CN117897141A - 富含类黄酮喷雾干燥粉末 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包括疏水性类黄酮和可食用磷酸盐如磷酸钠或磷酸钾盐的喷雾干燥粉末。与未加工类黄酮相比，喷雾干燥粉末形式的疏水性类黄酮具有高得多的分散性和溶解性。

Description

富含类黄酮喷雾干燥粉末
1.技术领域
本发明总体涉及一种包括疏水性类黄酮和可食用磷酸盐如磷酸钠或磷酸钾盐的喷雾干燥粉末。喷雾干燥粉末具有使其特别适于掺入食物和饮料中以增加其类黄酮含量的性质。
2.背景技术
类黄酮是由许多植物作为次级代谢物产生的多酚化合物。它们定义为存在由通过C3连接体相互连接的两个苯环组成的结构(杂环吡喃环)。最常见的类黄酮包括以下：芦丁、柚皮素和橙皮素(黄烷酮)；芹菜素(黄酮)；异鼠李素、山奈酚和槲皮素(黄酮醇)；染料木黄酮和黄豆苷原(异黄酮)；表没食子儿茶素、表儿茶素和没食子儿茶素(黄烷-3-醇/儿茶素)和花青素、飞燕草素、花葵素和锦葵色素(花色素苷)。
许多类黄酮具有与其抗氧化、抗菌和/或抗炎性质相关的治疗和药理学性质。不幸的是，很少有人能够获得允许他们获得这些化合物的全部益处的食物供应类型。
例如，芦丁(槲皮素-3-鼠李糖苷)是众所周知的黄酮苷，大量存在于天然来源如荞麦种子和果实(特别是柑橘和它们的果皮)中。该分子包含黄酮醇槲皮素和二糖芸香糖。芦丁在分子水平上具有有效的抗氧化性质。由于其显著的自由基清除性质，芦丁显示出治疗和药理学作用，例如抗炎、抗糖尿病、降血脂和抗癌性质。然而，在日常饮食中需要高剂量的这种类黄酮化合物以实现这些益处。目前市场上的补充剂(营养药物)推荐每天500mg的口服剂量。在典型的西方饮食中类黄酮如芦丁的每日摄入量低得多--中值摄入量仅为约10mg/天。
虽然胶囊、片剂和小药囊形式的营养补充物提供了益处，但是它们可能由于类黄酮不稳定而失效，并且可能味道和/或气味令人不快。因此，许多人不喜欢消费它们或只是忘记定期服用它们足以提供益处。因此，向食品中添加类黄酮将使更广范围的人受益于其治疗性质。
像许多其它有益的类黄酮一样，芦丁本质上是疏水性的。其它疏水性类黄酮包括姜黄素、橙皮苷、柚皮素和儿茶素。不幸的是，难以用在油和水中溶解性差的疏水性类黄酮强化食物。它们的低溶解度意味着加入的类黄酮将在液体食品(饮料)中沉淀并在半固体或固体食物中产生砂砾质地。
许多类黄酮还可以与食物成分如蛋白质和脂肪相互作用，改变食物的物理化学和感官特性。类黄酮本身也可经历化学和酶促降解。此外，难溶性类黄酮具有非常低的溶解速率以及在胃肠道中有限的释放曲线，这导致它们在人体内的低生物利用度。
因此，对包封/包埋疏水性类黄酮的方法的兴趣日益增加，使得它们可以成功地加入到食物系统中。已经开发了多种递送系统；例如，乳剂、脂质体、凝聚层和凝胶，其由不同的天然聚合物如多糖、蛋白质和磷脂组成。然而，由于需要使用GRAS(通常被认为是安全的)材料，并且仅对天然成分有强烈的消费者偏好，因此选择在一定程度上受到限制。
此外，许多类黄酮递送载体的制备涉及化学交联和/或有机溶剂如乙醇和甲醇。这些试剂在用于人类消费的产品中是不希望的，并且从食品中除去溶剂是不具成本效益的。目前可用的包封/递送方法通常还具有低的包封效率和/或负载能力。其它方法包括昂贵或技术上难以放大的制造步骤。
食物蛋白质如酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白等已广泛用作营养制品的递送载体的组分。特别地，酪蛋白形成许多利用其胶束结构的营养药物递送系统的一部分。已知酪蛋白自组装形成约40-300nm直径的酪蛋白胶束，其可包封一些化合物，如果解离，然后在待包封的化合物存在下重新组装。酪蛋白胶束的解离可以通过物理方法实现，例如使用流体静压，或通过化学方法实现，例如在含水乙醇中加热。酪蛋白胶束也可以在碱性条件下解离。
例如，Pan等人(Pan，2014)描述了通过酪蛋白酸钠(NaCas)的碱解离，随后加入酸以达到中性pH生产约100nm的酪蛋白纳米颗粒。将姜黄素加入到NaCas的碱性溶液中，然后中和，得到姜黄素包封在重组的酪蛋白颗粒中的产品。不幸的是，这不能提供用于食物强化的产品。
首先，胶束结构将仅在中性pH下在稀溶液中重新组装。因此，该方法掺入了相对少量的姜黄素(1mg/mL)和NaCas(2.0％)，在可以回收包封的产品之前留下不经济的待除去的大量水。增加姜黄素的浓度仅降低该方法的包封效率(EE)，其开始不高；(1mg/mL姜黄素在最长的孵育时间仅给出约70％的EE)。
此外，包封的产品具有类黄酮的低负载能力(LC)，因此产品中类黄酮的比例低。这意味着为了提供治疗益处，需要将如此大量的产品掺入食物中，以致食物的性能将受到损害。
WO2020/095238中描述的新的类黄酮递送系统克服了上述许多困难。该系统包括疏水性类黄酮和包埋在蛋白质基质中的蛋白质的共沉淀物。通过碱性溶解类黄酮，随后与蛋白质共沉淀来制备共沉淀物。干燥的共沉淀产物具有类黄酮的高负载能力，但高度可溶和可分散，使其适合用作食品添加剂。
不幸的是，由于其在水溶液中相对较大的粒度，这种共沉淀的类黄酮/蛋白质产品产生不透明的分散体，因此不适合掺入透明或半透明的液体食品中。
因此，仍然需要一种产品，其至少部分地克服与疏水性类黄酮递送相关的挑战，或至少为公众提供有用的选择。本发明的其它目的可从以下仅作为示例给出的描述中变得明显。
在本说明书中，当提及外部信息源时，包括专利说明书和其它文献，这通常是为了提供用于讨论本发明特征的上下文。除非另有说明，否则对这样的信息源的引用不应解释为在任何权限下承认这样的信息源是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。
3.发明内容
在一个方面，本发明提供了一种喷雾干燥粉末，其包含疏水性类黄酮和可溶性可食用磷酸盐，基本上由其组成或由其组成。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末还包含一种或多种选自蛋白质、多糖、脂质和非离子表面活性剂的大分子化合物。
在一个实施方案中，疏水性类黄酮具有约2至约4的疏水性和/或在高pH(优选高于约10)下可溶于水溶液中。
在一个实施方案中，疏水性类黄酮选自芦丁、柚皮素、槲皮素、姜黄素、橙皮苷、α-萘黄酮(ANF)、β-萘黄酮(BNF)、儿茶素和儿茶素衍生物、白杨素、木犀草素、杨梅黄酮和花色素苷。
在一个实施方案中，疏水性类黄酮选自由以下各项组成的组：由芦丁、柚皮素、儿茶素、姜黄素和橙皮苷。
在另一方面，本发明提供了一种制备包括疏水性类黄酮和可溶性可食用磷酸盐的喷雾干燥粉末的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向起始pH为约7.1至约10的可溶性可食用磷酸盐的水溶液中加入疏水性类黄酮，
(b)在约20℃至约85℃的温度下搅拌所述混合物直至所述疏水性类黄酮溶解，同时将所述pH保持在约起始pH；
(c)调节pH为约7.0至约7.5；以及
(d)将溶液喷雾干燥以提供粉末产品。
在一个实施方案中，在步骤(b)之后，在步骤(c)中调节pH之前，将选自蛋白质、多糖、脂质和非离子表面活性剂的一种或多种大分子化合物加入到疏水性类黄酮的溶解溶液中。
一方面，本发明提供一种食品，其包括本发明的喷雾干燥粉末。
在一个实施方案中，食品还包含一种或多种选自蛋白质、多糖、脂质和非离子表面活性剂，优选蛋白质的大分子化合物。
4.附图说明
现在将仅通过示例并参考附图来描述本发明，在附图中：
图1示出了在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中测量的未处理的/未加工的芦丁和一系列芦丁喷雾干燥粉末的分散颗粒的粒度测量。
图2示出了在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中测量的未处理的/未加工的柚皮素和一系列柚皮素喷雾干燥粉末的分散颗粒的粒度测量。
图3示出了在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中测量的未处理的/未加工的橙皮苷和一系列橙皮苷喷雾干燥粉末的分散颗粒的粒度测量。
图4示出了在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中测量的未处理的/未加工的姜黄素和一系列姜黄素喷雾干燥粉末的分散颗粒的粒度测量。
图5显示了在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中测量的未处理的/未加工的儿茶素和一系列儿茶素喷雾干燥粉末的分散颗粒的粒度测量。
图6显示在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中24小时后测量的未处理的/未加工的芦丁和一系列芦丁喷雾干燥粉末的分散颗粒的水溶性。
图7显示在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中24小时后测量的未处理的/未加工的柚皮素和一系列柚皮素喷雾干燥粉末的分散颗粒的水溶性。
图8示出了在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中24小时后测量的未处理的/未加工的橙皮苷和一系列橙皮苷喷雾干燥粉末的分散颗粒的水溶性。
图9示出了在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中24小时后测量的未处理的/未加工的姜黄素和一系列姜黄素喷雾干燥粉末的分散颗粒的水溶性。
图10示出了在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中24小时后测量的未处理的/未加工的儿茶素和一系列儿茶素喷雾干燥粉末的分散颗粒的水溶性。
图11示出了比较未处理的/未加工的柚皮素与一系列柚皮素喷雾干燥粉末的结晶度的XRD分析。所用的可食用磷酸盐是K2HPO4(磷酸氢钾)和TPP(磷酸三钠)。
图12是一系列扫描电子显微照片(SEM)，示出了未处理/未加工的儿茶素(A)和儿茶素喷雾干燥粉末的颗粒形态，其中B是儿茶素+K2HPO4(磷酸氢二钾)，C是儿茶素+K2HPO4+酪蛋白酸钠，D是儿茶素+K2HPO4+大豆蛋白分离物，E是儿茶素+K2HPO4+果胶。在每个显微照片的底部发现比例尺。
图13是示出从用如实施例9中所述的本发明的芦丁喷雾干燥粉末强化的香蕉味奶和速溶馥芮白咖啡获得的总体嗜好评分(A)和与对照的差异评分(B)的图(n＝28)。FP2(记为FP)500mg：每份含有500mg芦丁，FP2(命名为FP)250mg：每份含有250mg芦丁。
