生产即用型产品,生产和处理最小化,从而降低生产成本。
优选地,MSC的细胞大小在10μm至100μm之间,更优选在15μm至80μm之间、更优选在20μm至75μm之间、更加优选在25μm至50μm之间。在一个实施方案中,根据本发明用于所述用途的MSC是通过过滤系统按大小选择的,其中使用40μm过滤器使细胞通过双重过滤步骤过滤。优选两个或更多个过滤步骤。后者提供了大量的单细胞并避免了细胞聚集体的存在。这种细胞聚集体在通过冷冻保存细胞的过程中可能导致细胞死亡,并且都可能对细胞的进一步下游应用产生影响。例如,当静脉内施用时,细胞聚集体可能会增加发生毛细血管栓塞的风险。
之前发表的大多数研究都使用源自脂肪组织或骨髓(BM)的自体或同种异体MSC。
根据本发明用于所述用途的MSC可以源自多种组织或体液,特别是源自血液、BM、脂肪组织或羊膜组织。据报道,骨髓的MSC采集与出血、慢性疼痛、神经血管损伤甚至死亡有关。脂肪组织作为间充质干细胞的来源被认为是更安全的选择。然而,从脂肪组织中收获MSC仍然需要在供体动物上切开切口,因此这仍然是一种侵入性操作。源自血液的MSC与源自骨髓和脂肪组织的MSC表现出相似的形态。因此,优选地,MSC源自血液,包括但不限于脐带血和外周血。更优选地,MSC源自外周血。血液不仅是一种无创、无痛的来源,而且采集简单、安全,因此易于获取且之后并发症较少。MSC或包含MSC的血液可源自所有哺乳动物,包括但不限于人、家养动物和农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物、伴侣动物和实验动物,例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪和灵长类动物,例如猴子和猿;特别是马、人、猫、狗、啮齿动物等。在一个实施方案中,所述来源是马。特别地,MSC可以源自外周血,优选马外周血,这允许每年多次采集MSC,并且对供体动物的不适或发病率最小。
在某些情况下,使用同种异体或异种MSC是更有利的选择,因为它们可以严格选择健康和高质量的干细胞供体。它们允许生产即用型产品,避免从每个患者身上侵入性采集和耗时的MSC培养。由于与例如马或人MSC相比,犬科动物和猫科动物MSC的培养能力相对较低,因此异种(例如人或马)MSC的使用优于同种异体犬科动物和猫科动物MSC,特别是对于商业应用,例如用于治疗犬科动物和猫科动物的AD。
因此,在特定实施方案中,本发明的MSC可用于对对象进行同种异体或异种施用。如前所述,同种异体或异种使用允许更好地控制MSC的质量,因为可以筛选不同的供体,并且可以选择最佳供体。后者在制备功能性MSC方面是必不可少的。这与自体使用MSC形成对比,因为在这种情况下,更难确保细胞的质量。尽管如此,自体使用可能也有它的好处。在一种情况下,分离血液MSC,使用来自供体的血液,该供体后来也是分离的MSC的受体。在另一种情况下,使用来自供体的血液,其中供体优选地与从供体的血液中分离的MSC的受体具有相同的家庭、性别或种族。特别是,将对这些供体进行常见的当前可传播疾病或病理学测试,以避免这些病理或疾病通过干细胞水平传播的风险。优选地,供体/供体动物被隔离。当使用供体马时,例如可以对其进行以下病理学、病毒或寄生虫的测试:马传染性贫血(EIA)、马鼻肺炎(EHV-1、EHV-4)、马病毒性动脉炎(EVA)、西尼罗河病毒(WNV)、非洲马疾病(AHS)、马锥虫病(锥虫属)、马梨浆虫病、马鼻疽(锤骨、马鼻疽)、马流感、莱姆病(LB)(伯氏疏螺旋体,莱姆病)。
在一个实施方案中,用于本发明的MSC的特征可在于以下标志物:CD29、CD44、CD90、CD105、波形蛋白、纤连蛋白、Ki67、CK18或其任何组合中的一种或多种的存在/被测量为阳性。在另一个实施方案中,用于本发明的MSC的特征可在于间充质标志物CD29、CD44和CD90的存在。通过后者,可以分析所获得的MSC的纯度,并可以确定MSC的百分比。
CD29是由整联蛋白β1基因编码的细胞表面受体,其中该受体与其他蛋白质形成复合物,以调节配体结合时的生理活性。CD44抗原是一种参与细胞-细胞相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。此外,CD44是透明质酸的受体,也可以与其他配体如骨桥蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶(MMP)相互作用。CD90抗原是一种保守的细胞表面蛋白,被认为是干细胞(如MSC)的标志物。本发明的MSC对CD29/CD44/CD90呈三阳性,使本领域技术人员能够快速而明确地选择MSC,并提供了对进一步下游应用感兴趣的MSC生物学特性。
在一个实施方案中,用于本发明的MSC的特征在于不存在主要组织相容性复合体(MHC)II类分子/主要组织相容性复合体(MHC)II类分子测量为阴性,优选地所有目前已知的MHC II类分子,将所述细胞分类为可用于哺乳动物细胞疗法(如狗或猫细胞疗法)的细胞。即使MSC部分分化,MSC对MHC II类分子仍呈阴性。可以使用流式细胞术进行检测MHC II分子的存在或不存在以及量化其表达。
在另一个和进一步的实施方案中,MSC对CD45抗原(造血细胞的标志物)的测量结果为阴性。
在一个实施方案中,MSC对MHC II类分子和CD45测量均为阴性。
在一个特别优选的实施方案中,用于本发明的MSC对间充质标志物CD29、CD44和CD90测量为阳性,对MHC II类分子和CD45测量为阴性。
MSC通常在其表面表达MHC I类抗原。在一个特定实施方案中,用于本发明的MSC具有低水平或检测不到的MHC I类标志物。在最优选的实施方案中,所述MSC对MHC II类标志物测量为阴性,并且具有低水平或检测不到的MHC I类标志物,其中所述细胞表现出极低的免疫原性表型。为了本发明的目的,所述低水平应理解为小于表达所述MHC I或MHC II的总细胞的25%,更优选小于15%。可以使用流式细胞术进行检测MHC I和MHC II分子的存在或不存在以及量化其表达。
MSC的这些免疫特性限制了受体免疫系统在细胞移植后识别和排斥细胞,优选地同种异体或异种细胞的能力。MSC产生的调节免疫反应的因子,以及它们在局部刺激下分化为适当细胞类型的能力,使它们成为细胞治疗所需的干细胞。
在一个实施方案中,用于本发明的MSC在炎性环境或状况下存在时分泌免疫调节性前列腺素E2细胞因子。
炎性环境或状况的特征是血液中免疫细胞的募集。炎症介质包括前列腺素、炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-15、趋化因子如IL-8和其他炎性蛋白如TNF-α和IFN-γ。这些介质主要由单核细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞产生,在炎症部位募集白细胞,随后刺激刺激性和抑制性相互作用的复杂网络,同时破坏和治愈炎症过程中的组织。
前列腺素E2(PgE2)是前列腺素家族的一个亚型。PgE2是由膜磷脂释放的花生四烯酸(AA)通过连续的酶促反应合成的。环加氧酶-2(COX-2)被称为前列腺素内过氧化物酶合酶,将AA转化为前列腺素H2(PgH2),而PgE2合酶将PgH2异构化为PgE2。作为一种限速酶,COX-2响应生理条件控制PgE2的合成,所述生理条件包括生长因子、炎性细胞因子和肿瘤启动子的刺激。
在一个特定的实施方案中,存在于炎性环境中的所述MSC分泌浓度在103至106皮克/ml之间的可溶性免疫因子前列腺素E2(PgE2),以诱导或刺激MSC调节的免疫抑制。
MSC在这些特定浓度范围内的PgE2分泌刺激体外抗炎过程,并且与它们分化为适当细胞类型的能力一起使它们成为细胞移植所需要的。
在优选实施方案中,用于本发明用途的MSC测量:
-间充质标志物CD29、CD44和CD90呈阳性;
-包含在由波形蛋白、纤连蛋白、Ki67或其组合组成的组中的一种或多种标志物呈阳性;
-MHC II类分子呈阴性;
-造血标志物CD45呈阴性,以及
-优选地具有低水平或检测不到水平的MHC I类分子,其中所述低水平应理解为低于表达MHC I的总细胞的25%,更优选低于15%。
在最优选的实施方案中,用于本发明用途的MSC测量:
-间充质标志物CD29、CD44和CD90呈阳性;
-包含在由波形蛋白、纤连蛋白、Ki67或其组合组成的组中的一种或多种标志物呈阳性;
-MHC II类分子呈阴性;
-造血标志物CD45呈阴性;和
-优选地具有低水平或检测不到水平的MHC I类分子,其中所述低水平应理解为低于表达MHC I的总细胞的25%,更优选低于15%,
其中当存在于炎性环境或状况中时,所述细胞分泌的免疫调节性PgE2细胞因子的浓度范围在103至106皮克/ml之间。
在另一个或进一步的实施方案中,当存在于炎性环境或状况中时,并与具有相同特征但不经受所述炎性环境或状况的MSC进行比较,根据本发明使用的MSC具有选自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合的至少一种分子的分泌的增加,并且IL-1的分泌减少。
