CN117867080A - 用于恒温指数扩增反应的内参基因及其筛选方法、模板对 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于恒温指数扩增反应的内参基因及其筛选方法、模板对，内参基因包括：ACTB基因、GAPDH基因、TUBB基因、TUBB3基因、18s rRNA基因、28s rRNA基因、B2M基因、SDHA基因、HPRT1基因、RPLP0基因中的至少一种。本发明解决了现有用于恒温指数扩增反应的内参基因稳定性不佳，影响恒温指数扩增反应实验结果准确性的技术问题，实现了提供稳定性佳的用于恒温指数扩增反应的内参基因，提高实验结果准确性的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于恒温指数扩增反应的内参基因及其筛选方法、模板对。
背景技术
核酸扩增技术是一种用于检测和定量特定DNA或RNA序列的分子生物学方法。这种技术的出现和发展，使得我们能够在病原体检测、基因研究等领域进行更为精确和高效的工作。
核酸扩增技术中最常用的是聚合酶链反应(PCR)，其扩增速率高，可以在很短的时间内得到大量的扩增产物；灵敏度高，可以检测到非常低浓度的目标序列；可重复性好，可以在不同实验室和不同设备上得到一致的结果，同时适用于多种不同的样本类型和目标序列。但PCR扩增技术操作较为复杂，需要精确的温度控制和设备，扩增时间相对较长且成本较高。
恒温扩增技术是一种无需温度变化即可进行核酸扩增的技术，其主要包括：重组酶聚合酶扩增技术，环介导等温扩增技术，链替代扩增技术，滚环扩增技术等。恒温扩增技术具有以下优势：操作简单，不需要复杂的温度控制和设备；扩增时间相对较短，可在5min内扩增到106-109倍；灵敏度高，可以检测到低浓度的目标序列。而选择合适的内参基因是保证分析结果准确性的前提，常用的内参基因通常为细胞中具有高度保守性和稳定表达的管家基因，包括细胞骨架肌动蛋白(ACTB)编码基因，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)编码基因，微管蛋白(TUB)编码基因，编码真核生物核糖体小亚基的18s rRNA和28s rRNA，β2微球蛋白(B2M)编码基因，琥珀酸脱氢酶复合体A亚基(SDHA)编码基因，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)编码基因，核糖体蛋白侧柄亚基P0(RPLP0)编码基因。随着恒温指数扩增的应用，选择保守性强，表达量稳定的内参基因，对于评估指数扩增稳定性和准确性具有重要意义。
发明内容
本发明解决了现有用于恒温指数扩增反应的内参基因稳定性不佳，影响恒温指数扩增反应实验结果准确性的技术问题，实现了提供稳定性佳的用于恒温指数扩增反应的内参基因，提高实验结果准确性的技术效果。
为解决上述问题，本发明提供一种用于恒温指数扩增反应的内参基因，包括：ACTB基因、GAPDH基因、TUBB基因、TUBB3基因、18s rRNA基因、28s rRNA基因、B2M基因、SDHA基因、HPRT1基因、RPLP0基因中的至少一种；其中，ACTB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，TUBB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，TUBB3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，18s rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，28s rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，B2M基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示，SDHA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，HPRT1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示，RPLP0基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供了一种适合恒温指数扩增的内参基因组合，选择其中一个或多个基因作为恒温指数扩增反应的内参基因，可以作为恒温指数扩增结果数据归一化和质量控制的参考，进而提高检测结果分析的准确率。
本发明还提供一种上述实例的内参基因的筛选方法，包括以下步骤：S10：从NCBI数据库获取目标物种的参考基因组，搜索含有切刻内切酶识别序列的基因，根据已有的数据库分析相应基因在目标物种不同组织或同组织不同样本中的表达量，筛选搜索到的基因作为候选内参基因；或从NCBI数据库获取目标物种目标基因的全长序列，从中搜索含有切刻内切酶识别序列的基因片段，并设置为候选片段；S20：将候选内参基因或候选片段中切刻内切酶识别序列的上游和下游序列分别作为X’序列和/或Y’序列，设计并合成X’Y’模板和Y’Y’模板；S30：提取目标物种中不同组织或同组织不同样本的DNA或RNA，并与X’Y’模板和Y’Y’模板共同变性退火，得到变性退火产物；S40：将变性退火产物进行恒温指数扩增；S50：使用实时荧光定量PCR仪实时采集荧光信号，对候选内参基因或候选片段进行稳定性分析，筛选得到上述实例的内参基因。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：在目标物种基因组范围内搜索保守性强，表达量稳定同时含有切刻内切酶识别序列的基因，将切刻内切酶识别序列的上游和下游序列分别作为X’序列和Y’序列，设计并合成X’Y’模板和Y’Y’模板作为模板序列，X’Y’模板为靶序列识别模板，Y’Y’模板为信号指数放大扩增模板。在恒温指数扩增过程中将双模板作为内参模板，使用双模板触发恒温指数扩增，进而归一化目标基因的表达和扩增体系质量控制。本发明通过寻找内参基因中含有的切刻内切酶识别位点进而确定模板序列，当靶序列存在时触发整个恒温指数扩增，速度快，灵敏度高，反应稳定性好，以此来判定样品是否成功制备以及实验各环节是否在控。而且最终筛选得到的上述实例的内参基因均含有切刻内切酶识别序列。
在本发明的一个实例中，切刻内切酶为Nt.BstNBI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nt.BsmAI切刻内切酶、Nt.BspQI切刻内切酶中的任一种。
在本发明的一个实例中，X’序列和Y’序列的长度为15-35nt，Tm值为45-65℃。
在本发明的一个实例中，X’序列和Y’序列的长度为20-30nt，Tm值为50-60℃。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：X’序列长度适中，进而与靶序列结合具有良好的特异性，并且，较高的Tm值可以保证指数扩增的有效性，提高扩增的效率。
在本发明的一个实例中，X’序列与靶序列完全互补。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：X’序列与靶序列完全互补，进而能够特异性识别靶序列。
在本发明的一个实例中，Y’序列与X’序列不具有同源性；或Y’序列与靶序列完全互补。
在本发明的一个实例中，X’Y’模板和Y’Y’模板的3’端修饰封闭基团，封闭基团为氨基和ddC中的任一种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过封闭基团对X’Y’模板和Y’Y’模板的的3’端进行封闭，可以有效降低非特异性扩增，提高检测的准确性。
本发明还提供一种上述实例的内参基因的模板对，ACTB基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:11所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:12所示；和/或GAPDH基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:13所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:14所示；和/或TUBB基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:15所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:16所示；和/或TUBB3基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:17所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:18所示；和/或18s rRNA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:19所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:20所示；和/或28s rRNA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:21所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:22所示；和/或B2M基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:23所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:24所示；和/或SDHA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:25所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:26所示；和/或HPRT1基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:27所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:28所示；和/或RPLP0基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:29所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:30所示。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：在恒温指数扩增过程中将双模板作为内参模板，使用双模板触发恒温指数扩增，进而归一化目标基因的表达和扩增体系质量控制。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例提供的GAPDH基因和HIST1H4A基因的实时恒温指数扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
本发明提供一种用于恒温指数扩增反应的内参基因，包括：ACTB基因、GAPDH基因、TUBB基因、TUBB3基因、18s rRNA基因、28s rRNA基因、B2M基因、SDHA基因、HPRT1基因、RPLP0基因中的至少一种；其中，ACTB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，TUBB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，TUBB3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，18s rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，28s rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，B2M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，SDHA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，HPRT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，RPLP0基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明还提供一种上述实例的内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
S10：从NCBI数据库获取目标物种的参考基因组，搜索含有切刻内切酶识别序列的基因，根据已有的数据库分析相应基因在目标物种不同组织或同组织不同样本中的表达量，筛选搜索到的基因作为候选内参基因；
或从NCBI数据库获取目标物种目标基因的全长序列，从中搜索含有切刻内切酶识别序列的基因片段，并设置为候选片段；
S20：将候选内参基因或候选片段中切刻内切酶识别序列的上游和下游序列分别作为X’序列和/或Y’序列，设计并合成X’Y’模板和Y’Y’模板；
S30：提取目标物种中不同组织或同组织不同样本的DNA或RNA，并与X’Y’模板和Y’Y’模板共同变性退火，得到变性退火产物；
S40：将变性退火产物进行恒温指数扩增；
S50：使用实时荧光定量PCR仪实时采集荧光信号，对候选内参基因或候选片段进行稳定性分析，筛选得到上述实例的内参基因。
具体的，S20为，将候选内参基因或候选片段中切刻内切酶识别序列的上游和下游序列分别作为X’序列和Y’序列，设计并合成X’Y’模板和Y’Y’模板；或将候选内参基因或候选片段中切刻内切酶识别序列的上游和下游序列分别作为Y’序列和X’序列，设计并合成X’Y’模板和Y’Y’模板。
进一步地，切刻内切酶为Nt.BstNBI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nt.BsmAI切刻内切酶、Nt.BspQI切刻内切酶中的任一种。
进一步地，X’序列和Y’序列的长度为15-35nt，Tm值为45-65℃。
优选的，X’序列和Y’序列的长度为20-30nt，Tm值为50-60℃。
进一步地，X’序列与靶序列完全互补。
进一步地，Y’序列与X’序列不具有同源性；或Y’序列与靶序列完全互补。
进一步地，X’Y’模板和Y’Y’模板的3’端修饰封闭基团，封闭基团为氨基和ddC中的任一种。
本发明还提供一种上述实例的内参基因的模板对，ACTB基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:11所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:12所示；和/或GAPDH基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:13所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:14所示；和/或TUBB基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:15所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:16所示；和/或TUBB3基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:17所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:18所示；和/或18s rRNA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:19所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:20所示；和/或28s rRNA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:21所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:22所示；和/或B2M基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:23所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:24所示；和/或SDHA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:25所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:26所示；和/或HPRT1基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:27所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:28所示；和/或RPLP0基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:29所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:30所示。
参见表1，其为本发明提供的内参基因及其模板对序列表。
表1内参基因及其模板对序列表
实施例一：
本实施例提供一种用于恒温指数扩增反应的内参基因的筛选方法，步骤如下：
1.设计构建靶分子特异性信号扩增模板
从NCBI数据库获取GAPDH内参基因和HIST1H4A目标基因的全长序列信息，并从中搜索Nt.BstNBI切刻内切酶识别位点的序列信息，根据切刻内切酶识别位点的上下游序列信息，设计并合成靶分子特异性信号扩增模板，即X’Y’模板和Y’Y’模板，其中Seq1为内参基因X’Y’模板，其序列为SEQ ID NO：13所示序列，可以与GAPDH靶序列完全互补结合；Seq2为内参基因Y’Y’模板，标记有荧光基团，其序列为SEQ ID NO：14所示序列，5’端标记有淬灭基团BHQ1，其中Y’序列与seq1的Y’序列完全相同；Seq3为目标基因X’Y’模板，其序列为SEQ IDNO：31所示序列，可以与HIST1H4A靶序列完全互补结合；Seq4为目标基因Y’Y’模板，标记有荧光基团，其序列为SEQ ID NO：32所示序列，其中Y’序列与seq3的Y’序列完全相同。以上模板均为DNA序列，DNA序列参见表1。
表1DNA序列
2.实时荧光恒温指数扩增
实验组：提取检测样品的cfDNA，将cfDNA与上述Seq1～Seq4序列混合，并进行高温变性退火，得到变性退火产物，将变性退火产物加到合适的PCR反应体系中进行恒温指数扩增，体系总体积为20μL，体系中包含的组分为：2nMX’Y’模板，10nM Y’Y’模板，5μM dNTPsmix，1хNEBuffer，40mM TMAC，0.005U/μL WS Bst2.0，0.015U/μL Nt.BstNBI，无核酸酶水。反应条件为：55℃，60min，荧光采集为每30s采集一次，所用设备为SLAN-96P实时荧光定量PCR仪。
对照组：提取检测样品的cfDNA，进行高温变性退火，得到变性退火产物，将变性退火产物进行恒温指数扩增，并使用实时荧光定量PCR仪实时采集荧光信号，对照组的反应条件与实验组相同。对照组与实验组的区别在于对照组不含上述Seq1～Seq4序列。
3.结果分析
参见图1，其为GAPDH和HIST1H4A基因的实时恒温指数扩增曲线图，结果表明，相比于对照组，实验组获得足够数量的PCR产物所需的PCR合成循环的次数更少，进而能够缩短检测时长，且特异性和灵敏度高。因此，本发明提供的内参基因可以很好表征目标基因的表达和扩增体系质量控制。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (9)
1.一种用于恒温指数扩增反应的内参基因，其特征在于，包括：ACTB基因、GAPDH基因、TUBB基因、TUBB3基因、18s rRNA基因、28s rRNA基因、B2M基因、SDHA基因、HPRT1基因、RPLP0基因中的至少一种；
其中，所述ACTB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述TUBB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述TUBB3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述18s rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述28s rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述B2M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述SDHA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述HPRT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述RPLP0基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.一种如权利要求1所述的内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：从NCBI数据库获取目标物种的参考基因组，搜索含有切刻内切酶识别序列的基因，根据已有的数据库分析相应基因在目标物种不同组织或同组织不同样本中的表达量，筛选搜索到的基因作为候选内参基因；或
从NCBI数据库获取目标物种目标基因的全长序列，从中搜索含有所述切刻内切酶识别序列的基因片段，并设置为候选片段；
S20：将所述候选内参基因或所述候选片段中切刻内切酶识别序列的上游和下游序列分别作为X’序列和/或Y’序列，设计并合成X’Y’模板和Y’Y’模板；
S30：提取目标物种中不同组织或同组织不同样本的DNA或RNA，并与所述X’Y’模板和所述Y’Y’模板共同变性退火，得到变性退火产物；
S40：将所述变性退火产物进行恒温指数扩增；
S50：使用实时荧光定量PCR仪实时采集荧光信号，对所述候选内参基因或所述候选片段进行稳定性分析，筛选得到权利要求1所述的内参基因。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述切刻内切酶为Nt.BstNBI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nt.BsmAI切刻内切酶、Nt.BspQI切刻内切酶中的任一种。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述X’序列和所述Y’序列的长度为15-35nt，Tm值为45-65℃。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述X’序列和所述Y’序列的长度为20-30nt，Tm值为50-60℃。
6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述X’序列与靶序列完全互补。
7.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述Y’序列与所述X’序列不具有同源性；或
所述Y’序列与靶序列完全互补。
8.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述X’Y’模板和所述Y’Y’模板的3’端修饰封闭基团，所述封闭基团为氨基和ddC中的任一种。
9.一种如权利要求1所述的内参基因的模板对，其特征在于，
所述ACTB基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:11所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:12所示；和/或
所述GAPDH基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:13所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:14所示；和/或
所述TUBB基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:15所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:16所示；和/或
所述TUBB3基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:17所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:18所示；和/或
所述18s rRNA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:19所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:20所示；和/或
所述28s rRNA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:21所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:22所示；和/或
所述B2M基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:23所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:24所示；和/或
所述SDHA基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:25所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:26所示；和/或
所述HPRT1基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:27所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:28所示；和/或
所述RPLP0基因的X’Y’模板序列如SEQ ID NO:29所示，Y’Y’模板序列如SEQ ID NO:30所示。
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