图14是示出贮存期间对照和PF2强化的香蕉味奶(指定为FP250 mg和FP500 mg)的pH变化的图。
图15是示出在4℃下储存14天的对照(无类黄酮)和PF2强化的香蕉味奶(指定为FP250 mg和FP500mg)的粘度变化的图。
图16是在磷酸盐缓冲液中混合的芦丁和含芦丁的粉末的照片。每个小瓶包括100mg芦丁。从左到右，小瓶包括未加工/未食用的芦丁，FlavoPlus 1(WO2020/095238的主题)和FlavoPlus 2(本发明的产品)。
图17是示出用FP2(FlavoPlus 2)与RH(水合芦丁)强化的消化的香蕉奶对细胞内抗氧化剂活性60分钟的影响的图。使用样品的相对荧光值，用DCFH-DA测定定量细胞内抗氧化剂活性。数据表示每个测定中三个生物复制品与三个复制品的平均值。误差条对应于平均值的标准误差。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。
图18是示出FP2的总酚含量(TPC)对RH的图，表示为芦丁当量(μg/样品)。数据表示三次重复的平均值，误差条对应于平均值的标准误差。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。
图19是示出FP2对RH在60分钟内对细胞内抗氧化剂活性的影响的一系列图。使用样品的相对荧光值，用DCFH-DA(2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯)测定定量细胞内抗氧化剂活性。数据表示每个测定中三个生物复制品与三个复制品的平均值。误差条对应于平均值的标准误差。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。
图20是示出用FP2对RH强化的消化的香蕉奶对细胞内抗氧化剂活性60分钟的影响的一系列图。使用样品的相对荧光值，用DCFH-DA测定定量细胞内抗氧化剂活性。数据表示每个测定中三个生物复制品与三个复制品的平均值。误差条对应于平均值的标准误差。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。
图21是示出在肠消化阶段获得的掺入香蕉奶产品中的FP2中芦丁的体外生物可及性的图。数据表示三次重复的平均值，误差条对应于平均值的标准误差。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。
5.具体实施方式
本发明包括包含疏水性类黄酮和可溶性可食用磷酸盐的喷雾干燥粉末，所述可溶性可食用磷酸盐可用于用促进健康的类黄酮强化食物和饮料。喷雾干燥粉末令人惊奇地易于制备。当与可比较的未加工类黄酮化合物相比时，其显示出高负载能力以及优异的溶解度和分散性。
5.1本发明的喷雾干燥粉末
类黄酮是一类具有由两个苯环和连接的杂环组成的15-碳骨架的化合物。不同的子类由杂环连接体的不饱和度和氧化态的差异定义。
本文所用的术语“类黄酮”包括黄烷醇、黄酮醇、蒽酮、黄烷酮、异黄酮、黄酮、黄烷和花青素。“类黄酮”还包括异类黄酮和新类黄酮。
许多类黄酮是疏水性的，因此不能容易地掺入水基食品中。
本文所用的术语“疏水性类黄酮”是指疏水性大于约2的类黄酮。疏水性测量为LogP，其中P为分配系数(化合物在1-辛醇中的溶解度除以其在水中的溶解度)。这样的化合物在中性pH的水溶液中具有非常低的溶解度。
纯疏水性类黄酮通常以固体形式存在。疏水性类黄酮的溶解度取决于几个因素，包括类黄酮的离子强度、pH、温度和溶解它的溶剂的化学结构。
提高pH值和加热溶剂可增加水溶液中最疏水性类黄酮的比例。然而，这种高pH类黄酮溶液的干燥产品不能在不改变食物感官特性的情况下用于食品中。与水接触时，存在于干燥的类黄酮产物中的羟基离子将提高食物的pH。
在干燥类黄酮产物之前将溶液恢复到中性pH也不是一种选择，因为当pH降低时疏水性类黄酮将从溶液中沉淀出来。
尽管存在以上概述的挑战，本发明人已经开发了一种方法，该方法产生在水性介质中高度可溶和可分散的中性pH的粉末状疏水性类黄酮产物。根据本发明的方法制备产品，该方法使用可溶的可食用磷酸盐，例如钠盐、钾盐或铵盐。这样的干燥产品具有长的保存期限并且可以以高浓度掺入各种食品制剂(包括澄清或半澄清饮料，或用作即混小袋产品)中。
在一个方面，本发明提供了一种喷雾干燥粉末，其包含疏水性类黄酮和可溶性可食用磷酸盐，基本上由其组成或由其组成。
在一个实施方案中，疏水性类黄酮具有约2至约4的疏水性。在一个实施方案中，疏水性类黄酮在高pH(优选高于约10)下可溶于水溶液中。
在一个实施方案中，疏水性类黄酮选自芦丁、柚皮素、槲皮素、姜黄素、橙皮苷、α-萘黄酮(ANF)、β-萘黄酮(BNF)、儿茶素和儿茶素衍生物、白杨素、木犀草素、杨梅黄酮和花色素苷。
在一个实施方案中，疏水性类黄酮选自由以下各项组成的组：由芦丁、柚皮素、儿茶素、姜黄素和橙皮苷。
为了制备本发明的喷雾干燥粉末，首先将疏水性类黄酮溶解在可溶性可食用磷酸盐的水溶液中。术语“可溶性可食用磷酸盐”是指在25℃下在水中的溶解度为至少50wt％的盐，当以合理的量(至多约3g/天)摄入时，其对哺乳动物无毒。
在一个实施方案中，可溶性可食用磷酸盐是磷酸钠盐、磷酸钾盐或磷酸铵盐，优选磷酸钠盐或磷酸钾盐。
在一个实施方案中，可溶性可食用磷酸盐是单磷酸盐、二磷酸盐或多磷酸盐。
在一个实施方案中，可溶性可食用磷酸盐是磷酸一钠盐或磷酸一钾盐。在一个实施方案中，可溶性可食用磷酸盐是磷酸二钠盐或磷酸二钾盐。在一个实施方案中，可溶性可食用磷酸盐是磷酸三钠盐或磷酸三钾盐。
在一个实施方案中，可溶性可食用磷酸盐是单磷酸盐。在一个实施方案中，单磷酸盐衍生自正磷酸盐、磷酸氢盐或磷酸二氢盐。
在一个实施方案中，可溶性可食用磷酸盐选自磷酸一钠、磷酸二钠、磷酸三钠(TPP)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三磷酸钠、磷酸一钾、磷酸二钾、磷酸三钾、磷酸氢钾(K2HPO4)、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、二磷酸四钾、酸式焦磷酸钠、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、三聚磷酸钠、三聚磷酸钾、六偏磷酸钠、磷酸一铵和磷酸二铵。
在一个实施方案中，可溶性可食用磷酸盐是磷酸钠或磷酸钾盐，其选自K2HPO4、二磷酸四钾和三磷酸钠，优选K2HPO4。
在一个方面，本发明提供了一种喷雾干燥粉末，其包含疏水性类黄酮和磷酸钠或磷酸钾盐，基本上由其组成或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的喷雾干燥粉末包括约1至约70wt％的可食用磷酸盐，优选约3至50wt％，更优选约5wt％的磷酸盐。
在一个实施方案中，本发明的喷雾干燥粉末具有约2至约70wt％，优选约20至约50wt％，更优选约33wt％的类黄酮浓度。
在一个实施方案中，本发明的喷雾干燥粉末具有约5至约90％，优选约10至约70％，更优选约25至约35％，最优选约30至约35％的类黄酮负载能力(LC)。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末中磷酸盐：类黄酮的质量比为约20：1至约1：10，优选约15：1至约1：7，更优选约10：1至约1：6。
在一个实施方案中，当溶解于水溶液中时，喷雾干燥粉末具有约7至约7.5的pH。
本发明的喷雾干燥粉末包含固体形式的疏水性类黄酮，其在水性介质中是可分散的和可溶的。本发明的喷雾干燥粉末可以在使用前在室温下长期储存。然而，与许多粉末产品不同，它可以容易地掺入食品中而不会不利地影响食物的性能。
为了有效地作为食物成分，粉状材料必须能够在水性介质中再水合。分散性(物质在整个介质中分散成单个颗粒的能力)是再水合中的重要步骤。存在于本发明的喷雾干燥粉末中的疏水性类黄酮比相当的粉末状疏水性类黄酮在水溶液中更可分散。通过将大分子化合物掺入喷雾干燥产物中，进一步改善了分散性和溶解性。
在一个实施方案中，本发明的喷雾干燥粉末还包含一种或多种选自蛋白质、多糖、脂质和非离子表面活性剂的大分子化合物。
在一个实施方案中，蛋白质选自酪蛋白酸钠(NaCas)、乳清蛋白分离物(WPI)、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、大豆蛋白分离物(SPI)、豌豆蛋白分离物、大米蛋白分离物(RPI)和明胶，和/或任何这些蛋白质的水解产物，优选NaCas。
在一个实施方案中，多糖选自果胶、角叉菜胶、糊精、阿拉伯树胶、藻酸盐、壳聚糖、淀粉、羧甲基纤维素(CMC)和琼脂。
在一个实施方案中，脂质选自卵磷脂、乳脂、椰子油和可可脂。
在一个实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯型非离子表面活性剂。在一个实施方案中，聚山梨醇酯型非离子型表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80(分别为20、40、60和80)。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末中磷酸盐：高分子化合物：类黄酮的质量比为约5：5：1至约1：1：10，优选约2：2：1至约1：1：5，更优选约1：1：1至约1：1：8。
在一个实施方案中，大分子化合物是蛋白质。
在一个方面，本发明提供了一种喷雾干燥粉末，其包含疏水性类黄酮、可溶性可食用磷酸盐和一种或多种选自蛋白质、多糖、脂质和非离子表面活性剂的大分子化合物，基本上由其组成或由其组成。
如图1-5所示，本发明的含类黄酮的喷雾干燥粉末在水溶液中的分散性比未经历本发明方法的对比类黄酮(本文称为“未加工的”或“未处理的”类黄酮)高得多。
在一个实施方案中，本发明的喷雾干燥粉末中的疏水性类黄酮比相同的未加工固体类黄酮在水溶液中更可分散约10x、20x、30x、40x、50x、100x、200x、300x或400x。
在一个实施方案中，当以1至12wt％的浓度存在时，本发明的喷雾干燥粉末完全分散在水溶液中。在一个实施方案中，当以至少约8wt％，优选约12wt％的浓度存在时，本发明的喷雾干燥粉末完全分散在水溶液中。
如图6-10所示，本发明的含类黄酮化合物的喷雾干燥粉末在水溶液中比对比未加工类黄酮化合物更易溶。
