CN117883501A - 清咽滴丸在制备抗新冠病毒的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种清咽滴丸在制备抗新冠病毒的药物中的应用，涉及中药技术领域，本发明提供的清咽滴丸，或包含清咽滴丸的有效中药组分的中药组合物或其制剂在制备抗新冠病毒的药物，制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物，制备新冠病毒蛋白抑制剂，非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒，或非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白中的应用，缓解了现有技术中存在的缺乏有效抗新冠病毒手段和药物的问题。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其是涉及一种清咽滴丸在制备抗新冠病毒的药物中的应用。
背景技术
当前能够有效的抑制新冠病毒药物的数量相较于患者的需求仍显不足。目前用于治疗新冠病毒感染的药物主要有Paxlovid。Paxlovid为辉瑞制药公司治疗新冠病毒感染新药奈玛特韦（nirmatrelvir）片联用病毒蛋白酶增强药利托那韦（ritonavir）片共包装盒，但其还存在供应量不足以及副作用较大的问题。其他已经应用或仍处于研发阶段的药物还包括托珠单抗、干扰素、阿比多尔、利巴韦林、清肺排毒汤以及连花清瘟胶囊等。但目前对于预防和治疗新冠病毒感染，药物仍存在巨大缺口，因此开发更多的抑制新冠病毒药物以及治疗新冠病毒感染的药物具有重要意义。
清咽滴丸是津药达仁堂第六中药厂独家研制的高效、速效中药滴丸制剂，组方为《兰台轨范》所载清音丸及《喉科心法》所载六神丸加减化裁而成。虽源于古方却取之精华，独具优势特色，无毒性成分，具备较高的安全性，方中青黛（INDIGO NATURALIS）、诃子（CHEBULAE FRUCTUS）、人工牛黄（BOVIS CALCULUS ARTIFACTUS）、甘草（GLYCYRRHIZAERADIX ET RHIZOMA）、薄荷脑（l-MENTHOL）及冰片（BORNEOLUM SYNTHETICUM）共奏疏风清热、解毒利咽的功效，用于风热喉痹，咽痛，咽干及咽部红肿，对呼吸系统疾病尤其是咽喉部症状的治疗具备显著功效。大量文献报道清咽滴丸对流感病毒、柯萨奇病毒等多种病毒具有良好的抑制作用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本申请要求2023年03月21日提交中国专利局、申请号为2023102792146、发明名称为“清咽滴丸在制备抗新冠病毒的药物中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本发明的目的在于提供清咽滴丸，或包含清咽滴丸的有效中药组分的中药组合物或其制剂在制备抗新冠病毒的药物，制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物，制备新冠病毒蛋白抑制剂，非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒，或非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白中的应用，以缓解现有技术中存在的缺乏有效抗新冠病毒手段和药物的问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了清咽滴丸、中药组合物或其制剂在如下（a）~（e）任意一项中的应用；（a）制备抗新冠病毒的药物；（b）制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物；（c）制备新冠病毒蛋白抑制剂；（d）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒；和，（e）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白；所述的新冠病毒包括新冠病毒原始株、新冠病毒奥密克戎株和新冠病毒德尔塔株中的至少一种；所述新冠病毒蛋白包括主蛋白酶、木瓜蛋白酶和S蛋白中的至少一种；所述中药组合物包含青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份和人工牛黄12份。
优选地，所述清咽滴丸、中药组合物或其制剂中甘草查尔酮B的含量为7.23~28.31μg/g，柯里拉京的含量为0.10~0.36mg/g。
优选地，所述清咽滴丸的制备方法包括：
（1）按重量称取：青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份、人工牛黄12份；
（2）取诃子加15倍、10倍水分别提取3小时、1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至75℃时相对密度1.2的膏1，向所述膏1中加所述膏1质量6倍的体积浓度为90%的乙醇水溶液，醇沉2次，合并两次上清液1，回收乙醇至在70℃时相对密度1.3，得诃子膏；取青黛加10质量倍的体积浓度为20%的盐酸水溶液浸泡10小时，水洗至中性，60℃烘干得精制青黛；取甘草加入15倍水，提取2次，每次2.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至70℃时相对密度1.2的膏2，向膏2中加90%乙醇至乙醇体积浓度为70%，静置，取上清液2，加氨水调pH为8-8.5，过滤，滤液回收乙醇至85℃时相对密度1.1-1.3，加相当于上清液3体积倍的水，调节pH为2-3，过滤，沉淀用水洗3次，干燥得甘草提取物；
（3）取聚乙二醇6000加入所述精制青黛与人工牛黄，加热熔融，依次加入冰片、薄荷脑、甘草提取物和诃子膏，搅拌使溶化并混合均匀，在90±10℃保温，滴入20±5℃的液体石蜡、甲基硅油或植物油中，制成滴丸。
优选地，所述清咽滴丸的对照指纹图谱包括15个共有峰，以峰1为参照峰，15个共有峰的相对保留时间范围分别为：峰1：1.000，峰2：1.081~1.321，峰3：1.467~1.793，峰4：1.626~1.988，峰5：1.906~2.330，峰6：2.590~3.166，峰7：3.766~4.602，峰8：3.820~4.668，峰9：4.681~5.721，峰10：4.726~5.776，峰11：5.135~6.277，峰12：5.952~7.274，峰13：6.203~7.581，峰14：6.308~7.710，峰15：7.511~9.181；峰1为没食子酸色谱峰；
所述清咽滴丸的指纹图谱与所述对照指纹图谱相似度不低于0.90；
优选地，所述相似度采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价，所述清咽滴丸的指纹图谱与所述对照指纹图谱通用的相似度不低于0.90。
优选地，包括将清咽滴丸、中药组合物或其制剂中的如下活性成分应用于所述（a）~（e）任意一项中：特里马素 I、1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷、1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、柯里拉京、甘草查尔酮B、野漆树苷和金缕梅单宁中的至少一种。
优选地，所述应用包括应用于制备新冠病毒蛋白抑制剂，或应用于非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白。
优选地，所述新冠病毒奥密克戎株包括奥密克戎BA.1.1、奥密克戎BA.2.3、奥密克戎BA.4和奥密克戎BA.5中的至少一种；
优选地，所述新冠病毒包括新冠病毒奥密克戎BA.1.1株和/或BA.5。
优选地，所述清咽滴丸的浓度为20~200μg/mL；
优选地，所述新冠病毒为新冠病毒奥密克戎BA.1.1株和/或BA.5，所述清咽滴丸的浓度为20~100μg/mL。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了金缕梅单宁在如下（a）~（e）任意一项中的应用：（a）制备抗新冠病毒的药物；（b）制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物；（c）制备新冠病毒蛋白抑制剂；（d）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒；和，（e）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白；所述新冠病毒蛋白包括主蛋白酶、木瓜蛋白酶和刺突蛋白蛋白中的至少一种。
优选地，所述应用包括用于制备新冠病毒蛋白抑制剂和非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白，所述新冠病毒蛋白为S蛋白。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种清咽滴丸的制备方法，所述制备方法包括：
（1）按重量称取：青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份、人工牛黄12份；
（2）取诃子加15倍、10倍水分别提取3小时、1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至75℃时相对密度1.2的膏1，向所述膏1中加所述膏1质量6倍的体积浓度为90%的乙醇水溶液，醇沉2次，合并两次上清液1，回收乙醇至在70℃时相对密度1.3，得诃子膏；取青黛加10质量倍的体积浓度为20%的盐酸水溶液浸泡10小时，水洗至中性，60℃烘干得精制青黛；取甘草加入15倍水，提取2次，每次2.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至70℃时相对密度1.2的膏2，向膏2中加90%乙醇至乙醇体积浓度为70%，静置，取上清液2，加氨水调pH为8-8.5，过滤，滤液回收乙醇至85℃时相对密度1.1-1.3，加相当于上清液3体积倍的水，调节pH为2-3，过滤，沉淀用水洗3次，干燥得甘草提取物；