在优选的实施方案中,当存在于炎性环境或状况中时,MSC具有IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合中的至少一种分子的增加的分泌,以及IL-1的减少的分泌。可以与具有与上述相同特征但不受所述炎性环境或状况影响的间充质干细胞进行比较。
优选地,MSC具有与两种或更多种上述因子组合的PgE2的增加的分泌。
PgE2、IL-6、IL-10、TGF-β和NO有助于抑制如T细胞和B细胞等主要免疫细胞群的增殖和功能。此外,MSC在其表面表达低水平的MHC I类分子和/或对MHC II类分子呈阴性,从而逃避免疫原性反应。此外,目前的MSC可以通过增加上述因子的分泌来抑制白细胞的增殖,再次有助于避免宿主的免疫原性反应。
在另一个或进一步的实施方案中,在外周血单个核细胞(PBMC)存在的情况下,MSC刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的分泌和/或抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-13或其组合的分泌。在另一个或进一步的实施方案中,MSC在PBMC存在的情况下抑制TGF-β1的分泌。
在炎性环境中,MSC分泌多种调节宿主免疫反应的因子。此外,MSC具有诱导或刺激选自PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的一种或多种因子分泌的刺激作用。除了MSC在炎性环境中对PBMC的刺激作用外,MSC还对PBMC分泌具有抑制作用,导致一种或多种选自TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β1、IL-13或其组合的因子减少。MSC在炎性环境中具有调节作用,可用于治疗各种类型疾病,特别是免疫系统病症。
通常,文献中发表的任何用于鉴定和表征特定细胞类型的细胞标志物(例如间充质、肝、造血、上皮、内皮标志物)或具有特定定位(例如细胞内、细胞表面或分泌的)的细胞标志物的技术都可被认为适合于表征MSC。此类技术可分为两类:一类是允许在分析过程中保持细胞完整性的技术,另一类是基于使用此类细胞产生的提取物(包括蛋白质、核酸、膜等)的技术。在鉴定这些标志物并将其测量为阳性或阴性的技术中,优选免疫细胞化学或细胞培养基的分析,因为这些技术即使在低量细胞的情况下也允许标志物检测,而不会破坏它们(如在蛋白质印迹或流式细胞术的情况下)。
可以使用MLR测定法来测定MSC的免疫调节特性。对于这种MLR测定,应答T细胞用荧光染料标记,当其暴露于特定的光频率时,荧光染料会亮起绿色。然后用植物促分裂原(ConA)刺激这些应答T细胞以诱导或刺激增殖。当T细胞开始分裂时,染料会分布在其子细胞上,因此染料会随着每次细胞分裂而连续稀释。因此,可以通过观察颜色的减少来测量T细胞的增殖量。因此,为了研究MSC的免疫调节特性,将这些MSC添加到受刺激的应答T细胞中,并共同孵育几天。包括适当的阳性和阴性对照,以查看测试是否成功进行。在孵育期结束时,使用流式细胞术测量T细胞增殖量,使我们能够观察MSC是否抑制T细胞增殖。
MSC的相关生物学特征可以通过使用诸如流式细胞术、免疫细胞化学、质谱、凝胶电泳、免疫测定法(例如免疫印迹、蛋白质印迹、免疫沉淀、ELISA)、核酸扩增(例如实时RT-PCR)、酶活性、组学技术(蛋白质组学、脂质组学、糖组学、翻译组学、转录组学、代谢组学)和/或其他生物活性的技术来鉴定。
本发明的MSC可通过本领域已知的任何标准方案衍生。在一个实施方案中,所述MSC可通过一种方法获得,其中所述MSC从血液或血相分离,并且其中所述细胞在基础培养基(优选地低葡萄糖培养基)中培养和扩增。
本领域已知的基础培养基制剂包括但不限于Eagle基本必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α改良的基本必需培养基(alpha-MEM)、基本基础培养基(BME)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、基本改良的Eagle培养基(EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth's 10MB 752/1或Williams培养基E,及其修改和/或组合。上述基础培养基的组成在本领域中通常是已知的,并且根据培养的细胞的需要改变或调节培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的范围内。优选的基础培养基制剂可以是商业上可获得的那些制剂之一,例如DMEM,据报道其可维持MSC的体外培养,并且包括生长因子的混合物以使其适当生长、增殖、维持所需标志物和/或生物活性,或长期储存。
这种基础培养基制剂含有哺乳动物细胞发育所必需的成分,这些成分本身是已知的。通过说明而非限制,这些成分可包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P以及可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲剂(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸盐例如丙酮酸钠、乙酸盐例如乙酸钠)等。还显而易见的是,许多培养基可以作为含有或不含有丙酮酸钠的低葡萄糖制剂获得。
用于从血液或血相分离MSC并培养和扩增所述细胞的方法是本领域已知的并且例如描述于WO2014053418或WO2014053420中。
在一个实施方案中,这种用于从血液或血相分离MSC并在低葡萄糖培养基中培养和扩增所述细胞的方法可以包括以下步骤:
a)在涂有抗凝剂的样品瓶中收集来自供体的一份或多份血液样品;
b)离心血液样品以获得三相分布,包括血浆相、血沉棕黄层和红细胞相;
c)收集血沉棕黄层并将其上样到密度梯度上;
d)收集由步骤c)的密度梯度获得的相间血液;
e)通过离心从相间血液分离MSC;
f)在培养物中接种2.5x105/cm2和5x105/cm2之间的MSC,并将其保存在补充有地塞米松、抗生素和血清的低葡萄糖生长培养基中。
在一个实施方案中,可以向MSC补充抗凝剂。非限制性例子是EDTA或肝素。
接种数量对于最终获得可接受浓度的纯的且有活力的MSC群至关重要,因为接种太密会导致扩增过程中大量细胞死亡,并且MSC群不均匀,而过于分散的接种将导致MSC集落形成很少或没有形成,所以不能或几乎不可能扩增,或者会花费太多时间。在这两种情况下,细胞的活力都会受到负面影响。
在本发明的一个优选实施方案中,MSC具有高细胞活力,其中至少90%、更优选至少95%、最优选100%的所述细胞是有活力的。
相间血液是血液单个核细胞(BMC)的来源,包括单核细胞、淋巴细胞和间充质干细胞(MSC)。优选地,淋巴细胞在37℃下被洗掉,而单核细胞在缺乏维持其存活所需的细胞因子的情况下在2周内死亡。这样,MSC就被纯化了。从相间血液中分离MSC优选通过相间血液的离心来进行,之后用合适的缓冲液例如磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀至少一次。
在进一步的实施方案中,本发明的MSC对于单核细胞和巨噬细胞是阴性的,两者都在0%和7.5%之间的范围内。
特别地,间充质细胞在生长培养基中保存至少2周。优选地,使用含有1%地塞米松的生长培养基,因为MSC的具体特征保留在所述培养基中。
最短2周(14天)、优选地3周(21天)后,培养瓶中将可见MSC集落。在随后的步骤g)中,将至少6×103干细胞/cm2转移至含有低葡萄糖、血清和抗生素的扩增培养基中,以扩增MSC。优选地,MSC的扩增将在最少五次细胞传代中发生。这样就可以获得足够的细胞。优选地,细胞在70%至80%汇合时分裂。MSC在培养中最多可维持50代。此后,就会出现活力丧失、衰老或突变形成的风险。
在另一个实施方案中,MSC扩增期间每次传代之间的群体倍增时间(PDT)应当在胰蛋白酶消化后0.7天至3天之间。MSC扩增期间每次传代之间的所述PDT优选在胰蛋白酶消化后0.7至2.5天之间。
在一个优选的实施方案中,根据本发明使用的MSC具有纺锤形形态。本发明的MSC的形态表征将该细胞分类为细长的成纤维细胞样纺锤形细胞。这种类型的细胞与其他具有小型自我更新细胞的MSC群体不同,这些小型自我更新细胞大多呈三角形或星形细胞形状,与具有大的、立方体或扁平的图案,并具有突出的细胞核的MSC群体也不同。具有该特定形态特征以及生物标记的MSC的选择使得本领域技术人员能够分离本发明的MSC。本领域技术人员可以使用相差显微镜容易地进行细胞的形态学分析。此外,MSC的大小和粒度可以使用流式细胞术中的前向和侧向散射图或本领域技术人员已知的其他技术来评估。