在一个实施方案中，本发明的喷雾干燥粉末中的疏水性类黄酮比相同的未加工类黄酮在水溶液中的溶解度高约10x、15x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x或100x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括芦丁、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的芦丁在水溶液中的溶解度比未加工芦丁高至少10x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括芦丁、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的芦丁在水溶液中的溶解度比未加工芦丁高至少20x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括柚皮素、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的柚皮素在水溶液中的溶解度比未加工柚皮素高至少30x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括柚皮素、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的柚皮素在水溶液中的溶解度比未加工柚皮素高至少60x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括橙皮苷、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的橙皮苷在水溶液中的溶解度比未加工橙皮苷高至少70x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括橙皮苷、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的橙皮苷在水溶液中的溶解度比未加工橙皮苷高至少140x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括姜黄素、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的姜黄素在水溶液中的溶解度比未加工姜黄素高至少15x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括姜黄素、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的姜黄素在水溶液中的溶解度比未加工姜黄素高至少30x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括儿茶素、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的儿茶素在水溶液中的溶解度比未加工儿茶素高至少45x。
在一个实施方案中，喷雾干燥粉末包括儿茶素、NaCas和K2HPO4，并且粉末中的儿茶素在水溶液中的溶解度比未加工儿茶素高至少90x。
在一个实施方案中，本发明的类黄酮喷雾干燥粉末具有比未加工类黄酮高10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100X的体外类黄酮生物利用度。
优选地，本发明的类黄酮喷雾干燥粉末具有比未加工类黄酮大至少20X，优选比未加工类黄酮大至少50X的体外类黄酮生物利用度。
经过必要的修正，上述实施例也适用于本发明的其它方面。
可以将相对大量的本发明喷雾干燥粉末加入到食品中，因为即使当以高浓度存在时，粉末仍保持完全溶解和分散。
本发明的类黄酮喷雾干燥粉末在水溶液中具有约7.0至7.5的pH，因此不会改变其所加入的食品的pH。
图11是比较未处理的/未加工的柚皮素与本发明的一系列含有柚皮素的喷雾干燥粉末的X射线衍射图。数据表明，由于本发明的方法，柚皮素的结晶度显著降低。
在本发明的所有喷雾干燥粉末中都看到了这种效果。在本发明的方法之后，柚皮素的先前晶体结构变成几乎无定形的。这种结构的改变是本发明的喷雾干燥粉末与未加工类黄酮相比具有更高的分散性/溶解性的原因。
图12中的扫描电子显微照片示出，未处理儿茶素的高度结晶结构在处理显著改变，形成小的球形喷雾干燥颗粒。
5.2本发明的喷雾干燥粉末的制备
本发明的喷雾干燥粉末可以容易地大规模制备，仅使用可消耗的成分。
在一方面，本发明提供了一种制备包括疏水性类黄酮和可溶性可食用磷酸盐的喷雾干燥粉末的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向起始pH为约7.1至约10的可溶性可食用磷酸盐的水溶液中加入疏水性类黄酮，
(b)在约20℃至约85℃的温度下搅拌所述混合物直至所述疏水性类黄酮溶解，同时将所述pH保持在约起始pH；
(c)调节pH为约7.0至约7.5；以及
(d)喷雾干燥所述混合物以提供粉末产品。
通常，用于本发明方法的可溶性可食用磷酸盐将是食品级的，使得喷雾干燥的产品可以掺入食品中。
在一个实施方案中，步骤(a)的水溶液中磷酸盐的浓度为约0.5至约10％(w/v)，优选约3至约7％(w/v)，更优选约5％(w/v)。
在一个实施方案中，在步骤(a)中加入的疏水性类黄酮的量是导致疏水性类黄酮在水溶液中的浓度为约0.1至约10％(w/v)，优选约3至约6％(w/v)的量。
步骤(a)中的起始pH应为约7.1至10.0。如果步骤(a)中磷酸盐的浓度相对较低，则可能需要通过加入合适的碱如氢氧化钠或KOH调节pH以达到起始pH范围。合适的碱是食品级碱。
在一个实施方案中，起始pH为约7.6至8.5，优选约8.0。
在步骤(b)中，将疏水性类黄酮溶解在磷酸盐溶液中。虽然一些疏水性类黄酮可相当容易地溶解，但其它类黄酮溶解性较低且可能难以溶解，尤其是如果大量添加到磷酸盐溶液中时。
可以通过提高溶液的pH和/或温度和/或提高溶液中磷酸盐的浓度来提高疏水性类黄酮的溶解度。本领域技术人员将理解如何改变这些因素以实现类黄酮在溶液中的完全溶解。
例如，疏水性类黄酮的pKa提供了化合物将最可溶的pH的指示。尽管疏水性类黄酮通常在该方法中使用的较高pH下更可溶，但可能需要加热以完全溶解固体类黄酮。可将混合物加热至约85℃。
对于在高温下可能不稳定的疏水性类黄酮，应施加最小量的热以实现溶解。在这些情况下，疏水性类黄酮可溶解于较高pH-至多约10的磷酸盐溶液中。
在一个实施方案中，将步骤(b)中的混合物加热至约30至约85℃，优选约30至约60℃，更优选约30至45℃的温度。
在一个实施方案中，不加热步骤(b)中的混合物。
在步骤(b)的溶解过程中，溶液的pH可能开始下降。如果发生这种情况，应加入碱以将pH维持在“起始pH范围”内，使得类黄酮将继续溶解。
在一个实施方案中，将选自蛋白质、多糖、脂质和非离子表面活性剂的一种或多种大分子化合物加入到步骤(b)中产生的溶解的疏水性类黄酮的溶液中。
在一个实施方案中，在步骤(b)中加入到溶液中的大分子化合物的量是导致浓度为约0.1至约7％(w/v)，优选约0.5至约2.5％(w/v)，更优选约0.3至约1.5％(w/v)的量。
在一个实施方案中，大分子化合物是蛋白质，优选NaCas。
在步骤(c)中，疏水性类黄酮的磷酸盐溶液的pH被降低至约中性。如果混合物需要加热以溶解类黄酮，则可在调节pH之前将其冷却至小于约60℃。
令人惊奇的是，疏水性类黄酮在这些条件下保持在溶液中。不受理论束缚，提出当溶液的温度和pH回到中性条件时，磷酸盐与类黄酮相互作用以空间阻碍类黄酮的聚集。
然后将含有溶解在磷酸盐溶液中的疏水性类黄酮的溶液喷雾干燥以提供本发明的粉状产品。
在一个实施方案中，溶液在约150至180℃的入口温度下喷雾干燥。在一个实施方案中，将溶液在约75至90℃的出口温度下喷雾干燥。在一个实施方案中，溶液以约10至30mL/min，优选20mL/min的流速喷雾干燥。
本发明还提供通过上述方法生产的产品。
5.3包括本发明喷雾干燥粉末的食品
本发明的喷雾干燥粉末可用于许多应用中。它尤其可用于掺入食物和营养制品中。
喷雾干燥粉末的粉末掺入到一系列食品(包括液体、固体和半固体食品)中作为增强剂以增加食物中增强健康的类黄酮的含量。
喷雾干燥粉末也可以以即混小袋的形式使用，其可以在消费前立即溶于水(或选择的液体/饮料)中。
一方面，本发明提供一种食品，其包括本发明的喷雾干燥粉末。
在一个实施方案中，食品包含约0.3至约12wt％，优选约1至9wt％，更优选约4wt％的本发明的喷雾干燥粉末。
在本发明的含类黄酮化合物的喷雾干燥粉末的制备中获得的高LC使得它们在用作增强剂方面是经济的，因为仅需要加入少量就能大大增加食品中类黄酮化合物的含量。所需的量越小，喷雾干燥粉末对食物的感官特性的影响就越小。
本发明的喷雾干燥中时，本发明的喷雾干燥粉末令人惊讶地是透明的。这使得它们特别适用于透明食物和饮料，其中添加不透明成分是不可接受的。它们也可以以小袋形式使用，其中消费者在消费前立即将产品溶解在水(或其选择的液体/饮料)中。
在一个实施方案中，本发明的食品是透明或半透明的食物或饮料。透明或半透明饮料的示例包括但不限于调味水、蛋白质强化饮料制剂、过滤果汁、冰茶、能量饮料、碱性水、滋补水、矿泉水、软饮料和能量饮料。
在一个实施方案中，透明或半透明食物或饮料包括约0.3至约9wt％，优选约0.5至5wt％，更优选约3wt％的本发明喷雾干燥粉末。
本发明的喷雾干燥粉末还特别适于掺入乳制品中，所述乳制品包括但不限于奶和奶基饮料、酸奶、乳制品、奶酪、冰淇淋、果汁冻、果冻、单份散粒产品、蜂蜜和蜂蜜基产品等；蛋白质条；粉末饮料、饮料，特别是半固体蛋白质饮料如思慕雪和奶昔：谷物；和涂抹料，例如花生酱。
在一个实施方案中，食品是乳制品，包括但不限于酸奶、乳制品(包括奶粉)、奶酪、冰淇淋或果汁冻，优选酸奶。
在一个实施方案中，乳制品包含约0.2至约8wt％，优选约0.6至约6wt％，更优选约1.5至约4wt％的本发明喷雾干燥粉末。在一个实施方案中，乳制品是酸奶。
在一个实施方案中，食品是蛋白质饮料。在一个实施方案中，蛋白质饮料包含约0.2至约8(w/v)，优选约0.15至约6，更优选约4(w/v)的本发明的喷雾干燥粉末。
在一个实施方案中，食品是蛋白质条。在一个实施方案中，蛋白质条包括约0.5至约17wt％，优选约1至约10wt％，更优选约3至约8wt％的本发明喷雾干燥粉末。
在一个方面，本发明提供了包括大于约0.3wt％的疏水性类黄酮，优选大于0.5wt％的疏水性类黄酮的食品。在一个实施方案中，食品是乳制品，优选酸奶。