（3）取聚乙二醇6000加入所述精制青黛与人工牛黄，加热熔融，依次加入冰片、薄荷脑、甘草提取物和诃子膏，搅拌使溶化并混合均匀，在90±10℃保温，滴入20±5℃的液体石蜡、甲基硅油或植物油中，制成滴丸。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过实验发现，清咽滴丸具有抑制新冠病毒的作用。本发明基于质谱分析鉴定出清咽滴丸中48种活性成分，经分子对接验证，其中多种活性成分与新冠病毒的主蛋白酶、木瓜蛋白酶和S蛋白中的至少一种具有结合能力。经表面等离子共振实验体外验证了清咽滴丸中柯里拉京，野漆树苷和甘草查尔酮B对新冠病毒的主蛋白酶、木瓜蛋白酶和/或S蛋白具有抑制作用。本发明还发现，通过改进清咽滴丸的制备方法，能够提高清咽滴丸的抗新冠病毒效果。
基于上述发现的清咽滴丸及其活性成分对新冠病毒或新冠病毒蛋白的抑制作用，本发明提供的应用具有如下优势：清咽滴丸中含有多种有效的中药小分子，对新冠病毒的抑制途径涉及多个通路和靶点，在制备抗新冠病毒药物或制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物时能够从多方面抑制新冠病毒。清咽滴丸含有多种能够抑制新冠病毒主蛋白酶、木瓜蛋白酶和S蛋白的活性成分，主蛋白酶和木瓜蛋白酶较新冠病毒中其他蛋白更为保守，新冠病毒的变异株较少在上述两种蛋白中发生突变。以主蛋白酶和木瓜蛋白酶作为主要抑制靶点，能够使清咽滴丸有效的抑制多种新冠病毒变异株；清咽滴丸作为一种已经临床应用的药物，将其应用于制备抗新冠病毒相关的产品，或应用于非诊断和治疗目的的抗新冠病毒或新冠病毒蛋白中，具有更好的安全性。
本发明还通过实验发现，金缕梅单宁具有抑制新冠病毒蛋白酶活性的作用。将金缕梅单宁与新冠病毒主蛋白酶、木瓜蛋白酶和刺突蛋白进行分子对接，对接结果显示金缕梅单宁与三种新冠病毒蛋白均具有较强的结合能力。实验结果显示金缕梅单宁与刺突蛋白具有亲和力活性，对新冠病毒复制过程中的主蛋白酶具有显著的抑制活性，表明金缕梅单宁是阻断新冠病毒复制的潜在抑制剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为九批清咽滴丸指纹图谱叠加图；
图2为清咽滴丸的对照指纹图谱；
图3为没食子酸对照品溶液图谱；
图4为柯里拉京对照品溶液图谱；
图5为甘草苷对照品溶液图谱；
图6为异甘草苷对照品溶液图谱；
图7为甘草素对照品溶液图谱；
图8为甘草酸铵对照品溶液图谱；
图9为异甘草素对照品溶液图谱；
图10为清咽滴丸典型代表性指纹图谱；
图11为清咽滴丸70%甲醇提取物在正离子模式下的BPC图；
图12为清咽滴丸70%甲醇提取物在负离子模式下的BPC图；
图13为柯里拉京与新冠病毒蛋白的结合模式图，A1是化合物与Mpro的结合模式图，A2是化合物与PLpro的结合模式图A3是化合物与S蛋白的结合模式图；
图14为野漆树苷与新冠病毒蛋白的结合模式图，B1是化合物与Mpro的结合模式图，B2是化合物与PLpro的结合模式图B3是化合物与S蛋白的结合模式图；
图15为特里马素I与新冠病毒蛋白的结合模式图，D1是化合物与Mpro的结合模式图，D2是化合物与PLpro的结合模式图D3是化合物与S蛋白的结合模式图；
图16为1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷与新冠病毒蛋白的结合模式图，E1是化合物与Mpro的结合模式图，E2是化合物与PLpro的结合模式图E3是化合物与S蛋白的结合模式图；
图17为1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱与新冠病毒蛋白的结合模式图，F1是化合物与Mpro的结合模式图，F2是化合物与PLpro的结合模式图F3是化合物与S蛋白的结合模式图；
图18为甘草查尔酮B与Mpro的结合模式图；
图19为SARS-CoV-2 Mpro与利托那韦的SPR传感器图像；
图20为SARS-CoV-2 Mpro与利托那韦的SPR传感器图像；
图21为SARS-CoV-2 Mpro与野漆树苷的SPR传感器图像；
图22为SARS-CoV-2 Mpro与柯里拉京的SPR传感器图像；
图23为SARS-CoV-2 Mpro与甘草查尔酮B的SPR传感器图像；
图24为SARS-CoV-2 PLpro与利托那韦的SPR传感器图像；
图25为SARS-CoV-2 PLpro与利托那韦的SPR传感器图像；
图26为SARS-CoV-2 PLpro与野漆树苷的SPR传感器图像；
图27为SARS-CoV-2 PLpro与柯里拉京的SPR传感器图像；
图28为SARS-CoV-2 S蛋白与野漆树苷的SPR传感器图像；
图29为SARS-CoV-2 S蛋白与柯里拉京的SPR传感器图像；
图30为甘草查尔酮B、甘草查尔酮D、柯里拉京、阳性对照药Jun9-75-4和PF-07321332抗病毒结果；
图31为金缕梅单宁与新冠病毒蛋白的结合模式图，C1为与Mpro的结合模式图，C2为与PLpro的结合模式图，C3为与S蛋白的结合模式图；
图32为SARS-CoV-2 S蛋白与金缕梅单宁的SPR传感器图像；
图33为金缕梅单宁对RAW 264.7细胞活力的影响；
图34为金缕梅单宁对NO释放的影响；
图35为金缕梅单宁对TNF-α炎症因子的抑制作用；
图36为金缕梅单宁对IL-6炎症因子的抑制作用；
图37为金缕梅单宁对IL-1β炎症因子的抑制作用；
图38为实施例12中正常组病理切片图片；
图39为实施例12中模型组病理切片图片；
图40为实施例12中清咽滴丸组病理切片图片；
图41为实施例12中小鼠体重变化曲线；
图42为SARS-CoV-2 Mpro纯化SDS-PAGE分析结果；
图43为SARS-CoV-2 PLpro纯化SDS-PAGE分析结果；
图44为实施例1-2制备得到的清咽滴丸中甘草查尔酮B的含量测定质谱图（批次：622042）；
图45为实施例1-2制备得到的清咽滴丸中柯里拉京的含量测定质谱图（批次：622042）。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中，新型冠状病毒也记载为新冠病毒或SARS-CoV-2，上述记载方式可以任意的互相替换使用；新冠病毒的主蛋白酶（Main Protein）又名为3C样蛋白酶（3C likeprotease，3CLpro），本文中也被记载为Mpro、Mpro、SARS-CoV-2 Mpro、SARS-CoV-2 Mpro、3CLpro或SARS-CoV-2-3CLpro等，上述记载方式可以任意的互相替换使用；新冠病毒木瓜蛋白酶（Papain like protease）也被记载为PLpro、PLpro、SARS-CoV-2 PLpro或SARS-CoV-2PLpro等；新冠病毒刺突蛋白本文中也被记载为Spike蛋白、S蛋白、SARS-CoV-2 S蛋白或SARS-CoV-2 Spike蛋白等，上述记载方式可以任意的互相替换使用，刺突蛋白受体结合域也被记载为S蛋白RBD区、Spike RBD或SARS-CoV-2 Spike RBD等，上述记载方式可以任意的互相替换使用；可以理解的是，与刺突蛋白受体结合域结合也可以表述为与刺突蛋白结合；本文中，清咽滴丸、所述中药组合物及其制剂的活性成分指的是它们中含有的具有治疗作用的小分子化合物，本文中也记载为中药小分子、小分子、小分子化合物、单体成分等，上述记载方式可以任意的互相替换使用。
清咽滴丸的药材组成包含薄荷脑（l-MENTHOL）、青黛（INDIGO NATURALIS）、冰片（BORNEOLUM SYNTHETICUM）、诃子（CHEBULAE FRUCTUS）、甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX ETRHIZOMA）和人工牛黄（BOVIS CALCULUS ARTIFACTUS），辅料为聚乙二醇6000，其中有效中药组分来源于薄荷脑、青黛、冰片、诃子、甘草和人工牛黄。清咽滴丸的主要功效包括疏风清热，解毒利咽，用于风热喉痹，咽痛，咽干，口渴；或微恶风，发热，咽部红肿和急性咽炎等。
本发明通过实验发现，清咽滴丸具有抑制新冠病毒的作用，最高抑制浓度约为100µg/mL。动物实验表明清咽滴丸对新冠病毒感染模型动物的肺部炎症和体重下降具有改善作用。
进一步地，基于质谱分析鉴定的清咽滴丸中6味药材包括薄荷脑、冰片、甘草、诃子、青黛和人工牛黄所含的化学成分，采用SwissADME数据库检索成分作用靶点，借助Uniprot数据库检索靶点对应的基因，采用Cytoscape软件构建“药材-成分-靶点”网络和蛋白互作网络，可视化筛选核心基因，经分析筛选得到48个类药性良好的活性成分，对应作用靶点468个。以新冠感染为对象，基于GeneCards数据库检索与新冠感染相关靶点，用DAVID数据库对潜在的靶点进行GO和KEGG分析，结果表明参与清咽滴丸治疗作用有关的生物过程756个，参与清咽滴丸治疗作用相关通路信号160个，主要有Human cytomegalovirusinfection、Lipid and atherosclerosis、PI3K-Akt signaling pathway、IL-17signaling pathway、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection等信号通路，这些通路均与病毒感染、炎症靶点和氧化应激反应密切相关。
基于质谱分析鉴定出的清咽滴丸的活性成分，以SARS-CoV-2 Mpro为靶蛋白（PDB：6UL7），SARS-CoV-2 PLpro为靶蛋白（PDB：7CJM），和/或以SARS-CoV-2 S蛋白为靶蛋白（PDB：7T9L），运用Discovery studio 2020中的CDOCKER精准分子对接模块进行模拟。对接结果显示诃子和甘草中的单体成分与上述三种蛋白中的一种或多种的活性位点具有较强的结合能力，且作用的靶向氨基酸与原配体相近，该结果提示清咽滴丸中含有中药小分子在体外可能对Mpro、PLpro和/或S蛋白具有较强的抑制作用。并筛选出对上述三种蛋白具有较高对接结合能的如下活性成分：Tellimagrandin I（特里马素 I）、1,3,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose（1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷）、1-palmitoyl-lysophosphatidylcholine/isomer（1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱）、野漆树苷、柯里拉京和甘草查尔酮B。