在另一个或进一步优选的实施方案中,MSC具有10μm至100μm之间的悬浮直径。用于本发明的MSC是根据大小/悬浮直径来选择的。优选地,MSC的细胞大小为10至100μm,更优选地15至80μm,更优选地20至75μm,更优选地25至50μm之间。优选地,通过过滤步骤进行基于细胞大小的细胞选择。例如,通过过滤系统按大小选择细胞浓度范围为每毫升103至107个MSC的MSC,其中所述细胞优选在低葡萄糖DMEM培养基中稀释,其中细胞经过双重过滤步骤使用40μm过滤器过滤。优选双重或多重过滤步骤。后者提供大量的单细胞群体并避免细胞聚集体的存在。此类细胞聚集体可能在细胞冷冻保存期间导致细胞死亡,并且都可能对细胞的进一步下游应用产生影响。例如,静脉内施用时,细胞聚集体可能会增加发生毛细血管栓塞的风险。
在一个实施方案中,所述组合物中的所述治疗有效量的MSC在105–107MSC之间。
在一个优选的实施方案中,根据本发明用于所述用途的MSC被配制用于通过静脉内注射或输注的方式在对象中施用。
在一个实施方案中,每次静脉内注射或输注施用治疗有效量的MSC,优选地每次注射或输注包含105至107个所述MSC的剂量。优选地,MSC通过静脉内注射施用。
在一个实施方案中,将治疗有效量的MSC施用于犬科动物或猫科动物患者,优选地每位患者施用105–107个MSC,更优选地105–106个MSC的剂量。在一个实施方案中,施用单次剂量。
对对象产生治疗益处的最小治疗有效剂量是每次施用至少105个MSC。优选地,每次施用通过静脉内注射并且每次施用包含105到5x105个之间的MSC,其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的。
在一个实施方案中,所述MSC施用至少两次、至少三次、至少四次、至少五次,优选地间隔施用。
在另一个或进一步的实施方案中,治疗进一步包括:多次施用MSC或包含MSC的组合物,例如多次静脉内施用每只犬科动物或猫科动物患者105–107个MSC的剂量,其中所述多次剂量在不同时间点施用,包括但不限于以下一个或多个时间点:间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔7天(1周)、间隔2周、间隔3周、间隔4周、间隔5周、间隔6周、间隔7周、间隔8周、间隔3个月、间隔6个月、间隔9个月和/或间隔1年。优选地,每次剂量间隔至少2周、更优选地间隔至少3周、甚至更优选地间隔至少4周、最优选地间隔至少6周施用。
在一个实施方案中,所述组合物包含存在于无菌液体中的所述MSC。这种无菌液体的非限制性例子是基本必需培养基(MEM),例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。所述无菌液体对于静脉内施用(例如通过注射或输注)于哺乳动物患者应当是安全的。
作为非限制性实例,所述无菌液体是基本必需培养基,例如基础培养基。本领域已知的基础培养基制剂包括但不限于Eagle基本必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α改良的基本必需培养基(alpha-MEM)、基本基础培养基(BME)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、基本改良的Eagle培养基(EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth's 10MB 752/1或Williams培养基E,及其修改和/或组合。上述基础培养基的组成在本领域中通常是已知的,并且根据培养的细胞的需要改变或调节培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的范围内。优选的基础培养基制剂可以是商业上可获得的那些制剂之一,例如DMEM,据报道其可维持MSC的体外培养,并且包括生长因子的混合物以使其适当生长、增殖、维持所需标志物和/或生物活性,或长期储存。
这种基础培养基制剂含有哺乳动物细胞发育所必需的成分,这些成分本身是已知的。通过说明而非限制,这些成分可包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P以及可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲剂(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸盐,例如丙酮酸钠、乙酸盐,例如乙酸钠)等。还显而易见的是,许多培养基可以作为含有或不含有丙酮酸钠的低葡萄糖制剂获得。
优选地,所述组合物包含至少75%、更优选地至少80%、甚至更优选地至少85%、最优选地至少90%的单细胞,并且其中所述单细胞具有10μm至100μm之间,更优选地在15μm与80μm之间,更优选地在20μm与75μm之间,更优选地在25μm与50μm之间的悬浮直径。如前所述,细胞的直径及其单细胞性质对于任何下游应用(例如静脉内注射)并且对于细胞的活力都至关重要。
优选地,所述组合物包含至少90%的MSC,更优选地它将包含至少95%的MSC,更优选地至少99%,最优选地100%的MSC。
包含MSC的无菌液体形式的组合物的体积和浓度优选地适合于静脉内注射。在一个实施方案中,药物组合物可以以无菌液体的形式施用于动物,所述无菌液体在最终调整后包含浓度为105–107个细胞/mL的MSC。
在一个实施方案中,每次静脉内注射或输注施用治疗有效量的MSC,优选地每次注射或输注包含105至107个所述MSC的剂量。
在一个实施方案中,药物组合物包含每mL所述组合物105–107个MSC、优选每mL所述组合物105至106个MSC、更优选每mL所述组合物105-5x105个MSC的治疗有效量的MSC。
在一个实施方案中,所述组合物的一个剂量具有约0.5至5ml、优选地约0.5至5ml、优选地约0.5至3ml、优选地约0.5至2ml、更优选地约0.5至1.5ml、最优选地约1ml的体积。在另一个或进一步的实施方案中,所述组合物的一个剂量具有最大约5ml、优选地最大约4ml、更优选地最大约3ml、更优选地最大约2ml的体积,最优选地,所述体积为约1ml。该量适合静脉内施用。
所述剂量可以配制在小瓶或预装注射器中。
在一个实施方案中,所述组合物还包含选自由富血小板血浆(PRP)、透明质酸、基于透明质酸的组合物、葡糖胺聚糖或基于葡糖胺聚糖的组合物或其任何组合组成的组的组分。已知这些在根据本发明的组合物的下游应用期间具有额外的有益功能。在一些情况下,可能需要将MSC与此类载体物质混合以增加组合物的有效性或产生协同效应。例如,所述载体物质有助于细胞组合物中MSC的归巢能力和免疫调节作用。例如,PRP是一种富含生长因子的物质,可在植入后刺激干细胞。优选地,出于相容性原因,干细胞和PRP均从相同的供体收获。载体物质也可用于抵消重力:干细胞遵循重力定律,因此在没有可以迁移的载体的情况下难以到达更高的病变。此外,载体物质本身对病理环境也有有益作用,在所述病理环境中它们有助于组织自身修复,并提供良好的干细胞微环境,以帮助该区域的细胞分化。透明质酸、葡糖胺聚糖或基于此的组合物的实例包括和
在一个实施方案中,每次注射向患者施用的组合物的体积根据患者的体重进行调整。在另一个实施方案中,每位患者施用105–107个MSC、优选地105-106个MSC、更优选地105-5x105个MSC、最优选地3x105个MSC的固定剂量。
发明人还发现,特别有效的治疗通过包含至少两个剂量的如上所述的任何实施方案中所用的MSC或所用的药物组合物的给药方案来实现。
因此,另一个实施方案涉及用于在犬科动物和猫科动物中治疗骨特应性皮炎的药物组合物,其中:
-治疗包括施用(优选地静脉内)第一量的所述组合物的步骤,所述第一量包含每位患者105–107个MSC的总剂量,以及
-治疗还包括施用(优选地静脉内)第二量的所述组合物的步骤,所述第二量包含105–107个MSC的第二总剂量,其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的,并且
其中所述第二剂量在第一量后1天、第一量后2天、第一量后3天、第一量后4天、第一量后5天、第一量后6天、第一量后7天(1周)、第一量后2周、第一量后3周、第一量后4周、第一量后5周、第一量后6周、第一量后7周、第一量后8周、第一量后3个月、第一量后6个月、9个月、和/或第一量后1年施用。优选地,每个剂量在第一量之后至少2周、更优选地在第一量之后至少3周、甚至更优选地在第一量之后至少4周、最优选地在第一量之后至少6周施用。
在一个实施方案中,所述第二剂量与第一剂量相同。在另一个实施方案中,所述第二剂量低于第一剂量。在又一个实施方案中,所述第二剂量高于第一剂量。