虽然本发明的喷雾干燥粉末特别适合于食物强化，但它也可以用作膳食补充剂。膳食补充剂通常为单独服用或与食物一起服用以补充膳食的丸剂、胶囊、片剂、小药囊、凝胶或液体形式。
在一个方面，本发明提供包含本发明喷雾干燥粉末的膳食补充剂。
如本文所用，术语“包括”意指“至少部分由…组成”。当解释本说明书中包含术语“包括”的每个表述时，还可以存在不同于该术语或由该术语开头的那些特征。相关术语例如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”将以相同的方式解释。
本文所用的术语“基本上由…组成”是指具体的材料或步骤以及不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。
在本说明书中，参考了专利说明书、其它外部文件或其它信息源，这通常是为了提供用于讨论本发明特征的上下文。除非另外明确说明，否则对此类外部文献的引用不应被解释为承认此类文献或此类信息源在任何权利范围内是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。
本文公开的数字范围(例如，1至10)也包括提及该范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的有理数任何范围(例如，2到8、1.5到5.5和3.1到4.7)，因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围特此明确公开。这些仅仅是具体意图的示例，并且在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合被认为以类似的方式在本申请中明确地陈述。
无论何时在说明书中给出范围，例如，温度范围、时间范围或组成范围、所有中间范围和子范围，以及包括在给出的范围中的所有单个值都旨在包括在本公开中。在本公开和权利要求中，“和/或”是指附加地或替代地。此外，以单数使用的术语也包括复数形式。
如本文所用的术语“约”意指经修饰的术语的合理的偏差量，使得最终结果不显著改变。例如，当应用于一个值时，该术语应被解释为包括该值的+/-5％的偏差。
6.实施例
化学品
芦丁、柚皮素、橙皮苷、姜黄素、儿茶素、低甲氧基果胶和角叉菜胶购自Sigma-Aldrich(Castle Hill,NSW,Australia)。酪蛋白酸钠和乳清蛋白分离物(WPI)购自Fonterra Co-operative Ltd(Auckland,New Zealand)。大豆蛋白分离物(SPI)(Ajipron)购自Ajinomoto Co.,Inc。磷酸二氢钾和磷酸三钠购自Merck(Darmstadt,FRG)。使用的所有其它化学品或试剂是分析试剂级的，从Sigma-Aldrich(Auckland,New Zealand)或Thermo Fisher Scientific(Auckland,New Zealand)获得。
统计分析
样品制备三次，所有测量重复三次(尽管有X射线)。使用Excel 2016(MicrosoftRedmond,VA,USA)计算数据的平均值和标准偏差，使用SPSS20Advanced Statistics(IBM,Armonk,NY,USA)评价处理之间的显著差异，p<0.05。
实施例1：芦丁:NaCas:K2HPO4喷雾干燥粉末的制备
制备一升5％(w/v)的K2HPO4水溶液，并搅拌30分钟以完全溶解K2HPO4。将芦丁(1.5wt％)加入到K2HPO4溶液中，将混合物加热至75℃并搅拌直至芦丁完全溶解(约20分钟)。记录pH(约8.0-8.5)。
向该溶液中加入2.5wt％的NaCas，搅拌混合物直到蛋白质完全溶解(约15分钟)，同时连续监测pH。将温度降低至45℃并通过加入HCl将pH调节至7.3。
将温热的溶液喷雾干燥(入口和出口温度分别为150和75℃)，并将所得喷雾干燥粉末包装在铝袋中，并在4℃下储存直至进一步使用。
发现产物的LC为16.7％。
实施例2：芦丁:K2HPO4喷雾干燥粉末的制备
制备一升5％(w/v)的K2HPO4水溶液，并搅拌30分钟以完全溶解K2HPO4。将芦丁(1.5wt％)加入到K2HPO4溶液中，将混合物加热至75℃并搅拌直至芦丁完全溶解(约20分钟)。记录pH(约8.0-8.5)。
将温度降低至约60℃并通过加入HCl将pH调节至7.3。
将温热的溶液喷雾干燥(入口和出口温度分别为150和75℃)，并将所得喷雾干燥粉末包装在铝袋中，并在4℃下储存直至进一步使用。
发现产物的LC为23.1％。
实例3：其它类黄酮：磷酸盐喷雾干燥粉末的制备
实施例1和2中列出的方法用于制备如下表1中示例的本发明的一系列含芦丁的喷雾干燥粉末。用其它大分子化合物如WPI、明胶、果胶、大豆卵磷脂和角叉菜胶代替NaCas。在一些情况下，用TPP代替K2HPO4。还制备了类似的喷雾干燥粉末，用包括柚皮素、橙皮苷、姜黄素和儿茶素的其它类黄酮代替芦丁。
表1：使用磷酸盐和大分子化合物的不同组合制备的芦丁的喷雾干燥粉末的示例
NaCas：酪蛋白酸钠，WPI：乳清蛋白分离物，SPI：大豆蛋白分离物，K2HPO4：磷酸氢钾，TPP：磷酸三钠。
实施例4：负载能力(LC)确定
根据Ahmad等人(2016)的方法使用以下等式计算根据本发明的方法制备的喷雾干燥粉末的类黄酮LC；
LC(％)＝总类黄酮/喷雾干燥粉末的重量×100
“总类黄酮”是在本发明方法的步骤(a)中加入到磷酸盐溶液中的固体疏水性类黄酮的量。
本发明的喷雾干燥粉末具有约5至约90％的LC。当类黄酮组分具有较高的水溶性时，LC通常较高。
例如，实施例1和2的产物的LC值分别为16.7和23.1。在具有较高水溶性的类黄酮的情况下，LC高得多。例如，在儿茶素制剂中可实现90％的儿茶素LC：通过本发明的方法制备的K2HPO4
实施例5：本发明的喷雾干燥粉末的分散性
将每种类黄酮的喷雾干燥粉末分散在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中并以2000rpm搅拌120分钟，在这段时间内研究颗粒的尺寸性质(分散性)。如Fang等人(Fang，2011)所建议的，颗粒的表面材料在水性介质中释放后，它们的粒度减小。这种尺寸的减小可以指示改进的分散性。这意味着，在水性介质中在特定时间段(例如，120分钟)内测量特定粉末的粒度是该粉末在具有相同介质的食品中的分散行为的指示。
因此，根据Ji等人(2016)的方法，使用在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中分配期间和在搅拌期间粒度的变化作为可应用的技术来观察喷雾干燥粉末或未加工类黄酮(对照)随时间的分散行为。
将配备有4mW He-Ne激光器操作的Malvern Mastersizer 3000(MalvernInstruments Ltd,Worcestershire,UK)用于本发明的喷雾干燥粉末，其平均粒度大于600nm。将Malvern Zetasizer Nano(Malvern Instruments Ltd,Worcestershire,UK)用于平均粒度小于600nm的粉末，其中不透明度如此低(由于颗粒的高溶解度)以至于不能在Mastersizer中测量。
称取约30mg每种粉末(以在仪器中达到理想的遮蔽水平)，加入分散单元中的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。使用632.8nm的波长以2分钟间隔连续测量粒度性质。收集并分析各测量的粒度分布D50(μm)。结果如图1-5所示。
实施例6：本发明的喷雾干燥粉末的溶解度
将已知量的待测试的每种喷雾干燥粉末加入到10mL用于实施例5中分散性实验的水性介质(磷酸盐缓冲液)中并搅拌24小时。然后将样品离心(3000xg，20℃，10min)并收集上清液并过滤(0.45μm；Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)。然后将存在于上清液中的可溶性类黄酮在乙醇中提取，并使用下述高压液相色谱(HPLC)方法，按照Dammak等人(Dammak，2017)的方法定量。
HPLC机器配备有UV/可见光和diodray检测器(Agilent Technologies,1200Series,Santa Clara,CA,USA)。柱为反相PrevailTMC18，尺寸为4.6cm×150mm，粒度为5μm(Grace Alltech,Columbia,MD,USA)。流动相由酸性Milli-Q水(pH3.50，1％乙酸，v/v)和甲醇组成，体积比为50：50，流速为1mL/min，样品注射体积为5μL。当以特定保留时间洗脱时，在其特定波长下检测每种类黄酮。
为了校准HPLC柱并定量样品中的类黄酮，使用纯的未加工类黄酮(>97％)在流动相中的标准溶液(0.01-1mg/mL)，并相应地绘制标准曲线。通过使用外标法将保留时间与标准品和峰积分进行比较来获得分析物的色谱峰。
为了释放剩余类黄酮的总级分，将上清液在加热的乙醇(70℃)中破碎并过滤(0.45μm；Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)，然后注入HPLC柱。
结果如图6-10所示。
实施例7：喷雾干燥粉末的X射线衍射(XRD)
XRD分析在20.0℃下在设置为127.40mm的Rigaku RAPID图像板检测器(Rigaku,The Woodlands,Texas,USA)上进行。使用由Rigaku MicroMax007微焦点旋转阳极发生器(Rigaku，USA)产生并由Osmic-Rigaku金属多层光学器件(Rigaku，USA)聚焦的Cu Kα辐射将本发明的喷雾干燥粉末以及未处理的类黄酮和对照大分子化合物(作为参考)与少量的Fomblin油装在Hampton CryoLoops(Hampton Research,CA,USA)中。数据收集在RAPID II软件(版本2.4.2，Rigaku，USA)的控制下，其中用2DP程序(版本1.0.3.4，Rigaku，USA)对数据进行背景校正并将其转换为线轮廓，并使用晶体衍射软件(版本6.5.5，CrystalMaker Software Ltd.,Oxfordshire,UK)进行比较。由于冷冻环中的样本量是可变的，因此将数据按比例缩放至由束阻阴影引起的背景中的相同升高。在5°至100°的2θ角范围内分析所有样品。使用5°的窄振荡范围以突出X射线束中晶体的数量。
柚皮素的结果如图11所示。包含其它疏水性类黄酮(芦丁、姜黄素、儿茶素和橙皮苷)的喷雾干燥粉末得到类似的结果。