进一步地，采用荧光共振能量转移（FRET）法验证了甘草查尔酮B、柯里拉京和野漆树苷对SARS-CoV-2 Mpro具有体外抑制活性；采用表面等离子共振法（SPR）分析了在模拟分子对接中对SARS-CoV-2 Mpro、PLpro和S蛋白具有较好结合能力的野漆树苷、柯里拉京和甘草查尔酮B，实验结果表明清咽滴丸中的活性成分柯里拉京、野漆树苷和甘草查尔酮B与Mpro、PLpro和S蛋白中的至少一种具有较好的结合能力，且亲和力高于阳性对照药利托纳韦。并经抗病毒实验验证甘草查尔酮B和柯里拉京具有体外抑制病毒的活性。并且，清咽滴丸中单体成分体外抑制病毒活性实验发现，甘草查尔酮B和柯里拉京的EC50远高于清咽滴丸50%有效率浓度时甘草查尔酮B和柯里拉京浓度，说明清咽滴丸抗新冠病毒不仅依靠其中的有效活性成分各自发挥作用，各单体成分之间还具有协同作用，使清咽滴丸中各单体成分在具有较低含量时，就能发挥对新冠病毒的抑制作用。
基于网络药理学分析，清咽滴丸中诃子含有的金缕梅单宁具有抑制新冠病毒的潜力，金缕梅单宁属于多酚，在前期研究中通过虚拟对接，发现金缕梅单宁对新冠病毒入侵和复制的靶点，包括Spro、Mpro和PLpro具有潜在亲和活力，其对接结合能分别为56.252Kcal/mol、59.142 Kcal/mol和59.934 Kcal/mol，是新冠病毒潜在的抑制剂。在实验验证汇总，基于SPR分子互作研究，发现金缕梅单宁对Spro具有强的亲和活力，其解离常数KD为93.3 nM，提示金缕梅单宁是抑制新冠病毒入侵的潜在活性成分。基于FRET酶活性抑制研究中，发现金缕梅单宁对新冠病毒复制过程中的主蛋白酶Mpro具有显著的抑制活性，其IC50为12.71 μM，但对木瓜样蛋白酶PLpro的抑制活性较弱，说明金缕梅单宁对新冠病毒复制过程中的Mpro具有特异性，表明金缕梅单宁是阻断新冠病毒复制的潜在抑制剂。在抗炎研究中，金缕梅单宁在5 μM浓度下具有显著的NO抑制作用，对炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α具有显著抑制作用并呈现剂量依赖性。
综上，本发明发现清咽滴丸与新冠病毒治疗的多个信号通路和靶点相关。清咽滴丸中存在多种活性成分能够抑制新冠病毒Mpro、PLpro和S蛋白中的至少一种。基于此，根据本发明的一个方面，本发明提供了清咽滴丸在如下（a）~（e）任意一项中的应用：
（a）制备抗新冠病毒的药物；（b）制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物；（c）制备新冠病毒蛋白抑制剂；（d）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒；和，（e）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白。
上述新冠病毒包括新冠病毒原始株、新冠病毒奥密克戎株和新冠病毒德尔塔株中的至少一种。新冠病毒奥密克戎株包括但不限于奥密克戎BA.1.1、奥密克戎BA.2.3、奥密克戎BA.4和奥密克戎BA.5中的至少一种，优选包括新冠病毒奥密克戎BA.1.1株和/或BA.5。经实验发现，当清咽滴丸浓度为200 µg/mL时，对SARS-CoV-2（WT野生株）具有约70%的抑制率；对SARS-CoV-2 Delta株具有约50%的抑制率；对奥密克戎BA.2.3株具有约70%的抑制率；对奥密克戎BA.4株具有约50%的抑制率。当清咽滴丸浓度为100 µg/mL时，对奥密克戎BA.1.1株具有约70%的抑制率；对奥密克戎BA.5株具有约60%以上的抑制率。
在一些可选的实施方式中，清咽滴丸在制备抗新冠病毒的药物，制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物，以及制备新冠病毒蛋白抑制剂时，或应用于非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒和新冠病毒蛋白时的优选浓度为20~200μg/mL，例如可以为但不限于为20、50、80、100、150或200μg/mL。当上述（a）~（e）任意一项中的应用中的新冠病毒为新冠病毒奥密克戎BA.1.1株和/或BA.5时，清咽滴丸的浓度优选为20~100μg/mL，例如可以为但不限于为20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/mL。
上述新冠病毒蛋白包括主蛋白酶、木瓜蛋白酶和S蛋白中的至少一种。本文应用中新冠病毒蛋白任选地为天然蛋白或经生物学手段获得的重组蛋白，例如可以为但不限于为经过密码子优化表达的蛋白，含有新冠病毒蛋白主要结构域的多肽，含有新冠病毒蛋白或其主要结构域的融合蛋白等。
清咽滴丸有效中药组分来源于薄荷脑、青黛、冰片、诃子、甘草和人工牛黄。因此，根据上述清咽滴丸在抑制新冠病毒和抑制新冠病毒蛋白活性中的作用，本领域技术人员可以毫无疑义的得出如下结论：包含清咽滴丸有效中药组分：薄荷脑、青黛、冰片、诃子、甘草和人工牛黄的中药组合物也具有和清咽滴丸相同的抑制新冠病毒和新冠病毒蛋白的作用。依据清咽滴丸处方，所述中药组合物的配比为青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份和人工牛黄12份。
可以理解的是，由薄荷脑、青黛、冰片、诃子、甘草和人工牛黄为原料制备得到的不同于清咽滴丸的其他制剂也具有相同的作用。中药组合物的制剂类型例如可以为但不限于为片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、煎膏剂、散剂等本领域熟知的常规剂型，本发明对此不做限制。基于此，根据本发明的另一个方面，本发明还提供了中药组合物或其制剂在上述（a）~（e）任意一项中的应用：（a）制备抗新冠病毒的药物；（b）制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物；（c）制备新冠病毒蛋白抑制剂；（d）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒；（e）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白。其中上述新冠病毒蛋白包括主蛋白酶、木瓜蛋白酶和S蛋白中的至少一种。
本文中，非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒或新冠病毒蛋白的实施例，包括但不限于制备动物模型，在体外细胞抗病毒实验中将清咽滴丸或其活性成分，或中药组合物或其制剂，或它们的活性成分作为新冠病毒抑制剂，以作为实验对照组；或者用于研究新冠病毒相关机制；或者，在体外作为新冠病毒主蛋白酶、木瓜蛋白酶和S蛋白中的至少一种的抑制剂，以研究新冠病毒蛋白的相关作用机制。
在一些可选的实施方式中，所述应用包括将清咽滴丸或所述中药组合物及其制剂作为药物或抑制剂的制备原料，通过本领域一般的且成熟的方法对它们进行进一步的加工，采用其中的有效成分应用于所述（a）~（e）任意一项中。所述进一步的加工可选择本领域一般的且成熟的方式，包括但不限于破碎、浸渍、蒸馏、萃取和柱色谱法等方法对清咽滴丸或所述中药组合物及其制剂中的活性成分进行进一步的分离，以使其中的至少一种活性成分应用于所述（a）~（e）任意一项中。优选地，所述至少一种活性成分包括特里马素I、1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷、1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、柯里拉京、甘草查尔酮B、野漆树苷和金缕梅单宁中的至少一种。优选将上述至少一种活性成分应用于制备所述新冠病毒蛋白抑制剂，或应用于非诊断和治疗目的的抑制所述新冠病毒蛋白。
本发明还构建了清咽滴丸的指纹图谱，在一些优选的实施方式中，对照指纹图谱特征如下：对照指纹图谱包括15个共有峰，以峰1为参照峰，15个共有峰的相对保留时间范围分别为：峰1：1.000，峰2：1.081~1.321，峰3：1.467~1.793，峰4：1.626~1.988，峰5：1.906~2.330，峰6：2.590~3.166，峰7：3.766~4.602，峰8：3.820~4.668，峰9：4.681~5.721，峰10：4.726~5.776，峰11：5.135~6.277，峰12：5.952~7.274，峰13：6.203~7.581，峰14：6.308~7.710，峰15：7.511~9.181；峰1为没食子酸色谱峰。上述应用中的清咽滴丸的指纹图谱与对照指纹图谱相比相似度不低于0.9。所述相似度可采用本领域任选地，可接受的方式进行比对。在一些可选的实施方式中，所述相似度采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价，所述清咽滴丸的指纹图谱与所述对照指纹图谱通用的相似度大于0.90。
在一些优选的实施方式中，当清咽滴丸、中药组合物或其制剂中的甘草查尔酮B的含量为7.23~28.31μg/g，柯里拉京的含量为0.10~0.36mg/g时，具有更好的抗病毒效果。
在一些优选的实施方式中，通过改进清咽滴丸的制备方法，能够使清咽滴丸中的甘草查尔酮B和柯里拉京的含量分别为7.23~28.31μg/g和0.10~0.36mg/g，优选地清咽滴丸的制备方法如下：
（1）按重量称取：青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份、人工牛黄12份；
（2）取诃子加15倍、10倍水分别提取3小时、1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至75℃时相对密度1.2的膏1，向所述膏1中加所述膏1质量6倍的体积浓度为90%的乙醇水溶液，醇沉2次，合并两次上清液1，回收乙醇至在70℃时相对密度1.3，得诃子膏；取青黛加10质量倍的体积浓度为20%的盐酸水溶液浸泡10小时，水洗至中性，60℃烘干得精制青黛；取甘草加入15倍水，提取2次，每次2.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至70℃时相对密度1.2的膏2，向膏2中加90%乙醇至乙醇体积浓度为70%，静置，取上清液2，加氨水调pH为8-8.5，过滤，滤液回收乙醇至85℃时相对密度1.1-1.3，加相当于上清液3体积倍的水，调节pH为2-3，过滤，沉淀用水洗3次，干燥得甘草提取物；