在一个实施方案中,可以向所述患者施用第三、第四和/或甚至第五量的所述组合物,优选地静脉内施用,其中所述第三、第四和/或第五量包括第三、第四和/或第五个105–107个MSC的总剂量,其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的。
在一个实施方案中,可以向所述患者施用第六或更多量的所述组合物,优选地静脉内施用,其中所述第六或更多量包含第六或更多个105–107个MSC的总剂量,其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的。
在一个实施方案中,本发明涉及用于在诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物或猫科动物中治疗AD相关临床和/或组织病理学症状的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物。MSC如上述任一实施方案中所描述。
如前所述,犬科动物和猫科动物(例如家犬或家猫)中特应性皮炎的典型临床症状可能包括瘙痒(发痒)和各种皮肤损伤。
AD最常见的临床症状和发病原因是瘙痒,瘙痒可能是非季节性的、季节性的或非季节性但季节性恶化的。瘙痒的严重程度可以使用评分方案来评估,例如瘙痒视觉模拟量表(pVAS)评分方案。pVAS是由10厘米长的线和单个问题组成的量表。它最常用于临床试验中测量瘙痒强度,具有高可信度和同时有效性的特点。
对于狗来说,这个评分系统可以基于 et al.,2019(https://doi.org/10.1111/j.1365-3164.2008.00728.x)的文章。在这个评分系统中,左端点代表“不痒”,右端点代表“极度痒”。它可以解释如下:VAS 0=正常(瘙痒不是问题),VAS2=“非常轻微的瘙痒/仅偶尔发作”,VAS 4=“轻度瘙痒(不在睡觉、吃饭、玩耍、运动时或分心时发生)”,VAS 6=“中度瘙痒/定期发作(瘙痒可能在夜间发生,但不会在吃饭、玩耍、运动或分心时发生)”,VAS 8=“严重瘙痒/长时间发作”,VAS 10=“极其严重瘙痒(需要物理上抑制瘙痒)”。
对于猫,可以使用经过调整的双重猫pVAS评分方案(见表1)。在此方案中,猫的舔和抓行为均按0到10的等级评分。
表1:双重猫瘙痒视觉模拟量表。
/>
在一个实施方案中,在施用MSC或包含MSC的药物组合物之前,将MSC或包含MSC的药物组合物用于治疗pVAS评分为至少1的犬科动物或猫科动物,并且在用MSC或包含MSC的药物组合物治疗的至少35%的犬科动物或猫科动物中施用一次或多次MSC或包含MSC的药物组合物后的1个月内,pVAS评分具有至少20%的相对降低。
AD的另一个临床症状是皮肤病变。可以使用皮肤损伤评分方案来评估这些皮肤损伤的严重程度。在狗中,该评分方案可以是例如犬特应性皮炎程度和严重程度指数(CADESI)-04评分方案。在该方案中,在20个典型受特应性犬影响的身体部位,为三种不同的病变(红斑、苔藓样变和脱发/表皮脱落)提供0至3分。轻度、中度和重度AD皮肤病变的基准分别为10、35和60。
临床上使用两种评估系统评估猫科动物病变的严重程度:猫科动物过敏性皮炎评分(SCORFAD)和猫科动物范围和严重程度指数(FeDESI)。SCORFAD系统以0到4的等级评估4种病变的严重程度和范围:擦伤、嗜酸性斑块、粟粒性皮炎和瘙痒性脱发。SCORFAD已得到部分验证,并被建议用于评估猫过敏性皮肤病的严重程度。FeDESI系统是对犬特应性皮炎范围和严重程度指数(CADESI)的改进,用于犬类。它以0到5的等级评估42个身体部位的红斑、表皮脱落/糜烂和自身诱发的脱发,其中猫获得的最高630点,Steffan J等人的文章(DOI:10.1111/j.1365-3164.2012.01071.x)中对此进行了描述。
由于患有AD的犬科动物和猫科动物通常存在多个皮肤损伤,因此与MSC的局部皮下施用相比,静脉内施用MSC或包含MSC的药物组合物在一次多个位置的治疗中提供了显著的益处。
在一个实施方案中,患有AD的犬科动物在施用MSC或包含MSC的药物组合物之前具有至少10的CADESI-04评分,并且在一次或多次施用MSC或包含MSC的药物组合物之后,在用MSC或包含MSC的药物组合物治疗的至少35%的犬科动物中,所述CADESI-04评分在1个月内具有至少25%、更优选地至少30%的相对降低。
在一个实施方案中,患有AD的猫科动物在施用MSC或包含MSC的药物组合物之前具有至少10的SCORFAD评分或FeDESI评分,并且在一次或多次施用MSC或包含MSC的药物组合物之后,在用MSC或包含MSC的药物组合物治疗的至少35%的猫科动物中,所述评分具有至少25%、更优选地至少30%的相对降低。
当更多地观察犬猫科和猫科动物AD的组织病理学症状时,犬科AD病变皮肤的组织病理与人类AD病变皮肤相似。表皮表现为轻度至重度增生和轻度至有时的斑片状海绵层水肿。存在淋巴细胞向表皮的胞吐作用。在真皮中,可见浅表性血管周皮炎,T淋巴细胞和树突状抗原呈递细胞混合浸润。
在一个实施方案中,MSC或包含MSC的药物组合物用于治疗诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物或猫科动物的皮肤损伤中具有浸润性T细胞的淋巴细胞性血管周皮炎。
皮肤变应原暴露后,皮肤中的抗原呈递细胞(APC)可以吸收和处理变应原。它们通过MHC分子在区域淋巴结表面呈递致敏肽来激活区域淋巴结中的幼稚T细胞。T细胞受体(TCR)对变应原-MHC复合体的特异性识别与同时的共刺激信号相结合,导致幼稚T细胞的活化、增殖和分化,随后T细胞皮肤归巢。这导致变应原特异性T细胞在皮肤中受影响的部位积聚。浸润性皮肤T细胞由CD4+和CD8+亚群组成,主要由真皮CD4+T细胞组成,根据表型和功能,这些细胞可细分为不同的群体,如辅助性T细胞1和辅助性T细胞2T细胞。
在一个实施方案中,被诊断有或患有特应性皮炎的所述犬科或猫科动物的所述皮肤病变在一次或多次施用MSC或包含MSC的药物组合物后表现出浸润性CD4+T细胞数量的减少,其中所述减少包括在所述犬科或猫科动物中施用所述MSC或包含MSC的药物组合物之前存在的浸润性CD4+T细胞数量的至少15%。在一个实施方案中,在施用所述MSC或包含MSC的药物组合物后,浸润性Th1和Th2细胞的数量均减少。在一个实施方案中,Th1和Th2细胞的这种减少通过细胞因子IFN-γ、IL-4和/或IL-13的分泌减少来反映。
在一个实施方案中,本发明涉及MSC或包含MSC的药物组合物,其用作诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物和猫科动物的预防性治疗。在一个实施方案中,MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物用于预防与AD恶化相关的一种或多种症状。在一个实施方案中,所述症状包括瘙痒。在另一个实施方案中,所述症状包括特应性皮炎相关的皮肤损伤。在另一个实施方案中,所述症状包括具有浸润性T细胞的淋巴细胞性血管周皮炎。在一个实施方案中,MSC或包含MSC的药物组合物用作预防性治疗,用于预防被诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物和猫科动物中与AD恶化相关的两种或更多种上述症状。
当失衡的免疫系统导致疾病时,可以使用免疫调节剂帮助将免疫系统推向正确的方向。
在第二方面,本发明涉及MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其在诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物和猫科动物的AD炎症反应的急性和/或慢性期用作免疫调节剂。
在一个实施方案中,所述免疫调节剂的施用通过与施用前浸润性CD4+T细胞的数量相比将浸润性CD4+T细胞的数量减少15%来减轻被诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物和猫科动物的皮肤损伤中的淋巴细胞性血管周皮炎。
在一个实施方案中,作为两种不同的CD4+辅助性T细胞亚群的浸润性Th1和Th2细胞的数量在施用所述免疫调节剂后均减少。在一个实施方案中,Th1和Th2细胞的这种减少通过细胞因子IFN-γ和/或IL-13和IL-4的分泌减少来反映。
在最后一个方面,本发明涉及包含外周血来源的MSC的特定药物组合物。所述组合物包含天然外周血来源的MSC,所述MSC是动物来源的,优选地哺乳动物来源的,并且以每毫升所述组合物105–107个MSC的浓度存在于无菌液体中,其中一个剂量的所述组合物的体积约为0.5至5毫升,其中所述MSC对间充质标志物CD29、CD44和CD90的测量结果为阳性,对MHCII类分子和CD45的测量结果为阴性,并且其中所述MSC的悬浮直径在10μm至100μm之间。
在一个实施方案中,所述药物组合物是静脉内施用的。在一个优选实施方案中,所述MSC是马来源的。