实施例8：使用扫描电子显微镜(SEM)的本发明喷雾干燥粉末的形态
使用环境扫描电子显微镜(FEIQuanta 200，荷兰)研究喷雾干燥粉末的形态。使用双面胶带将少量喷雾干燥的类黄酮(以及未处理的类黄酮和对照大分子化合物，作为参考)固定在铝短柱上(粘在其上)。当剥离背衬时，将样品舀到暴露的带上，并将任何过量的样品吹掉。然后，用约100nm的金(Baltec SCD 149 050溅射涂布机)溅射涂布样品，然后使用不同的放大倍数在20kV的加速电压下在显微镜下观察。
结果如图12所示。包含其它疏水性类黄酮(芦丁、姜黄素、儿茶素和橙皮苷)的喷雾干燥粉末得到类似的结果。
实施例9：将本发明的喷雾干燥粉末掺入食品中
本发明的含芦丁的喷雾干燥粉末(FlavoPlus II)在中试工厂规模根据以下方法制备：
1.称取181.6g磷酸二钾，溶于18.16L蒸馏水中。
2.缓慢加入273.4g食品级芦丁。
3.将pH增加至9.0(使用氢氧化钠)并将溶液加热至75℃并搅拌直至溶解。
4.缓慢加入545g酪蛋白酸钠，搅拌直至溶解。
5.调节pH至7.5并在75℃下保持搅拌。
6.将上述溶液热喷雾干燥(入口和出口温度分别为150℃和75℃)。
7.真空包装干燥的粉末。
表2：FlavoPlus II规格
评价了用本发明的喷雾干燥粉末强化的食品的感官属性和消费者对消费的行为。测试的产品是香蕉味奶和速溶馥芮白咖啡。
产品含有250mg或500mg芦丁/份，通过FlavoPlus II成分加入。香蕉味奶和速溶馥芮白咖啡的份量分别为250和200mL。每份产品250mg芦丁的香蕉奶中FlavoPlus II的浓度为3.66g/L，每份产品500mg芦丁的香蕉奶中FlavoPlus II的浓度为7.32g/L。在速溶馥芮白咖啡中FlavoPlus II的浓度对于每份产品250mg芦丁为4.56g/L，对于每份产品500mg芦丁为9.15g/L。
为了制备香蕉奶，将FlavoPlus II粉末在奶中搅拌15分钟。然后将混合物均化、巴氏灭菌并装瓶。为了制备速溶馥芮白咖啡，将FlavoPlus II粉末与干燥的咖啡混合物(咖啡、奶粉和糖)混合，将其加入热水中并搅拌直至溶解。
使用9点快感量表研究香蕉味奶和速溶馥芮白咖啡的可接受性水平，其中1表示“极度不喜欢”，9表示“极度喜欢”。还要求参与者确定FlavoPlus II强化产品和对照产品(无FlavoPlus II)之间的差异。用7点标度记录差异水平，其中1表示“无差异”，7表示“非常大的差异”。最后，要求参与者选择他们在超市中购买的用FlavoPlus II强化的产品中的哪一种。结果如图13所示。
用本发明的喷雾干燥粉末强化的产品对于消费者是相对可接受的，表现出6至7之间的平均喜好分数。参与者喜欢这两种产品至非常相似的水平，意味着它们中的一种没有特别的偏好(图13A)。
当要求参与者鉴定不含FlavoPlus II的对照样品和两种测试制剂(FP250 mg和FP500 mg)之间的差异时，他们发现用最低含量的FlavoPlus II强化的产品中的“轻微差异”和具有最高含量的产品中的“中等差异”(图13B)。这些差异在香蕉味奶中比在咖啡中更显著。这些结果表明，向两种产品中加入本发明的喷雾干燥粉末不会显著影响食品的原始感官属性。
当分别加入250和500mg/份的粉末时，本发明的含芦丁的喷雾干燥粉末的加入将香蕉奶样品的pH(6.60)增加至6.90和7.0。喷雾干燥粉末中的含量越高，pH越高。然而，在储存期间，没有样品显示出pH随时间的显著变化。这在图14中示出。
两种饮料的表观粘度使用锥板几何形状由流变学测量计算。随着储存时间的延长，对照样品的粘度没有变化。然而，无论制剂中使用的浓度如何，将本发明的喷雾干燥粉末添加到奶中引起粘度的小幅增加。结果如图15所示。粘度的变化没有被消费者负面地感知，如在感官测试的结果中观察到的，其表明强化产品对于消费者是合理地可接受的。
实施例10：本发明的喷雾干燥粉末在饮料中的稳定性
将FlavoPlus II(如实施例9中制备)溶于水、碱性水、牛奶、椰子水和蔬菜汁中(以每份递送500mg芦丁)，并评估类黄酮组分的溶解度和稳定性。监测饮料的物理稳定性、pH、粒度、ζ电位和UV-可见光谱并在4℃下储存9天进行比较。
发现所有饮料在该时间段内是稳定的。
实施例11：本发明的喷雾干燥粉末在透明饮料中的用途
制备三小瓶50ml芦丁的磷酸盐缓冲液(在1L MilliQ水中的20.21g磷酸氢二钠和3.39g磷酸二氢钠)以包含100mg芦丁/样品(2g/L)。小瓶示于图16中，记录每个小瓶的pH。
左边的小瓶包含溶解在磷酸盐缓冲液中的100mg未加工/未处理的芦丁。右边的小瓶包含0.767g FlavoPlus II(如实施例9中制备)，对应于约100mg芦丁。
中间的小瓶包含如WO2020/095238中所述的FlavoPlus I，其浓度相当于100mg芦丁。FlavoPlus I通过以下方法制备：
制备1升10％(w/v)酪蛋白酸钠(NaCas)水溶液并使其完全水合过夜。然后使用4M氢氧化钠将溶液调节至pH11.0，并在室温下搅拌(300rpm)30分钟以使NaCas完全解离。向该溶液中加入100g(10％，w/v)食品级芦丁，并将pH再次增加至11.0，因为芦丁显著降低pH。
在室温下搅拌混合物直至所有加入的芦丁溶解，同时不断监测溶液的pH并在需要时调节至11.0。从所有芦丁溶解在NaCas溶液中的时间开始，将混合溶液再搅拌30分钟，同时连续监测pH。
使用4M HCl将溶液快速酸化至pH4.6(酪蛋白的pI)，导致芦丁和NaCas共沉淀。将所得混合物在室温下以3000g离心10分钟。
然后将共沉淀的产物(10％干重/v)分散在磷酸钾溶液中并在以下条件下喷雾干燥：入口温度180℃，出口温度75℃，流速20mL/min。
如图16所示，FlavoPlus II溶解在磷酸盐缓冲液中以提供透明溶液，而FlavoPlusI提供不透明的悬浮液。前一种喷雾干燥粉末适用于强化透明和半透明饮料，而后一种粉末则不适用。
实施例12：FlavoPlus 2在水中的最大溶解度
通过混合30分钟，将根据实施例2制备的本发明的含芦丁的喷雾干燥粉末(FlavoPlus 2)以表2中所示的浓度溶解在水中。然后将溶液在室温下储存以检查溶液稳定性(相分离)，如图16所示。
如表2所示，30分钟足以将高达83.3g FlavoPlus 2粉末溶解在1L水中。这等于45g纯芦丁，与未处理的形式相比，该疏水性类黄酮的溶解度显著增加。图16显示了可溶性FlavoPlus 2粉末的外观。
表2：FlavoPlus 2在水中的溶解度
实施例13：FlavoPlus 2(FP2)的抗氧化潜能
采用体外细胞和消化模型比较了芦丁-酪蛋白复合FlavoPlus 2(FP2)与水合芦丁(RH)的抗氧化能力。将实验方法分成2个阶段，每个阶段用于其分类目的。阶段1通过基于细胞的和生物化学测定证明了FP2对人肠上皮细胞(Caco-2)的潜在抗氧化作用。
在阶段2中，用FP2强化香蕉奶饮料(实施例9)并用INFOGEST体外消化模型消化。随后，测量其生理化学特征及其细胞内抗氧化潜力。
阶段1：FP2抗氧化潜能的细胞和生化评估(由Anubhavi Singh,MasseyUniversity,Palmerston North,New Zealand，和Dr Raise Ahmed,AgResearch Ltd.,Palmerston North,New Zealand收集和处理的数据)
人肠上皮细胞系Caco-2用于测试FP2的抗氧化活性。将Caco-2细胞在最低必需培养基(MEM)中培养72小时，并在5％CO2加湿孵育箱中始终保持在37℃。在测试FP2和RH的细胞毒性作用之前，用剂量为0％至5％的DMSO处理细胞。在Caco-2细胞上DMSO浓度的优化通过各种实验性试验研究细胞活力来测试。同时，FP2和RH对Caco-2细胞的细胞毒性作用通过MTT测定确定，如下所述。
通过荧光抗氧化剂测定确定通过Caco-2细胞模型与RH相比FP2的体外抗氧化剂活性的评价。DCFH-DA，一种有助于检测细胞内ROS的荧光染料，用作检测细胞内活性的探针。将细胞用各种浓度的含有FP2和RH的抗氧化剂培养基预处理1小时。将DCFH-DA染料加入到这些预处理的细胞中并孵育1小时，在此它转化成可氧化形式的DCFH。为了测定FP2和RH的有效细胞内抗氧化活性，将称为AAPH的自由基产生剂加入到这些预处理的细胞中，并监测1小时时间段内的相对荧光以指示细胞内的任何抗氧化活性。
细胞系、培养基和试剂
(/>American Tissue Culture Collection，#HTB-37)，传代数为19，由Dr Rachel Anderson(AgResearch Ltd.,Palmerston North,New Zealand)惠赠。在完全最低必需培养基(MEM)中维持和培养细胞，并以70％汇合度接种在96孔板中用于实验。
细胞培养基和试剂
完全最低必需培养基
通过补充GibcoTM MEM(L-谷氨酰胺；目录号11095080，ThermoFisherScientificTM，Waltham，MA，USA)和10％胎牛血清(FBS，澳大利亚来源，γ辐射的，目录号FBSF，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)，1％NEAA(MEM非必需氨基酸100x溶液；目录#11140-050)和1％青霉素-链霉素(青霉素-链霉素，10,000单位/mL青霉素G钠盐和10,000μg/mL硫酸链霉素在0.85％盐水中)，购自Gibco,Invitrogen,MA,USA。使用胰蛋白酶(TrypLETM,GibcoTM,Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)和pH7.4的GibcoTM PBS(目录#10010023)每3天对细胞进行次培养。将完整MEM储存在4℃下。
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)储备溶液
通过将5mg染料(目录#M6494，Invitrogen by Thermo Fisher ScientificTM，Waltham，MA，USA)溶解在1mL不含苯酚的GibcoTMMEM中来制备MTT储备溶液。将溶液用注射器过滤(0.22μm)并储存在-20℃下直至进一步使用。通过在不含苯酚的MEM中将储备溶液稀释10倍(1：10)来制备MTT染料的工作溶液。由于MTT的光敏性质，将储备溶液覆盖在箔中。
二甲基亚砜(DMSO)
制备0.3％DMSO的储备溶液(目录#D4540，St.Louis，MO，USA)，将其进一步稀释于PBS，pH7.4(目录#10010023)中，并且将该储备溶液注射过滤(0.22μm)并且储存在-20℃下直至使用，储存在-20℃下。
DCFH-DA/细胞抗氧化剂测定
用于DCFH-DA测定的所有试剂和缓冲液根据Ma等人(2018)制备
2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)储备溶液
为了制备12.5mM储备溶液，将12.182mgDCFH-DA(目录#4091-99-0，St.Louis，MO，USA)溶解于2mL DMSO(目录#D4540，/>St.Louis，MO，USA)中并在-20℃下以100μl单次使用等分试样储存以避免重复的冻融循环。
2,2′-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(AAPH)储备溶液
为了制备60mM储备溶液，将32.542mg AAPH(目录#2997-92-4，St.Louis，MO，USA)溶解于2mL GibcoTM HBSS(目录#14175095，Thermo FisherScientificTM，Waltham，MA，USA)中并在-20℃下以100μl单次使用等分试样储存以避免重复的冻融循环。
生物活性化合物的制备和再悬浮
水合芦丁储备溶液
水合芦丁储备溶液(≥94％；目录#207671-50-9；(Thermo Fisher ScientificTM，Waltham，MA，USA)通过将1mg粉末溶解在0.3％DMSO溶液中，然后在处理培养基中进一步稀释来制备。将溶液注射器过滤(0.22μm)并储存在-20℃直至使用。
FlavoPlus 2(FP2)储备溶液
本实施例中测试的FP2粉末由酪蛋白酸钠(54.5％)、芦丁(27.3％)和磷酸二钾(18.2％)组成，按照实施例1中描述的方法制备。
通过将2mg粉末溶解在1mL Milli-Q(Millipore Corp.,SAS–67120,Bedford,MA,USA)水中，然后在处理介质中进一步稀释来制备储备溶液。将溶液注射器过滤(0.22μm)并储存在-20℃直至使用。
DPPH储备溶液
通过将0.025g DPPH试剂(从Sigma-Aldrich Co.,Inc.Darmstadt,Germany获得)溶于100mL甲醇(分析级，目录#67561，St.Louis，MO，USA)中来制备DPPH储备溶液。由于其光敏性，储备溶液被箔覆盖并储存在黑暗和凉爽的地方直至使用。
总酚含量(TPC)储备溶液
将Folin-Ciocalteu试剂(购自Merck Co.,Inc.New Jersey,USA)与milli-Q水以1：1的比例混合以产生储备溶液。由于其光敏性，储备溶液被箔覆盖并储存在黑暗和凉爽的地方直至使用。
方法
Caco-2细胞的维持和培养
Caco-2细胞在腐殖化孵育箱(HeracellTMVIOS 160i CO2孵育箱,Thermo FisherScientificTM,Waltham,MA,USA)中在37℃，5％CO2下在完全MEM中生长和维持。在倒置显微镜(Nikon eclipse TS100，日本)下每天监测细胞生长，直至达到70％汇合。每三天通过用pH7.4的PBS(目录#10010023)洗涤并与胰蛋白酶一起孵育4分钟来传代培养细胞以从烧瓶(TrypLETM,GibcoTM,Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)的表面去除粘附细胞。然后将细胞以110RCF离心4分钟(MegaFugeTM8离心机，Thermo Fisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)并重悬于MEM培养基中。随后，将它们接种到96孔板中用于相应的测定(Natoli等人,2012)。
Caco-2细胞的分化
进行Caco-2细胞的分化以进行细胞单层的吸收实验和屏障完整性评估。使用台盼蓝溶液(0.4％，目录#T10282，InvitrogenTMThermo Fisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)测试细胞的活力，其中将细胞悬浮液与台盼蓝染料以1：1的比例混合并在Eppendorf管中混合。将约12μl样品加载到一次性CountessTM室载玻片(ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)上，并在CountessTM自动细胞计数器(ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)下观察。活细胞和活的细胞是透明和清澈的，而死细胞用台盼蓝染成蓝色。
以8×104细胞/Transwell(6.5mm，聚酯，0.33μm孔径；Inc.，目录#CLS3470，ThermoFisher ScientificTM，Waltham，MA，USA)的密度接种Caco-2细胞。顶端室中新鲜MEM培养基的体积为200μl，基底外侧室为810μl。在37℃，5％CO2下，在加湿孵育箱中孵育平板。每两天后更换transwell中的培养基。孵育15-17天后发生Caco-2细胞的分化。在细胞达到汇合后，使用与EVOM2细胞电位仪(Epithelial Voltohmmeter)(World PrecisionInstruments,Sarasota,FL,USA)连接的EndOhm TEER杯(World Precision Instruments,Sarasota,FL,USA)测量跨越Caco-2细胞单层的背景跨上皮电阻(TEER)，以在吸收实验前测定细胞的屏障完整性。
用FlavoPlus 2TM(FP2)处理Caco-2细胞
用FP2和RH以0.1μg/mL至50μg/mL的各种浓度处理Caco-2细胞。在新鲜MEM培养基中从储备溶液稀释后达到这些浓度。为了理解样品的效果，将对照载体如DMSO在0.01％至5％的不同浓度下优化。用于稀释RH的DMSO的浓度对应于用于其优化的DMSO的浓度范围。在96孔板(Co-star 3596Inc.,目录#07-200-90,ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)中以4×105细胞/mL的密度接种细胞后，细胞粘附于孔的表面需要孵育24小时。孵育后，用DMSO(0.01％至5％)处理细胞。通过MTT试验快速评估这些细胞以优化DMSO的细胞毒性浓度。
MTT测定
用DMSO、FP2和RH处理后，用无酚红的MEM培养基洗涤细胞。将MTT染料工作溶液(0.5mg/mL)加入到每个孔中孵育3-4小时。阴性对照为DMSO+细胞，阳性对照不含样品，空白孔视为不含细胞的孔。孵育后，孔具有深蓝色/紫色甲瓒晶体沉淀。小心地从孔中吸出MEM培养基后，加入100μl/孔DMSO。需要在37℃下偶尔摇动下进一步孵育10分钟以溶解甲臜晶型。使用微量板读数器(FlexStation 3TM多模式微量板读数器，Bio-Strategy，NZ)在570nm下测量吸光度。使用以下等式(等式1)计算细胞活力。该方法经过一些修改而从Kuntz等人(1999)改编。
细胞内抗氧化活性
通过使用Wan等人(2015)提到的2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯DCFH-DA测定，略加修改，测量细胞内抗氧化活性。将细胞以6×105细胞/mL的密度接种在96孔板(Co-star 3596Inc.,目录#07-200-90,ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)中，其中细胞粘附到孔表面需要孵育24小时。孵育后，弃去MEM培养基，用pH7.4的GibcoTM PBS(目录#10010023,ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)洗涤细胞。用一定浓度的样品处理细胞，并使用等式1定量它们对FP2和RH的响应(即，细胞活力)。所有试剂都储存在4℃下，并在使用前平衡至室温。通过应用Ma等人(2018)开发的方法进行测定，并有一些修改。将细胞用100μl样品连同25μM DCFH-DA(目录#4091-99-0,/>St.Louis,MO,USA)染料液处理，将其在37℃下孵育1小时。孵育1小时后，用PBS洗涤细胞3次。在清洗细胞后，将100μl(600μM)AAPH(目录#2997-92-4,/>St.Louis,MO,USA)添加到96孔板中。立即在37℃下通过荧光微量板读数器(FlexStation 3TM多模式微量板读数器,Bio-Strategy,NZ)以480nm的激发和530nm的发射波长每5分钟测量荧光强度，持续1小时。对照组无任何样品，空白组无AAPH和样品，仅PBS处理视为空白。使用等式2计算样品的荧光强度。
其中，F样品是样品的荧光，F对照是对照的荧光。
紫外分光光度法DPPH测定
使用DPPH(2,2-二苯基-1-苦基-偕腙肼)自由基清除方法(Vogrincic等人,2010)通过基于UV分光光度化学的测定来测试FP2和RH的抗氧化剂清除能力。将100μl样品与DPPH储备溶液的1：10稀释液在比色杯中混合，然后在室温(25℃)下在黑暗中孵育30分钟直至记录吸光度。对于对照样品，将3.9mL DPPH溶液加入到比色杯中，并使用分光光度计(MultiskanTMGO Microplate spectrophotometer,ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)在517nm立即记录其吸光度。空白样品由具有DPPH溶液的水组成。随着生物活性化合物(即芦丁)浓度的增加，稳定的DPPH自由基被还原成其非自由基形式，使溶液的颜色从紫色变为黄色。清除活性或抑制％使用以下等式(等式3)相对于对照计算。
其中对照的吸光度在t＝0分钟，样品的吸光度在t＝30分钟。所有测量均在室温下进行。
总酚含量(TPC)估计
为了评价FP2和RH中的TPC值，使用Folin-Ciocalteu(FC)试剂(购自Merck Co.,Inc.New Jersey,USA)应用了Gangwar等人(2014)改编的方法。从样品储备液中取出0.1ml的等分试样，加入2.5ml FC试剂并孵育10分钟。孵育后，加入2mL碳酸钠(75g/L)，将样品涡旋并在室温下避光孵育2小时。通过分光光度计在765nm测量吸光度(MultiskanTMGOMicroplate spectrophotometer,ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)。将吸光度值与没食子酸标准曲线进行比较以将结果表示为样品的没食子酸当量的μg。
阶段1的结果(由Anubhavi Singh,Palmerston North,New Zealand，和Dr RaiseAhmed,AgResearch Ltd.,Palmerston North,New Zealand收集并处理的数据)
如图17所示，FP2的抗氧化活性(以清除活性的形式表示)显著超过RH，表明FP2产物中的芦丁是比RH中有效得多的抗氧化剂。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。必须注意，在该实施例中测试的FP2粉末中芦丁的浓度比RH粉末中纯芦丁的浓度低得多(低约三倍)；尽管如此，该粉末的抗氧化活性远高于纯芦丁(即RH)。为了清楚起见，我们还提供了两种样品的芦丁当量形式的数据(图17中的线)，其中可以更清楚地看到差异。
图18显示FP2粉末的总酚含量对未处理形式的芦丁(RH)的结果。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。对于该实施例，我们测试了相同量的两种粉末，但是FP2粉末中芦丁的浓度约为RH粉末的三倍。这导致了结果的一些变化，尤其是在低浓度的情况下，但总体上，甚至在这些不等的浓度下，FP2显示出更强的酚含量。当该粉末中芦丁当量的数据标准化时(图18中的线)，FP2在酚类性质方面显著更强。这证实了图17中所示的结果，总体而言，在这样的样品的情况下，总酚含量和抗氧化剂活性之间的正的和强的相关性是预期的。
FP2相对于未处理的芦丁(RH)在60分钟内对细胞内抗氧化剂活性的影响如图18所示。使用样品的相对荧光值，用DCFH-DA(2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯)测定定量细胞内抗氧化剂活性，并且数据表示三次生物重复的平均值，每次测定重复三次。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。如该图(图18)所示，在几乎每个时间点FP2表现出的抗氧化活性与RH表现出的抗氧化活性之间存在显著差异(p≤0.05)。这些差异证实使用本文发明的方法处理RH可导致更高的抗氧化剂活性，这与由溶解度和结晶度测试获得的结果一致。值得注意的是FP2中芦丁的浓度远低于纯RH的浓度，然而比较了相同浓度的粉末(不是芦丁)。
图20示出了用FP2相对于RH强化的消化的香蕉奶对细胞内抗氧化剂活性超过60分钟的影响。使用样品的相对荧光值，用DCFH-DA测定对细胞内抗氧化剂活性进行定量，数据表示三次生物重复的平均值，每次测定重复三次。不具有相同字母的样品显著不同(p≤0.05)。基于这些结果(图20)，在每个时间点(A-D)，与含有RH的相同奶相比，含有FP2的香蕉奶显示出更强的细胞内抗氧化活性。这与图19所示的结果一致(粉末单独存在而不存在于食物中)。值得注意的是，FP2中芦丁的浓度远低于纯RH的浓度，然而比较了相同浓度的粉末(不是芦丁)。
阶段2：用FP2强化的香蕉奶饮料的制备及其物理化学和抗氧化性质的表征
这部分研究旨在制备用FP2或RH强化的香蕉味的奶饮料。开发了浓度为7.32g/L粉末的奶饮料，每份250mL香蕉味奶中含有500mg芦丁。
通过体外静态消化模型消化这种香蕉味奶。进行体外消化以了解生物可及芦丁在香蕉味奶饮料中的结构和功能性质的变化。采用高效液相色谱法(HPLC)对消化后0、30、60、120min的样品中芦丁进行定量；即研究芦丁的释放，其决定消化后可利用的芦丁的生物可及量。随后，将生物可及量的样品加入分化的Caco-2细胞单层以评估对细胞毒性、屏障完整性和细胞内抗氧化活性的影响。
材料、化学品和试剂
实验中使用的市售香蕉奶购自当地超市(Pak n Save,Palmerston North,NewZealand)，其组成和营养信息列于表3中。
表3：香蕉味奶的组成/营养信息
用于体外消化的酶是猪来源的；将胃蛋白酶(目录#P7012-5G,St.Louis,MO,USA)储存在0℃下，将胰酶制剂(目录#P7545-100G,/>St.Louis,MO,USA)储存在0℃下，并且将胆汁盐(目录#B8631-100G)储存在室温下。Milli-Q水(Millipore Corp.,SAS–67120,Bedford,MA,USA)用于制备所有溶液。高纯度(HPLC级)芦丁和槲皮素标准品购自/>St.Louis,MO,USA。本研究使用的所有化学品和试剂均为分析级。
方法
用FP2和RH强化的香蕉味奶的制备
选择每份250mL奶500mg芦丁的一份量，并制备400ml强化香蕉奶。香蕉奶制品中FP2和RH粉末的浓度分别为7.32g/L和2g/L。将粉末在牛奶中搅拌15分钟并将混合物在70℃下加热30分钟并冷却，然后储存。将强化牛奶装瓶并在4℃下储存直至进一步使用。
体外消化
根据Minekus等人(2014)经过一些修改对FP2和RH强化的香蕉味奶进行体外消化。新鲜制备的强化香蕉奶饮料用于体外消化研究(一式三份)。将用FP2强化的香蕉奶样品与用RH强化的香蕉奶进行比较。将未经强化的香蕉奶与作为空白的Milli-Q水一起用作对照。每个时间点取三个等分试样以产生足够的样品用于进一步的实验，而两个管用于进行每个重复的体外消化。将振荡水浴保持在37±1℃以保持人体温度。
将10mL样品与含有5μlCaCl2，8mL SGF和0.5mL胃蛋白酶(最终胃蛋白酶活性为2000U/mL)的模拟胃液(SGF)以最终比例1：1混合，并将管的pH调节至3±0.1。第一时间点(在0分钟)标志着在该实验中胃相的开始。在胃相期间，在0、30、60和120分钟收集样品。在肠相的情况下，从水浴中剩余的管获得样品，其具有从胃相20mL的最终体积。将消化物与模拟肠液(SIF)混合至最终比例为1：1，包含40μlCaCl2，2.5mL胆汁盐(10mM)和5mL胰酶(最终100U/mL胰蛋白酶活性)，并在常规搅拌下将管的pH调节至7±0.1。在肠相期间，在0、30、60和120分钟收集样品。
为了停止酶促反应，立即向样品中加入酶抑制剂。每取1mL胃消化物样品加入10μl溶于甲醇(0.5mg/mL)的胃酶抑素A(目录#ab141416,Abcam,UK)，每1mL肠消化物样品加入0.45mL蛋白酶抑制剂混合(1片在50ml Milli-Q水中；Catalogue#S8820,St.Louis,MO,USA)溶液。将所有洋地黄样品储存在-20℃下用于进一步实验分析。
高效液相色谱(HPLC)
根据Naveen等人(2017)和Acevedo-Fani等人(2021)报道的方法，稍加修改，分析芦丁标准。使用配备有UV/可见光二极管阵列检测器(Agilent technologies,1200Series,Santa Clara,CA,USA)和Kinetex XB-C18柱(100A°，100mm×4.6mm，2.6μm孔径)的Agilent1200系列HPLC机器测量提取后香蕉强化乳产品中生物可及的芦丁的量。流动相由两种不同的溶液组成；0.5％乙酸作为A，乙腈作为B，流速为1mL/min，样品注射体积为5μl。柱温保持在26℃，UV检测器设定在356nm。在356nm检测芦丁，并使用EZ Chrome软件(AgilentOpenLab Technologies,USA)通过积分获得峰高和峰面积。芦丁的鉴定取决于峰的保留时间和它们的光谱与由标准品(105-421ppm)制成的校准曲线的比较。
粒度
使用具有两个激光源的Mastersizer(Malvern MasterSizer Hydro 2000MU,Malvern Instruments Ltd.,Malvern,UK)在体外消化后获得样品的粒度。牛奶的折射率为1.460，水的折射率为1.33，不透明度保持在9.5％。将少量(2-3mL)消化的奶样品加入到含有800mL水的测量池中以达到阴暗水平。
ζ电位
通过Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical Ltd,UK)在25℃下测定样品的ζ电位。在分析之前用去离子水稀释奶样品以防止在实验过程中的多重散射事件。在测量前将样品平衡2分钟。
MTT测定
MTT测定的程序如上所述。在体外消化后，用生物可及量的FP2和RH处理细胞，并通过使用酶标仪(FlexStation 3TM多模式酶标仪，Bio-Strategy，NZ)测量570nm处的吸光度来计算它们的细胞活力。使用等式1计算细胞活力。
DCFHDA测定
细胞活力定量后，将细胞接种在Transwell插入物(6.5mm，聚酯，0.33μm孔径；Inc.，目录#CLS3470,ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)在15-17天后变成分化的细胞单层。DCFH-DA测定的程序如上所述。DCFH-DA测定定量在Caco-2单层上吸收24小时后生物可及样品的细胞内抗氧化能力，其荧光值有变化。
跨上皮电阻(TEER)
TEER测量跨细胞单层的电阻。这是证实单层完整性和渗透性的可靠和灵敏的方法。在该实施例中，将Caco-2细胞以8×104细胞/Transwell(6.5mm，聚酯，0.33μm孔径；Inc.,目录#CLS3470,ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)的密度接种在GibcoTM MEM培养基中的具有200μl的顶端室和具有810μl的基底外侧室中。将板在37℃下在5％CO2下在加湿孵育箱(HeracellTMVIOS160i CO2孵育箱,ThermoFisher ScientificTM,Waltham,MA,USA)中孵育，并且每两天后更换transwell中的培养基。孵育15-17天后发生Caco-2细胞的分化。在达到汇合后，使用与EVOM2细胞电位仪(World PrecisionInstruments,Sarasota,FL,USA)连接的EndOhm TEER杯(World Precision Instruments,Sarasota,FL,USA)测量跨越Caco-2细胞单层的跨上皮电阻以确定细胞的屏障完整性。通过初步试验，当TEER高于500Ω/cm2时，认为细胞汇合。在接下来的12小时中每2小时定期记录TEER值，并在24小时获取最终读数。使用等式4计算电阻值。