（3）取聚乙二醇6000加入所述精制青黛与人工牛黄，加热熔融，依次加入冰片、薄荷脑、甘草提取物和诃子膏，搅拌使溶化并混合均匀，在90±10℃保温，滴入20±5℃的液体石蜡、甲基硅油或植物油中，制成滴丸。
基于上述改进的清咽滴丸的制备方法能够使制备的清咽滴丸获得更佳的抑制新冠病毒的效果，本发明还提供了一种清咽滴丸的制备方法，该制备方法按照上述实施。
基于前述发现的金缕梅单宁具有抑制新冠病毒蛋白的作用，本发明的另一个方面还提供了金缕梅单宁在如下（a）~（e）任意一项中的应用：（a）制备抗新冠病毒的药物；（b）制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物；（c）制备新冠病毒蛋白抑制剂；（d）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒；和，（e）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白；所述新冠病毒蛋白包括主蛋白酶、木瓜蛋白酶和S蛋白中的至少一种。优选将金缕梅单宁应用于制备新冠病毒S蛋白抑制剂和非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒S蛋白中。
下面结合优选实施方式进一步说明本发明的技术方案和技术效果。
实施例1
实施例1-1
本实施例提供了一种清咽滴丸的制备方法，包括：
（1）按重量称取：青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份和人工牛黄12份。
（2）取诃子加28倍、14倍水分别提取1小时、1小时，滤过，合并滤液，浓缩至90℃相对密度1.1的膏1，向所述膏1中加所述膏1质量10倍的体积浓度为85%的乙醇水溶液，醇沉3次，合并上清液1，回收乙醇至在85℃时相对密度1.1，得诃子膏；取青黛加6质量倍的体积浓度为9%的盐酸水溶液浸泡12小时，水洗至中性，烘干得精制青黛；取甘草加入30倍水，提取2次，每次4小时，滤过，合并滤液，浓缩至90℃时相对密度1.1的膏2，向膏2中加乙醇至乙醇体积浓度为75%，静置，取上清液2，加氨水调pH为8，过滤，滤液回收乙醇至85℃时相对密度1.1，加相当于上清液2体积倍的水，调节pH为3，过滤，沉淀用水洗4次，干燥得甘草提取物；
（3）取聚乙二醇6000加入所述精制青黛与人工牛黄，加热熔融，依次加入冰片、薄荷脑、甘草提取物和诃子膏，搅拌使溶化并混合均匀，在100℃保温，滴入25℃的植物油中，制成滴丸。每20mg/粒。
实施例1-2
本实施例提供了一种清咽滴丸的制备方法，包括如下步骤：
（1）青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份和人工牛黄12份。
（2）取诃子加15倍、10倍水分别提取3小时、1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至75℃时相对密度1.2的膏1，向所述膏1中加所述膏1质量6倍的体积浓度为90%的乙醇水溶液，醇沉2次，合并两次上清液1，回收乙醇至在70℃时相对密度1.3，得诃子膏；取青黛加10质量倍的体积浓度为20%的盐酸水溶液浸泡10小时，水洗至中性，60℃烘干得精制青黛；取甘草加入15倍水，提取2次，每次2.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至70℃时相对密度1.2的膏2，向膏2中加90%乙醇至乙醇体积浓度为70%，静置，取上清液2，加氨水调pH为8.5，过滤，滤液回收乙醇至85℃时相对密度1.1-1.3，加相当于上清液3体积倍的水，调节pH为2，过滤，沉淀用水洗3次，干燥得甘草提取物；
（3）取聚乙二醇6000加入所述精制青黛与人工牛黄，加热熔融，依次加入冰片、薄荷脑、甘草提取物和诃子膏，搅拌使溶化并混合均匀，在90±10℃保温，滴入20±5℃的液体石蜡、甲基硅油或植物油中，制成滴丸。
检测实施例1-1和实施例1-2（共六批次样品）中柯里拉京和甘草查尔酮B的含量，结果如表1所示。检测方法见实施例12。
表1
实施例2 清咽滴丸指纹图谱
构建清咽滴丸指纹图谱，采用液相色谱法对清咽滴丸进行测定，方法如下：
（1）对照品溶液的制备：
没食子酸对照品：称取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸1mg的溶液，即得。
甘草苷对照品：称取甘草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草苷1mg的溶液，即得。
异甘草苷对照品：称取异甘草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含异甘草苷1mg的溶液，即得。
甘草素对照品：称取甘草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草素1mg的溶液，即得。
异甘草素对照品：称取异甘草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含异甘草素1mg的溶液，即得。
甘草酸铵对照品：称取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草酸铵1mg的溶液，即得（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207）。
诃子酸对照品：称取诃子酸对照品适量，精密称定，加20%乙腈制成每1ml含诃子酸0.5mg的溶液，即得。
诃子鞣酸对照品：称取诃子鞣酸对照品适量，精密称定，加20%乙腈制成每1ml含诃子鞣酸0.5mg的溶液，即得。
柯里拉京：称取柯里拉京对照品适量，精密称定，加20%乙腈制成每1ml含柯里拉京0.5mg的溶液，即得。
（2）供试品溶液的制备：
将清咽滴丸置干燥研钵中研成粉末状，称取0.5g，精密加入70%乙醇溶液10ml，称重，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
（3）色谱条件及系统适用性：
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 4.6×250mm
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。
检测波长：260nm；流速：1ml/min；柱温：25℃；理论塔板数按没食子酸色谱峰计不低于15000。
液相色谱仪为Waters e2695型，PDA检测器，美国沃特世公司生产。
表2-1 指纹图谱梯度洗脱程序
（4）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录85分钟内的色谱图，九批清咽滴丸指纹图谱叠加图如图1所示。以峰1为参照峰（S峰），计算采集到的9批清咽滴丸图谱中15个共有峰的相对保留时间，结果见表2-2。
表2-2共有峰保留时间
用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版对图谱进行处理，即得清咽滴丸的对照指纹图谱，如图2所示，以表2-2中平均相对保留时间的±10%作为对照图谱的相对保留时间，对照指纹图谱特征为：有15个共有峰，以峰1为参照峰，15个共有峰的相对保留时间范围分别为：峰1：1.000，峰2：1.081~1.321，峰3：1.467~1.793，峰4：1.626~1.988，峰5：1.906~2.330，峰6：2.590~3.166，峰7：3.766~4.602，峰8：3.820~4.668，峰9：4.681~5.721，峰10：4.726~5.776，峰11：5.135~6.277，峰12：5.952~7.274，峰13：6.203~7.581，峰14：6.308~7.710，峰15：7.511~9.181；峰1为没食子酸色谱峰；通过对对照品溶液和供试品溶液同时检测，鉴别出其中7个色谱峰，如图3~图9所示。清咽滴丸典型代表性指纹图谱（批号620040）如图10所示，其中15个共有峰的保留时间分别为:峰1：7.949min，峰2：9.558min，峰3：12.966min，峰4：14.382min，峰5：16.97min，峰6：22.885min，峰7：33.286min，峰8：33.746min，峰9：41.426min，峰10：41.819min，峰11：45.413min，峰12：52.669min，峰13：54.886min，峰14：55.788min，峰15：66.432min。
（5）相似度比较：将采集到的9批清咽滴丸的HPLC图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，与生成的对照指纹图谱进行相似度对比，结果见表2-3。
表2-3九批清咽滴丸相似度结果
实施例3 清咽滴丸抗病毒实验
清咽滴丸由津药达仁堂集团股份有限公司中药研究院提供，生产企业为津药达仁堂集团股份有限公司第六中药厂。本实施例中清咽滴丸制备方法按照实施例1-2记载的方法制备得到。
细胞系：非洲绿猴肾细胞Vero E6购自ATCC公司（货号：CRL-1586）。
SARS-CoV-2毒株由广州国家实验室基础研究部实验员扩增滴定，并由广州海关技术中心卫生检疫研究所BSL-3实验室双人双锁保存。细胞培养和EC50测试均在广州海关技术中心卫生检疫研究所完成。SARS-CoV-2信息如表3-1所示。SARS-CoV-2毒株由广州国家实验室基础研究部实验员扩增滴定，并由广州海关技术中心卫生检疫研究所BSL-3实验室双人双锁保存。
表3-1SARS-CoV-2病毒信息
实验方法：
细胞培养：弃掉汇合度已达95%的Vero E6细胞培养上清，用PBS漂洗1遍；向T75细胞培养瓶加入2 mL胰酶室温消化2分钟；加入8 mL DMEM完全培养基终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞直至完全吹散；按1:4进行传代，每个T75细胞培养瓶加入10 mL DMEM完全培养基和2 mL；两天传一代，每天在显微镜下观察细胞生长情况。
测试清咽滴丸EC50溶液的配制：每10 mL 2% FBS DMEM加入10 μL 10 mM CP-100356（此时终浓度为10 μM，待加入等体积病毒液后终浓度为5 μM），利用上述溶液稀释各化合物，按最高浓度12.5 μM进行4倍倍比稀释，共8个稀释度（312.5ng/ml、1.25μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、1mg/ml和10mg/ml），每个稀释度设置4个复孔。阴性对照组使用DMSO处理。
抗病毒活性测试实验过程：
CPE是由病毒感染引起的宿主细胞的活率和形态变化。通过细胞病死率定量病毒滴度，评估小分子药物、中和抗体等的抗病毒效果。本实验通过测试受试化合物在Vero E6细胞中抑制SARS-CoV-2感染的EC50来评价其作用。
（1）将100 μL含2×104细胞接种至96孔板中，放置于37℃恒温恒湿培养箱过夜培养；
（2）细胞贴壁20小时后吸弃培养液，每孔分别加入100 μL含指定浓度测试化合物的培养液。每种测试化合物设置8个稀释度，每个稀释度设置4个复孔，同时设置DMSO处理组和正常细胞组。除正常细胞组外，其它孔加入含0.01 MOI病毒完全培养液，37℃恒温恒湿培养箱孵育72小时。
（3）在感染后72小时使用全视野细胞扫描仪记录细胞病变率，抑制率=（1－测试化合物组的病变率）×100％。
（4）根据抑制率结果，进行四参数拟合计算EC50。
实验结果：评价清咽滴丸成药对新冠病毒SARS-CoV-2野生株、Delta株，奥密克戎BA.1.1、BA.2.3、BA.4和BA.5病毒株的药效学结果，详见表3-2~表3-7。
表3-2清咽滴丸成药对SARS-CoV-2 WT株抑制结果
表3-3清咽滴丸成药对SARS-CoV-2 Delta株抑制结果
表3-4清咽滴丸成药对奥密克戎BA.1.1株抑制结果
表3-5清咽滴丸成药对奥密克戎BA. 2.3株抑制结果
表3-6清咽滴丸成药对奥密克戎BA.4株抑制结果
表3-7清咽滴丸成药对奥密克戎BA.5株抑制结果
从表3-2~表3-7可以看出：当清咽滴丸浓度为200 µg/mL时，对SARS-CoV-2（WT野生株）具有约70%的抑制率；对SARS-CoV-2 Delta株具有约50%的抑制率；对奥密克戎BA.2.3株具有约70%的抑制率；对奥密克戎BA.4株具有约50%的抑制率。当清咽滴丸浓度为100 µg/mL时，对奥密克戎BA.1.1株具有约70%的抑制率；对奥密克戎BA.5株具有约60%以上的抑制率。分析清咽滴丸成药分别对不同SARS-CoV-2 毒株及奥密克戎毒株的效果，由结果可以看出清咽滴丸成药在体外细胞水平对SARS-CoV-2感染具有一定的抑制作用，在100μg/ml条件下，清咽滴丸对各毒株的抑制率BA.1.1＞BA.5＞WT野生株＞BA.2.3＞BA.4/Delta。在100μg/ml条件下对奥密克戎BA.1.1抑制效率最高，可达约75%的抑制率。
实施例4
LC-MS/MS分析，分析对象为实施例1-2制备得到的清咽滴丸：Agilent 6520 Q-TOF仪器由Agilent 1290 UHPLC及带有电喷雾电离（ESI）源的质谱部分组成，对样品进行定性分析。使用ACQUITY UPLC®BEH C18（2.1×100 mm, 1.7μm;Waters）进行色谱分离。设置柱温为35℃，进样量为3 μL。流速设定为0.3 mL/min。流动相A为乙腈，0.1%甲酸水溶液为流动相B。采用多步线性梯度洗脱方案:0~4min，5~9%A；4~10min，9~44.5%A；10~12min，44.5~51%A；12~14min，51~58%A；14~16min，58~62%A；ESI源设置参数包括：干燥气体温度，350℃；雾化器气体压力，30 psi；碎片电压175 V；碰撞能量为20/30 eV。在m/z 100 ~ 1500 Da范围内，采用正反两种分析模式进行分析。数据采集在MassHunter工作站进行。
采用质谱检测的方法，从清咽滴丸中共鉴定出48种化合物，结果如表4所示。其中9种与标准品进行了比较。根据确切的质量数、片段信息、MS裂解规律、参考文献、PubChem、HMDB数据库等信息综合比较，推断剩余化合物的结构。清咽滴丸提取物UPLC-Q-TOF-MS基峰图分别如图11和图12所示。
表4清咽滴丸化学成分鉴定结果
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实施例5
基于实施例4的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析结果，进行网络药理学分析。
基于化合物信息，通过中药系统药理学分析平台数据库(traditional Chinesemedicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php) 检索与实施例5清咽滴丸分离鉴定成分相关的潜在靶点，通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）检索靶点蛋白名称。利用Gene Cards数据库（https://www.genecards.org/）及OMIM数据库（https://omim.org/）检索基因和疾病相关靶标。以“COVID-19”及“coronavirus pneumonia”为关键词收集疾病靶点信息，将药物及疾病靶点基因进行比对，获得交集靶点。将清咽滴丸和COVID-19相关基因由Uniport ID统一。利用可视化软件Cytoscape 3.8.1构建的制剂-药材-化学成分-靶点的PPI网络。将药物与疾病作用交集靶点，采用String数据库（https://string-db.org/）构建蛋白-蛋白的互作（PPI）网络。采用Bioconductor（http://www.bioconductor.org/）数据库R语言包对清咽滴丸治疗COVID-19潜在靶点进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encydopedia of Genes andGenomes（KEGG）通路富集，利用Cytoscape 3.8.1对富集结果进行可视化展示。
分析结果：
来源于清咽滴丸的48个成分对应468个蛋白靶点。通过数据库检索到1958个COVID-19相关靶点。以新冠感染为对象，基于GeneCards数据库检索与新冠感染相关靶点，用DAVID数据库对潜在的靶点进行GO和KEGG分析，结果表明参与清咽滴丸治疗作用有关的生物过程756个，参与清咽滴丸治疗作用相关通路信号160个，主要有Humancytomegalovirus infection、Lipid and atherosclerosis、PI3K-Akt signalingpathway、IL-17 signaling pathway、Kaposi sarcoma-associated herpesvirusinfection等信号通路，这些通路均与病毒感染、炎症靶点和氧化应激反应密切相关。
通过中药调控网络的构建，6味药材成分对应靶点与疾病对应靶点蛋白进行比对，得到交集共102种。根据可视化网络中度值进行分析，清咽滴丸治疗COVID-19的有效成分共33种，其中度值较高的包括蓖麻油酸、1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷、野漆树苷、18β-甘草次酸-3-O-β-D-葡萄糖苷等多种成分。按照度值由大到小排序的前十个作用靶点包括：ACTB、TNF、TP53、VEGFA、IL6、CAPS3、INS、EGFR、STAT3。提示ACTB、TNF、TP53、VEGFA、IL6和CASP3可能是清咽滴丸治疗COVID-19药理学作用的核心靶点，NF-κB、Apoptosis、MAPK信号通路在网络中连接的通路较多，提示调控这些通路可能会影响整个网络形成连锁反应。
表5中药调控网络中化合物度值
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实施例6
对实施例4鉴定出的清咽滴丸中的活性物质进行分子对接研究，本实施例选定病毒复制相关的主蛋白酶（Mpro）、木瓜蛋白酶（PLpro）和S蛋白中的至少一种为对接的靶点。从蛋白质数据库(PDB)数据库（https://www.rcsb.org/）获取上述三种蛋白的三维结构。将Mpro、PLpro和S protein结果进行整理总结，筛选对新冠病毒蛋白具有显著亲和力的化合物，如表6。表6中6个化合物与新冠病毒蛋白的对接结果图如图13~图18所示。
表6化合物与新冠病毒蛋白靶点的分子对接结合能
对接结果显示诃子和甘草中的单体成分均与Mpro和PLpro活性位点具有较强的结合能力，且作用的靶向氨基酸与原配体相近，结果提示该具有较强结合能力的中药小分子在体外可能对Mpro和PLpro具有较强的抑制作用。
本实施例分子对接方法如下：
从蛋白质数据库(PDB)数据库（https://www.rcsb.org/）获取Mpro（PDB ID:6LU7）、PLpro（PDB ID: 7CJM）和S蛋白（PDB ID:7T9L）的三维结构。通过Discovery studio软件对分子和靶向蛋白进行预处理。优化分子结构以获得最低能量构象。然后，通过删除多余的水分子、去除其他配体并加入氢、添加缺失的氨基酸残基和末端残基来制备目标蛋白的结构。对接过程采用半柔性对接模式，利用PyMoL进行可视化。
实施例7 酶活性的测定
基于荧光共振能量转移（FRET）检测清咽滴丸中活性小分子对新冠病毒蛋白体外抑制活性。
1. 单点筛选：
底物准备：订购多肽底物：MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2。该底物N端连接有MCA荧光基团（吸收波长320nm，发射波长405nm）。SARS-CoV-2-Mpro在P1位谷氨酰胺残基（Q）和P1'位丝氨酸残基（S）之间进行序列切割后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团在320nm激发光下可以产生405nm的发射光；如酶活性被中药小分子抑制，序列无法被切割，淬灭基团对荧光基团有抑制作用，不会产生405nm的发射光。通过荧光分析仪检测体系中荧光强度的变化，可以反映化合物对SARS-CoV-2-Mpro的抑制活性。
反应体系：将40µM抑制剂（清咽滴丸中的中药活性成分）与0.2µM Mpro蛋白（实施例11）在50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA条件下混合，室温静置1h，再加入20µM底物多肽，在室温进行反应，然后立即置于酶标仪进行检测。以依布硒作为阳性对照，DMSO作为阴性对照，筛选与阳性对照抑制率相当的中药活性成分继续进行IC50测试。
2. IC50测试
多肽底物同单点筛选方法。反应体系：将13个连续梯度稀释浓度的抑制剂与0.2µM蛋白在50mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA或50mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA，0.01%Triton X-100条件下混合，室温静置1h，再加入20µM底物多肽，在室温进行反应，然后立即置于酶标仪进行检测。所有实验数据均采用GraphPad Prism进行分析，作图得到IC50。实验结果如表7所示。
表7
实施例8 蛋白相互作用
采用表面等离子共振法（SPR）分析清咽滴丸中的活性物质与新冠病毒蛋白的亲和力活性。
本实施例验证Mpro、PLpro和Spike RBD中至少一种蛋白与清咽滴丸中的活性物质柯里拉京、野漆树苷和甘草查尔酮B的亲和力活性。使用Biacore T200进行了SPR实验。其中Mpro和PLpro是实验室自制的，自制方法参见实施例11。Spike RBD（40592-V49H7-B）购自中国生物科技股份有限公司。采用胺偶联试剂盒(BR-1000-50;通用电气医疗集团)。分子用流动缓冲液（1.05×PBS P+ 5% DMSO）逐级稀释8倍，以30 μL/min的速率注入通道的流式细胞仪。结合时间为120s，解离时间为180s。采用Biaevaluation软件2.0进行数据分析。
SARS-CoV-2 Mpro与各化合物的亲和力如图19~图23所示，以利托那韦为阳性对照，利托那韦对Mpro的解离平衡常数KD是70.35µM，结果可知柯里拉京、野漆树苷和甘草查尔酮B与Mpro的解离平衡常数分别是45.15nM、5.129µM和5.65µM，与Mpro均具有较好的亲和力，是Mpro潜在的抑制剂。
SARS-CoV-2 PLpro与各化合物的亲和力如图24~图27所示，以利托那韦为阳性对照，利托那韦对PLpro的解离平衡常数KD是65.65µM，结果可知柯里拉京和野漆树苷与PLpro的解离平衡常数分别是62.38nM和7.718µM，与PLpro均具有较好的亲和力，是PLpro潜在的抑制剂。
SARS-CoV-2 S蛋白与各化合物的亲和力如图28和图29所示，野漆树苷和柯里拉京与S蛋白的解离平衡常数分别是7.068µM和192nM。
上述结果表明柯里拉京、野漆树苷和甘草查尔酮B与参与病毒复制过程的Mpro、PLpro及参与病毒入侵过程的S蛋白具有强亲和力，且KD值均大于药性对照药利托那韦。金缕梅单宁与参与病毒入侵过程的S蛋白具有强亲和力。
实施例9 清咽滴丸单体成分抗病毒实验
采用实施例3相同实验条件和方法，进行清咽滴丸成分抗病毒实验，共评价了8个化合物与2个阳性药在奥密克戎BA.5病毒株（保藏号：GDPCC-303-YQ-300 μL，感染剂量0.01MOI）的药效学结果。各单体化合物浓度点设置为12.5μM、3.12μM、0.78125μM、0.195313μM、0.048828μM、0.012207μM、0.003052μM和0.000763μM，每个稀释度设置4个复孔，阴性对照组使用DMSO处理。。
结果显示，阳性药PF-07321332的EC50为44.3 nM，Jun9-75-4的EC50为3.99 µM，该研究体系可以用于评价化合物对奥密克戎BA.5的药效学研究。由结果可知，甘草查尔酮B和柯里拉京在体外细胞水平可以高效拮抗奥密克戎BA.5毒株感染，抗病毒效果均在微摩尔级，是潜在的病毒抑制剂。甘草查尔酮B、甘草查尔酮D、柯里拉京、阳性对照药Jun9-75-4和PF-07321332抗病毒结果如图30所示。
表 8-1各单体成分在细胞水平的抑制病毒能力评价结果汇总
分析清咽滴丸系列8个受试化合物在非洲绿猴肾细胞Vero E6细胞分别抗奥密克戎BA.5毒株的效果。甘草查尔酮B和柯里拉京在体外细胞水平可以高效拮抗奥密克戎BA.5毒株感染，抗病毒效果均在微摩尔级，是潜在的病毒抑制剂。
比较甘草查尔酮B和柯里拉京的EC50与清咽滴丸50%有效率浓度时甘草查尔酮B和柯里拉京浓度发现，前者远大于后者（参见表8-2），说明清咽滴丸抗新冠病毒不仅依靠其中的有效活性成分各自发挥作用，各单体成分之间还具有协同作用，使清咽滴丸中各单体成分在具有较低含量时，就能发挥对新冠病毒的抑制作用。
表8-2
实施例10
金缕梅单宁对新冠病毒蛋白的抑制作用：
（1）分子对接：使用Discovery studio 2020软件进行配体和蛋白的优化优，经Chemspider数据库下载金缕梅单宁的mol.2结构，点击Small Molecules项下Prepare orFilter Ligands>Prepare Ligands对配体小分子进行处理，点击Small Molecules-Minimize Ligands将配体结构进行能量最小化，获得化合物不同的构象。针对受体蛋白，从PDB数据库获取目的蛋白结构，删除多余的水分子，点击Macromolecules>Prepare Protein>Clean Protein即可完成蛋白加氢、补全缺失的氨基酸残基和末端残基等过程。采用CDOCKER半柔性对接模式，以对接结果中−CDOCKER_INTERACTION_ENERGY为评价标准。
表9
（2）表面等离子共振法（SPR）分析金缕梅单宁与新冠病毒蛋白的亲和力活性。实验方法同实施例8。实验结果如图32所示，缕梅单宁与SARS-CoV-2 S蛋白的解离平衡常数为93.3nM。
实施例11
金缕梅单宁的抗炎作用：
实验方法：
（1）溶液的配制：
1）完全培养的配制
取50 mL无菌离心管，加入含有1%抗生素的基础培养基45 mL，再向其中加入5 mL胎牛血清配成含有10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的DMEM高糖培养基，备用。
2）2.5 mg/mL MTT的配制
避光条件下称取MTT噻唑蓝100 mg，加入PBS 40 mL振荡充分溶解，放入4℃冰箱中避光保存。
（2）细胞复苏
取出冻存的小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7），快速放置于37℃恒温水浴锅中解冻，75%酒精擦拭后置于超净台，加入8 mL完全培养基中，1000 rpm离心3 min，弃去上清，加入1mL完全培养基吹吸数次使细胞分散均匀，转移至预先加有4 mL完全培养基的T25 cm2细胞培养瓶中，培养箱设置温度为37℃、培养气体为5% CO2和95%空气。
（3）细胞传代
取出细胞培养瓶，显微镜下观察细胞生长密度达到95%，进行传代操作，加入无菌PBS润洗两次，加入3 mL完全培养基，使用细胞刮，按同一方向轻轻刮取细胞，使用移液枪轻轻吹吸使细胞均匀分散，转移至预先加入完全培养基的培养瓶中，按照1:3比例进行传代。静置几分钟后，显微镜下观察细胞已有部分贴壁，细胞生长状态良好，继续放入CO2孵育箱中进行培养。
（4）细胞冻存
细胞培养完成后，取整瓶细胞进行冻存，弃去上层培养基，加入PBS润洗两次，加入5 mL完全培养基，使用细胞刮板刮取细胞，转移至离心管内，1000 rpm离心3min，弃去上清，加入1 mL冻存液（FBS：DMSO=9:1），采用程序降温方式冻存。
（5）炎症模型的建立及给药
从孵育箱中取出RAW 264.7细胞，使用细胞刮取细胞使细胞脱落，加入3 mL完全培养基，加入PBS稀释10倍后，使用细胞计数板进行计数，设置细胞密度为1 × 105个细胞/mL，取96孔板，每孔中加入100 μL，置于CO2孵育箱中培养24 h。
称取LPS粉末10 mg 加入PBS 10 mL 配制成1 mg/mL LPS溶液母液，每1 mL含药完全培养基中分别加入LPS母液1 μL、2 μL、5 μL、10 μL，使LPS终浓度为1 μg/mL、2 μg/mL、5μg/mL、10 μg/mL，进行LPS诱导炎症模型浓度的考察。精密称取化合物适量，加入1% DMSO预溶，加入完全培养基配制成浓度为100 μM的母液，取母液依次稀释成5 μM、10 μM、20 μM、40μM、60 μM、80 μM、100 μM不同浓度进行后续实验。以地塞米松为抗炎实验的对照药，称取地塞米松适量，加入完全培养基溶剂配制浓度为10 μM，备用。取出96孔板，弃去上清，每孔加入不同浓度化合物的完全培养基200 μL，依次设置空白对照组、模型组、地塞米松组、不同浓度给药组。
（6）细胞活力检测
经细胞培养箱中孵育24 h后，取出96孔板，每孔加入2.5 mg/mL MTT溶液50 μL，放入培养箱中继续孵育4 h，取出弃去上清，每孔中加入150 μL DMSO，振荡，使用酶标仪在490nm下记录每孔的吸光度值。
（7）NO含量测定
取给药后的细胞96孔板，取每孔细胞培养基上清50 μL，分别加入NO检测试剂盒中Griess试剂I和II各50 μL，于540 nm测量吸光度。使用试剂盒随行内标，绘制标准曲线，获得回归方程，代入公式进行样品中NO含量的测定。
（8）细胞炎症因子含量测定
取给药后的细胞96孔板，每孔取上清25 μL、样品稀释液25 μL，加入至ELISA试剂盒板条中，除空白孔外，每孔加入辣根过氧化物酶（HPR）100 μL，封口膜封板，置于37℃恒温箱中孵育1 h，取出，弃去上清液，每孔均加入洗涤液350 μL，拍干，重复洗涤5次。避光加入底物A、B各50 μL，封板后放入37℃恒温箱中孵育15 min，加入终止液50 μL，立即于540 nm下进行检测。使用试剂盒所带标准品制备标准曲线，得到回归方程，代入公式计算所检测样品浓度。
实验结果：
采用MTT法进行金缕梅单宁对RAW 264.7巨噬细胞的细胞活力进行检测。采用完全培养基稀释至5 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、40 μΜ、60 μΜ、80 μΜ、100 μΜ不同浓度，给药24 h后采用MTT法测定细胞活力。实验结果如图33所示，金缕梅单宁在5~40 μΜ浓度下对细胞活性无显著影响。基于无细胞毒性的浓度下展开后续的细胞抗炎实验研究，收集细胞培养上清液，采用Griss法测定NO含量。如图34所示，金缕梅单宁在实验检测的最低浓度5 μΜ浓度下即呈现出显著的NO抑制作用，具有较强的抑制NO释放的活性，进一步探究以上化合物对TNF-α（图35）、IL-6（图36）、IL-1β（图37）细胞炎症因子的抑制活性，结果表明金缕梅单宁在不同浓度下对多种细胞因子均呈现出显著的抑制作用。
实施例12
通过构建K18-hACE2小鼠感染SARS-CoV-2 Omicron BA.5病毒模型，检测清咽滴丸体内对新冠病毒感染模型动物的影响。
实验方法：
（1）受试药物为实施例1-2制备的清咽滴丸。SARS-CoV-2感染K18-hACE2小鼠，会引起模型动物剂量依赖性的致死性呼吸道疾病，其特征类似于严重的人类COVID-19，包括弥漫性肺泡损伤、炎症细胞浸润、组织损伤、肺血管损伤和死亡等，因此本实施例采用K18-hACE2小鼠作为模式动物。模型小鼠参考文献Guo,Y.,Huang,L.,Zhang,G.et al.A SARS-CoV-2 neutralizing antibody with extensive Spike binding coverage andmodified for optimal therapeutic outcomes.Nat Commun 2021,12,2623-2032.和ZhouX,Wang H,et al.Molecular deconvolution of the neutralizing antibodies inducedby an inactivated SARS-CoV-2 virus vaccine.Protein Cell.2021 Oct;12(10):818-823.
（2）小鼠感染：小鼠攻毒当天称量体重，之后每天下午称重一次。攻毒方式：正常组不感染，模型组和清咽滴丸组滴鼻感染SARS-CoV-2 Omicron BA.5毒株。
给药：灌胃给药。将样品稀释至相应浓度，异氟烷麻醉情况下，将药物通过灌胃针递送至小鼠胃内。
小鼠体重和生存监测：感染当日记录小鼠体重，之后每日定时称取小鼠体重和观察小鼠死亡情况并进行记录。
小鼠组织病理检测：小鼠安乐死，取左边完整肺用4%多聚甲醛固定，用于后续病理切片观察。
实验结果：
（1）对肺部炎症的改善：
正常组，结果如图38所示：肺组织结构基本正常，视野内支气管上皮细胞排列规则紧密，未见明显脱落，支气管周围未见炎症细胞浸润；血管平滑肌纤维结构清晰，未见内皮细胞脱落；肺泡壁厚度均匀，肺泡壁上可见丰富的毛细血管，肺泡结构清晰，未见萎缩；肺泡壁及肺泡内未见明显炎症细胞浸润。
模型组，结果如图39所示：肺组织结构中度异常，视野内支气管周围内可见少量炎症细胞浸润，如箭头A所示；血管周围可见大量炎症细胞浸润，如箭头B所示；部分区域大量肺泡上皮细胞增生，肺泡壁明显增厚，并伴随大量炎症细胞浸润，如箭头C所示；部分肺泡排列紊乱，肺泡萎缩、塌陷，如箭头D所示，并伴随少量炎症细胞浸润。
清咽滴丸组，结果如图40所示：肺组织结构轻度异常，视野内支气管上皮细胞排列规则紧密，未见明显脱落，支气管周围未见炎症细胞浸润；血管周围可见少量炎症细胞浸润，如箭头B所示；部分肺泡上皮细胞增生，肺泡壁增厚，并伴随少量炎症细胞浸润，如箭头C所示；部分肺泡排列紊乱，肺泡萎缩、塌陷，如箭头D所示。
（2）对体重下降的改善：
对感染后小鼠体重进行监测，如图41所示，模型组和清咽滴丸组在小鼠感染病毒后出现不同程度的体重下降；模型组小鼠体重明显低于正常组，具有显著性差异；清咽滴丸组小鼠体重高于模型组，但无统计学差异。提示清咽滴丸对病毒侵染过小鼠体重下降具有一定的改善作用。
本实施例结果显示：①对肺部炎症的改善作用：正常组小鼠肺组织结构正常，支气管周围、血管周围、肺泡壁及肺泡内均未见明显炎症细胞浸润；模型组小鼠肺组织结构中度异常，支气管周围、血管周围、肺泡壁及肺泡内可见不同程度炎症细胞浸润；清咽滴丸组小鼠肺组织结构轻度异常，支气管周围、血管周围、肺泡壁及肺泡内可见少量炎症细胞浸润；②对体重下降的改善作用：模型组和清咽滴丸组小鼠感染病毒后体重出现不同程度的下降；模型组小鼠体重明显低于正常组，具有显著性差异；清咽滴丸组小鼠体重高于模型组，但无统计学差异。综上：清咽滴丸可以减轻新冠病毒感染后小鼠肺部炎症反应，并对病毒感染后小鼠体重下降具有一定的改善作用。
实施例13
SARS-CoV-2-Mpro蛋白的异源重组表达与纯化：
选取SARS-CoV-2 3CLpro编码基因的全长，采用PCR技术进行体外扩增。经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收大小为1 kb的片段，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，涂LB平板（含100mg/L氨苄青霉素）培养过夜。随后从平板上挑取单克隆，分别接种与5mL LB的小试管（含100mg/L氨苄青霉素）培养12h。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切后用琼脂糖凝胶回收大小合适的片段，筛选阳性克隆并鉴定和测序，以确保COVID-19 3CLpro的编码基因正确的克隆到pGEX-6p-1载体中，即获得pGEX-6p-1- SARS-CoV-2-3CLpro重组质粒。
将pGEX-6p-1-SARS-CoV-2-3CLpro重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，并用LB平板（含100mg/L氨苄青霉素）37℃培养过夜，筛选阳性克隆。挑取单克隆扩大培养，IPTG诱导表达，收集上清液。
采用镍离子金属螯合层析，将纯化得到的目的蛋白用SDS-PAGE进行鉴定，分装于-80℃保存待用。经Hi-trap Q阴离子交换层析分离及Superdex 200分子筛层析后纯化所得蛋白溶液，进行SDS-PAGE凝胶电泳纯化检测。从图42中可以看出目的蛋白的纯度可达95%以上。
SARS-CoV-2 PLpro的异源重组表达与纯化：
1. 质粒的构建：冠状病毒PLpro的基因根据其原始编码序列中G/C含量和适用于大肠杆菌原核表达系统密码子进行优化，为了提高PLpro的表达量和纯度，在PLpro的基因上连接底物修饰蛋白即类泛素蛋白修饰分子SUMO标签。
将PLpro融合表达片段以PCR进行扩增，经BamHI和XhoI双酶酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收大小为1 kb的片段，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，涂LB平板（含50mg/L卡那霉素）培养过夜。随后从平板上挑取单克隆，扩大培养后用质粒提取试剂盒提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切后用琼脂糖凝胶回收大小合适的片段，筛选阳性克隆并鉴定和测序，以确保PLpro与SUMO的编码基因正确的克隆到pET-28a载体中，获得pET-28a-SARS-CoV-2-PLpro重组质粒。
2. 蛋白的表达：
将测序正确的pET-28a-SARS-CoV-2-PLpro重组质粒热击法转化至E．coli BL21(DE3)中。取BL21(DE3)感受态菌株置于冰上消融30 min，加入PLpro质粒（150 mg/mL）1~2 μL。加入质粒后，于冰上放置15~30 min。置于42℃水浴锅中热激60 s，取出置于冰上5 min，向14 mL圆底摇菌管中加入1mL LB无抗性液体培养基，将转化产物转入1 mL LB 培养基中，复苏45 min，涂布于50 µg/mL卡纳抗性LB平板上，37℃过夜倒置培养；
挑取单菌落，扩大培养，IPTG诱导表达，收菌。菌种破碎后过镍柱，将洗脱下来的蛋白浓缩至1 mL，过Superdex 200分子筛，经Superdex 200分子筛层析后纯化所得纯化后的蛋白溶液，从图43中可以看出框区域所标位置即为目的蛋白。
实施例14
清咽滴丸甘草查尔酮B含量测定的构建方法，采用液质联用法对清咽滴丸进行测定，具体方法如下：
甘草查尔酮B为对照品，制成每1ml甲醇含甘草查尔酮B0.04µg的溶液；供试品溶液的制备：将清咽滴丸置干燥研钵中研成粉末状，称取0.8g，精密加入100ml甲醇溶液，称重，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱、质谱条件及系统适应性试验：
以ACQUITY UPLC-HSS T3(2.1×100mm,1.7µm)为色谱柱；以乙腈:水(24:76)为流动相，流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM)，监测离子对见下表：
表10
理论塔板数按甘草查尔酮B峰计不低于10000。质谱数据采集时间为4-7min。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。实施例1-2制备得到的清咽滴丸供试品中甘草查尔酮B的质谱图如图44所示。
清咽滴丸柯里拉京含量测定的构建方法，采用液质联用法对清咽滴丸进行测定，具体方法如下：
柯里拉京为对照品，制成每1ml甲醇含柯里拉京4µg的溶液；供试品溶液的制备：将清咽滴丸置干燥研钵中研成粉末状，称取0.2g，精密加入10ml甲醇溶液，称重，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱、质谱条件及系统适应性试验：以ACQUITY UPLC-HSS T3(2.1×100mm,1.7µm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，按表11中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃。采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM)，监测离子对见表10。理论塔板数按柯里拉京峰计不低于10000。质谱数据采集时间为12-15min。实施例1-2制备得到的清咽滴丸供试品中柯里拉京的质谱图如图45所示。
表11 柯里拉京含量测定梯度洗脱程序
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最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (11)
1.清咽滴丸、中药组合物或其制剂在如下（a）~（e）任意一项中的应用；
（a）制备抗新冠病毒的药物；
（b）制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物；
（c）制备新冠病毒蛋白抑制剂；
（d）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒；
和，（e）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白；
所述的新冠病毒包括新冠病毒原始株、新冠病毒奥密克戎株和新冠病毒德尔塔株中的至少一种；
所述新冠病毒蛋白包括主蛋白酶、木瓜蛋白酶和刺突蛋白中的至少一种；
所述中药组合物包含青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份和人工牛黄12份。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述清咽滴丸、中药组合物或其制剂中甘草查尔酮B的含量为7.23~28.31μg/g，柯里拉京的含量为0.10~0.36mg/g。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述清咽滴丸的制备方法包括：
（1）按重量称取：青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份、人工牛黄12份；
（2）取诃子加15倍、10倍水分别提取3小时、1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至75℃时相对密度1.2的膏1，向所述膏1中加所述膏1质量6倍的体积浓度为90%的乙醇水溶液，醇沉2次，合并两次上清液1，回收乙醇至在70℃时相对密度1.3，得诃子膏；取青黛加10质量倍的体积浓度为20%的盐酸水溶液浸泡10小时，水洗至中性，60℃烘干得精制青黛；取甘草加入15倍水，提取2次，每次2.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至70℃时相对密度1.2的膏2，向膏2中加90%乙醇至乙醇体积浓度为70%，静置，取上清液2，加氨水调pH为8-8.5，过滤，滤液回收乙醇至85℃时相对密度1.1-1.3，加相当于上清液3体积倍的水，调节pH为2-3，过滤，沉淀用水洗3次，干燥得甘草提取物；
（3）取聚乙二醇6000加入所述精制青黛与人工牛黄，加热熔融，依次加入冰片、薄荷脑、甘草提取物和诃子膏，搅拌使溶化并混合均匀，在90±10℃保温，滴入20±5℃的液体石蜡、甲基硅油或植物油中，制成滴丸。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述清咽滴丸的对照指纹图谱包括15个共有峰，以峰1为参照峰，15个共有峰的相对保留时间范围分别为：峰1：1.000，峰2：1.081~1.321，峰3：1.467~1.793，峰4：1.626~1.988，峰5：1.906~2.330，峰6：2.590~3.166，峰7：3.766~4.602，峰8：3.820~4.668，峰9：4.681~5.721，峰10：4.726~5.776，峰11：5.135~6.277，峰12：5.952~7.274，峰13：6.203~7.581，峰14：6.308~7.710，峰15：7.511~9.181；峰1为没食子酸色谱峰；
所述清咽滴丸的指纹图谱与所述对照指纹图谱相似度不低于0.90。
5. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括将清咽滴丸、中药组合物或其制剂中的如下活性成分应用于所述（a）~（e）任意一项中：特里马素 I、1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷、1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、柯里拉京、甘草查尔酮B、野漆树苷和金缕梅单宁中的至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述新冠病毒奥密克戎株包括奥密克戎BA.1.1、奥密克戎BA.2.3、奥密克戎BA.4和奥密克戎BA.5中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述清咽滴丸的浓度为20~200μg/mL。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述新冠病毒为新冠病毒奥密克戎BA.1.1株和/或BA.5，所述清咽滴丸的浓度为20~100μg/mL。
9.金缕梅单宁在如下（a）~（e）任意一项中的应用：
（a）制备抗新冠病毒的药物；
（b）制备预防、缓解或治疗新冠病毒感染的药物；
（c）制备新冠病毒蛋白抑制剂；
（d）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒；
和，（e）非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白；
所述新冠病毒蛋白包括主蛋白酶、木瓜蛋白酶和S蛋白中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于制备新冠病毒蛋白抑制剂和非诊断和治疗目的的抑制新冠病毒蛋白，所述新冠病毒蛋白为S蛋白。
11.一种清咽滴丸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
（1）按重量称取：青黛100份、甘草100份、诃子80份、薄荷脑80份、冰片20份、人工牛黄12份；
（2）取诃子加15倍、10倍水分别提取3小时、1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至75℃时相对密度1.2的膏1，向所述膏1中加所述膏1质量6倍的体积浓度为90%的乙醇水溶液，醇沉2次，合并两次上清液1，回收乙醇至在70℃时相对密度1.3，得诃子膏；取青黛加10质量倍的体积浓度为20%的盐酸水溶液浸泡10小时，水洗至中性，60℃烘干得精制青黛；取甘草加入15倍水，提取2次，每次2.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至70℃时相对密度1.2的膏2，向膏2中加90%乙醇至乙醇体积浓度为70%，静置，取上清液2，加氨水调pH为8-8.5，过滤，滤液回收乙醇至85℃时相对密度1.1-1.3，加相当于上清液3体积倍的水，调节pH为2-3，过滤，沉淀用水洗3次，干燥得甘草提取物；
（3）取聚乙二醇6000加入所述精制青黛与人工牛黄，加热熔融，依次加入冰片、薄荷脑、甘草提取物和诃子膏，搅拌使溶化并混合均匀，在90±10℃保温，滴入20±5℃的液体石蜡、甲基硅油或植物油中，制成滴丸。
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| Zhao et al. | Investigation of the therapy targets of Yi-Qi-Yang-Yin-Hua-Tan-Qu-Yu recipe on type 2 diabetes by serum proteome labeled with iTRAQ | |
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| Zhu et al. | Identification and quantification of nine compounds in Fangwen Jiuwei decoction by liquid chromatography–mass spectrometry | |
| Fan et al. | Exploring the molecular mechanism of action of Polygonum capitatum Buch-Ham. ex D. Don for the treatment of bacterial prostatitis based on network pharmacology and experimental verification | |
| Jiao et al. | A strategy based on gene sequencing and molecular docking for analysis and prediction of bioactive peptides in Shuxuetong injection | |
| Gao et al. | Explore bioactive ingredients and potential mechanism of Houpo Mahuang decoction for chronic bronchitis based on UHPLC-Q exactive orbitrap HRMS, network pharmacology, and experiment verification | |
| Sun et al. | Effect and mechanism of Angelic Shaoyaosan mediated AMPK/SIRT1 positive feedback loop to promote autophagy and regulate the systemic inflammatory response in acute pancreatitis | |
| Peng et al. | Lianhua Qingke ameliorates lipopolysaccharide‐induced lung injury by inhibiting neutrophil extracellular traps formation and pyroptosis | |
| Huang et al. | DCTPP1, a reliable Q-biomarker for comprehensive evaluation of the quality of tripterygium glycoside tablets based on chemical references | |
| Hakim et al. | Molecular Study of Acalypha indica to Leptin, Alpha Glucosidase, and its Antihyperglycemic Effect on Alpha Glucosidase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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