在一个实施方案中,所述组合物的所述一个剂量的体积为约0.5至5ml,优选地约0.5至5ml,优选地约0.5至3ml,优选地约0.5至2ml,更优选地约0.5至1.5ml,最优选地约1ml。在另一个或进一步的实施方案中,所述组合物的一个剂量具有最大约5ml的体积,优选地最大约4ml,更优选地最大约3ml,更优选地最大约2ml,最优选地所述体积为约1ml。该量适合静脉内施用。
在另一个或进一步优选的实施方案中,MSC的悬浮直径在15和80μm之间,更优选地在20和75μm之间、更优选地在25和50μm之间。
本领域普通技术人员将理解,用于治疗特应性皮炎的MSC或药物组合物的各方面的要素,或用作如上所述的免疫调节剂的MSC或药物组合物的各方面的要素回溯至本发明的药物组合物的方面。因此,本发明的所有方面都是相关的。在如上所述的一个方面中描述的所有特征和优点可以涉及这些方面中的任何一方面,即使它们是结合特定方面来描述的。
根据本发明使用的MSC或包含MSC的药物组合物,可能与如上所述的其它组分一起,将优选地冷冻,以允许MSC或组合物的长期储存。优选地,MSC或组合物将在低温和恒定温度下冷冻,例如低于-20℃的温度。这些条件允许节省MSC或组合物的储存,并使MSC能够在储存期间和解冻后保持其生物学和形态学特征以及其高细胞活力。
在更优选的实施方案中,根据本发明使用的MSC或包含MSC的药物组合物可以在-80℃的最高温度下,任选地在液氮中储存至少6个月。MSC冷冻的关键因素是低温培养基,特别是包含DMSO的低温培养基。DMSO在冷冻过程中防止培养基中形成冰晶,但在高浓度下可能对细胞有毒。在优选实施方案中,DMSO的浓度包括高达20%,更优选地高达15%,更优选地在冷冻剂中DMSO的浓度包括10%。低温培养基还包括低葡萄糖培养基,例如低葡萄糖DMEM(Dulbecco修饰的Eagle培养基)。
之后,根据本发明用于所述用途的MSC或包含MSC的药物组合物优选地在施用前在室温附近的温度下解冻,优选地在20℃和37℃之间的温度下,更优选地在25℃和27℃之间,并且在最长20分钟,优选地最长10分钟,更优选地最长5分钟的时间跨度内解冻。
此外,MSC或组合物优选地在解冻后2分钟内施用,以保护MSC的活力。
本发明通过以下非限制性实施例进一步描述,这些非限制性实例进一步说明了本发明,并且它们不旨在也不应被解释为限制本发明的范围。
实施例和/或附图说明
现在将参照以下实施例进一步举例说明本发明。本发明决不限于所给出的实施例。实施例1:客户所有的患有特应性皮炎的狗的可行性研究
设置:
本研究的目的是评估单次静脉内注射ePB-MSC(马外周血来源的MSC)治疗患有特应性皮炎的狗的可行性。
ePB-MSC的分离与培养
根据先前描述的方法,ePB-MSC是从自一匹供体马的颈静脉采集的静脉血中分离的。在培养ePB-MSC之前,如Broeckx等人2012所述,测试血清中是否存在多种可传播疾病。随后,根据良好生产规范(GMP)指南,在GMP认证的生产场所培养干细胞,直到传代(P)5,并对其活力、形态、细胞表面标志物的存在和群体倍增时间进行表征。特定细胞表面标志物的存在(分化簇CD29、CD44和CD90)和不存在(主要组织相容性复合体(MHC)II和CD45)的评估通过使用流式细胞术完成,如前所述(Spaas等人,2013)。然而,详细的表达和分泌模式先前已在WO 2020/182935中描述。
使用锥虫蓝评估细胞活力。然后,将细胞进一步培养至P10,用胰蛋白酶消化并以最终浓度300,000个细胞/mL重悬于含有10%二甲基亚砜(DMSO)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)低葡萄糖中。ePB-MSC在-80℃下储存在冷冻小瓶中,直到进一步使用。通过不存在需氧细菌、厌氧细菌、真菌、内毒素和支原体来测试最终产品的无菌性。
研究
在两种兽医实践中,共有11名患有自然发生的特应性皮炎的犬患者接受ePB-MSC治疗。患者入选受以下入选标准的限制:基于第0天的一般体检和入组前至少2个月的病史,入组前至少1个月出现犬特应性皮炎症状,犬特应型皮炎程度和严重程度指数-04(CADESI-04)-得分至少为10,除目标疾病外的总体健康状况良好。患有以下病况和治疗的患者被排除在研究之外:患有季节性皮炎的狗,除非敏感期是已知的,如果在敏感期结束时没有治疗,正在进行的皮质类固醇治疗,任何实际或预期的病况,兽医认为其会局限或限制患者在研究期间的成功参与(例如寄生虫感染,如蠕虫、跳蚤等)。
评估前至少进行2个月的身体检查和病史评估。此外,通过对CADESI-04进行评分来评估皮肤(见下表2)。所有检查都由经验丰富的兽医进行。如果动物符合入选标准,但没有任何排除标准,则对其进行静脉内注射300,000个ePB MSC。接下来,由经验丰富的兽医在三个随访评估点对狗进行临床评估:第28天、第56天和第84天。在评估点,通过执行CADESI-04分级系统对治疗效果进行调查和评分。在每次随访期间,都会进行全面的身体检查。在兽医访视之间,主人每天评估异常行为或不良事件,并被要求填写主人问卷,内容涉及第0天、第14天、第42天、第84天和第168天家中狗的食欲、活动、舒适度、瘙痒(使用pVAS评分方案)、皮肤发红和脱发。
结果:
不同治疗的狗的CADESI-04评分治疗后的初步结果如表2所示。1号至3号狗用低效批次进行处理。如“发明详述”中所述,通过MLR评估免疫调节,然而该特定批次不能充分抑制被刺激的PBMC的增殖。这也转化为临床疗效,我们发现三分之二的狗对治疗没有反应。因此,这些狗被排除在有效ePB-MSC的疗效评估之外。
在评估有效的ePB-MSC的功效时,结果显示,在第28天,接受ePB-MSC治疗的8只狗中,有5只的CADESI评分提高了至少45%(平均改善38.27%;50%中(8只狗中有4只)CADESI-04减少>50%)。此外,根据主人问卷调查,第14天,60%的患者的pVAS评分相对下降至少20%(信息适用于5只狗)。第28天可任选评估PVAS。在可获得PVAS评分的5只狗中,有4只相对下降了至少50%。
结论:
总之,静脉内注射30万ePB-MSC是治疗犬特应性皮炎的有效治疗方法。初步结果显示,在大多数接受治疗的狗中,对瘙痒症以及与该疾病相关的典型皮肤病变都有有益效果。
表2:不同评估时间点每只动物的CADESI-04评分
1狗在两次访视之间以apoquel开始,该评分对于评估ePB-MSC的疗效不可靠
*因目标疾病而过早退出
°因主人依从性而过早退出
实施例2:对患有特应性皮炎的客户所有的猫的可行性研究
设置:
本研究的目的是评估单次静脉内注射ePB-MSC(马外周血来源的MSC)治疗患有特应性皮炎的猫的可行性。
ePB-MSC的分离和培养如上面实施例1中所述进行。
研究
在兽医实践中,患有自然发生的特应性皮炎的猫科动物患者接受ePB-MSC治疗。特应性皮炎是根据Favrot等人的临床诊断标准(https://doi.org/10.1111/j.1365-3164.2011.01006.x)诊断的。每只动物至少满足Favrot的6项诊断标准。根据第0天的一般体检和登记前至少2个月的病史,除目标疾病外,所有纳入的动物的总体健康状况良好。根据毛发镜检查、皮肤刮除和细胞学检查,排除了其他瘙痒性疾病。适当的抗跳蚤药物和严格的8周消除饮食分别排除了对跳蚤叮咬的超敏反应和食物过敏。有以下情况和治疗的患者被排除在研究之外:正在进行的皮质类固醇治疗,兽医认为会局限或限制患者在研究期间的成功参与的实际的或预期的任何病况(例如寄生虫感染,如蠕虫、跳蚤等)。
评估前至少进行2个月的身体检查和病史评估。此外,通过FeDESI评分打分来评估皮肤。所有检查都由经验丰富的兽医进行。如果动物符合入选标准,但没有任何排除标准,则对其进行静脉内注射300,000个ePB MSC。接下来,由经验丰富的兽医在三个后续评估点:第28天、第56天和第84天对猫进行临床评估。在评估点,通过执行FeDESI分级系统对治疗效果进行调查和评分。在每次随访期间,都会进行全面的身体检查。在兽医就诊之间,主人每天评估异常行为或不良事件,并被要求填写主人问卷(双重猫pVAS评分方案),内容涉及第0天、第14天、第42天、第84天和第168天家中猫的瘙痒症。
结果:
初步结果显示,用ePB-MSC治疗的16只猫中有13只在第28天的FeDESI评分有所改善。此外,根据主人问卷,大多数猫患者的pVAS评分在第28天下降。
结论:
总之,静脉内注射300,000个ePB-MSC是治疗猫科动物特应性皮炎的有效方法。初步结果显示,在大多数接受治疗的猫中,对瘙痒症以及与该疾病相关的典型皮肤病变都有有益的效果。
实施例3:用ePB-MSC治疗前后狗的混合淋巴细胞反应(MLR):
设置:
在犬特应性皮炎(cAD)的急性期,特应性炎症主要由辅助性T细胞2表达的增加驱动,并在疾病的慢性期变为辅助性T细胞(Th2)和辅助性T细胞1(Th1)均增加。为了进一步研究ePB-MSC在治疗犬特应性皮炎中的作用模式,使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定法在体外研究了ePB-MSC对犬辅助性细胞亚群1和2表达的影响。用ePB-MSC与伴刀豆球蛋白A(conA)刺激的犬外周血单个核细胞(PBMC)共同孵育建立MLR测定。共孵育4天后,针对细胞外标志物对PBMC进行染色,以使用流式细胞术评估增殖的PBMC群体中Th1和Th2的特异性表达。此外,使用市售的IFN-γ和IL-13试剂盒对阳性对照的上清液和MLR测定的共培养样品进行了两次ELISA测定。这两种细胞因子分别由Th1和Th2分泌,并将用于支持T亚群分析。
结果:
MLR测定与辅助性T细胞亚群分析相结合的结果显示,与阳性对照相比,共培养样品中增殖的CD4+细胞,更特别地Th1和Th2群体的绝对表达降低(图1B)。ELISA测定结果进一步支持了这种下降,显示与阳性对照相比,共培养样品上清液中的IFN-γ(图2)和IL-13(图3)均下降。此外,当观察共孵育后在该小的增殖PBMC群体中的相对表达时,与阳性对照相比,共培养后增殖的PBMC群体中Th2群体的表达显著降低。相反,与阳性对照相比,共孵育后Th1群体增加(图1A)。
结论:
在该体外实验中,ePB-MSC的免疫调节特性通过CD4+细胞的绝对数量的显著减少,更具体地说是该群体的Th1和Th2亚群的减少而得到证实。这些结果表明ePB-MSC对严重参与cAD急性期和慢性期的白细胞的Th1和Th2亚群进行免疫调节。此外,当观察相对数量时,诱导了从Th2向Th1亚群的转变。这些结果证实了ePB-MSC在治疗cAD中的治疗潜力,并为ePB-MSC的体内作用模式提供了见解。
实施例4:健康猫的混合淋巴细胞反应(MLR)
设置:
为了研究ePB(马外周血来源的)-MSC在猫中的免疫调节特性,根据本发明的一个实施方案,在三个时间点(T0、T1和T2)用包含在DMEM低葡萄糖和10%DMSO中的3x105个ePB-MSC的组合物静脉内(IV)以1ml的体积注射10只健康猫,在每次注射之间间隔2周。这10只健康的猫,4只雄性和6只雌性,属于不同的品种,具体是欧洲短毛猫、欧洲长毛猫和缅因库恩猫,平均年龄为6±4岁。
ePB-MSC的分离与培养
根据先前描述的方法,ePB-MSC是从自一匹供体马的颈静脉采集的静脉血中分离的。在培养ePB-MSC之前,如Broeckx等人2012所述,测试血清中是否存在多种可传播疾病。随后,根据GMP指南,在良好生产规范(GMP)认证的生产场所培养干细胞,直到传代(P)5,并对其活力、形态、细胞表面标志物的存在和群体倍增时间进行表征。特异性细胞表面标志物的存在(分化簇CD29、CD44和CD90)和不存在(主要组织相容性复合体(MHC)II和CD45)的评估通过使用流式细胞术完成,如前所述(Spaas等人,2013)。然而,详细的表达和分泌模式先前已在WO 2020/182935中描述。
使用锥虫蓝评估细胞活力。然后,将细胞进一步培养至P10,用胰蛋白酶消化并以最终浓度300,000个细胞/mL重悬于含有10%二甲基亚砜(DMSO)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)低葡萄糖中。ePB-MSC在-80℃下储存在冷冻小瓶中,直到进一步使用。通过不存在需氧细菌、厌氧细菌、真菌、内毒素和支原体来测试最终产品的无菌性。
研究
所有猫每天都会由看护人检查,并在第0天(T0)、第2周(T1)、第4周(T2)和第6周(T3)由兽医进行全面体检,包括评估直肠温度、心率、呼吸频率、粘膜外观和毛细血管再充盈时间,以及血液学和生化分析。
此外,在T0(治疗施用前)和T3(最后一次(第三次)治疗后两周)用每只猫的新鲜外周血单个核细胞(PBMC)进行改良混合淋巴细胞反应(MLR)。该测定研究ePB-MSC的免疫调节(通过刺激的PBMC)特性。为了刺激PBMC,将它们与伴刀豆球蛋白A(ConA)共同孵育。
在T0、T1和T2,一般体检后,给猫静脉内(i.v.)注射3x105个ePB-MSC。在手掌中解冻冷冻管后,检查内容物的透明度和澄清度,并立即使用22G i.v.导管注射细胞悬液。
在MLR测定过程中,通过将这些细胞与伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的猫PBMC共孵育四天并评估猫PBMC的增殖来研究ePB-MSC的免疫调节特性。未刺激的猫PBMC或刺激的猫PBMC分别用作阴性和阳性对照。因此,使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯7-氨基放线菌素D(CFSE-7AAD)标记,用流式细胞术评估PBMC增殖(%)。该测定在所有猫的治疗前后进行。
为此,将每只猫的猫静脉血收集到EDTA采血管中,用HBSS稀释,并在等量的Percoll密度梯度上分层。在Percoll上离心后,收集含有PBMC的界面。将PBMC洗涤3次。接下来,将每只猫的PBMC浓度调整为每毫升1x106个细胞。然后,用CFSE标记PBMC,每mL PBMC细胞悬浮液使用1μL CFSE溶液。将CFSE标记的PBMC洗涤并重悬于MLR培养基(DMEM,补充有20% FBS、1%AB/AM(抗生素/抗真菌剂)和1% BME(β-巯基乙醇)100x)中,终浓度为2x106个PBMC/mL。然后,将ConA溶液添加到除阴性对照样品之外的板的所有孔中。最后,将指定猫的PBMC添加到相关孔中。孵育4天后,将所有样品转移至FACS管中,离心并用7-AAD染色以进行流式细胞术分析。
结果:
在两个时间点(T0和T3),与相关阴性对照(T0:3.4±2.7%,T3:4.9±1.3%)相比,与受刺激的猫PBMC共培养的ePB-MSC的增殖(T0:12.6±10%,T3:26.2±9.8%)显著更高(p值分别为0.05和0.008)。然而,共培养物的增殖显著低于在基线时(79.7±4.7%)(p值=0.008)和治疗后(83.2±5.7%)(p值=0.008)的阳性对照。与基线(12.6±10%)相比,治疗后(26.2±9.8%)的ePB-MSC与刺激的猫PBMC共培养物中的平均PBMC增殖没有显著差异(p值=0.017)(图1)。
结论:
目前的研究结果证实了ePB-MSC对猫PBMC的免疫调节特性。这表明异种ePB-MSC可用于猫的治疗。
实施例5:目标动物安全性:狗
为了评估单次和重复静脉内施用ePB-MSC对狗的安全性,在本实施例中评估了几个临床安全性参数。
方法
48只健康的专门饲养的比格犬被随机分配接受测试项目(n=40)或参考项目(n=8)的静脉内注射。用测试项目治疗的狗在第0天接受3x105ePB-MSC(1mL)(n=8),9x105ePB-MSC(3mL)(n=8)和15x105 ePB-MSC(5mL)(n=8)(单次注射治疗组)或第0、42和84天接受3x105ePB-MSC(1mL)(n=8)和15x105 ePB-MSC(5mL)(n=8)(重复注射治疗组)。注射后,所有狗都要接受为期252天的评估。所有狗每天都要接受临床观察,以评估不良事件的发生情况。采集血液和尿液样本进行血液学、凝血和生化分析。在研究期结束时,对所有动物实施安乐死,以进行彻底的尸检和组织学分析,并分析ePB-MSC的保留情况。
结果
对照组和治疗组之间没有观察到临床安全参数的明显差异。然而,这与任何不良事件无关,总体平均值在参考范围内。在体检、临床和注射部位观察期间,没有一只狗表现出任何临床异常。体重没有发生明显下降。没有观察到与研究药物相关的不良事件,并且实验室结果没有表明研究期间有任何明显的异常。根据文献研究,整个研究中的异常发现(网织红细胞增多除外)可被认为是偶然的且与测试项目无关。在尸检和组织病理学评估过程中未观察到异位组织。此外,观察到的所有(轻微)异常不太可能与测试项目相关。PCR分析发现分析的样品中不存在eMSC,这表明MSC不会长期驻留在组织或循环中。
结论
该测试项目被证明对于静脉内使用/施用是安全的。
本发明决不限于实施例中描述的和/或附图中所示的实施方案。相反,根据本发明的方法可以以许多不同的方式实现而不背离本发明的范围。
Claims (25)
1.间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,用于在犬科动物和猫科动物中治疗特应性皮炎(AD)。
2.根据权利要求1用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC是天然的。
3.根据权利要求1-2任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC是源自血液的,优选地是源自外周血的。
4.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC是同种异体或异种MSC,优选地是异种MSC。