TEER(Ω/cm2)＝原始TEER值(Ω)×插入的表面积(cm2)……(等式4)
统计分析
所有实验重复至少三次。结果表示为平均值±标准误差平均值。单向ANOVA(方差分析)用于确定FP2和RH在α＝0.05时对各种生物化学和物理化学性质的影响。对于多重比较，使用IBM SPSS统计软件(版本26)采用Tukey事后检验来确定这三个样品组(即FP2和RH)的平均值之间的显著差异(P<0.05)。使用ORIGIN软件(OriginPro，64位，2020)和MicrosoftExcel(Version 2111，64位，2021)分析和创建图表。
阶段2的结果(由Anubhavi Singh,Massey University,Palmerston North,NewZealand，和Dr Raise Ahmed,AgResearch Ltd.,Palmerston North,New Zealand收集并处理的数据)
图21显示了在体外肠消化阶段获得的FP2(加入香蕉奶中)中可利用的生物可及芦丁。如该图(图21)所示，在模拟肠消化的不同时间点，掺入香蕉奶中的FP2粉末中芦丁的生物可及性没有显著差异(p>0.05)。这表明该产品中几乎一半的芦丁在胃相后是生物可及的。这是芦丁的生物可及性的实质性改善，因为这种疏水性类黄酮在其未处理的(未加工的/商业的)形式中具有非常差的生物可及性(和生物利用度)。我们还使用相同的方法在对照(即RH)中体外测试了芦丁，并且发现此时没有来自RH的芦丁是生物可及的。这并不令人惊讶，因为由于不溶性和沉降(高度结晶)，在消化的早期阶段的取样过程中所有的RH都被抽出。因此，本发明解决了RH的生物可及性挑战，因为其分散性和溶解性由于其结晶度显著降低而显著改善。
含有FP2的消化的强化香蕉奶，含有RH的消化的强化香蕉奶和未强化香蕉奶的粒度分析结果和ζ电势(表面电荷)分别示于下表4、5和6中。我们在模拟胃和肠条件下在240分钟内监测这些参数的变化(各120分钟)。首先，在模拟消化的两个阶段中，每种奶在不同时间点的粒度之间存在显著差异，这是预期的。有趣的是，含有FP2的样品中的粒度在任何时间点均大于不含芦丁的样品(表6)或含有RH的样品。这对于芦丁递送可能是有益的，因为它可能导致芦丁的延迟释放(在胃消化期间的保护)。在含有RH的香蕉奶的情况下，由于RH在水性介质中的不溶性，添加的芦丁在消化装置的底部沉降，结果可能不够可靠(和相当)。
在模拟消化的两个阶段中，每种奶在不同时间点的ζ电势值之间也存在显著差异。这是预期的，因为随着消化的进行，颗粒的表面被破坏。另外，对于相同的特定时间点，不同样品的ζ电势值存在显著差异，进一步表明在应用本发明的方法之后颗粒性质的变化。似乎向香蕉奶中加入FP2可能对其ζ电位有轻微影响，特别是在消化开始时，这可能与颗粒表面电荷的变化有关。然而，在该实验的情况下，重要的是FP2是否能够保护胃相中的芦丁并将其递送至肠相。这由图21所示的结果证实，其中FP2粉末中几乎一半的芦丁在模拟肠消化结束时是生物可及的。相反，此时没有来自RH的芦丁是生物可及的，因为由于不溶性和沉降，所有芦丁在消化的早期阶段在取样过程中被取出。因此，可以确信地指出，本发明的方法导致关于芦丁和其它疏水性类黄酮的递送的改进的产物，包括在模拟消化系统下的行为，和因此最终的体外生物可及性。
表4：含有FP2的消化的强化香蕉奶的粒度(D[4，3]-体积加权平均值(μm))、比表面积(m2/gm)和ζ电位(mV)。
数据表示三次重复的平均值，误差条对应于平均值的标准误差。不共享相同字母的三列中的值显著不同(p≤0.05)。
表5：含有RH的消化的强化香蕉奶的粒度(D[4，3]-体积加权平均值(μm))、比表面积(m2/gm)和ζ电位(mV)。
数据表示三次重复的平均值，误差条对应于平均值的标准误差。不共享相同字母的三列中的值显著不同(p≤0.05)。
表6：消化的未强化香蕉奶的粒度(D[4，3]-体积加权平均值(μm))、比表面积(m2/gm)和ζ电位(mV)。
数据表示三次重复的平均值，误差条对应于平均值的标准误差。不共享相同字母的三列中的值显著不同(p≤0.05)。
7.致谢
新西兰高价值营养国家科学挑战(新西兰)支持这项工作。作者想要致谢从以下人接收的对本说明书中的一些数据的收集和处理的帮助和支持：Dr Hamid Gharanjig、Anubhavi Singh和Matthijs Nieuwkoop(Riddet Institute,Massey University,Palmerston North,New Zealand)和Dr Raise Ahmed(AgResearch Ltd.,PalmerstonNorth,New Zealand)。感谢Geoffrey B.Jameson教授(Massey University,PalmerstonNorth,New Zealalnd)在XRD分析期间提供其科学建议和支持。我们致谢来自新西兰北帕默斯顿梅西大学Manawatu显微成像中心(MMIC)和MacDiarmid高级材料与纳米技术研究所的工作人员的科学和技术支持。
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Claims (21)

1.一种喷雾干燥粉末，其包括疏水性类黄酮和可溶性可食用磷酸盐。
2.根据权利要求1所述的喷雾干燥粉末，其中所述疏水性类黄酮具有约2至约4的疏水性和/或在高pH，优选高于7下可溶于水溶液中。
3.根据权利要求1所述的喷雾干燥粉末，其中所述疏水性类黄酮选自由以下各项组成的组：芦丁、柚皮素、槲皮素、姜黄素、橙皮苷、α-萘黄酮(ANF)、β-萘黄酮(BNF)、儿茶素和儿茶素衍生物、白杨素、木犀草素、杨梅黄酮和花色素苷。
4.根据权利要求3所述的喷雾干燥粉末，其中所述疏水性类黄酮选自由以下各项组成的组：芦丁、柚皮素、姜黄素、橙皮苷和儿茶素。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的喷雾干燥粉末，其中所述可溶性可食用磷酸盐是磷酸钠盐、磷酸钾盐或磷酸铵盐。
6.根据权利要求5所述的喷雾干燥粉末，其中所述可溶性可食用磷酸盐选自由以下各项组成的组：K2HPO4、二磷酸四钾和三磷酸钠。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的喷雾干燥粉末，其包括约1至约70wt％的可食用磷酸盐，优选约3至50wt％，更优选约5wt％的磷酸盐。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的喷雾干燥粉末，其具有约2至约70wt％，优选约20至约50wt％，更优选约33wt％的类黄酮浓度。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的喷雾干燥粉末，其具有约5至约90％，优选约10至约70％，更优选约25至约35％，最优选约30至约35％的类黄酮负载能力(LC)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的喷雾干燥粉末，其具有约20：1至约1：10，优选约15：1至约1：7并且更优选约10：1至约1：6的磷酸盐：类黄酮的质量比。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的喷雾干燥粉末，其还包括选自蛋白质、多糖、脂质和非离子表面活性剂的大分子化合物，优选蛋白质，更优选NaCas。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的喷雾干燥粉末，其中所述疏水性类黄酮比相同的未加工/未处理的固体类黄酮在水溶液中更可分散约10x、20x、30x、40x、50x、100x、200x、300x或400x。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的喷雾干燥粉末，当以至少约8wt％，优选约12wt％的浓度存在时，其完全分散在水溶液中。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的喷雾干燥粉末，其中所述疏水性类黄酮比相同的未加工(未处理的)类黄酮在水溶液中更易溶约10x、15x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x或100x。
15.一种制备包括疏水性类黄酮和可溶性可食用磷酸盐的喷雾干燥粉末的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向起始pH为约7.1至约10的可溶性可食用磷酸盐的水溶液中加入疏水性类黄酮，
(b)在约20℃至约85℃的温度下搅拌所述混合物直至所述疏水性类黄酮溶解，同时将所述pH保持在约起始pH；
(c)调节pH为约7.0至约7.5；以及
(d)喷雾干燥所述混合物以提供粉末产品。
16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤(a)的水溶液中磷酸盐的浓度为约0.5至约10％(w/v)，优选约3至约7％(w/v)，更优选约5％(w/v)。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中在步骤(a)中加入的疏水性类黄酮的量是导致疏水性类黄酮的浓度为约0.1至约10％(w/v)，优选约3至约6％(w/v)的量。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中将选自蛋白质、多糖、脂质和非离子表面活性剂的大分子化合物加入到步骤(b)中产生的溶解的疏水性类黄酮的溶液中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在步骤(b)中加入到溶液中的大分子化合物的浓度为约0.1至约7％(w/v)，优选约0.5至约2.5％(w/v)，更优选约0.3至约1.5％(w/v)。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中将蛋白质加入到步骤(b)中产生的溶解的疏水性类黄酮，优选NaCas的溶液中。
21.一种通过根据权利要求15-20中任一项所述的方法制备的喷雾干燥粉末或包括根据权利要求1-14和21中任一项所述的喷雾干燥粉末的食品，优选其中所述食品是透明或半透明的食物或饮料。
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