CN117867021A - 经修饰的自复制rna - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种经修饰的自复制RNA。本发明中针对不同的自复制RNA骨架进行不同比例的修饰，经修饰的自复制RNA能够在保证自复制RNA的蛋白表达水平的同时，降低自复制RNA的固有免疫刺激，因而更有利于在自复制RNA的应用中提高其使用效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种经修饰的自复制RNA。
背景技术
传统灭活疫苗、重组蛋白疫苗生产周期长，工艺复杂。
mRNA 疫苗是利用线性化的质粒DNA为模板，在体外进行酶转录反应合成的，该合成策略避免了活细胞培养生产方式，以及复杂的生产工艺等问题。mRNA疫苗平台具有安全有效、生产周期短、工艺简洁的特点。
自复制RNA（self-replicating RNA, srRNA）疫苗在动物实验中有很强的固有免疫刺激，能够以自身为模板复制出自身的序列，因此相比常规mRNA 疫苗需要的接种剂量更少，并且自复制时所诱导的免疫反应形成的佐剂效应，能够诱导出更强的免疫应答，进一步增强体液和细胞免疫反应。
mRNA技术之所以被大规模应用，其中一个重要的原因是mRNA在生产过程中，尿苷可以被N1-甲基化-假尿苷或者其他修饰核苷酸取代，其主要作用是能够降低mRNA在体内的固有免疫刺激，并且增加了mRNA的稳定性及蛋白翻译效率。
自复制RNA在体内的固有免疫刺激反应，会影响其序列的稳定性、复制效率及蛋白表达水平等，因此需要选择合适的方式降低自复制RNA引起的固有免疫反应以提高其使用效果。
目前已经有一些研究在尝试降低自复制RNA的固有免疫刺激，其中一种方法是借鉴传统mRNA的生产方式，对自复制RNA添加核苷酸修饰，该方法可以有效降低其固有免疫刺激，但是后续有研究表明，核苷酸的掺入影响了自复制RNA的起始复制效率。也有一些研究在自复制RNA上插入或者共表达免疫抑制类因子，以降低体内的先天炎性反应，然而该方法会引入额外的蛋白，且在体内高表达免疫抑制因子效果不可控。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种经修饰的自复制RNA，其包含：5’非翻译区 (5’UTR)；一个或多个来自甲病毒的非结构蛋白（NSP），且其中含有NSP2；以及目标片段；
其中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照1%~100%的比例被修饰为假尿苷或N1-甲基化-假尿苷；
当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷按照1%~80%的比例被修饰为假尿苷或N1-甲基化-假尿苷。
本发明的第二目的在于提供一种药物组合物，其包含前述的经修饰的自复制RNA。
本发明的第三目的在于提供一种方法，其用于改变自复制RNA的如下至少一种特性：
i）提高自复制RNA的蛋白表达水平；
ii）降低自复制RNA的固有免疫刺激；
所述方法包括：
对自复制RNA进行修饰，得到前述的经修饰的自复制RNA。
本发明中经修饰的自复制RNA能够在保证自复制RNA的蛋白表达水平的同时，降低自复制RNA的固有免疫刺激，因而更有利于在自复制RNA的应用中提高其使用效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为传统mRNA与自复制RNA结构与蛋白表达方式比较。
图2为本发明实施例中的自复制RNA结构示意图。
图3为本发明实施例中合成自复制RNA凝胶电泳图。
图4为本发明实施例中海拉细胞中被修饰自复制RNA- 人促红细胞生成素蛋白表达检测。
图5为本发明实施例中海拉细胞中被修饰自复制RNA- 萤火虫荧光素酶蛋白表达检测。
图6为本发明实施例中海拉细胞中被修饰编码人促红细胞生成素自复制RNA引起的先天炎症基因表达检测。
图7为本发明实施例中海拉细胞中被修饰编码萤火虫荧光素酶自复制RNA引起的先天炎症基因表达检测。
图8为本发明实施例中在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中检测被修饰自复制RNA表达人促红细胞生成素的水平。
图9为本发明实施例中在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中检测被修饰自复制RNA表达萤火虫荧光素酶的水平。
图10为本发明实施例中核苷酸修饰的自复制RNA在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞的复制效率检测。
图11为本发明实施例中合成自复制RNA质量分析，具体为使用RNA凝胶电泳检测编码新冠病毒刺突蛋白结合结构域或萤火虫荧光素酶的自复制RNA的质量。
图12为本发明实施例中不同自复制RNA骨架系统被修饰后，在海拉细胞中的刺突蛋白结合结构域表达检测。
图13为本发明实施例中不同自复制RNA骨架系统被修饰后，在海拉细胞中的萤火虫荧光素酶表达检测。
图14为本发明实施例中不同自复制RNA骨架系统被修饰后，在海拉细胞中先天炎性基因表达检测。
图15为本发明实施例中不同自复制RNA骨架系统被修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中的刺突蛋白结合结构域蛋白表达检测。
图16为本发明实施例中不同自复制RNA骨架系统被修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中的萤火虫荧光素酶蛋白表达检测。
图17为本发明实施例中不同自复制RNA骨架系统被修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中检测自复制RNA复制效率。
图18为本发明实施例中自复制RNA骨架系统及核苷酸修饰长时效表达比较。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明中涉及核苷酸修饰数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以允许±10%范围内波动。本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中所提到术语缩写及对应通用名如下表1：
表1
经修饰的自复制RNA
传统的mRNA与自复制RNA有很大的区别，其表达方式比较见图1，图1中的A为传统mRNA结构与蛋白表达；图1中的B为自复制RNA结构、复制及蛋白表达。传统mRNA包含5’帽子（5’ Cap）、5’非翻译区（5’ UTR）、目的基因（GOI）、3’非翻译区（3’ UTR）及多聚腺苷尾，核酸转染进入细胞或者组织后，即可表达编码的蛋白（图1中的A）。而本发明所述的“自复制RNA”（self-replicating RNA, srRNA）指含有目标片段及自复制组件的RNA。在一些实施方式中，自复制RNA包含5’帽子（5’ Cap）、5’非翻译区（5’ UTR）、非结构蛋白1~非结构蛋白4（NSP1~NSP4）、亚基因组启动子、目的基因（GOI）、3’非翻译区（3’ UTR）及多聚腺苷尾。自复制RNA除了带有目标片段，一般还有四个非结构蛋白，用于自身的复制，因此合成的自复制RNA可以被称为基因组RNA，因为基因组RNA本身也可以直接翻译蛋白，因此也被称为正链RNA (+RNA)；当自复制RNA转染进入细胞或者组织后，首先表达的是四个非结构蛋白，这四个蛋白会以初始自复制RNA为模板，合成其互补的RNA (也被称为-RNA)，然后再以其为模板合成完整的自复制RNA基因组，这一步称为复制过程，同时，非结构蛋白也会结合在自复制RNA基因组的亚基因组启动子上，并转录出一个较短的RNA，被称为亚基因组RNA，而亚基因组RNA带有目的基因，主要作用是表达目的蛋白 (图1中的B)。
传统mRNA制备过程中掺入N1-甲基化-假尿苷，可以有效地降低mRNA在细胞内的先天免疫反应。而已有研究表明对在自复制RNA掺入N1-甲基化-假尿苷同样可以降低其先天炎性反应，但是降低了复制效率。
对此，本发明意外发现，通过针对不同的自复制RNA骨架而修饰不同比例的假尿苷或N1-甲基化-假尿苷，能够保证自复制RNA的蛋白表达水平的同时，降低自复制RNA的固有免疫刺激。而以往的研究都是用N1-甲基化-假尿苷完全取代尿苷，未考虑自复制RNA本身的序列及N1-甲基化-假尿苷的修饰比例对其复制效率及免疫反应的影响。
具体地，本发明涉及经修饰的自复制RNA，其包含：5’非翻译区(5’ UTR)；一个或多个来自甲病毒的非结构蛋白（NSP），且其中含有NSP2；以及目标片段；
其中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照1%~100%的比例被修饰为假尿苷或N1-甲基化-假尿苷；
当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷按照1%~80%的比例被修饰为假尿苷或N1-甲基化-假尿苷。
在本发明中，自复制RNA具有不同的骨架类型，如在5’非翻译区中第3个位点的碱基，若该碱基是腺苷（A），那么合成的自复制RNA更倾向于基因组RNA的复制，若该碱基是鸟苷 (G)，合成的自复制RNA倾向于亚基因RNA的转录；又如，在自复制RNA编码蛋白NSP2的739位点的氨基酸，如果该氨基酸是谷氨酰胺 (Gln, Q)，那么合成的自复制RNA具有较高的复制效率，相比之下，如果该氨基酸是亮氨酸 (Leu, L)，那么合成的自复制RNA的复制效率将大大降低，而引入该位点突变的初衷是降低自复制RNA的复制效率，减弱其在细胞内的毒性，并可能延长自复制RNA的半衰期。
在5’非翻译区中的第3个位点，野生型的碱基为腺苷，突变型的为鸟苷，本发明中使用A3表示该位点的野生型碱基特征，使用A3G表示该位点的突变型碱基特征，即该位点的碱基由腺苷突变成鸟苷；而在NSP2的739位点的氨基酸，野生型的氨基酸为Q，突变型的氨基酸为L，因此本发明中使用Q739来表示NSP2中第739位点的野生型氨基酸特征，使用Q739L表示NSP2该位点的突变型氨基酸特征。
为了进一步提高自复制RNA的蛋白表达水平，并降低自复制RNA的固有免疫刺激，本发明进一步优化并得到如下的修饰方案：
在一些实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照10%~100%，或20%~100%的比例被修饰为假尿苷或N1-甲基化-假尿苷。
在一些实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照10%~100%，或10%~80%，或10%~70%，或20~60%的比例被修饰为假尿苷。其中，当所述自复制RNA（A3+Q739）中的尿苷按照10%~70%的比例修饰为假尿苷时，修饰后的自复制RNA具有更低的固有免疫刺激，同时具有更优的复制效率及蛋白表达水平。当所述自复制RNA中的尿苷按照20%~60%的比例修饰为假尿苷时，修饰后的自复制RNA各方面性能更优。
作为示例，在一些具体的实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照10%，或15%，或20%，或25%，或30%，或35%，或40%，或45%，或50%，或55%，或60%，或65%，或70%，或80%，或90%，或100%的比例被修饰为假尿苷。
在一些实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照10%~100%，或20%~100%，或30%~100%，或40%~100%的比例被修饰为N1-甲基化-假尿苷。其中，当所述自复制RNA（A3+Q739）中的尿苷按照30%~100%的比例修饰为N1-甲基化-假尿苷时，修饰后的自复制RNA具有更低的固有免疫刺激，同时具有更优的复制效率及蛋白表达水平。当所述自复制RNA中的尿苷按照40%~100%的比例修饰为N1-甲基化-假尿苷时，修饰后的自复制RNA各方面性能更优。
作为示例，在一些具体的实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷可以按照10%，或20%，或30%，或35%，或40%，或45%，或50%，或55%，或60%，或65%，或70%，或75%，或80%，或85%，或90%，或95%，或100%的比例被修饰为N1-甲基化-假尿苷。
在一些实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷按照10%~80%，或20%~80%，或30%~80%，或40%~80%的比例被修饰为假尿苷或N1-甲基化-假尿苷。
在一些实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷可以按照10%~80%，或20%~80%，或30%~70%，或40%~60%的比例被修饰为假尿苷。其中，当所述自复制RNA（A3G+Q739L）中的尿苷按照30%~70%的比例修饰为假尿苷时，修饰后的自复制RNA具有更低的固有免疫刺激，同时具有更优的复制效率及蛋白表达水平。当所述自复制RNA中的尿苷按照40%~60%的比例修饰为假尿苷时，修饰后的自复制RNA各方面性能更优。
作为示例，在一些具体的实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷可以按照10%，或20%，或30%，或35%，或40%，或45%，或50%，或55%，或60%，或65%，或70%，或80%的比例被修饰为假尿苷。
在一些实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷按照10%~80%，或20%~80%，或30%~80%，或40%~80%的比例被修饰为N1-甲基化-假尿苷。其中，当所述自复制RNA（A3G+Q739L）中的尿苷按照30%~80%的比例修饰为N1-甲基化-假尿苷时，修饰后的自复制RNA具有更低的固有免疫刺激，同时具有更优的复制效率及蛋白表达水平。当所述自复制RNA中的尿苷按照40%~80%的比例修饰为N1-甲基化-假尿苷时，修饰后的自复制RNA各方面性能更优。
作为示例，在一些具体的实施方式中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷可以按照10%，或20%，或30%，或35%，或40%，或45%，或50%，或55%，或60%，或65%，或70%，或75%，或80%的比例被修饰为N1-甲基化-假尿苷。
本发明还进一步发现，自复制RNA的多聚腺苷尾的长度并不影响自复制RNA的表达模式，仅影响了在一些比例核苷酸修饰下蛋白的相对表达水平。因而提出如下有关多聚腺苷尾的技术方案。
在一些实施方式中，所述自复制RNA还包含多聚腺苷尾；所述多聚腺苷尾的长度为5~200 nt，或10~150 nt，或30~100 nt，或40~65 nt，或50~65 nt。
作为示例，在一些具体的实施方式中，所述多聚腺苷尾的长度可以为5 nt、10 nt、20 nt、30 nt、40 nt、45 nt、50 nt、60 nt、65 nt、70 nt、80 nt、90 nt、100 nt、120 nt、150nt、180 nt或200 nt。
在一些实施方式中，所述甲病毒选自：委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（TC83Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEEV），辛德毕斯病毒（Sin-dbis virus）、屈曲病毒（Chikungunya virus）、东方马脑脊髓炎病毒（Eastern equine encephali-tisvirus）、西方马脑脊髓炎病毒（Western equineencephalitis virus）、马雅鲁病毒（Mayarovirus）、生里基森林病毒（Semliki forest virus）以及委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（Venezuelan equine encephalitisvirus）中的至少一种。
在一些实施方式中，所述自复制RNA自5’端到3’端依次包含：5’帽子结构 (5’Cap)，5’非翻译区 (5’ UTR)，非结构蛋白1~非结构蛋白4 (NSP1~NSP4)，亚基因组启动子(Subgenomic promoter)，目标片段，3’非翻译区 (3’ UTR) 以及多聚腺苷尾。
在一些实施方式中，所述自复制RNA含有：
a）骨架；
所述骨架自5’端到3’端依次包含：5’帽子结构 (5’ Cap)，5’非翻译区 (5’ UTR)，非结构蛋白1~非结构蛋白4 (NSP1~NSP4)，亚基因组启动子 (Subgenomic promoter)， 3’非翻译区 (3’ UTR) 以及多聚腺苷尾，具体包含如下任一所述序列：
a1）如SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：6中任一项所示的核苷酸序列；
a2）与a1）所示的核苷酸序列具有至少90%，优选至少95%，更优选至少97%，进一步优选至少98%，最优选至少99%的序列同一性的序列；
以及
b）目标片段，所述目标片段位于所述骨架中的亚基因组启动子与3’非翻译区之间。
本领域人员结合常识能够确认所述骨架（如SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：6中任一项所示的核苷酸序列）中的亚基因组启动子与3’非翻译区之间的位置，并对应合成相关序列的自复制RNA。
在一些实施方式中，所述目标片段包含至少一种编码抗原或其片段或表位的RNA序列。
在一些优选的实施方式中，所述抗原是致病性抗原。
在一些更优选的实施方式中，所述抗原为病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、真菌抗原、原生动物抗原、朊病毒抗原或肿瘤抗原。
可选的，所述病毒包括：腺病毒科(adenoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、星状病毒科(astroviridae)、本雅病毒科(bunyaviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、肝炎病毒科(hepeviridae)、单分子负链RNA病毒目(mononegavirales)、网巢病毒目(nidovirales)、小RNA病毒科(picornaviridae)、正冠状病毒亚科（orthocoronavirinae）、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、反转录病毒科(retroviridae)以及披膜病毒科(togaviridae)中的一种或多种。
可选的，所述细菌包括：葡萄球菌属、链球菌属、李式杆菌属、丹毒丝菌属、肾杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、分支杆菌属、放线菌属、奴卡菌属、棒状杆菌属、红球菌属中的一种或多种，和/或，炭疽杆菌、丹毒杆菌、破伤风杆菌、李氏杆菌、气肿疽杆菌结核杆菌、大肠杆菌外、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩拉克氏菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌以及副溶血性杆菌中的一种或多种。
可选的，所述真菌包括：粗球孢子菌、普赛德斯球抱子菌、荚膜组织胞浆菌、杜氏组织胞浆菌、洛博芽生菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、申克氏孢子丝菌、马尔尼菲青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、葡萄牙假丝酵母、曲霉菌、甄氏外瓶霉、裴氏着色霉、紧密着色霉、疣状着色霉、皮炎着色霉、白地霉、波氏足肿菌、新型隐球菌、丝孢酵母菌、米根霉、印度毛霉、伞枝犁头霉、总状共头霉、蛙粪霉、冠状耳霉、异孢耳霉、西伯鼻孢子菌、透明丝孢霉以及暗色丝孢霉中的一种或多种。
可选的，所述寄生虫包括：消化道内寄生虫、肝内寄生虫、肺内寄生虫、脑组织寄生虫、血管内寄生虫、淋巴管内寄生虫、肌肉组织寄生虫、细胞内寄生虫、骨组织寄生虫以及眼内寄生虫中的一种或多种。
可选的，所述肿瘤包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、血液、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。
在一些实施方式中，所述目标片段包含编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD或其片段的RNA、或包含编码hEPO的RNA、或包含编码Fluc的RNA。通过在含有上述三种目标片段的自复制RNA中的验证可知，本发明所提及的修饰对含有不同目标片段的自复制RNA中均具有相同或相近的影响趋势。在具体实施时，本发明所提及的修饰能够应用于含有不同目标片段的自复制RNA中，而不限于含有上述三种目标片段的自复制RNA。
在一些实施方式中，所述目标片段包含编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD或其片段的RNA序列。
在一些实施方式中，所述目标片段包含如下任一所述序列：
b1）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
b2）与b1）所示的核苷酸序列具有至少90%，优选至少95%，更优选至少97%，进一步优选至少98%，最优选至少99%的序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述目标片段包含编码hEPO的RNA序列。
在一些实施方式中，所述目标片段包含如下任一所述序列：
b3）如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b4）与b3）所示的核苷酸序列具有至少90%，优选至少95%，更优选至少97%，进一步优选至少98%，最优选至少99%的序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述目标片段包含编码Fluc的RNA序列。
在一些实施方式中，所述目标片段包含如下任一所述序列：
b5）如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
b6）与b5）所示的核苷酸序列具有至少90%，优选至少95%，更优选至少97%，进一步优选至少98%，最优选至少99%的序列同一性的序列。
在一些实施方式中，与未修饰的自复制RNA相比，所述经修饰的自复制RNA具有更低的固有免疫刺激，同时具有部分、相当或更高的复制效率及蛋白表达水平。
在一些实施方式中，所述经修饰的自复制RNA所引起的先天炎症基因的表达水平为未修饰的自复制RNA的0.8倍以下，优选为0.004~0.8倍；优选所述先天炎症基因包括IFN-β1和RIG-I中的至少一种。
在一些实施方式中，所述经修饰的自复制RNA的复制效率为未修饰的自复制RNA的0.3倍以上，优选为0.3~1.8倍。
在一些实施方式中，所述经修饰的自复制RNA的蛋白表达水平为未修饰的自复制RNA的0.1倍以上，优选为0.1~6.5倍。
本领域人员可以结合常识对上述所提到的实施方式进行组合，得到有关于本发明中经修饰的自复制RNA的较优实施例。
药物组合物
本发明还涉及一种药物组合物，其包含前述任一实施方式中经修饰的自复制RNA。
在一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、核酸稳定剂和转染试剂中的至少一种。
术语“药学上可接受的”指当分子本体、分子片段或组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体示例包括磷酸，柠檬酸，和其它有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸和甲硫氨酸)；抗菌剂(例如，十八烷基二甲基苯氯化铵，氯化六烃季铵，苯扎氯铵，酚，丁醇或苯甲醇，烷基尼泊金，邻苯二酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇，或间甲酚)；低分子量(不到约10kDa)多肽；蛋白，例如，血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如，聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸(例如，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸)；单糖，二糖和其它碳水化合物(包括例如，葡萄糖，甘露糖，或葡聚糖)；螯合剂(例如，EDTA)；糖(例如，蔗糖，甘露醇，海藻糖，或山梨醇)；成盐反离子；金属复合物；和/或非离子型表面活性剂(例如，包括TWEENTM，PLURONICSTM，或聚乙二醇)。此外，根据配制方法，可以由本领域普通技术人员适当选择常用的填充剂，稀释剂，结合剂，增湿剂，崩解剂，和/或表面活性剂。
在具体实施时，核酸稳定剂（用于稳定化和保持核酸的稳定化药剂）的例子包括阳离子化合物、去污剂、离液盐、核糖核酸酶抑制剂、螯合剂等及其混合物。稳定剂可以包括例如诸如多聚甲醛的交联固定剂或诸如乙醇的沉淀剂。稳定剂可以通过在细胞分子之间形成共价键或通过将一些细胞内分子沉淀或通过其它方法来起作用。在一些实施方式中，稳定剂包括细胞裂解缓冲液。细胞透化缓冲液也是本领域已知的，并且可以包含使细胞膜透化从而允许探针和染料穿过膜的去污剂。在细胞裂解缓冲液中使用的去污剂的例子包括但不限于TWEENTM、Triton X-100、皂草苷、NP-40等。针对给定的最终用途调整细胞裂解和透化剂的浓度。当以过低的浓度存在时，细胞裂解和透化可能不能达到最佳。在过高的浓度下，可能出现不希望的细胞破坏。可以进行常规的根据经验的步骤来确定在每种情况下优选的路线。在一些实施方式中，稳定剂包括氯仿、苯酚、TRIzol。但在更优选的实施方式中，稳定剂是易于被除去的或者对细胞毒性较低的成分，最优选是药学上可接受的成分。
在一些实施方式中，所述药物组合物为疫苗。所述的疫苗可以以固体、半固体或液体形式存在，优选以液体形式存在。
在一些实施方式中，所述疫苗还包含佐剂。适用于本发明疫苗的佐剂包括可增强针对自复制RNA，特别是其中的目标片段的免疫原性。例如，对于抗原的B细胞表位的抗体反应的佐剂，以及可增强细胞介导的针对所述抗原中T细胞表位的反应的佐剂等。这些佐剂是本领域所熟知的。
在一些实施方式中，所述佐剂选自明矾、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烯、角鲨烷、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly（I：C），以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。
其中完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烷和明矾一般不用于人。
在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。
在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。
疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过口腔和皮下(SC)、鼻腔途径、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。
上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。
在一些实施方式中，所述的疫苗以质粒、病毒载体、脂质体、树状大分子、无机纳米粒子或细胞穿膜肽的形式进行包装递送。
RNA分子可直接包装，或以其前体的方式进行包装，所述质粒和病毒载体可以包含选择标记（例如便于富集的标签，例如his tag；或便于被检测的标签，例如GFP），以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。病毒载体可以为噬菌体、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。
脂质体可以为阳离子脂质体或中性脂质体，其可通过公知的方法进行制备或修饰，例如加入聚乙二醇（PEG）修饰的脂质体可以有效防止脂质体载体的聚集并增加其稳定性。
树枝状大分子是一种具有明确的分子结构、可精确控制的化学结构和独特的多价性质的特殊聚合物家族，逐渐成为基因传递的非病毒载体。典型的树枝状大分子例如聚（酰氨基胺）（PAMAM）树枝状聚合物，其可做进一步修饰，例如在PAMAM表面修饰核碱基类似物2-氨基-6-氯嘌呤构建衍生物 AP-PAMAM，或者通过硫酸软骨素(CS)与PAMAM偶联制备CS-PAMAM等等。
无机纳米粒子可选择金纳米粒子（AuNPs）、磁性纳米粒子、介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）等。
细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类具有较强跨膜转运能力的小分子肽，可携带多肽、蛋白质和核酸等多种大分子物质进入细胞。其可以为阳离子型CPPs（如TAT，Penetratin，Polyarginine，P22N，DPV3和DPV6等）、两亲型CPPs（可以由疏水性肽序列和NLSs共价连接而成，或者从天然蛋白质中分离获得，如pVEC，ARF(1-22)和BPrPr(1-28)）、疏水型CPPs（一般只含有非极性氨基酸残基，净电荷量约低于氨基酸序列总电荷量的20%）。
方法
本发明还涉及一种方法，其用于改变自复制RNA的如下至少一种特性：i）提高自复制RNA的蛋白表达水平；ii）降低自复制RNA的固有免疫刺激；
所述方法包括：对自复制RNA进行修饰，得到前述任一实施方式中经修饰的自复制RNA。
在一些实施方式中，所述经修饰的自复制RNA所引起的先天炎症基因的表达水平为未修饰的自复制RNA的0.8倍以下，优选为0.004~0.8倍；优选所述先天炎症基因包括IFN-β1和RIG-I中的至少一种。
在一些实施方式中，所述经修饰的自复制RNA的复制效率为未修饰的自复制RNA的0.3倍以上，优选为0.3~1.8倍。
在一些实施方式中，所述经修饰的自复制RNA的蛋白表达水平为未修饰的自复制RNA的0.4倍以上，优选为0.4~6.5倍。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
以下实施例中提供了在 A3G+Q739L+40A自复制RNA骨架下，对三种修饰核苷（假尿苷, N1-甲基化-假尿苷, 5-羟甲基-胞嘧啶）不同比例掺入修饰的自复制RNA在细胞内对蛋白表达和复制效率的影响，同时检测了其对细胞先天免疫反应的刺激。为了验证结果的普遍性，以下实施例中分别使用了人促红细胞生成素 (Human Erythropoietin, hEPO) 和萤火虫荧光素酶 (FireflyLuciferase, Fluc) 作为蛋白表达验证模型。
在以下实施例中，还使用不同比例的N1-甲基化-假尿苷分别掺入A3G+Q739L 和A3+Q739 两种不同的自复制RNA骨架中，检测不同的自复制RNA骨架在核苷酸修饰下对蛋白表达、复制效率及细胞先天免疫反应的影响。为了验证结果的普遍性，以下实施例中分别使用了新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域(SARS-CoV2 Spike receptor bindingdomain, RBD)和萤火虫荧光素酶 (FireflyLuciferase, Fluc) 作为蛋白表达验证模型。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
1 RNA制备
1.1 自复制RNA 质粒模板制备
本实施例中使用的自复制RNA结构如图2所示，包含5’帽子结构 (5’ Cap), 5’非翻译区 (5’ UTR)，非结构蛋白1~非结构蛋白4 (NSP1~NSP4)，亚基因组启动子(Subgenomic promoter)，外源基因插入区 (GOI)，3’非翻译区 (3’ UTR)以及多聚腺苷尾。
本实施例分别使用了人促红细胞生成素、新冠病毒刺突蛋白的受体结合结构域和萤火虫荧光素酶作为蛋白表达模型，其编码序列信息依次分别见SEQ ID NO：1~ SEQ IDNO：3.
本实施例中使用了 A3+Q739 和 A3G+Q739L 两种自复制RNA骨架及40A和65A两种多聚腺苷尾 (图2)，具体包括A3G+Q739L+40A骨架（图2中的A）、A3G+Q739L+65A骨架（图2中的B）及A3+Q739+65A骨架（图2中的C），其序列信息依次分别见SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：6。
1.2 体外转录 (In vitrotranscription, IVT)
1.2.1 本实施例使用体外转录的方法制备自复制RNA，反应体系如下表2：
表2
1.2.2 反应条件：30℃反应3小时。
1.2.3 反应结束后，向上述反应体系中加入DNA酶 (每50微升反应体系加入1微升DNA酶)，30℃反应3小时；反应结束后，加入终浓度为3M的氯化锂以沉淀RNA，充分混匀后，置于-20℃ 30分钟；然后在4℃条件下离心，12000转离心15分钟，弃上清，并用75%的乙醇洗沉淀一次，4℃离心，12000转离心5分钟，弃上清；最后用无RNA酶水溶解沉淀，并测定RNA浓度。
1.2.4 制备不同修饰核苷及不同比例掺入的自复制RNA，实验条件及方法保持不变，仅替换相应的修饰核苷。
对于不同比例假尿苷修饰的自复制RNA，反应体系中的尿苷被不同比例掺入的假尿苷替代 (假尿苷 / (尿苷+假尿苷)的比例为20%、40%、60%、80%、100%)；对于不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA，反应体系中的尿苷被不同比例掺入的N1-甲基化-假尿苷替代 (N1-甲基化-假尿苷 / (尿苷+N1-甲基化-假尿苷)的比例为20%、40%、60%、80%、100%)；对于不同比例5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，反应体系中的胞苷被不同比例掺入的5-羟甲基-胞嘧啶替代 (5-羟甲基-胞嘧啶 / (胞苷+5-羟甲基-胞嘧啶)的比例为20%、40%、60%、80%、100%)。
1.3 RNA加帽
1.3.1 为了获得有功能的自复制RNA，体外转录获得的RNA需要对5’ 端进行加帽处理，反应体系如下表3：
表3
1.3.2 反应条件: 37℃反应1.5小时。
1.3.3 反应结束后，加入终浓度为3 M的氯化锂以沉淀RNA，充分混匀后，置于-20℃ 30分钟；然后在4℃条件下离心，12000转离心15分钟，弃上清，并用75%的乙醇洗沉淀一次，4℃离心，12000转离心5分钟，弃上清；最后用无RNA酶水溶解沉淀，并测定RNA浓度。
2 细胞转染与样本检测
2.1 细胞培养
将复苏好的 BHK-21、Hela和PLC-5 细胞接种在 75 cm2的培养瓶中，培养基为DMEM 高糖培养基+5%的双抗+10%胎牛血清，待细胞在瓶底的密度达到 80% 以上，用胰酶将细胞消化下来，并计数。在6孔细胞培养板中铺入适宜数量的细胞，37℃ CO2培养箱过夜。
2.2 细胞转染
转染前，对培养过夜的细胞更换新鲜的培养基，每个细胞培养孔加入1.5 mL 培养基，放入培养箱继续培养，每个样本两副孔；每个孔转染0.5微克自复制RNA，使用2.5微升脂质体转染试剂，转染24小时后，收集细胞样本。
2.3 细胞蛋白样本收集及检测
2.3.1 蛋白提取
对于细胞内蛋白的提取，使用细胞裂解液 (Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA) 用于细胞内蛋白的提取，提取的蛋白使用蛋白定量试剂盒定量蛋白的浓度，然后取相同量的蛋白样本，加入上样缓冲液，在95℃煮样10分钟。对于细胞培养上清中蛋白的提取，取1毫升细胞培养上清液，然后加入110微升的三氯乙酸 (TCA)，充分混匀后，冰上放置30分钟，然后在4℃条件下离心，12000转离心15分钟，弃上清，并用无水乙醇洗沉淀两次，4℃离心，12000转离心5分钟，弃上清；最后用100微升蛋白上样缓冲液重悬沉淀，在95℃煮样10分钟。对于转染荧光素酶的细胞样本，使用荧光素酶检测专用细胞裂解液与细胞孵育十分钟，然后在4℃条件下离心，12000转离心10分钟，取上清。
2.3.2 蛋白免疫印迹
电泳：聚丙稀酰胺分离胶浓度为 6%，蛋白上样量 20 μL，积层胶电泳条件150 V，10 min，分离胶电泳条件为 200 V，30 min。电转：使用硝酸纤维素膜，在 100 V 电压下转膜 1 小时。封闭：使用 1X PBST 配制 5% BSA 作为封闭液，4℃封闭过夜。一抗孵育：使用封闭液将目标蛋白的抗体根据实际需要进行稀释，在室温下孵育 1 小时。用 1X PBST 洗3 次，每次 10 分钟。二抗孵育：使用封闭液稀释二抗，稀释比为 1：5000，在室温下孵育 1小时。用1X PBST 洗3 次，每次 10 分钟。 显影：显影液 A 液：B 液=1：1，在成像系统中进行显影。
2.3.3 荧光素酶活性检测
取细胞裂解液 10 微升加入黑色酶标板孔中，然后加入100微升底物，充分混匀后，将酶标板置于酶标仪上读数。
2.3.4 细胞RNA提取
收集培养细胞，并加入1毫升的TRIzol试剂，充分裂解细胞后，置于冰上十分钟，然后加入200微升的氯仿，充分震荡后，静置分层3分钟，4℃条件下离心，12000转离心10分钟，取上清300微升，加入等体积的异丙醇，充分混匀后，静置10分钟，4℃条件下离心，12000转离心10分钟，弃上清，并用75%的乙醇洗沉淀两次，4℃离心，12000转离心5分钟，弃上清；最后用无RNA酶水溶解沉淀，并测定RNA浓度。
2.3.5 RNA反转录及荧光定量PCR
制备 cDNA 样品：各取 1.5 μg RNA 样品加入5×gDNA Digester Mix 和无核酸酶水定容至15 μL，42℃孵育2 min。加入10×Hifair® III Super Buffer 2 μL、Hifair®III RT Enzyme Mix 1 μL、随机引物 N6 1 μL、无核酸酶水 1 μL，混合均匀，进行反转录反应。反转录程序为：25℃，5 min；60℃，15 min；85℃，5 min。
实时荧光定量 PCR 检测：将cDNA 样品稀释 5 倍，配置反应体系：2×ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 5 μL、10 μM 上游引物0.2 μL、10 μM 下游引物 0.2 μL、稀释 cDNA 样品 1 μL、无核酸酶水 3.6μL，混合均匀并检测。用于检测IFN-β1基因表达的上游引物序列为CATTACCTGAAGGCCAAGGA（SEQ ID NO：7），下游引物序列为CAGCATCTGCTGGTTGAAGA（SEQ ID NO：8）。用于检测内参 GAPDH 基因表达的上游引物序列为GAAGGCTGGGGCTCATTT（SEQ ID NO：9），下游引物序列为CAGGAGGCATTGCTGATGAT（SEQ ID NO：10）。用于检测 RIG-I 基因表达的上游引物序列为GTTGTCCCCATGCTGTTCTT（SEQ ID NO：11），下游引物序列为GCAAGTCTTACATGGCAGCA（SEQ ID NO：12）。使用Thermo Fisher QuantStudio 1 实时荧光定量 PCR 系统进行检测。检测程序为，阶段 1：95℃，3 min，重复1次；阶段 2：95℃，10s，60℃，30 s，重复40 次；阶段3溶解曲线：95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15s，重复1 次。采用相对定量法分析目的基因表达情况：倍数变化= 2-ΔΔCT。
3 效果检测
3.1 自复制RNA质量检测
为了检测合成的自复制RNA质量，使用RNA凝胶电泳的方法检测合成的RNA，每个样本取800纳克RNA。
实验结果如图3所示，图3中的A~C依次分别为不同比例(0%，20%，40%，60%，80%，100%)假尿苷、N1-甲基化-假尿苷、5-羟甲基-胞嘧啶修饰的编码人促红细胞生成素的自复制RNA(srRNA-hEPO)的凝胶电泳条带；图3中的D~F依次分别为不同比例(0%，20%，40%，60%，80%，100%)假尿苷、N1-甲基化-假尿苷、5-羟甲基-胞嘧啶修饰的编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA(srRNA-Fluc)的凝胶电泳条带。由该结果可知，本实施例合成的自复制RNA条带大小正确，RNA的纯度大于90%，证明合成的RNA具有较高的质量。
在本实施例中，选择A3G+Q739L+40A骨架系统的自复制RNA为研究模型，同时选择人促红细胞生成素和萤火虫荧光素酶作为蛋白表达模型。
3.2 核苷酸修饰的自复制RNA在Hela细胞中蛋白表达检测
为了分析核苷酸修饰的自复制RNA对蛋白表达的影响，将不同比例 (0%, 20%,40%, 60%, 80%, 100%) 假尿苷、N1-甲基化-假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA转染至Hela细胞，24小时后收集样本检测蛋白表达。
实验结果如图4~图5所示。图4中的A为不同比例假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中人促红细胞生成素蛋白的表达检测；图4中的B为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中人促红细胞生成素蛋白的表达检测；图4中的C为不同比例5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA在细胞裂解液中人促红细胞生成素蛋白的表达。图5中的A为不同比例假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的表达检测；图5中的B为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的表达检测；图5中的C为不同比例5-羟甲基-胞嘧啶 修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的表达检测；图5中的D为不同比例假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的酶活性检测；图5中的E为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的酶活性检测；图5中的F为不同比例5-羟甲基-胞嘧啶 修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的酶活性检测。
对于表达hEPO的自复制RNA，当假尿苷的修饰水平在20%和40%时，与未修饰的自复制RNA相比，hEPO的表达水平逐渐增加；当假尿苷的修饰水平在60%、80%和100%时，hEPO的表达水平逐渐降低，且当假尿苷的修饰比例为100%时，hEPO的表达低至不可检测(图4中的A)。类似的，当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在20%、40%和60%时，与未修饰的自复制RNA相比，hEPO的表达水平逐渐增加；当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在80%和100%时，hEPO的表达水平逐渐降低，而当N1-甲基化-假尿苷的修饰比例为100%时，hEPO的表达水平最低，但仍可被检测到(图4中的B)。而当5-羟甲基-胞嘧啶的修饰水平在20%40%和60%时，hEPO的表达水平增加；当5-羟甲基-胞嘧啶的修饰水平在80%和100%时，hEPO的表达水平相近，相比于60%略有降低，但与40%相当(图4中的C)。
对于表达Fluc的自复制RNA，当假尿苷的修饰水平在20%时，与未修饰的自复制RNA相比，Fluc的表达水平逐渐增加；当假尿苷的修饰水平在40%、60%、80%和100%时，Fluc的表达水平逐渐降低，且当假尿苷的修饰比例为100%时，Fluc的表达低至不可检测(图5中的A)。类似的，当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在20%、40%时，与未修饰的自复制RNA相比，Fluc的表达水平逐渐增加；当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在60%、80%和100%时，Fluc的表达水平逐渐降低，而当N1-甲基化-假尿苷的修饰比例为100%时，Fluc的表达水平最低(图5中的B)。而当5-羟甲基的修饰水平在20%和40%时，Fluc的表达水平增加；当5-羟甲基的修饰水平在60%、80%和100%时，Fluc的表达水平保持不变(图5中的C)。
同时，检测了细胞中Fluc的酶活性，以更准确地定量分析不同修饰对蛋白表达水平的影响，样本中Fluc的酶活变化趋势与蛋白表述趋势一致(图5中的D~F)。图5中的D~F的实验结果是不同比例 (0%，20%，40%，60%，80%，100%) 的假尿苷、N1-甲基化-假尿苷、5-羟甲基-胞嘧啶修饰后的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的酶活性检测。
以未修饰的自复制RNA表达萤火虫荧光素酶酶活的结果为参照，分析不同核苷酸修饰种类和比例分析酶活的相对变化。对于假尿苷修饰的自复制RNA，当修饰水平在20%时，酶活的水平比未修饰高1.6倍，而当修饰水平在40%-100%，酶活水平分别为未修饰的0.84、0.35、0.06和0.003倍，实验结果表明对于假尿苷修饰，当修饰水平在0-20%时，会促进蛋白的表达，而当修饰水平在40%-100%时会降低蛋白的表达，尤其是当修饰水平在80%-100%时，蛋白的表达水平会被明显抑制。
对于N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA，当修饰水平在20%-80%时，酶活水平分别为未修饰的3.7、6.1、4.6和1.4倍，而当修饰水平在100%时，酶活水平为未修饰的0.09倍。实验结果表明，当修饰水平在20%-80%时，会促进蛋白的表达，且修饰水平在40%时，蛋白表达水平提高最明显，而当修饰水平在100%时，会降低蛋白的表达。
对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，当修饰水平在20%时，酶活水平为未修饰的3.2倍，当修饰水平在40%-100%时，酶活水平为未修饰的4倍左右，且保存不变。
综上所述，本发明发现，当自复制RNA被假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷修饰后，在Hela细胞中，蛋白的表达随着修饰比例的增加先增加后降低，但是两种修饰具有不同的拐点，且对蛋白表达水平的增加效果不同；自复制RNA被5-羟甲基-胞嘧啶修饰后，在Hela细胞中，蛋白的表达先随着修饰比例的增加先增加，而后当修饰水平达到40%后，蛋白表达水平不再随修饰比例的增加而增加，而是保持不变。
3.3 核苷酸修饰的自复制RNA的免疫应激反应
为了分析核苷酸修饰的自复制RNA对细胞先天炎症基因表达的影响，将上述不同比例 (0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%) 假尿苷、N1-甲基化-假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA转染至Hela细胞，24小时后收集样本，分别检测IFN-β1和RIG-I两个先天炎症基因表达，以未转染自复制RNA的细胞中两个先天炎症作为对照。
实验结果如图6~图7所示。图6中的A为编码人促红细胞生成素的自复制RNA在不同比例假尿苷、N1-甲基化-假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰后，转染海拉细胞引起的干扰素β1基因表达检测；图6中的B为编码人促红细胞生成素的自复制RNA在不同比例假尿苷、N1-甲基化-假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰后，转染海拉细胞引起的维甲酸诱导基因-I表达检测。图7中的A为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA在不同比例假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰后，转染海拉细胞引起的干扰素β1基因表达检测；图7中的B为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA在不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，转染海拉细胞引起的干扰素β1基因表达检测；图7中的C为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA在不同比例假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰后，转染海拉细胞引起的维甲酸诱导基因-I表达检测；图7中的D为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA在不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，转染海拉细胞引起的维甲酸诱导基因-I表达检测。
对于表达hEPO的自复制RNA，将未修饰的自复制RNA转染人细胞后，IFN-β1的表达相比于对照组细胞增加了4000多倍，随着假尿苷修饰比例的增加，IFN-β1的表达水平为对照组细胞的4600、3000、2300、1180和230倍，当假尿苷的掺入比例为60%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的一半左右，当假尿苷的掺入比例为100%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的5%。而随着N1-甲基化-假尿苷修饰比例的增加，IFN-β1的表达水平为对照组细胞的4700、3100、2400、1200和420倍，当N1-甲基化-假尿苷的掺入比例为60%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的一半左右，当假尿苷的掺入比例为100%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的10%。对于相同水平的假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷修饰，它们对降低自复制RNA引起的IFN-β1的表达具有相同的效果。而对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，IFN-β1的表达水平并不随着修饰比例的增加而降低至未修饰自复制RNA引起IFN- β1表达水平的一半(图6中的A)。RIG-I的表达变化与IFN-β1相似，将未修饰的自复制RNA转染人细胞后，RIG-I的表达相比于对照组细胞增加了230多倍，随着假尿苷修饰比例的增加，RIG-I的表达水平为对照组细胞的230、173、144、134和63倍，当假尿苷的掺入比例为60%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的63%，当假尿苷的掺入比例为100%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的20%。而随着N1-甲基化-假尿苷修饰比例的增加，RIG-I的表达水平为对照组细胞的230、178、152、130和72倍，当N1-甲基化-假尿苷的掺入比例为60%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的66%，当N1-甲基化-假尿苷的掺入比例为100%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的30%。对于相同水平的假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷修饰，它们对降低自复制RNA引起的RIG-I的表达具有相同的效果。而对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，RIG-I的表达水平并不随着修饰比例的增加而降低至未修饰自复制RNA引起RIG-I表达水平的60%(图6中的B)。
对于表达Fluc的自复制RNA，将未修饰的自复制RNA转染人细胞后，IFN-β1的表达相比于对照组细胞(未转染自复制RNA的细胞)增加了750多倍，随着假尿苷修饰比例的增加，IFN-β1的表达水平为对照组细胞的180、120、26、7.5和4倍，当假尿苷的掺入比例为60%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的3.5%，当假尿苷的掺入比例为100%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的0.5%。而随着N1-甲基化-假尿苷修饰比例的增加，IFN-β1的表达水平为对照组细胞的60、18、10、3.5和5.5倍，当N1-甲基化-假尿苷的掺入比例为60%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的1.3%，当N1-甲基化-假尿苷的掺入比例为100%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的0.7%。而对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，IFN-β1的表达水平为对照组细胞的154、118、77、54和29倍，当5-羟甲基-胞嘧啶的掺入比例为60%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的10%，当5-羟甲基-胞嘧啶的掺入比例为100%时，IFN-β1的表达水平降低至未修饰自复制RNA的3.9%。假尿苷修饰、或者N1-甲基化-假尿苷修饰或者5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，均可以大幅度降低表达Fluc的自复制RNA引起的IFN-β1的高表达，且效果相当。与hEPO不同的是，IFN-β1的表达也随着5-羟甲基-胞嘧啶修饰水平的增加而逐渐降低至未修饰自复制RNA引起IFN-β1表达水平的一半以上(图7中的A~B)。将未修饰的自复制RNA转染人细胞后，RIG-I的表达相比于对照组细胞增加了110多倍，随着假尿苷修饰比例的增加，RIG-I的表达水平为对照组细胞的51、40、18、7和3倍，当假尿苷的掺入比例为60%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的16.4%，当假尿苷的掺入比例为100%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的2.7%。而随着N1-甲基化-假尿苷修饰比例的增加，RIG-I的表达水平为对照组细胞的66、32、10、3.5和1.6倍，当N1-甲基化-假尿苷的掺入比例为60%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的9.1%，当N1-甲基化-假尿苷的掺入比例为100%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的1.4%。而对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，RIG-I的表达水平为对照组细胞的45、35、23、18和9倍，当5-羟甲基-胞嘧啶的掺入比例为60%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的21%，当5-羟甲基-胞嘧啶的掺入比例为100%时，RIG-I的表达水平降低至未修饰自复制RNA的8.1%。假尿苷、或者N1-甲基化-假尿苷修饰或者5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，均可以大幅度降低表达Fluc的自复制RNA引起的RIG-I的高表达，假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷修饰效果略优于5-羟甲基-胞嘧啶修饰(图7中的C~D)。
综上所述，本发明发现假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA表达不同的蛋白都可以有效的降低其对细胞先天炎症基因的刺激，且修饰比例越高，先天炎症基因表达降低越明显。
3.4 核苷酸修饰对自复制RNA复制的影响
Hela的蛋白表达是受自复制效率和细胞先天性炎性反应两个因素作用共同的结果，而核苷酸修饰可能影响自复制RNA的复制效率以及对细胞先天性炎性反应的刺激程度。BHK-21是一个免疫缺陷的细胞系，外源RNA的转入或自复制RNA的复制不会引起先天性炎性反应，因此通过检测自复制RNA转入后蛋白的表达水平，可以反应自复制RNA的复制和蛋白翻译效率。为了分析核苷酸修饰对自复制RNA复制效率的影响，将不同比例 (0%, 20%,40%, 60%, 80%, 100%) 假尿苷、N1-甲基化-假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA转染BHK-21细胞，24小时后收集样本，检测蛋白表达水平。NSP4是自复制RNA复制子的一部分，检测NSP4 RNA片段的相对变化，同样可以反应自复制RNA的复制。
实验结果如图8所示，图8中的A为不同比例假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中人促红细胞生成素蛋白的表达检测；图8中的B为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中人促红细胞生成素蛋白的表达检测；图8中的C为不同比例5-羟甲基-胞嘧啶 修饰的自复制RNA在细胞裂解液中人促红细胞生成素蛋白的表达；图8中的D为不同比例假尿苷修饰的自复制RNA在细胞培养上清中人促红细胞生成素蛋白的表达检测；图8中的E为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA在细胞培养上清中人促红细胞生成素蛋白的表达检测；图8中的F为不同比例5-羟甲基-胞嘧啶 修饰的自复制RNA在细胞培养上清中人促红细胞生成素蛋白的表达。
对于在BHK-21细胞中表达hEPO的自复制RNA，当假尿苷的修饰比例在0%-80%时，细胞裂解液中蛋白的表达无明显变化，而当修饰比例在100%时，细胞裂解液中蛋白的明显降低 (图8中的A)；而对于细胞培养上清中hEPO的表达变化，当假尿苷的修饰比例在0%-40%时，蛋白表达无明显变化，当修饰比例在60%-100%，蛋白表达明显降低 (图8中的D)；当N1-甲基化-假尿苷的修饰比例在0%-60%时，细胞裂解液中蛋白的表达增加，而当修饰比例在80-100%时，细胞裂解液中蛋白的表达明显降低 (图8中的B)；而对于细胞培养上清中hEPO的表达变化，当N1-甲基化-假尿苷的修饰比例在0%-60%时，蛋白表达无明显变化，当修饰比例在80%-100%，蛋白表达明显降低 (图8中的E)；对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，修饰比例的变化并不影响hEPO的表达 (图8中的C和图8中的F)。实验结果表明，假尿苷及N1-甲基化-假尿苷的掺入会影响自复制RNA的蛋白表达效率，且掺入比例越高，对蛋白表达的影响就越大。
为了验证实验结果的普适性，检测了不同比例 (0%，20%，40%，60%，80%，100%) 的假尿苷、N1-甲基化-假尿苷、5-羟甲基-胞嘧啶修饰后的自复制RNA在BHK-21细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的酶活性。以未修饰的自复制RNA表达萤火虫荧光素酶酶活的结果为参照，分析不同核苷酸修饰种类和比例分析酶活的相对变化。
实验结果如图9所示，图9中的A为不同比例假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的表达检测；图9中的B为不同比例假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的酶活性检测；图9中的C为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的表达检测；图9中的D为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的酶活性检测；图9中的E为不同比例5-羟甲基-胞嘧啶 修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的表达检测；图9中的F为不同比例5-羟甲基-胞嘧啶 修饰的自复制RNA在细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的酶活性检测。
在BHK-21细胞中，当假尿苷的掺入比例增加后，Fluc的蛋白表达水平及酶活随着修饰比例的增加而逐渐降低，分别为未修饰的自复制RNA的0.77、0.56、0.27、0.05和0.002倍，当假尿苷的修饰比例为80%-100%时，极大地抑制了蛋白的表达(图9中的A~B)。类似的，当N1-甲基化-假尿苷的掺入比例增加后，Fluc的蛋白表达水平及酶活随着修饰比例的增加而逐渐降低，分别为未修饰的自复制RNA的0.77、0.73、0.35、0.11和0.008倍，当N1-甲基化-假尿苷修饰的修饰比例为80%-100%时，极大地抑制了蛋白的表达 (图9中的C~D)。而对于相同比例的假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA，N1-甲基化-假尿苷修饰的蛋白表达水平要优于假尿苷修饰。对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，酶活并不随着修饰比例的增加而改变，在20%-100%修饰范围内，蛋白表达水平保持不变 (图9中的E~F)。这些实验结果与编码hEPO的自复制RNA具有相同的趋势，即假尿苷和N1-甲基化-假尿苷掺入影响自复制RNA的蛋白表达效率。推测可能是因为假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷的掺入可能影响了自复制RNA的复制效率，导致其基因组的减少，进而降低了蛋白的表达水平。
为了进一步验证核苷酸修饰对自复制RNA复制效率的影响，检测了不同比例 (0%，20%，40%，60%，80%，100%) 的假尿苷、N1-甲基化-假尿苷、5-羟甲基-胞嘧啶修饰后的自复制RNA在BHK-21细胞中复制效率，分别检测了NSP4基因片段和Fluc基因片段的RNA拷贝数的相对变化水平。结果见图10，图10中的A为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA在不同比例假尿苷、N1-甲基化-假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰后，转染叙利亚小仓鼠肾细胞后非结构蛋白4 RNA相对拷贝数检测；图10中的B为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA在不同比例假尿苷、N1-甲基化-假尿苷和5-羟甲基-胞嘧啶修饰后，转染叙利亚小仓鼠肾细胞系后荧光素酶Fluc RNA相对拷贝数检测。
当假尿苷的修饰水平在20%和40%时，NSP4位点的拷贝数为未修饰的自复制RNA的1.14和1.04倍，无明显变化；而当修饰水平在60%时，NSP4位点的拷贝数为未修饰自复制RNA的0.72倍，当修饰水平在80%和100%时，NSP4位点的拷贝数为未修饰自复制RNA的0.16和0.06倍，自复制RNA的复制明显被抑制。对于N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA，当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在20%和40%时，NSP4位点的拷贝数为未修饰的自复制RNA的1.43和1.46倍，自复制RNA的拷贝数略有增加；而当修饰水平在60%时，NSP4位点的拷贝数为未修饰的自复制RNA的0.88倍，当修饰水平在80%和100%时，NSP4位点的拷贝数为未修饰自复制RNA的0.42和0.23倍，自复制RNA的复制明显被抑制。对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，随着修饰比例的增加，NSP4位点的拷贝数无明显变化(图10中的A)。类似的，在自复制RNA的Fluc位点，当假尿苷的修饰水平在20%和40%时，Fluc位点的拷贝数为未修饰的自复制RNA的1.01和1.07倍，无明显变化；而当假尿苷的修饰水平在60%时，Fluc位点的拷贝数为未修饰自复制RNA的0.72倍，当假尿苷的修饰水平在80%和100%时，Fluc位点的拷贝数为未修饰自复制RNA的0.15和0.02倍，自复制RNA的复制明显被抑制。对于N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA，当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在20%和40%时，Fluc位点的拷贝数为未修饰的自复制RNA的1.5和1.7倍，自复制RNA的拷贝数略有增加；而当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在60%时，Fluc位点的拷贝数为未修饰自复制RNA的0.83倍，当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在80%和100%时，Fluc位点的拷贝数为未修饰自复制RNA的0.4和0.11倍，自复制RNA的复制明显被抑制。对于5-羟甲基-胞嘧啶修饰的自复制RNA，随着修饰比例的增加，Fluc位点的拷贝数无明显变化(图10中的B)。实验结果表明，在BHK-21细胞中，当假尿苷或N1-甲基化-假尿苷的修饰比例在20%-60%时，对自复制RNA的复制效率无明显影响或者影响较小，而当修饰比例在80%-100%时，会明显抑制自复制RNA的复制效率，而相同的修饰比例下，N1-甲基化-假尿苷修饰对复制的影响要略小于假尿苷修饰；5-羟甲基-胞嘧啶修饰对自复制RNA的复制无明显影响。
综上所述，本发明发现了核苷酸修饰的自复制RNA在细胞中蛋白表达、先天炎性反应及复制效率的一般规律，假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷的掺入会影响自复制RNA的复制效率，降低了对细胞内先天炎性因子基因的刺激，这些作用会促进其编码的蛋白的表达水平，然而因为复制效率的降低，会导致自复制RNA拷贝数的减少，这种作用会降低其编码的蛋白表达水平。因此未修饰或者修饰比例过高的自复制RNA，都不是最佳的条件，本发明的实验结果表明，当假尿苷或者N1-甲基化-假尿苷的修饰比例在40%-80%时，自复制RNA的相对蛋白水平表达最高，且对细胞先天炎症反应的刺激较低，这种修饰比例的自复制RNA是相对理想的条件。
3.5 核苷酸修饰对不同自复制RNA骨架系统表达的影响
3.5.1 自复制RNA骨架系统
自复制RNA的复制系统有不同的突变型，这些突变主要影响自复制RNA的复制效率以及亚基因组的转录水平等，同时自复制RNA的多聚腺苷尾的长度也会影响蛋白的表达水平。上文的实验结果在 A3G+Q739L+40A 的自复制RNA骨架系统下，分析了不同核苷酸以及不同比例修饰后蛋白表达、先天炎症基因刺激及复制效率。
为了研究不同自复制RNA骨架在核苷酸修饰后的表达规律，本实施例中选择以下三种自复制RNA骨架作为研究对象：srRNA #1 (A3G+Q739L+40A), srRNA #2 (A3G+Q739L+65A), srRNA #3 (A3+Q739+65A)。其中A3代表自复制RNA第三位的核苷酸为腺苷，A3G则代表该位点的核苷酸由腺苷突变成鸟苷；Q739代表NSP2第739位的氨基酸为谷氨酰胺，Q739L则代表该位点的氨基酸由谷氨酰胺突变成亮氨酸；其中选择了两种不同长度的多聚腺苷尾，比较其对蛋白表达的影响，40A代表自复制RNA的多聚腺苷尾的长度为40个腺苷，65A则代表多聚腺苷尾的长度为65个腺苷 (图2)。
根据上文的实验结果，选择N1-甲基化-假尿苷作为修饰核苷来比较修饰后的自复制RNA蛋白表达、先天免疫炎症基因刺激及复制效率的变化特征。
3.5.2 自复制RNA质量检测
为了检测合成的自复制RNA质量，使用RNA凝胶电泳的方法检测合成的RNA，每个样本取800纳克RNA。
实验结果如图11所示，图11中的A~C依次分别为不同比例N1-甲基化-假尿苷(0%，20%，40%，60%，80%，100%)修饰的自复制RNA #1_新冠病毒刺突蛋白结合结构域(srRNA #1_CD5-RBD)、自复制RNA #2_新冠病毒刺突蛋白结合结构域(srRNA #2_CD5-RBD)、自复制RNA#3_新冠病毒刺突蛋白结合结构域(srRNA #3_CD5-RBD)的凝胶电泳条带；图11中的D~F依次分别为不同比例N1-甲基化-假尿苷(0%，20%，40%，60%，80%，100%)修饰的自复制RNA #1_编码萤火虫荧光素酶(srRNA #1_Fluc)、自复制RNA #2_编码萤火虫荧光素酶(srRNA #2_Fluc)、自复制RNA #3_编码萤火虫荧光素酶(srRNA #3_ Fluc)的凝胶电泳条带。由该结果可知，合成的自复制RNA条带大小正确，RNA的纯度大于90%，证明合成的RNA具有较高的质量。
3.5.3 核苷酸修饰的不同骨架自复制RNA在Hela细胞中蛋白表达检测
为了分析核苷酸修饰的不同自复制RNA骨架系统对蛋白表达的影响，将不同比例(0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%) N1-甲基化-假尿苷自复制RNA转染至Hela细胞，24小时后收集样本检测蛋白表达。本实施例中选择新冠病毒刺突蛋白结合结构域蛋白和萤火虫荧光素酶作为模型。
对于表达RBD的自复制RNA，实验结果如图12所示，图12中的A为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA #1和自复制RNA #3转染海拉细胞后，检测刺突蛋白结合结构域的表达水平；图12中的B为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA #1和自复制RNA#2转染海拉细胞后，检测刺突蛋白结合结构域的表达水平；图12中的C为图12中的A和B中刺突蛋白结合结构域蛋白表达灰度统计图，每个刺突蛋白结合结构域蛋白灰度值以自身内参蛋白灰度值做归一化，并以图12中的B中srRNA #1在0%条件下刺突蛋白结合结构域的相对灰度值作为1换算其它条件下的蛋白相对表达水平。由该结果可知，在Hela细胞中，srRNA #1 中RBD的表达水平随着N1-甲基化-假尿苷修饰水平的增加先增加后降低，当N1-甲基化-假尿苷修饰水平在40%-60%时，RBD的表达水平最高 (图12中的A~C)；类似的，srRNA #2中RBD的表达水平也随着N1-甲基化-假尿苷修饰水平的增加先增加后降低，但是N1-甲基化-假尿苷修饰水平在20%-80%时，RBD的表达水平无明显变化，在20%和80%的修饰水平上，RBD的表达均高于srRNA #1(图12中的B和C)，此实验结果表明65A尾对蛋白表达的效果要优于40A尾；然而，对于srRNA #3中RBD的表达却随着N1-甲基化-假尿苷修饰水平的增加而增加(图12中的A和C)。而RBD的表达水平在srRNA #1 的40%-60% N1-甲基化-假尿苷、srRNA #2的20%-80% N1-甲基化-假尿苷及srRNA #3 的80%-100% N1-甲基化-假尿苷修饰状态下无明显差异 (图12中的C)。
对于表达Fluc的自复制RNA，实验结果如图13所示，图13中的A为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA #1和自复制RNA #2转染海拉细胞后，检测萤火虫荧光素酶的表达水平；图13中的B为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA #1和自复制RNA #3转染海拉细胞后，检测萤火虫荧光素酶的表达水平；图13中的C为不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3转染海拉细胞后，检测萤火虫荧光素酶的酶活性。
在Hela细胞中，srRNA #1 中Fluc的表达水平随着N1-甲基化-假尿苷修饰水平的增加先增加后降低，当N1-甲基化-假尿苷修饰水平在40%时，Fluc的表达水平最高 (图13中的A~B)；类似的，srRNA #2中Fluc的表达水平也随着N1-甲基化-假尿苷修饰水平的增加先增加后降低，但是N1-甲基化-假尿苷修饰水平在40%-60%时，Fluc的表达水平无明显变化，在40%和60%的修饰水平上，Fluc的表达均高于srRNA #1 (图13中的A)；对于srRNA #3中Fluc的表达随着N1-甲基化-假尿苷修饰水平的增加而增加 (图13中的B)。同时也检测了Fluc的酶变化趋势，以未修饰的srRNA #1表达的萤火虫荧光素酶的酶活作为标准，比较各实验组的酶活相对变化倍数。对于srRNA #1，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的荧光素酶相对酶活分别为1、3.72、6.07、4.55、1.4和0.09倍，修饰比例在40%时，酶活相对最高，而当修比例为80%时，酶活虽然仍比未修饰的自复制RNA高，但是增加比例明显降低，而当修饰比例在100%时，酶活明显降低。对于srRNA #2，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的荧光素酶相对酶活分别为1.23、5.37、7.16、7.77、4.61和0.57倍，未修饰的自复制srRNA#2的酶活与srRNA #1相当，当修饰比例在40%和60%时，相对酶活最高，而当修饰比例在100%时，酶活为未修饰的50%，srRNA#1和srRNA#2的骨架均为A3G+Q739L，因此当N1-甲基化-假尿苷修饰后，编码蛋白的表达呈现先增加后降低的趋势，而srRNA#1为40A多聚腺苷尾，srRNA#2为65A多聚腺苷尾，相同比例修饰下，65A的自复制RNA对编码蛋白的表达要高于40A。对于srRNA#3，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的荧光素酶相对酶活分别为0.96、2.28、3.72、4.33、5.44和5.96倍，酶活随着修饰比例的增加而增加，未修饰的srRNA#3的酶活与srRNA#1相当，当修饰比例为100%时，酶活为未修饰的6倍。srRNA#3的骨架为A3+Q739，因此与srRNA#1或srRNA#2不同，N1-甲基化-假尿苷修饰后，编码蛋白的表达呈现递增的趋势。可见，Fluc的酶活变化与蛋白表达变化趋势一致，而Fluc的表达水平在srRNA #1 的40%-60% N1-甲基化-假尿苷、srRNA #2的20%-80% N1-甲基化-假尿苷及srRNA #3 的40%-100% N1-甲基化-假尿苷修饰状态下无明显差异 (图13中的C)。
综上所述，本发明发现当自复制RNA为A3G+Q739L的骨架系统时，蛋白的表达随着N1-甲基化-假尿苷修饰水平的增加，呈现先增加后降低的特点，且65A尾具有更好的蛋白表达效果；而当mRNA为A3+Q739的骨架系统时，蛋白的表达随着N1-甲基化-假尿苷修饰水平的增加，呈现一直上升的特点。
3.5.4 核苷酸修饰的自复制RNA的免疫应激反应
为了分析核苷酸修饰的不同自复制RNA骨架对细胞先天炎症基因表达的影响，将不同比例 (0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%) N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA转染至Hela细胞，24小时后收集样本，分别检测IFN-β1和RIG-I两个先天炎症基因表达。
实验结果如图14所示，图14中的A为编码刺突蛋白结合结构域的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在海拉细胞中检测转染后干扰素β1的表达水平；图14中的B为编码刺突蛋白结合结构域的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在海拉细胞中检测转染后维甲酸诱导基因-I的表达水平；图14中的C为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在海拉细胞中检测转染后干扰素β1的表达水平；图14中的D为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在海拉细胞中检测转染后维甲酸诱导基因-I的表达水平。
对于表达RBD的自复制RNA，三种不同骨架系统的自复制RNA所引起的细胞先天炎症基因的表达，均随着N1-甲基化-假尿苷修饰比例的增加而降低，然而，在相同水平的修饰下，srRNA #1与srRNA #2具有相同水平的IFN-β1或者RIG-I的表达，且当N1-甲基化-假尿苷的修饰水平大于40%时，先天炎症基因的表达水平与背景表达水平相当；但是对于srRNA #3，其先天炎症基因的表达水平均明显高于srRNA #1和srRNA #2 (图14中的A~B)。
进一步检测了表达Fluc的自复制RNA，以未转染自复制RNA的细胞作为对照，比较各组自复制RNA对先天炎症基因的刺激程度。对于srRNA#1，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的IFN-β1基因的表达水平分别为对照组细胞的166、60、18、9.5、4和5倍，IFN-β1的表述水平随着修饰比例的增加而降低，当修饰比例为60%时，IFN-β1的表达水平为未修饰自复制RNA的5.7%，而当修饰比例为100%，IFN-β1的表达水平为未修饰自复制RNA的3%；对于srRNA#2，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的IFN-β1基因的表达水平分别为对照组细胞的403、82、32、22、6和4.5倍，IFN-β1的表述水平随着修饰比例的增加而降低，当修饰比例为60%时，IFN-β1的表达水平为未修饰自复制RNA的5.5%，而当修饰比例为100%，IFN-β1的表达水平为未修饰自复制RNA的1%；对于srRNA#3，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的IFN-β1基因的表达水平分别为对照组细胞的718、420、176、274、75和29倍，IFN-β1的表述水平随着修饰比例的增加而降低，当修饰比例为60%时，IFN-β1的表达水平为未修饰自复制RNA的38.2%，而当修饰比例为100%，IFN-β1的表达水平为未修饰自复制RNA的4%。实验结果发现，对于不同类型的自复制RNA骨架，其对细胞IFN-β1的刺激程度都随着修饰水平的增加而逐渐降低，但是对于相同水平的N1-甲基化-假尿苷修饰而言，srRNA#1与srRNA#2 转染细胞后IFN-β1相差不多，但是srRNA#3的IFN-β1表达水平要高于它们 (图14中的C)。对于srRNA#1，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的RIG-I基因的表达水平分别为对照组细胞的117、66.7、32.2、10.6、4.2和1.7倍，RIG-I的表述水平随着修饰比例的增加而降低，当修饰比例为60%时，RIG-I的表达水平为未修饰自复制RNA的9.1%，而当修饰比例为100%，RIG-I的表达水平为未修饰自复制RNA的1%；对于srRNA#2，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的RIG-I基因的表达水平分别为对照组细胞的129、65、32、15、4.4和1.5倍，RIG-I的表述水平随着修饰比例的增加而降低，当修饰比例为60%时，RIG-I的表达水平为未修饰自复制RNA的11.6%，而当修饰比例为100%，RIG-I的表达水平为未修饰自复制RNA的1.2%；对于srRNA#3，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的RIG-I基因的表达水平分别为对照组细胞的154、107、88、69、69和37倍，RIG-I的表述水平随着修饰比例的增加而降低，当修饰比例为60%时，RIG-I的表达水平为未修饰自复制RNA的44.8%，而当修饰比例为100%，RIG-I的表达水平为未修饰自复制RNA的24%。实验结果发现，对于不同类型的自复制RNA骨架，其对细胞RIG-I的刺激程度都随着修饰水平的增加而逐渐降低，但是对于相同水平的N1-甲基化-假尿苷修饰而言，srRNA#1与srRNA#2 转染细胞后RIG-I相差不多，但是srRNA#3的RIG-I表达水平要高于它们(图14中的D)。可见，表达Fluc各修饰比例的自复制RNA其IFN-β1和RIG-I的表达具有与表达RBD各修饰比例的自复制RNA相同的趋势 (图14中C~D)。
综上所述，本发明发现对于三种不同的自复制RNA骨架系统，N1-甲基化-假尿苷修饰比例的增加均能降低自复制RNA 对细胞先天炎症基因的刺激，且与多聚腺苷尾的长度、表达蛋白的类型或骨架类型无关，然而A3+Q739骨架系统能够引起更高的先天炎症基因的表达。
3.5.5 核苷酸修饰对不同骨架自复制RNA复制的影响
为了分析核苷酸修饰的不同自复制RNA骨架在细胞中的复制效率，将不同比例(0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%) N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA转染至BHK-21细胞，24小时后收集样本，在BHK-21细胞中检测蛋白的表达变化以反映复制效率，同时检查检测NSP4 和RBD或者Fluc的基因片段相对变化趋势。
蛋白表达结果如图15~图16所示，图15中的A为编码刺突蛋白结合结构域的自复制RNA #1和自复制RNA #2，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞裂解液中检测转染后刺突蛋白结合结构域的表达水平；图15中的B为编码刺突蛋白结合结构域的自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞裂解液中检测转染后刺突蛋白结合结构域的表达水平；图15中的C为图15中的A和B中刺突蛋白结合结构域蛋白表达灰度统计图，每个刺突蛋白结合结构域蛋白灰度值以自身内参蛋白灰度值做归一化，并以图15中的A中自复制RNA #1在0%条件下刺突蛋白结合结构域的相对灰度值作为1换算其它条件下的蛋白相对表达水平。图16中的A为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA #1和自复制RNA #2，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞裂解液中检测转染后荧光素酶的表达水平；图16中的B为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA #1和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞裂解液中检测转染后荧光素酶的表达水平；图16中的C为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞裂解液中检测转染后荧光素酶的酶活性。
对于表达RBD的srRNA #1，当N1-甲基化-假尿苷修饰水平在0%-60%时，RBD的表达无明显变化，在80%-100%修饰水平时，RBD表达明显降低 (图15中的A和C)；而对于表达RBD的srRNA #2，当N1-甲基化-假尿苷修饰水平在0%-80%时，RBD的表达无明显变化，在100%修饰水平时，RBD表达明显降低 (图15中的A~C)，在80%-100%水平，srRNA #2表达的RBD水平要高于srRNA #1 (图15中的A和C)，说明了65A对蛋白表达有促进作用。相比之下，当N1-甲基化-假尿苷修饰水平在0%-80%时，srRNA #3表达的RBD水平无明显变化，而在100%修饰水平时，RBD的表达仍有未修饰的srRNA #3表达水平的50% (图15中的B~C)。
进一步检测了表达Fluc的自复制RNA，以未修饰的srRNA #1表达的萤火虫荧光素酶的酶活作为标准，比较各实验组的酶活相对变化倍数。对于srRNA#1，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的荧光素酶活的相对表达水平为1、0.77、0.73、0.35、0.11、0.008，酶活水平随着修饰比例的增加而逐渐降低，当修饰水平在20%和40%时，酶活下降不明显，当修饰水平在60%-100%，酶活水平明显降低，尤其是当修饰水平在100%时，酶活仅为未修饰的0.8%，说明蛋白表达被极大地抑制；对于srRNA#2，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的荧光素酶活的相对表达水平为0.85、0.84、0.72、0.57、0.38、0.06，未修饰的srRNA#2的酶活水平与srRNA#1中未修饰的自复制RNA相当，其余组中，酶活水平随着修饰比例的增加而逐渐降低，当修饰水平在20%和40%时，酶活下降不明显，当修饰水平在60%-100%，酶活水平明显降低，而当修饰水平在100%时，酶活仅为未修饰的7%，虽然酶活也明显降低，但是要高于srRNA#1中100%修饰水平；对于srRNA#3，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，对应的荧光素酶活的相对表达水平为0.41、0.46、0.42、0.40、0.37、0.23，未修饰的srRNA#3的酶活水平要低于srRNA#1中未修饰的自复制RNA，其余组中，当修饰水平在20%-80%时，酶活无明显变化，当修饰水平在100%，酶活水平仍为未修饰组的一半。 综上所述，对于srRNA#1和srRNA#2，蛋白表达会随着修饰水平的增加而降低，且当修饰水平达到100%时，蛋白表达被抑制到极低的水平，而对于srRNA#3，当修饰水平在20%-80%时，蛋白表达无明显变化，即使修饰水平达到100%时，蛋白表达仅降低50%。可见，各srRNA骨架不同修饰水平下Fluc的蛋白表达水平 (图16中的A~B) 和对应的酶活检测结果 (图16中的C) 具有与RBD蛋白表达相同的趋势。
实验结果表明，当N1-甲基化-假尿苷修饰水平在0%-60%时，修饰对三种骨架系统的自复制RNA的复制影响不大，而当修饰水平在80%和100%时，会严重影响A3G+Q739L类型的自复制RNA的复制，而对A3+Q739类型的自复制RNA复制影响相对较小。
自复制RNA核酸变化结果如图17所示，图17中的A为编码刺突蛋白结合结构域的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中检测非结构蛋白4 RNA的相对拷贝数；图17中的B为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中检测非结构蛋白4 RNA的相对拷贝数；图17中的C为编码刺突蛋白结合结构域的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中检测刺突蛋白结合结构域 RNA的相对拷贝数；图17中的D为编码萤火虫荧光素酶的自复制RNA #1、自复制RNA #2和自复制RNA #3，被不同比例N1-甲基化-假尿苷修饰后，在叙利亚小仓鼠肾细胞系细胞中检测萤火虫荧光素酶 RNA的相对拷贝数。
以srRNA#1未修饰的表达萤火虫荧光素酶（Fluc）的自复制RNA为对照，分析不同核苷酸修饰种类和比例对自复制RNA复制的影响。三种不同骨架系统的自复制RNA中NSP4的拷贝数都随着N1-甲基化-假尿苷修饰比例的增加而降低，且与编码的蛋白无关 (图17中的A~B)，而RBD和Fluc的拷贝数也随着N1-甲基化-假尿苷修饰比例的增加而降低，且与何种自复制RNA骨架系统无关 (图17中的C~D)。因为编码RBD和Fluc的自复制RNA复制变化趋势相似，因此我们以编码Fluc的NSP4 RNA相对拷贝数和Fluc RNA相对拷贝数变化趋势作为具体例子详细描述。具体的，对于srRNA#1，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，NSP4的相对拷贝数分别为1、0.70、0.40、0.38、0.28、0.47，自复制RNA的复制效率随着修饰比例的增加而逐渐降低；对于srRNA#2，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，NSP4的相对拷贝数分别为0.98、0.65、0.32、0.45、0.40、0.30，自复制RNA的复制效率也随着修饰比例的增加而逐渐降低；对于srRNA#3，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，NSP4的相对拷贝数分别为2.29、2.47、1.97、1.43、1.31、0.76，自复制RNA的复制效率也随着修饰比例的增加而逐渐降低。虽然三种自复制RNA的复制效率都随着修饰比例的增加呈现降低的趋势，但是对于相同比例的修饰而言，srRNA#1和srRNA#2的NSP4相对拷贝数相当，而srRNA#3的相对拷贝数要远高于它们 (图17中的B)。对于srRNA#1，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，Fluc的相对拷贝数分别为1、0.80、0.74、0.54、0.47、0.55，自复制RNA的复制效率随着修饰比例的增加而逐渐降低；对于srRNA#2，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，Fluc的相对拷贝数分别为1.10、0.98、0.79、0.74、0.78、0.47，自复制RNA的复制效率也随着修饰比例的增加而逐渐降低；对于srRNA#3，当修饰比例为0%、20%、40%、60%、80%和100%时，Fluc的相对拷贝数分别为4.44、4.88、4.74、3.70、2.80、1.79，自复制RNA的复制效率也随着修饰比例的增加而逐渐降低。虽然三种自复制RNA的复制效率都随着修饰比例的增加呈现降低的趋势，但是对于相同比例的修饰而言，srRNA#1和srRNA#2的Fluc相对拷贝数相当，而srRNA#3的相对拷贝数要远高于它们 (图17中的D)。
可见，对于相同水平的核苷酸修饰，srRNA #1与srRNA #2具有相同水平的拷贝数，而srRNA #3的拷贝数要高于srRNA #1或srRNA #2。实验结果表明A3+Q739类型的自复制RNA具有更高的复制效率。上文的实验结果发现srRNA #3对细胞有更高的先天免疫刺激反应（图14），而先天免疫刺激与自复制RNA复制过程中产生的dsRNA有关，因此，在相同核苷酸修饰比例的情况下，A3+Q739类型（srRNA #3）的自复制RNA对细胞先天炎症基因的刺激总是高于A3G+Q739L（srRNA #1或#2）。
另外，对于蛋白表达与自复制相对拷贝量之间的关系上，首先需要说明的是RBD的蛋白表达结果统计为半定量性质（蛋白免疫印迹灰度分析），因此具有一定的偏差。而Fluc荧光素的酶活性测定可以精确定量，更好的反应出蛋白表达的精准趋势，所以我们主要参考Fluc酶活性趋势。如前所述，在BHK-21细胞系中，已经排除了先天炎性反应对蛋白表达的影响，所以核苷酸修饰仅影响RNA的相对拷贝数。实验结果显示随着修饰比例的增加，RNA拷贝数呈现降低的趋势，对于同一个自复制RNA骨架，蛋白表达与RNA拷贝数呈正相关，因此蛋白表达水平随着修饰比例的增加而降低。而对于不同的自复制RNA骨架，虽然srRNA #3的RNA相对拷贝数要高于srRNA #1和srRNA #2，但是A3G骨架（srRNA #1和srRNA #2）倾向于亚基因组转录，A3（srRNA #3）则倾向于自复制RNA的复制，所以对比图16中的C和图17中的D，即使srRNA #3的Fluc RNA相对拷贝数更高，但其Fluc蛋白表达水平低于具有A3G骨架的srRNA #1和srRNA #2 (图16中的C)。
综上所述，本发明发现不同类型的自复制RNA在被N1-甲基化-假尿苷修饰后，均能降低自复制RNA的复制效率，进而降低其对细胞先天炎症基因的刺激，但是因为不同类型的自复制RNA本身复制效率的差异，A3+Q739类型的自复制RNA复制效率更好，相同条件下，其具有更高的固有免疫刺激。
3.5.6 核苷酸修饰的不同骨架自复制RNA长时效表达检测
为了获得相对高表达目的蛋白、低固有免疫刺激和表达持续时间较长的自复制RNA系统，根据前述实验结果，A3G+Q739L+65A srRNA骨架且具有40%-60% N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA和A3+Q739+65A srRNA骨架且具有100% N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA有相同的蛋白表达水平（图12中的C，图13中的C），虽然A3+Q739+65A srRNA骨架具有相对较高的固有免疫刺激，但是因为其复制效率相对较高，可能会有相对较长的表达持续时间。为了系统分析和比较二者的特点，将srRNA #2 + 60% N1-甲基化-假尿苷、srRNA #3+ 0% N1-甲基化-假尿苷和srRNA #3 + 100% N1-甲基化-假尿苷三种自复制RNA转染细胞，然后分别在转染后24、48、72、96和120小时检测蛋白表达及先天炎症基因的表达。以0%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #3 24小时的荧光素酶的酶活作为参考，比较各组之间酶活相对变化比例。以未转染自复制RNA的细胞为对照细胞比较各组之间炎症基因IFN-β1表达水平相对变化比例。本实施例中使用Fluc作为自复制RNA表达的目的蛋白。RNA被阳离子脂质体包裹后，经静脉注射会在肝脏中富集，为了检测自复制RNA在肝脏中的表达效果，使用PLC-5肝癌细胞系作为检测模型。
实验结果如图18所示，图18中的A为60%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA#2、未修饰的自复制RNA #3及100%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA #3编码的萤火虫荧光素，转染人肝癌细胞系后，在转染后24-120小时的荧光素酶活性检测；图18中的B为60%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA #2、未修饰的自复制RNA #3及100%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA #3编码的萤火虫荧光素，转染人肝癌细胞系后，在转染后24-120小时细胞干扰素β1基因表达检测。
对于60%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #2，在24-120小时中，酶活的相对表达水平为2.96、0.85、0.57、0.25、0.57，酶活随细胞培养时间的增加而逐渐降低；对于0%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #3，在24-120小时中，酶活的相对表达水平为1.00、0.17、0.04、0.006、0.003，酶活随细胞培养时间的增加而逐渐降低；对于100%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #3，在24-120小时中，酶活的相对表达水平为1.75、0.65、0.28、0.08、0.06，酶活随细胞培养时间的增加而逐渐降低。在24小时，60%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #2具有最高的酶活水平，100%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #3次之，而在120小时后，60%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #2的相对酶活水平要远高于其余两组 (图18中的A)。而对于先天炎症基因的表达，对于60%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #2，在24-120小时中，IFN-β1的表达水平为3.47、7.39、1.88、1.34和0.83，IFN-β1的表达最高值为对照细胞（未转染自复制RNA的细胞）的7.39倍，在72小时降低至2倍以内；对于0%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #3，在24-120小时中，IFN-β1的表达水平为95.89、18.2、1.31、0.63和0.26，IFN-β1的表达最高值为对照细胞的96倍，在72小时降低至2倍以内；对于100%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #3，在24-120小时中，IFN-β1的表达水平为8.87、7.09、1.81、1.44和0.71，IFN-β1的表达最高值为对照细胞的8.87倍，在72小时降低至2倍以内。实验结果表明，N1-甲基化-假尿苷修饰可以降低自复制RNA引起的先天炎性基因的表达，而对于60%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #2和100%比例N1-甲基化-假尿苷修饰的srRNA #3两组转入的细胞，其所引起的先天炎性基因的表达水平相近(图18中的B)。因此根据实验结果，srRNA #2 + 60% N1-甲基化-假尿苷具有较高的蛋白表达和相对较低的固有免疫刺激。
4 总结
4.1 合适的核苷酸修饰比例
传统的mRNA在制备过程中，会使用100%的N1-甲基化-假尿苷修饰，这种修饰水平的mRNA具有极低的固有免疫刺激、较高的蛋白表达水平和相对稳定的mRNA。然而，自复制RNA与传统的mRNA在细胞内的作用机制并不相同，其存在一个复制的过程，而100%的N1-甲基化-假尿苷修饰的自复制RNA，虽然也降低了固有免疫刺激反应，但其自复制会被不同程度的抑制，甚至会导致目的蛋白几乎不表达。
本发明的实验结果显示，选择合适比例的修饰核苷的掺入自复制RNA，不仅会促进目的蛋白的表达，而且也能够有效降低自复制RNA的固有免疫刺激。其机理是，自复制RNA的复制效率，会随着修饰核苷掺入比例的增加而降低，拷贝数的降低会导致蛋白表达模板的减少，进而引起蛋白表达水平的降低；而自复制RNA复制效率的降低，可以降低对细胞先天炎症基因的刺激，导致自复制RNA模板稳定性增加和蛋白翻译效率提高，最终促进蛋白表达水平的增加。因此核苷修饰的掺入同时存在正面和负面的作用，二者的动态变化，最后本发明发现了当假尿苷的修饰比例在40%-60%或者N1-甲基化-假尿苷的修饰水平在20%-80%时，自复制RNA的蛋白表达水平最高，且固有免疫刺激相对较低。
4.2 自复制RNA骨架系统的影响
自复制RNA的骨架存在不同的碱基突变，它们会影响自复制RNA的复制效率、亚基因组的转录等。而这些都会影响自复制RNA的蛋白表达水平和在细胞内的固有免疫刺激反应。
本发明比较了不同自复制RNA系统在核苷酸修饰后的蛋白表达、固有免疫刺激反应和复制效率，A3G+Q739L类型的自复制RNA具有较低的复制效率，而A3+Q739类型的自复制RNA的复制效率较高。本发明发现，对N1-甲基化-假尿苷修饰的A3G+Q739L，随着修饰比例的增加，其蛋白表达水平先增加后降低；而对N1-甲基化-假尿苷修饰的A3+Q739，随着修饰比例的增加，其蛋白表达水平也一直增加。而进一步实验发现，A3+Q739类型的自复制RNA具有较高的固有免疫刺激性，因此，核苷酸修饰的优势在于能够降低固有免疫刺激，但也会降低自复制RNA的复制效率。尽管核苷酸修饰会使自复制RNA复制效率降低，由于A3+Q739本身相较A3G+Q739L的复制效率更高，其在高比例（比如100%）的核苷酸修饰情况下，也能保证蛋白的表达在一个相对更高的水平；而本身复制效率更低的A3G+Q739L在高比例（比如100%）核苷酸修饰的情况下，蛋白表达则受到严重抑制。
本发明的实验结果表明，针对不同骨架系统的自复制RNA，N1-甲基化-假尿苷修饰可以提高蛋白的表达效率同时降低其固有免疫刺激，且需要针对性的选择核苷酸的修饰比例。对于A3+Q739骨架系统的自复制RNA，可以选择40%-100%比例N1-甲基化-假尿苷掺入的条件；对于A3G+Q739L骨架系统的自复制RNA，应当选择40%-80%比例N1-甲基化-假尿苷掺入的条件；而关于不同核苷修饰的自复制RNA实验结果表明，假尿苷与N1-甲基化-假尿苷修饰具有相似的实验结果，因此选择假尿苷修饰不同骨架的自复制RNA，通过调整修饰比例，也能得到与N1-甲基化-假尿苷修饰类似的结果。对于多聚腺苷尾，根据本发明实验的结果，多聚腺苷尾并不影响自复制RNA的表达模式，仅影响了在特定比例核苷酸修饰下蛋白的相对表达水平，因此多聚腺苷尾的长度包括但应不限于40A或65A或者其他形式的多聚腺苷尾。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (18)
1.经修饰的自复制RNA，其特征在于，其包含：
5’非翻译区；
一个或多个来源于甲病毒表达载体的非结构蛋白，且其中含有NSP2；
以及，
目标片段；
其中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照1%~100%的比例被修饰为假尿苷或N1-甲基化-假尿苷；
当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷按照1%~80%的比例被修饰为假尿苷或N1-甲基化-假尿苷。
2.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照20%~60%的比例被修饰为假尿苷。
3.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为腺苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为谷氨酰胺时，所述自复制RNA中的尿苷按照40%~100%的比例被修饰为N1-甲基化-假尿苷。
4.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷按照40%~60%的比例被修饰为假尿苷。
5.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，当所述5’非翻译区中第3个位点的碱基为鸟苷，且NSP2的第739个位点的氨基酸为亮氨酸时，所述自复制RNA中的尿苷按照40%~80%的比例被修饰为N1-甲基化-假尿苷。
6.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，所述自复制RNA还包含：
多聚腺苷尾；
所述多聚腺苷尾的长度为30~100 nt。
7.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，所述甲病毒选自：委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，辛德毕斯病毒、屈曲病毒、东方马脑脊髓炎病毒、西方马脑脊髓炎病毒、马雅鲁病毒、生里基森林病毒以及委内瑞拉马脑脊髓炎病毒中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，所述自复制RNA自5’端到3’端依次包含：5’帽子结构，5’非翻译区，非结构蛋白1~非结构蛋白4，亚基因组启动子，目标片段，3’非翻译区以及多聚腺苷尾。
9.根据权利要求8所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，所述自复制RNA含有：
a）骨架；
所述骨架自5’端到3’端依次包含：5’帽子结构，5’非翻译区，非结构蛋白1~非结构蛋白4，亚基因组启动子， 3’非翻译区以及多聚腺苷尾，具体包含如下任一序列：
a1）如SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：6中任一项所示的核苷酸序列；
a2）与a1）所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的序列；
以及，
b）目标片段，所述目标片段位于所述骨架中的亚基因组启动子与3’非翻译区之间。
10.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，所述目标片段包含编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD或其片段的RNA、或包含编码hEPO的RNA、或包含编码Fluc的RNA。
11.根据权利要求1所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，与未修饰的自复制RNA相比，所述经修饰的自复制RNA具有更低的固有免疫刺激，同时具有部分、相当或更高的复制效率及蛋白表达水平。
12.根据权利要求11所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，所述经修饰的自复制RNA所引起的先天炎症基因的表达水平为未修饰的自复制RNA的0.004~0.8倍；所述先天炎症基因包括IFN-β1和RIG-I中的至少一种。
13.根据权利要求11所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，所述经修饰的自复制RNA的复制效率为未修饰的自复制RNA的0.3~1.8倍。
14.根据权利要求11所述的经修饰的自复制RNA，其特征在于，其中，所述经修饰的自复制RNA的蛋白表达水平为未修饰的自复制RNA的0.1~6.5倍。
15.药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1~14中任一项所述的经修饰的自复制RNA。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，其还包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、核酸稳定剂和转染试剂中的至少一种。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，其中，所述药物组合物为疫苗；所述疫苗以质粒、病毒载体、脂质体、树状大分子、无机纳米粒子或细胞穿膜肽的形式进行包装递送。
18.一种自复制RNA的修饰方法，其特征在于，其用于在降低自复制RNA的固有免疫刺激的同时，使自复制RNA具有部分、相当或更高的复制效率及蛋白表达水平；
所述修饰方法包括：
对自复制RNA进行修饰，得到权利要求1~14中任一项所述的经修饰的自复制RNA。
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