5.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC是动物来源的,优选地是哺乳动物来源的,更优选地是马来源的。
6.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC是静脉内施用的。
7.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中每只犬科动物或猫科动物施用105-107个MSC的剂量。
8.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中施用单剂量。
9.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中施用多个剂量,每个剂量在不同时间点施用。
10.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述组合物的一个剂量具有最大约5ml的体积,优选地所述体积为约1ml。
11.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC对于MHC II类分子和/或CD45的测量为阴性。
12.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC对于间充质标志物CD29、CD44和CD90的测量为阳性,并且对于MHC II类分子和CD45的测量为阴性。
13.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC当存在于炎性环境或状况中时分泌免疫调节性前列腺素E2细胞因子。
14.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中当存在于炎性环境或状况中并且与具有相同特征但未经受所述炎性环境或状况的细胞相比时,所述MSC具有至少一种选自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合的分子的分泌增加;和/或IL-1的分泌减少。
15.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中当存在PBMC时,所述MSC刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的表达和/或当存在PBMC时,所述MSC抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β、IL-13或其组合的分泌。
16.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述MSC存在于无菌液体中。
17.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的组分:富血小板血浆(PRP)、透明质酸、基于透明质酸的组合物、葡糖胺聚糖或基于葡糖胺聚糖的组合物或其任何组合。
18.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述治疗是治疗诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物和猫科动物中的AD相关的临床和/或组织病理学症状。
19.根据权利要求18用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述临床症状是瘙痒并且其中使用瘙痒视觉模拟量表(pVAS)评分方案评估所述瘙痒的严重程度。
20.根据权利要求19用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中在施用所述MSC或所述包含MSC的药物组合物之前,所述犬科动物或猫科动物的pVAS评分为至少1,并且在一次或多次施用所述MSC或所述包含MSC的药物组合物后,在至少35%的用所述MSC或所述包含MSC的药物组合物治疗的犬科动物或猫科动物中,所述pVAS评分在1个月的时间内相对降低至少20%。
21.根据权利要求18用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述临床症状包括AD相关皮肤损伤,并且其中通过使用皮肤损伤评分方案,例如犬科动物中的犬科动物特应性皮炎范围和严重性指数(CADESI)-04评分方案和猫科动物中的猫科动物过敏性皮炎评分(SCORFAD)或猫科动物范围和严重程度指数(FeDESI)评分方案,计算皮肤损伤评分来评估所述皮肤损伤的严重程度。
22.根据权利要求21用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中患有AD的犬科动物或猫科动物在施用所述MSC或所述包含MSC的药物组合物之前具有至少10的皮肤损伤评分,并且在一次或多次施用所述MSC或所述包含MSC的药物组合物后,在1个月的时间内用所述MSC或所述包含MSC的药物组合物治疗的至少35%的犬科动物或猫科动物中,所述评分相对降低至少25%,更优选地降低至少30%。
23.根据权利要求18用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其中所述组织病理学症状包括皮肤损伤中具有浸润性T细胞的淋巴细胞性血管周皮炎。
24.MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物,其在诊断有或患有特应性皮炎的犬科动物和猫科动物的AD炎症反应的急性和/或慢性期期间用作免疫调节剂。
25.包含外周血来源的MSC的药物组合物,所述MSC是动物来源的,优选地是哺乳动物来源的,并且以每mL所述组合物105-107个MSC之间的浓度存在于无菌液体中,其中一个剂量的所述组合物具有约1ml的体积,其中所述MSC对间充质标志物CD29、CD44和CD90的测量为阳性,并且对MHC II类分子和CD45的测量为阴性,并且其中所述MSC具有在10μm和100μm之间的悬浮直径。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP21184480.8 | 2021-07-08 | ||
EP21184480 | 2021-07-08 | ||
PCT/EP2022/068551 WO2023280834A1 (en) | 2021-07-08 | 2022-07-05 | Mesenchymal stem cells for use in the treatment of atopic dermatitis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117897165A true CN117897165A (zh) | 2024-04-16 |
Family
ID=76845067
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202280057627.3A Pending CN117897165A (zh) | 2021-07-08 | 2022-07-05 | 用于治疗特应性皮炎的间充质干细胞 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230014698A1 (zh) |
EP (1) | EP4366748A1 (zh) |
CN (1) | CN117897165A (zh) |
AU (1) | AU2022308332A1 (zh) |
TW (1) | TW202320818A (zh) |
WO (1) | WO2023280834A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023280832A1 (en) * | 2021-07-08 | 2023-01-12 | Boehringer Ingelheim Veterinary Medicine Belgium | Mesenchymal stem cells for use in the treatment of osteoarthritis in animals |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BE1020480A5 (nl) | 2012-10-01 | 2013-11-05 | Global Stem Cell Technology | Werkwijze voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed van zoogdieren, en gebruik ervan. |
KR20140076198A (ko) * | 2012-12-12 | 2014-06-20 | 서울대학교산학협력단 | 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
WO2014203269A2 (en) * | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Kasiak Research Pvt. Ltd. | Method for isolation, purification and industrial scale expansion of canine adipose tissue derived mesenchymal stem cells |
EP3419635B1 (en) * | 2016-02-22 | 2022-01-05 | Centauri Biotech, S.L. | Pharmaceutical or veterinary cell compositions comprising mesenchymal stromal cells (mscs) and dimethyl sulfoxide (dmso) |
CA3127868A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Primegen Biotech, Llc | Treatment of atopic dermatitis using mesenchymal stem cells and immune modulation |
US20220154147A1 (en) * | 2019-03-12 | 2022-05-19 | Global Stem Cell Technology | Immunomodulating mesenchymal stem cells |
WO2021226455A1 (en) * | 2020-05-07 | 2021-11-11 | Primegen Biotech, Llc | Methods and compositions for reducing joint inflammation using mesenchymal stem cells |
-
2022
- 2022-07-05 WO PCT/EP2022/068551 patent/WO2023280834A1/en active Application Filing
- 2022-07-05 AU AU2022308332A patent/AU2022308332A1/en active Pending
- 2022-07-05 EP EP22744180.5A patent/EP4366748A1/en active Pending
- 2022-07-05 CN CN202280057627.3A patent/CN117897165A/zh active Pending
- 2022-07-05 US US17/857,495 patent/US20230014698A1/en active Pending
- 2022-07-05 TW TW111125064A patent/TW202320818A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2022308332A1 (en) | 2024-01-18 |
TW202320818A (zh) | 2023-06-01 |
EP4366748A1 (en) | 2024-05-15 |
WO2023280834A1 (en) | 2023-01-12 |
US20230014698A1 (en) | 2023-01-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210260129A1 (en) | Cell Expansion Methods and Therapeutic Compositions | |
ES2914692T3 (es) | Células madre adhesivas derivadas de cordón umbilical mejoradas, método de preparación para las mismas, y uso de las mismas | |
Jalalie et al. | Distribution of the CM-Dil-labeled human umbilical cord vein mesenchymal stem cells migrated to the cyclophosphamide-injured ovaries in C57BL/6 mice | |
TW200902718A (en) | Procurement, isolation, and cryopreservation of endometrial/menstrual cells | |
WO2014053418A2 (en) | Method for obtaining mesenchymal stem cells and use thereof | |
Arévalo-Turrubiarte et al. | Analysis of mesenchymal cells (MSCs) from bone marrow, synovial fluid and mesenteric, neck and tail adipose tissue sources from equines | |
CN113396333A (zh) | 使用间充质干细胞和免疫调节治疗特应性皮炎 | |
US20210393697A1 (en) | Use of mesenchymal stem cells for the treatment of inflammation | |
Debosschere et al. | Safety and immunomodulatory properties of equine peripheral blood-derived mesenchymal stem cells in healthy cats | |
US20230346842A1 (en) | Methods and Compositions For Reducing Joint Inflammation Using Mesenchymal Stem Cells | |
CN117897165A (zh) | 用于治疗特应性皮炎的间充质干细胞 | |
JP2017520582A (ja) | 関節リウマチ治療のための間葉系間質細胞 | |
US20170224736A1 (en) | Method and apparatus for recovery of umbilical cord tissue derived regenerative cells and uses thereof | |
US20230012590A1 (en) | Mesenchymal stem cells for use in the treatment of chronic gingivostomatitis | |
US20230014549A1 (en) | Mesenchymal stem cells for use in the treatment of chronic kidney disease | |
KR20130056782A (ko) | 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포 | |
US20230022259A1 (en) | Mesenchymal stem cells for use in the treatment of osteoarthritis in animals | |
KR102011634B1 (ko) | 향상된 산후 부착형 세포 및 그의 용도 | |
JP2024524519A (ja) | 慢性腎臓病の治療で使用するための間葉系幹細胞 | |
JP2024525062A (ja) | 慢性歯肉口内炎の治療で使用するための間葉系幹細胞 | |
JP2024524520A (ja) | 動物の変形性関節症の治療で使用するための間葉系幹細胞 | |
WO2024133886A1 (en) | Primed mesenchymal stem cells for use in the treatment of chronic kidney disease | |
WO2024033462A1 (en) | Mesenchymal stem cells for use in the treatment of insect-bite hypersensitivity in equines |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication |