CN118119930A

CN118119930A - 抗新型冠状病毒感染的mRNA疫苗的组合物和方法

Info

Publication number: CN118119930A
Application number: CN202280066965.3A
Authority: CN
Inventors: 尼斯·阿南塔斯瓦米; 永植·奉; 大卫·布朗; 陈任翔; 柱衡·全; 龙智锋; 沈栋; 陆春; 帕特里克·Y·陆; 唐盛高; 何嘉曦; 何耔阳
Original assignee: Damian Biology Co ltd
Current assignee: Damian Biology Co ltd
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2022-08-10
Publication date: 2024-05-31
Also published as: WO2023018831A9; WO2023018831A2; EP4384214A2; JP2024530672A; US20240226275A1; TW202328166A

Abstract

本文提供了编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的核糖核酸(RNA)，该刺突(S)蛋白或其免疫原性片段包含至少一个非天然存在的氨基酸突变。在一些实施方案中，该S蛋白来源于δ变体。另外提供了相关的多核苷酸、载体、细胞、组合物、试剂盒、生产方法和使用方法。

Description

抗新型冠状病毒感染的mRNA疫苗的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年8月11日提交的美国临时申请号63/232,101的优先权，该专利申请的内容据此全文以引用方式并入。

技术领域

提供了用于疫苗接种、预防和治疗2019-nCoV感染的预防剂和治疗剂。

背景技术

冠状病毒(CoV)一再跨越物种屏障，并且其中一些已成为重要的人类病原体。在过去二十年中，感染动物的两种冠状病毒已经进化并在人类中引起爆发：严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV，2002，属：β冠状病毒(Betacoronavirus)，亚属：沙贝病毒(Sarbecovirus))和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV，2012，属：β冠状病毒，亚属：Merbecovirus)。参见，例如，Drosten等人，New Engl J Med.2003年，第348卷：第1967-1976页；和Zaki等人，New Engl J Med.2012年，第367卷：第1814-1820页。

SARS-CoV-2 2019(COVID-19)是引起冠状病毒病的冠状病毒的新毒株。参见，例如，Zhu等人，N Engl J Med.2020年，第382卷：第727-733页。根据世界卫生组织(WHO)于2021年7月26日发布的COVID-19流行病学和操作性周报(COVID-19WeeklyEpidemiological Update and Weekly Operational Update)，全球有近2亿确诊病例和超过4百万的确诊死亡病例。COVID-19尚无治愈方法，而类固醇已被用于住院成人的治疗管理，并且食品药品监督管理局(FDA)已发布用于治疗患有COVID-19的非住院个体的抗SARS-CoV-2抗体(诸如索托维单抗(sotrovimab)，以及卡西瑞单抗(casirivimab)和伊德维单抗(imdevimab)的组合)的紧急使用授权(EUA)。参见，例如，COVID-19治疗指南小组，“Coronavirus Disease 2019(COVID-19)Treatment Guidelines.”，美国国立卫生研究院，可见于www.covid19treatmentguidelines.nih.gov，最后一次访问日期为2021年7月27日。

因此，仍然迫切需要有效预防和治疗SARS-CoV-2感染。本公开满足了这一需要，并且还提供了相关的优点。

发明内容

本文提供了严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突蛋白(S)或其免疫原性片段，以及编码刺突蛋白(S)或其免疫原性片段的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。例如，与SARS-CoV-2δ变体的S蛋白诸如SEQ ID NO:1或其变体相比，该S蛋白或其免疫原性片段包含至少一个非天然存在的氨基酸突变，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该至少一个非天然存在的氨基酸突变包含以下项中的一者或多者，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成：作为与SEQ ID NO:1的R682对应的氨基酸的丝氨酸(S)(R682S)、作为与SEQ ID NO:1的R685对应的氨基酸的甘氨酸(G)(R685G)、作为与SEQ ID NO:1的F817对应的氨基酸的脯氨酸(P)(F817P)、作为与SEQ IDNO:1的A892对应的氨基酸的P(A892P)、作为与SEQ ID NO:1的A899对应的氨基酸的P(A899P)、作为与SEQ ID NO:1的A942对应的氨基酸的P(A942P)、作为与SEQ ID NO:1的K986对应的氨基酸的P(K986P)或作为与SEQ ID NO:1的V987对应的氨基酸的P(V987P)。在一些实施方案中，编码刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的RNA不包含SEQ ID NO:2。在一方面，编码S蛋白或其免疫原性片段的RNA包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)。

在一些实施方案中，mRNA编码S蛋白，该S蛋白还包含一个或多个突变，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，该一个或多个突变可在SARS-CoV-2天然存在的变体诸如δ变体中发现。在一些实施方案中，这些突变包括以下项中的一者或多者，或另选地基本上由其组成，或进一步由其组成：作为与SEQ ID NO:1的N440对应的氨基酸的赖氨酸(K)(N440K)、作为与SEQ ID NO:1的E484对应的氨基酸的K(E484K)、作为与SEQ ID NO:1的T19对应的氨基酸的精氨酸(R)(T19R)、作为与SEQ ID NO:1的V70对应的氨基酸的苯丙氨酸(F)(V70F)、作为与SEQ ID NO:1的T95对应的氨基酸的异亮氨酸(I)(T95I)、作为与SEQ ID NO:1的G142对应的氨基酸的天冬氨酸(D)(G142D)、作为与SEQ ID NO:1的E156对应的缺失(E156Δ)、作为与SEQ ID NO:1的F157对应的缺失(F157Δ)、作为与SEQ ID NO:1的R158对应的氨基酸的G(R158G)、作为与SEQ ID NO:1的A222对应的氨基酸的缬氨酸(V)(A222V)、作为与SEQ IDNO:1的W258对应的氨基酸的亮氨酸(L)(W258L)、作为与SEQ ID NO:1的K417对应的氨基酸的天冬酰胺(N)(K417N)、作为与SEQ ID NO:1的K417对应的氨基酸的R(L452R)、作为与SEQID NO:1的T478对应的氨基酸的K(T478K)、作为与SEQ ID NO:1的D614对应的氨基酸的G(D614G)、作为与SEQ ID NO:1的P681对应的氨基酸的R(P681R)，或作为与SEQ ID NO:1的D950对应的氨基酸的N(D950N)。

在一些实施方案中，S蛋白或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:5、6、7、10、11或14中任一者的多肽或它们中每一者的等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。本公开还提供了编码这些多肽及其等效物的RNA或DNA。在一些实施方案中，RNA包含SEQ IDNO:9、13或16的多核苷酸或它们中每一者的等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，RNA还包含三引物非翻译区(3'UTR)、聚腺苷酸化(polyA)尾和五引物非翻译区(5'UTR)中的一者或多者。在一些实施方案中，RNA包含SEQ ID NO:32，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。SEQ ID NO:9、13、16编码S多肽。SEQ ID NO:32为SEQ ID NO:9，还包含5和3'UTR和polyA尾。

在一方面，提供了编码如本文所公开的RNA的多核苷酸诸如DNA。还提供了编码DNA的互补物。在进一步的方面，提供了包含本文所公开的多核苷酸的载体。在一个实施方案中，载体是质粒，任选地包含SEQ ID NO:33或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在又一方面，提供了包含以下项中的一者或多者的细胞：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸或本文所公开的载体。在一方面，提供了包含载体(任选地，药学上可接受的载体)和以下项中的一者或多者的组合物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体或本文所公开的细胞。

另外提供了一种产生本文所公开的DNA或RNA的方法。在一些实施方案中，该方法包括在适用于表达DNA和/或RNA的条件下培养本文所公开的细胞，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在其他实施方案中，该方法包括在适用于表达RNA的条件下，使本文所公开的多核苷酸或载体与RNA聚合酶、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、鸟苷-5'-三磷酸(GTP)和三磷酸尿苷(UTP)或经化学修饰的UTP(诸如N1-甲基假尿苷三磷酸)接触，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，本文所公开的方法还包括分离DNA或RNA。

在一方面，提供了一种组合物，该组合物包含本文所公开的蛋白质、多肽、RNA或DNA和载体诸如药学上可接受的载体，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括聚合物纳米颗粒，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，聚合物纳米颗粒包含组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，药学上可接受的载体还包含脂质，任选地以下项中的一者或多者：阳离子脂质(诸如Dlin-MC3-DMA，即MC3)、辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。.在一些实施方案中，药学上可接受的载体包含脂质纳米颗粒(LNP)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该LNP包含以下项中的一者或多者：8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物。在进一步的实施方案中，该LNP还包含以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。可向纳米颗粒组合物中加入另一种药学上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐水等。

在进一步的实施方案中，该药学上可接受的载体还包括稀释剂、佐剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂或防腐剂。在一些实施方案中，该纳米颗粒是自组装纳米颗粒。在进一步的方面，提供了一种组合物，该组合物包含含有本文所公开的RNA的自组装纳米颗粒，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，纳米颗粒包封RNA。在其他实施方案中，纳米颗粒方便地或非共价地连接到RNA。

在进一步的实施方案中，提供了生产该组合物的方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文所公开的RNA与HKP接触，从而使RNA和HKP自组装成纳米颗粒，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。另外地或另选地，该方法包括使本文所公开的RNA与脂质接触，从而使RNA和脂质自组装成纳米颗粒，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，接触步骤在微流体混合器诸如NanoAssemblr Ignite中进行。

在另一方面，提供了一种用于以下项中的一者或多者的方法：(a)预防受试者患有有症状SARS-CoV-2感染，(b)在有需要的受试者中诱导对SARS-CoV-2的免疫应答，(c)在有需要的受试者中减少SARS-CoV-2或其S蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合，(d)治疗感染有SARS-CoV-2的受试者，或(e)在有需要的受试者中减少SARS-CoV-2病毒载量。该方法包括向该受试者施用以下项中的一者或多者：本文所公开的RNA或DNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体或本文所公开的组合物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一方面，提供了吸入系统，该吸入系统包括本文所公开的RNA或DNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体或本文所公开的组合物和雾化器，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在另一方面，提供了产生严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的方法。该方法包括在适用于表达S蛋白或其免疫原性片段的条件下培养如本文公开的细胞，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，本文的方法还包括分离S蛋白或其免疫原性片段。另选地或除此之外，可通过向受试者施用包含DNA和/或RNA的组合物来产生S蛋白或其免疫原性片段。

另外，提供了一种筛选候选药物的方法，该候选药物任选地在受试者中或在受试者的细胞上或在两者上减少或抑制SARS-CoV-2与其受体诸如ACE2的结合。该方法包括从本文所公开的RNA表达刺突(S)蛋白或其免疫原性片段，以及在存在或不存在候选药物或存在不同浓度的候选药物的情况下，测量表达的S蛋白或其免疫原性片段与SARS-CoV-2受体诸如ACE2之间的结合，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，与没有候选药物相比，在候选药物存在的情况下表达的S蛋白或其免疫原性片段与SARS-CoV-2受体之间的结合较少，表明候选药物降低或抑制了SARS-CoV-2与其受体的结合。在一些实施方案中，表达的S蛋白或其免疫原性片段与SARS-CoV-2受体之间结合的降低，而候选药物的浓度增加，表明候选药物降低或抑制了SARS-CoV-2与其受体的结合。

在又一方面，提供了选择编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的RNA的方法。该方法包括将RNA转导到细胞中，在适用于表达RNA的条件下培养细胞，并测量细胞分泌的IFN-α或IFN-β或两者，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该方法还包括：如果与编码野生型S蛋白或其免疫原性片段的RNA相比，没有IFN-α或IFN-β或两者的分泌，或IFN-α或IFN-β或两者的分泌较少，则选择该RNA。

还提供了用于如本文所述方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的组合物或本文所公开的吸入系统，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

附图说明

图1提供了用于在RL-007脂质中产生RNA的NanoAssemblr Ignite的代表性参数设置。通过混合终浓度6.25mM的SM-102、1.25mM的DSPC、4.815mM的胆固醇和0.1875mM的DMG-PEG2000(即，50:10:38:1.5摩尔比)来制备RL-007。将0.13mg/mL的mRNA以3:1(v/v)的比率与RL-007混合。

图2A至图2C提供了显示在用编码蓝色荧光蛋白并包含各种polyA尾(图2A，polyA40；和图2B，polyA 60)或不含polyA尾(图2C)的RNA转染的细胞中蓝色荧光蛋白表达的代表性图像。

图3提供了显示蓝色荧光蛋白表达的条形图，该表达由在编码蓝色荧光蛋白并包含不同UTR的RNA转染后的各个时间点(0小时、24小时、48小时、72小时、96小时和144小时)测量的荧光强度表示。左起第一组条代表使用β-球蛋白5'UTR获得的数据。左起第二组条代表使用本文所公开的SYS 5'UTR获得的数据。左起第三组条代表不使用5'UTR获得的数据。左起第四组条代表从空白对照组获得的数据。误差条表示3次重复的标准偏差。

图4显示了实施例9中详述的代表性IFN-α和IFN-βELISA结果。S WT代表野生型刺突蛋白。S RBD代表刺突受体结合蛋白。S2P代表包含K986P和V987P突变。S6P代表包含F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P的突变。UK代表在英国首次鉴定的α变体。SA代表在南非首次鉴定的β变体。GS代表序列优化的RNA(SEQ ID NO:54)。A549表示阴性对照A549肺癌上皮细胞。

图5A至图5B提供了如实施例9所示的IFN-αELISA的定量结果。图5A是标准曲线，而图5B提供了对应的计算。

图6A至图6B提供了如实施例9所示的IFN-βELISA结果的定量结果。图6A是标准曲线，而图6B提供了对应的计算。

图7示出了用SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020病毒攻击后免疫小鼠和未免疫小鼠的临床严重程度评分曲线。向组1中的小鼠施用PBS，组2的小鼠用mRNA RL-007 1μg/动物免疫，组3的小鼠用mRNA RL007 5μg/动物免疫，组4的小鼠在病毒攻击前用mRNA RL007 10μg/动物免疫。

图8A至图8D示出了经处理的小鼠的体重。图8A示出了未免疫小鼠和免疫小鼠的组平均体重。图8B示出了用SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020分离物(NCBI登录号：MT066156)病毒攻击后，未免疫小鼠和免疫小鼠的组平均体重。在NLS进行免疫后并且用SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020分离物病毒攻击后，组1至组4的小鼠体重。将每只个体小鼠的体重计算为在递送至NLS后测量的体重的百分比，以及在GMU进行病毒攻击前测量的体重的百分比。给出了每组小鼠的平均值和平均值的标准误差(SEM)。第1组—“C”代表对照的未免疫小鼠。图8C示出了用SARS-CoV-2B.1.1617.2δ变体进行病毒攻击之前，未免疫小鼠和免疫小鼠的组平均体重。图8D示出了用SARS-CoV-2B.1.1617.2δ变体进行病毒攻击之后，未免疫小鼠和免疫小鼠的组平均体重。m-Co是以低剂量(0.50μg/小鼠)和高剂量(5μg/小鼠)递送的对照疫苗。将非对照小鼠接种使用RL-007载体的RV-1730(在图8C和图8D中标记为“RNAImmune”)。

图9示出了用SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020(NCBI登录号：MT066156)病毒攻击后，组1至组4的小鼠的体温曲线。描绘了每组小鼠的平均值和平均值的标准误差(SEM)。向组1中的小鼠施用PBS，组2的小鼠用mRNA RL-007 1μg/动物免疫，组3的小鼠用mRNA RL0075μg/动物免疫，组4的小鼠在病毒攻击前用mRNA RL007 10μg/动物免疫。实验描述于实施例10中。

图10是Kaplan Meier曲线，示出了用SARS-CoV-2攻击的小鼠的存活率。向组1中的小鼠施用PBS，组2的小鼠用mRNA RL-007 1μg/动物免疫，组3的小鼠用mRNA RL007 5μg/动物免疫，组4的小鼠在病毒攻击前用mRNA RL007 10μg/动物免疫。实验描述于实施例10中。

图11A、图11B、图11C和图11D示出了使用噬菌斑减少中和滴定(PRNT)评估的针对SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020的小鼠血清滴定数据。中和滴度计算为最低稀释度的倒数，该最低稀释度导致噬菌斑形成单位(p.f.u.)相对于阴性对照血清减少超过50％(PRNT₅₀)或减少超过90％(PRNT₉₀)。图11A示出了第13天收集的初免免疫后小鼠血清的PRNT₅₀；图11B示出了第13天收集的初免免疫后小鼠血清的PRNT₉₀；图11C示出了第27天收集的加强免疫后小鼠血清的PRNT₅₀；图11D示出了第27天收集的加强免疫后小鼠血清的PRNT₉₀。符号和水平线分别代表每个样品的单个滴度和每组的平均滴度。血清滴度表示为Log₂稀释度的倒数。实验描述于实施例10中。

图12示出了在安乐死时收获的肺组织的组织病理学评分。组织病理学评分是总肺评分、间质性肺炎(pn)和血管套(Pervascular cuff)的图形表示，这些评分基于每组所涉及的肺的百分比(0＝无；1＝0％-25％；2＝26％-50％；3＝51％-75％；和4＝76％-100％)和(特定肺部病变：0＝无；1＝最小；2＝轻度；3＝中度；和4＝严重)的量表来评分。对SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020攻击后第3天指定安乐死的小鼠的一部分肺组织进行了肺组织中病毒滴度的分析。在病毒攻击后三(3)天，测定每组的五(5)只小鼠的肺组织中的病毒滴度。向第1组小鼠施用PBS对照(在图7中标识为“C”)。第2、3和4组小鼠分别用剂量为1μg/动物、5μg/动物、10μg/动物的RL007mRNA疫苗免疫。病毒滴度计算为p.f.u./mL。实验描述于实施例11中。

图13示出了用SARS-CoV-2攻击后13天收获的按图7所公开的方式处理的小鼠的代表性肺组织的组织病理学图像。以20倍放大倍数扫描每组代表性小鼠的H&E染色组织切片。向第1组小鼠施用PBS对照。第2、3和4组小鼠分别用剂量为1μg/动物、5μg/动物、10μg/动物的mRNA疫苗RL007免疫。左上：第1组，小鼠R24-101-010；右上：第2组，小鼠R24-101-013；左下：第3组，小鼠R24-101-023；右下：第4组，小鼠R24-101-034。实验描述于实施例11中。

图14示出了在加强后九周按图7所公开的方式处理的小鼠的Th-1和Th-2细胞因子测量。从每组5只小鼠中分离出脾细胞，并且用不含来自SARS-CoV-2S蛋白的肽或重叠肽库重新刺激。72小时后，通过离心收获培养上清液，并使用基于珠的11重TH1/TH2小鼠ProcartaPlex多重免疫测定(Thermo Fisher Scientific)测量分泌的Th1-细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2-细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)。用Luminex100/200系统测量荧光，并用ProcartaPlex Analyst 1.0软件(Thermo Fisher Scientific)分析。低于定量下限的均设定为零。**P＜0.01，***P＜0.001，并且****P＜0.0001(与PBS对照相比，未配对的学生t检验)。实验描述于实施例14中。

图15A、图15B和图15C示出了对脾细胞的IFN-γELISPOT分析。加强后9周，从每组5只小鼠中分离出脾细胞，然后将脾细胞(2×10⁵个细胞/96孔)铺板到小鼠IFN-γELISpot板(Mabtech)上，并用来自SARS-CoV-2δ刺突蛋白亚基S1和S2的重叠肽库进行离体重新刺激16小时。图15A示出了通过使用Cytation7拍摄和定量的图像。*P＜0.05，****P＜0.001。图15B是对用δ刺突蛋白亚基S1离体重新刺激的每2×10⁵个细胞的IFN-γ斑点进行定量的图。图15C是对用δ刺突蛋白亚基S2离体重新刺激的每2×10⁵个细胞的IFN-γ斑点进行定量的图。实验描述于实施例15中。

图16示出了使用流式细胞术对记忆T细胞进行的细胞因子分析。加强后九周，从每组5只小鼠中分离出脾细胞，并在蛋白质转运抑制剂混合物的存在下用不含来自SARS-CoV-2S蛋白的肽或重叠肽库重新刺激。按实施例16所示处理小鼠。16小时后，进行细胞内细胞因子染色(ICS)以定量CD4⁺和CD8⁺T细胞应答。没有肽存在时的细胞因子表达被视为背景，并从每个个体小鼠的S1和S2肽库测量的应答中减去。实验描述于实施例16中。

图17示出了针对不同变体刺突蛋白的RV-1730免疫血清的终点IgG滴度。RV-1730是根据实施例3制备的、包含SEQ ID NO:52的代表性RL-007mRNA疫苗制剂。SEQ ID NO:52包含SEQ ID NO:55所示的开放阅读框。RV-1730使用根据实施例3制备的RL-007载体。实验描述于实施例12中。

图18A和图18B示出了如实施例13所示的RV-1730免疫后第14天(图18A)和第35天(图18B)的针对SARS-CoV-2假病毒颗粒(PP)的中和抗体滴度。显示了针对以下的数据：巴西：γ变体，614D：野生型，UK：α变体，δ：δ变体，614G：D614G变体，SA：β变体假病毒颗粒。实验描述于实施例13中。

图19A至图19D示出了免疫小鼠血清对五组小鼠(G1、G2、G3、G4和G5)中不同SARS-CoV-2-PP感染的影响。x轴显示化合物浓度，并且Y轴显示相对的PP感染性。显示了614D-PP(图19A)、δ-PP(图19B)、奥密克戎-PP(图19C)、BA.2-PP(图19D)的数据。实验描述于实施例13中。

图20是在五组小鼠(G1、G2、G3、G4和G5)的假病毒中和测定中异源疫苗接种血清的IC₅₀(血清％)图。在第一剂和第二剂SARS-CoV-2mRNA疫苗免疫接种后，测量针对SARS-CoV-2假病毒颗粒的中和抗体滴度，这些假病毒颗粒包括野生型SARS-CoV-2、δSARS-CoV-2、奥密克戎BA.1SARS-CoV-2和奥密克戎BA.2SARS-CoV-2。小鼠接受第一和第二疫苗免疫剂量的RV-1730的组合，或本领域已知的SARS-CoV-2疫苗的组合，诸如可从Pfizer-BioNTech获得的BNT162b2，或可从Moderna获得的mRNA-1273。实验描述于实施例13中。

具体实施方式

定义

如将理解的，本文所用的章节或子章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制和/或分离所描述的主题。

应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以有所不同。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制，原因是本公开的范围仅由所附权利要求书限定。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但优选的方法、设备和材料是目前描述的。本文引用的所有技术和专利出版物均以引用方式全文并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本公开无权因在先公开而早于此类公开物。

除非另有说明，否则本公开的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook和Russell编著(2001年)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第3版；Ausubel等人编著(2007年)“Current Protocols in Molecular Biology”系列；“Methodsin Enzymology”系列，(Academic Press,Inc.，纽约)；MacPherson等人(1991年)“PCR 1：APractical Approach”(Oxford University Press的IRL Press)；MacPherson等人(1995年)“PCR 2:A Practical Approach”；Harlow和Lane编著(1999年)“Antibodies,ALaboratory Manual”；Freshney(2005年)“Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique”，第5版；Gait编著(1984年)“Oligonucleotide Synthesis”；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编著(1984年)“Nucleic Acid Hybridization”；Anderson(1999年)“Nucleic Acid Hybridization”；Hames和Higgins编著(1984年)“Transcription andTranslation”；“Immobilized Cells and Enzymes”(IRL Press(1986年))；Perbal(1984年)“A Practical Guide to Molecular Cloning”；Miller和Calos编著(1987年)“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides编辑(2003年)“Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells”；Mayer和Walker编辑(1987年)“Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology”(AcademicPress，伦敦)；Herzenberg等人编著(1996年)“Weir's Handbook of ExperimentalImmunology”；“Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual”，第3版(ColdSpring Harbor Laboratory Press(2002))；Sohail编著(2004年)“Gene Silencing byRNA Interference:Technology and Application”(CRC Press)；和Plotkin等人，Plotkin；“Human Vaccines”，第7版(Elsevier)。

如本说明书和权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括多个细胞，该多个细胞包括它们的混合物。

如本文所用，术语“包含”意在指化合物、组合物和方法包括列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义化合物、组合物和方法时，“基本上由……组成”应意指排除对组合具有任何基本意义的其他要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除例如来自分离和纯化方法的痕量污染物以及药学上可接受的载体、防腐剂等。“由……组成”应意指排除超过痕量要素的其他成分。由这些过渡术语中的每一者定义的实施方案都在本技术的范围内。

所有的数字符号(例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围)都是近似值，以1％、5％或10％的增量正向(+)或负向(-)变化。应当理解，尽管不总是明确地陈述，但所有数字符号前面均有术语“约”。还应理解，尽管不总是明确地陈述，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物是本领域已知的。

本文所用的术语“约”在涉及可测量值诸如量或浓度等时，意指涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。

如本文所用，本文所用的比较性术语，诸如高、低、增加、减少、降低或其任何语法上的变化，可指相对于参考物的某些变化。在一些实施方案中，这种变化可指比参考物高约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约1倍、或约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约6倍、或约7倍、或约8倍、或约9倍、或约10倍、或约20倍、或约30倍、或约40倍、或约50倍、或约60倍、或约70倍、或约80倍、或约90倍、或约100倍或更多倍。在一些实施方案中，这样的变化可指参考物的约1％、或约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约8％、或约0％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％或约99％。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及它们的子范围的组合。此外，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的情况可能发生或可能不发生，因此该描述包括该情况发生的情形和该情况不发生的情形。

如本文所用，“和/或”是指并涵盖相关的所列项目中一个或多个项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代形式(“或”)理解时缺少组合。

“大体上”或“基本上”意指几乎全部或完全，例如某一给定量的95％或更大。在一些实施方案中，“大体上”或“基本上”意指95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。

当用于描述对本文公开的任何组分、范围、剂型等的选择时，这些术语或“可接受的”、“有效的”或“足够的”意指所述组分、范围、剂型等适用于所公开的目的。

在一些实施方案中，组件名称中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”或类似术语用于区分和识别在名称上有特定一致性的多于一个组件。例如，“第一RNA”和“第二RNA”用于区分两个RNA。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，也称为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)或人冠状病毒2019(HCoV-19或hCoV-19)，是导致COVID-19(冠状病毒病2019)的病毒，该呼吸道疾病是造成COVID-19大流行的原因。

每个SARS-CoV-2病毒粒子直径为50–200纳米，包含线性、正义的单链RNA基因组(约30,000个碱基长)和四种结构蛋白，称为S(刺突)、E(包膜)、M(膜)和N(核衣壳)蛋白。N蛋白包含RNA基因组，并且S蛋白、E蛋白和M蛋白一起形成病毒包膜。冠状病毒S蛋白是糖蛋白，分为两个功能部分(S1和S2)。在SARS-CoV-2中，刺突蛋白是负责让病毒附着在宿主细胞膜上并与之融合的蛋白质；具体地，该蛋白的S1亚基催化附着，即S2亚基融合。研究表明，SARS-CoV-2对人细胞上的受体血管紧张素转化酶2(ACE2)具有足够的亲和力，可利用它们作为细胞进入机制。由跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)引发的初始刺突蛋白也被证明对于SARS-CoV-2的进入至关重要。宿主蛋白神经毡蛋白1(NRP1)可使用ACE2帮助病毒进入宿主细胞。在SARS-CoV-2病毒粒子附着于靶细胞后，细胞的TMPRSS2切开病毒的刺突蛋白，暴露出S2亚基中的融合肽和宿主受体ACE2。融合后，核内体在病毒粒子周围形成，将病毒粒子与宿主细胞的其余部分隔开。当核内体的pH降低时或当组织蛋白酶(即宿主半胱氨酸蛋白酶)切割核内体时，病毒粒子逃逸。然后病毒粒子将RNA释放到细胞中，并迫使细胞产生和散布病毒的拷贝，这些拷贝会感染更多的细胞。

在整个COVID-19大流行期间，SARS-CoV-2的遗传变体不断出现并在世界各地流行。在美国流行的B.1.1.7(α)、B.1.351(β)、B.1.617.2(δ)和P.1(γ)变体被分类为所关注的变体。还存在其他变体，诸如B.1.526(ι)、B.1.427(ε)、B.1.429(ε)、B.1.617(κ、δ)、B.1.525(η)和P.2(ζ)。因此，本文所用的术语“SARS-CoV-2”可指任何一种或多种或所有变体。在一些实施方案中，本文所用的SARS-CoV-2指在印度首次鉴定的δ变体。在进一步的实施方案中，SARS-CoV-2δ变体在编码S蛋白的基因中包含突变，这些突变导致S蛋白中下列氨基酸突变中的一者或多者：T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R或D950N。在一些实施方案中，该δ变体是包含K417N氨基酸突变的δ+变体。

患有SARS-CoV-2感染的受试者可能会出现一系列临床表现，从没有症状的无症状SARS-CoV-2感染到有危重疾病的有症状SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2感染可被分组为以下严重程度的疾病类别；然而，每个类别的标准可能会在临床指南和临床试验中重叠或变化，并且患者的临床状态可能会随着时间的推移而变化。当使用病毒学检测进行受试者SARS-CoV-2检测呈阳性时，但是没有表现出与有症状SARS-CoV-2感染一致的症状(例如，发烧、咳嗽、喉咙痛、不适、头痛、肌肉疼痛、恶心、呕吐、腹泻、味觉和嗅觉丧失)，即发生无症状或症状前SARS-CoV-2感染。根据美国国立卫生研究院的定义，当受试者表现出与SARS-CoV-2感染相关的轻度、中度、严重或危重疾病时，即发生有症状SARS-CoV-2感染。患有与SARS-CoV-2感染相关的轻度疾病的受试者表现出的症状包括但不限于发烧、咳嗽、喉咙痛、不适、头痛、肌肉疼痛、恶心、呕吐、腹泻、味觉和嗅觉丧失，但是没有呼吸短促、呼吸困难或胸部成像异常。患有与SARS-CoV-2感染相关的中度疾病的受试者在临床评估或成像期间显示出下呼吸道疾病的证据，并且在海平面的室内空气中的氧饱和度(SpO₂)≥94％。患有与SARS-CoV-2感染相关的严重疾病的受试者在海平面的室内空气中的SpO₂＜94％，动脉氧分压与吸入氧分数的比率(PaO₂/FiO₂)＜300mm Hg，呼吸频率＞30次呼吸/分钟，或者肺部浸润＞50％。患有与SARS-CoV-2感染相关的危重疾病的受试者出现呼吸衰竭、感染性休克和/或多器官功能障碍。

冠状病毒感染的症状包括但不限于：轻度症状，诸如疲劳、刺痛、手脚刺痛或麻木、头晕、意识模糊、脑雾、身体疼痛、寒战、食欲不振、恶心、呕吐、腹痛或不适、嗅觉丧失、味觉丧失、肌肉无力、畏光、腺病、头痛、咳嗽、干咳、呼吸短促、喉咙痛、下肢无力/麻木、腹泻、低血氧症、打喷嚏、流鼻涕或鼻后滴漏；严重症状，诸如使用呼吸机、高热、严重咳嗽、谵妄、癫痫发作、中风、系统性炎症、细胞因子风暴；以及其他症状，诸如发烧、腺样体肿胀、肺炎、支气管炎和呼吸困难。

冠状病毒诸如SARS-COV-2的病毒感染可通过本领域已知的可商购获得的检测来检测，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或可使用免疫测定。在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括使用本领域已知的检测来检测冠状病毒。在一个实施方案中，活性病毒感染是指正在进行的感染，其中病毒正在复制并产生新病毒。这种活性病毒感染可使用聚合酶链式反应(PCR)检测。适用于PCR的引物和探针的非限制性示例包括用于SARS-CoV-2的2019-nCoV CDC探针和引物试剂盒(BioSearch Technologies，目录号KIT-nCoV-PP1-1000)、2019-nCoV试剂盒、500次反应(Integrated DNA Technologies(IDT)，目录号10006606)和2019-nCoV试剂盒、1000次反应(Integrated DNA Technologies(IDT)，目录号10006770)。还参见www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html和www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/List-of-Acceptable-Commercial-Primers-Probes.pdf。用于进行此类检测的合适方案可在www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/virus-requests.html、www.fda.gov/media/134922/download、www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/processing-sputum-specimens.pdf、www.fda.gov/media/134922/download、www.fda.gov/media/134919/download、www.fda.gov/media/134922/download找到，最后一次访问日期为2021年8月10日。在一些实施方案中，基于检测抗体的COVID-19的诊断测定与本文所公开的那些诊断测定相结合，例如Lisboa Bastos M等人所讨论的那些(“Diagnostic accuracy ofserological tests for covid-19:systematic review and meta-analysis.”BMJ.2020年7月1日；370:m2516.doi:10.1136/bmj.m2516)。

其他可商购获得的检测包括但不限于下表中所列的那些检测。

用于SARS-CoV-2和COVID-19的可商购获得的检测

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基(也被称为残基)可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可以通过其他键例如酯键、醚键等连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸(包括甘氨酸，D和L光学异构体)、氨基酸类似物和肽模拟物。

如本文所用，术语“刺突蛋白”、“刺突糖蛋白”或“S蛋白”可互换使用，指从包膜病毒(诸如SARS-CoV-2)表面的脂双层突出的糖蛋白。在一些实施方案中，S蛋白指SARS-CoV-2的S蛋白。在进一步的实施方案中，本文所用的S蛋白或其等效物也指S蛋白变体(例如，天然存在的SARS-CoV-2变体的S蛋白，诸如δ变体)、S蛋白突变体(例如，本文所公开的突变的S蛋白)、S蛋白片段(诸如免疫原性片段)或其任何组合(诸如，用额外的突变工程化的天然存在的变体，或其片段)。

在一些实施方案中，本文所用的S蛋白包含S1多肽或S2多肽或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，本文所用的S蛋白是包含S1和S2两者、或基本上由其组成、或还进一步由其组成的前体蛋白。这种前体可通过组织蛋白酶L(CTSL)、跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)或弗林蛋白酶加工成S1和S2，产生成熟的S1和S2蛋白。在一些实施方案中，本文所用的S蛋白指包含成熟S1蛋白和成熟S2蛋白、或基本上由其组成、或还进一步由其组成的蛋白复合物。在其他实施方案中，本文所用的S蛋白指S1蛋白。在其他实施方案中，本文所用的S蛋白指S2蛋白。在一些实施方案中，前体蛋白包含SEQ ID NO:1所示的多肽或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，S1蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸(aa)13至aa 685中所示的多肽或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，S2蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸(aa)686至aa1273中所示的多肽或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，S2蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸(aa)816至aa 1273中所示的多肽或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。S蛋白或潜在基因的其他非限制性示例性序列可根据以下信息找到：Gene ID:43740568(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/43740568，最后一次访问日期为2021年8月1日)、NCBI Reference Sequence:NC_045512.2(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512.2/，最后一次访问日期为2021年8月1日)或UniProtKB/Swiss-Prot:P0DTC2(检索自www.uniprot.org/uniprot/P0DTC2，最后一次访问日期为2021年8月1日)，这些内容以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，S蛋白的片段(诸如免疫原性片段)包含S蛋白的受体结合结构域(RBD)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，受体结合结构域(RBD)指来自病毒的短免疫原性片段，该片段与特定内源性受体序列结合以进入靶细胞。在一些实施方案中，RBD是指“刺突”糖蛋白(S-结构域)的一部分，该部分需要与内源性受体相互作用以促进膜融合并递送至细胞质。在一些实施方案中，本文所用的RBD包含SEQ ID NO:1的aa 319至aa 541所示的多肽或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。

如本文所用，术语“血管紧张素转化酶2”或“ACE2”是指附着于任选地位于肠、肾、睾丸、胆囊和心脏的细胞膜上的酶。ACE2用作一些冠状病毒(包括HCoV-NL63、SARS-CoV和SARS-CoV-2)进入细胞的进入点。已知SARS-CoV-2刺突蛋白本身通过下调ACE2破坏上皮。在一些实施方案中，术语“ACE2”指人ACE2。该蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可根据以下信息找到：Gene Cards ID:GC0XM015494(检索自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝ACE2，最后一次访问日期为2021年8月1日)、HGNC:13557(检索自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#！/hgnc_id/13557，最后一次访问日期为2021年8月1日)、NCBI Entrez Gene:59272(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/59272，最后一次访问日期为2021年8月1日)、Ensembl:ENSG00000130234(检索自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary？g＝ENSG00000130234；r＝X:15494566-15607236，最后一次访问日期为2021年8月1日)、300335(检索自omim.org/entry/300335，最后一次访问日期为2021年8月1日)或UniProtKB/Swiss-Prot:Q9BYF1(检索自www.uniprot.org/uniprot/Q9BYF1，最后一次访问日期为2021年8月1日)，这些内容以引用方式并入本文。

如本文所用，术语“跨膜丝氨酸蛋白酶2”或“TMPRSS2”指包含II型跨膜结构域、A类受体结构域、清道夫受体富含半胱氨酸结构域和蛋白酶结构域的蛋白质。这种蛋白质通过蛋白水解裂解和激活病毒包膜糖蛋白，促进病毒进入宿主细胞。发现利用这种蛋白质进入细胞的病毒包括流感病毒和人类冠状病毒HCoV-229E、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2。在一些实施方案中，术语“TMPRSS2”指人TMPRSS2。该蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可根据以下信息找到：Gene Cards ID GC21M041464(检索自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝TMPRSS2，最后一次访问日期为2021年8月1日)、HGNC:11876(检索自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#！/hgnc_id/11876，最后一次访问日期为2021年8月1日)、NCBI Entrez Gene:7113(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7113，最后一次访问日期为2021年8月1日)、Ensembl:ENSG00000184012(检索自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary？g＝ENSG00000184012；r＝21:41464300-41531116，最后一次访问日期为2021年8月1日)、602060(检索自omim.org/entry/602060，最后一次访问日期为2021年8月1日)或UniProtKB/Swiss-Prot:O15393(检索自www.uniprot.org/uniprot/O15393，最后一次访问日期为2021年8月1日)，这些内容以引用方式并入本文。

如本文所用，术语“组织蛋白酶L”或“CTSL”是指作为肽酶C1家族成员的蛋白质，以及由二硫键连接的重链和轻链组成的二聚体，两者均由单一蛋白质前体产生。另外，该蛋白质还能裂解SARS-CoV-2刺突蛋白的S1亚基，这是病毒进入细胞所必需的。在一些实施方案中，术语“CTSL”指人CTSL。该蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可根据以下信息找到：Gene Cards ID GC09P087725(检索自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝CTSL，最后一次访问日期为2021年8月1日)、HGNC:2537(检索自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#！/hgnc_id/2537，最后一次访问日期为2021年8月1日)、NCBIEntrez Gene:1514(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1514，最后一次访问日期为2021年8月1日)、Ensembl:ENSG00000135047(检索自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary？g＝ENSG00000135047；r＝9:87724051-87731469，最后一次访问日期为2021年8月1日)、116880(检索自omim.org/entry/116880，最后一次访问日期为2021年8月1日)或UniProtKB/Swiss-Prot:P07711(检索自www.uniprot.org/uniprot/P07711，最后一次访问日期为2021年8月1日)，这些内容以引用方式并入本文。

如本文所用，术语“弗林蛋白酶”是指能够在RX(K/R)R(SEQ ID NO:50，(RKR或RRR))共有基序处切割的蛋白酶。它还通过在单碱基S1/S2切割位点RRAR(SEQ ID NO:48)处蛋白水解切割刺突蛋白而促进SARS-CoV-2感染。这种切割对于刺突蛋白介导的细胞间融合和进入人肺细胞至关重要。在一些实施方案中，术语弗林蛋白酶是指哺乳动物弗林蛋白酶诸如牛弗林蛋白酶，参见例如检索自www.uniprot.org/uniprot/Q28193的UniProtKBQ28193，最后一次访问日期为2021年8月10日。在一些实施方案中，术语“弗林蛋白酶”是指人弗林蛋白酶。该蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可根据以下信息找到：GeneCards ID GC15P090868(检索自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝FURIN，最后一次访问日期为2021年8月1日)、HGNC:8568(检索自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#！/hgnc_id/8568，最后一次访问日期为2021年8月1日)、NCBI EntrezGene:5045(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5045，最后一次访问日期为2021年8月1日)、Ensembl:ENSG00000140564(检索自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary？g＝ENSG00000140564；r＝15:90868588-90883564，最后一次访问日期为2021年8月1日)、136950(检索自omim.org/entry/136950，最后一次访问日期为2021年8月1日)或UniProtKB/Swiss-Prot:P09958(检索自www.uniprot.org/uniprot/P09958，最后一次访问日期为2021年8月1日)，这些内容以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，蛋白质的片段可以是免疫原性片段。如本文所用，术语“免疫原性片段”指这样的多肽片段，其至少部分地保留了其所来源的蛋白质的免疫原性。在一些实施方案中，免疫原性片段为至少约3个氨基酸(aa)长，或至少约4个aa长，或至少约5个aa长，或至少约6个aa长，或至少约7个aa长，或至少约8个aa长，或至少约9个aa长，或至少约10个aa长，或至少约15个aa长，或至少约20个aa长，或至少约25个aa长，或至少约30个aa长，或至少约35个aa长，或至少约40个aa长，或至少约50个aa长，或至少约60个aa长，或至少约70个aa长，或至少约80个aa长，或至少约90个aa长，或至少约100个aa长，或至少约120个aa长，或至少约150个aa长，或至少约200个aa长，或更长。在一些实施方案中，S蛋白的免疫原性片段包含S蛋白的RBD，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

如本文所用，目的序列中“对应于”参考序列中的鉴定位置的氨基酸(aa)或核苷酸(nt)残基位置是指在目的序列与参考序列之间的序列比对中，残基位置与鉴定位置对齐。各种程序可用于执行此类序列比对，诸如Clustal Omega和BLAST。在一方面，等效多核苷酸、蛋白质和对应序列可使用BLAST(可访问blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，最后一次访问日期为2021年8月1日)来确定。

如本文所用，氨基酸突变在本文是指被整数分隔的两个字母，诸如T19R。第一个字母提供了待突变的原始氨基酸残基的单字母代码；而最后一个字母提供突变，诸如指示缺失的Δ，或突变后的氨基酸残基的单字母代码。在一些实施方案中，整数是未发生突变的氨基酸序列中待突变氨基酸残基的编号，任选地从N末端到C末端计数。在一些实施方案中，整数是突变后的氨基酸序列中突变氨基酸残基的编号，任选地从N末端到C末端计数。在一些实施方案中，整数是SEQ ID NO:1中对应于(例如，比对于)待突变残基或突变残基或两者的氨基酸残基的编号。

除非另有说明，否则无需明确叙述即可推断，当本公开涉及多肽、蛋白质、多核苷酸时，其等效物或生物学等效物也在本公开的范围内。如本文所用，当提及参考蛋白质、多肽或核酸时，术语“其生物学等效物”意在与“其等效物”同义，指具有最小同源性同时仍保持所需结构或功能的蛋白质、多肽或核酸。除非本文特别列举，否则预期本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等效物。例如，等效物与参考蛋白、多肽或核酸具有至少约70％的同源性或同一性、或至少80％的同源性或同一性、或至少约85％的同源性或同一性、或另选地至少约90％的同源性或同一性、或另选地至少约95％的同源性或同一性、或另选地至少约96％的同源性或同一性、或另选地至少约97％的同源性或同一性、或另选地至少约98％的同源性或同一性、或另选地至少约99％的同源性或同一性(在一方面，如使用Clustal Omega比对程序所测定的)，并且表现出与参考蛋白、多肽或核酸基本上等效的生物活性。另选地，当提及多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。

参考多肽的等效物包含与参考多肽具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少约96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％的氨基酸同一性的多肽(在一方面，如使用Clustal Omega比对程序所测定的)，或由在高严格度条件下与编码参考多肽的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，基本上由其组成，或另选地由其组成，任选地其中高严格度条件包括：约55℃至约68℃的温育温度；约1×SSC至约0.1×SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。

在一些实施方案中，将第一序列(核酸序列或氨基酸)与第二序列进行比较，并且可以计算两条序列之间的同一性百分比。在进一步的实施方案中，第一序列在本文中可称为等效物，并且第二序列在本文可称为参考序列。在再进一步的实施方案中，基于第一序列的全长序列计算同一性百分比。在其他实施方案中，基于第二序列的全长序列计算同一性百分比。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的任何长度的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并可执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在多核苷酸组装之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另外指明或要求，否则本公开的任何实施方案，即多核苷酸，涵盖双链形式以及已知或预测构成该双链形式的两种互补单链形式中的每一种。

多核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；当多核苷酸为RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。这种字母表示可以输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，诸如功能基因组学和同源性搜索。

本文所用的术语“RNA”是指其在本领域普遍接受的含义。通常，术语“RNA”是指包含至少一个呋喃核糖核苷部分的多核苷酸。该术语可包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(诸如部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可以包括(例如在RNA的一个或多个核苷酸处)添加非核苷酸物质。核酸分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸(诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸)或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为类似物或天然存在的RNA的类似物。在一些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)。

“信使RNA”(mRNA)是指编码(至少一种)多肽(天然存在的、非天然存在的或经修饰的氨基酸聚合物)并且可以被翻译以在体外、体内、原位或离体产生编码的多肽的任何多核苷酸。在一些实施方案中，本文所公开的mRNA包含至少一个编码区、5'非翻译区(UTR)、3'UTR、5'帽子和poly-A尾，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。

疫苗接种是预防和控制疾病的最成功的医学方法。疫苗的成功开发和使用已经挽救了数千人的生命并节省了大量的资金。RNA疫苗的关键优势是可在实验室中使用容易获得的材料从DNA模板产生RNA，比可能需要使用鸡蛋或其他哺乳动物细胞的常规疫苗生产更便宜且更快。此外，mRNA疫苗具有简化疫苗发现和开发的潜力，并促进对出现的感染性疾病的快速应答(参见例如，Maruggi等人，Mol Ther.，2019年，第27卷第4期：第757-772页)。

临床前和临床试验已经表明，mRNA疫苗在动物模型和人中提供了安全且持久的免疫应答。针对感染性疾病的mRNA疫苗可以开发为预防性或治疗性疗法。表达感染性病原体抗原的mRNA疫苗已被证明能诱导有效的T细胞和体液免疫应答。参见例如，Pardi等人，NatRev Drug Discov.，2018；17:261-279.与全微生物、减毒活疫苗和亚单位疫苗的生产相比，生成mRNA疫苗的生产方法是无细胞的、简单且快速的。这种快速且简单的生产方法使得mRNA成为有前景的生物产物，其有可能填补新出现的感染性疾病和对有效疫苗的迫切需求之间的空白。

本文所用的关于核酸诸如DNA或RNA的术语“分离的”是指分别从大分子天然来源中存在的其他DNA或RNA分离的分子。术语“分离的核酸”意指包括不是作为片段天然存在的并且在天然状态下不存在的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白质分离的多肽、蛋白质和/或宿主细胞，并且意在包括纯化的和重组的多肽。在其他实施方案中，术语“分离的”意指从与细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽或蛋白质通常天然地关联的成分、细胞和其他物质分离。例如，分离的细胞是从具有不相似表型或基因型的组织或细胞分离的细胞。如本领域技术人员所显而易见的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽或蛋白质不需要“分离”以将其与其天然存在的对应物区分。

在一些实施方案中，术语“工程化的”或“重组的”是指具有通常不存在于天然存在的蛋白质、多肽、多核苷酸、菌株、野生型菌株或所提及物种的亲本宿主菌株中的至少一种修饰。在一些实施方案中，术语“工程化的”或“重组的”是指通过人类干预合成的。如本文所用，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码多肽的DNA插入到合适的表达载体中，该表达载体进而用于转化宿主细胞以产生异源蛋白。

如本文所用，“互补”序列是指这样的两条核苷酸序列，它们在彼此反向平行比对时含有多个相互配对的单独核苷酸碱基。核苷酸碱基的配对形成氢键，从而稳定由互补序列形成的双链结构。两条序列中的每一个核苷酸碱基都必须相互配对，才能被认为是“互补”的序列。例如，如果两条序列中至少30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的核苷酸碱基相互配对，则序列可被认为是互补的。在一些实施方案中，术语互补是指两条序列中100％的核苷酸碱基相互配对。此外，当两条序列的总长度彼此显著不同时，序列仍可被认为是“互补的”。例如，当15个核苷酸的引物与含有数百个核苷酸的较长多核苷酸的特定区域反向平行比对时，如果该引物的多个单独核苷酸碱基与该较长多核苷酸中的核苷酸碱基配对，则该引物可被认为与该较长多核苷酸“互补”。配对的核苷酸碱基是本领域已知的，诸如在DNA中，嘌呤腺嘌呤(A)与嘧啶胸腺嘧啶(T)配对，嘧啶胞嘧啶(C)总是与嘌呤鸟嘌呤(G)配对；而在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。此外，在两条互补序列中彼此反向平行比对但并非为一对的核苷酸碱基在本文称为错配。

“基因”是指含有至少一个开放阅读框(ORF)的多核苷酸，该多核苷酸能够在被转录和翻译后编码特定的多肽或蛋白质。

术语“表达”是指产生基因产物，诸如mRNA、肽、多肽或蛋白质。如本文所用，“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程或所转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。

“基因产物”，或另选地，“基因表达产物”是指当基因被转录和翻译时产生的氨基酸(例如肽或多肽)。在一些实施方案中，基因产物可以指当基因被转录时产生的mRNA或其他RNA，诸如干扰RNA。

当应用于多核苷酸时，术语“编码”是指，如果多核苷酸在其天然状态下或在通过本领域技术人员熟知的方法操作时可被转录以产生多肽或其片段的mRNA，并且任选地被翻译以产生多肽或其片段，则称该多核苷酸“编码”多肽。反义链是这种核酸的互补链，并且可由其推导编码序列。此外，如本文所用，氨基酸序列编码序列是指编码该氨基酸序列的核苷酸序列。

术语“化学修饰”和“经化学修饰的”是指针对腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷在其位置、模式、百分比或群体中的至少一个方面进行修饰。在一些实施方案中，该术语是指在天然存在的5'-末端mRNA帽子部分中的核糖核苷酸修饰。在进一步的实施方案中，化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，经化学修饰的核苷酸的掺入程度已被优化，以改善对疫苗制剂的免疫应答。在其他实施方案中，该术语不包括在天然存在的5'-末端mRNA帽子部分中的核糖核苷酸修饰。

在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括在多核苷酸合成期间或合成后引入以实现所需功能或性质的非天然修饰核苷酸。修饰可存在于核苷酸间键、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可用化学合成或用聚合酶在链的末端或链中的任何其他地方引入。多核苷酸的区域中的任一区域可被化学修饰。

在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的残基被本文所公开的一种或多种修饰化学修饰。在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的尿苷残基被本文所公开的一种或多种修饰化学修饰。

在一些实施方案中，本文所公开的RNA是“优化的”。在一些实施方案中，优化可用于使目标和宿主生物体中的密码子频率匹配以确保正确的折叠；偏重GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串(base run)最小化；自定义转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列(trafficking sequence)；在编码的蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点(例如糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译速率以使蛋白质的各个结构域正确折叠；或减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。

“3'非翻译区”(3'UTR)是指mRNA的位于终止密码子(即，mRNA转录物中发出翻译终止信号的密码子)的正下游(即，3')的不编码多肽的区域。在一些实施方案中，本文所用的3'UTR包含SEQ ID NO:18、22或24中的一者或多者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。

“5'非翻译区”(5'UTR)是指RNA的位于起始密码子(即，mRNA转录物中由核糖体翻译的第一密码子)的正上游(即，5')的不编码多肽的区域。在一些实施方案中，本文所用的5'UTR包含SEQ ID NO:20或26中的一者或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。

“polyA尾”是mRNA的位于3'UTR的下游，例如正下游(即3')，含有多个连续的单磷酸腺苷的区域。polyA尾可含有10个至300个单磷酸腺苷。另外地或另选地，在相关生物环境中(例如，在细胞中，在体内)，polyA尾具有保护mRNA免于酶促降解(例如在细胞质内)的功能，并协助转录终止、mRNA从细胞核运出和翻译。在一些实施方案中，本文所用的polyA尾包含SEQ ID NO:27、28或30中的一者或多者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。

体外转录(IVT)方法涉及几乎任何序列的RNA分子的模板导向合成。可以使用IVT方法合成的RNA分子的大小从短寡核苷酸到几千个碱基的长核酸聚合物不等。IVT方法允许合成大量的RNA转录物(例如，从微克到毫克量)(Beckert等人，Methods Mol Biol.，第703卷：第29-41页(2011年)；Rio等人，“RNA:ALaboratory Manual.”，Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2011年，第205-220页；和Cooper,Geoffery M.，“The Cell:A Molecular Approach.”，第4版，Washington D.C.:ASM Press，2007年，第262-299页)。通常，IVT利用具有目的序列上游的启动子序列的DNA模板。启动子序列最常见的是噬菌体来源(例如T7、T3或SP6启动子序列)，但也可以接受许多其他启动子序列，包括从头设计的启动子序列。DNA模板的转录通常最好通过使用对应于特异性噬菌体启动子序列的RNA聚合酶来实现。示例性RNA聚合酶包括但不限于T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶等。IVT通常起始于dsDNA，但可以在单链上进行。

应当理解，本文所公开的RNA可使用任何合适的合成方法制备。例如，在一些实施方案中，使用IVT从作为模板的单底链DNA和作为启动子的互补寡核苷酸来制备RNA。单底链DNA可作为RNA体外转录的DNA模板，并且可从例如质粒、PCR产物或化学合成获得。在一些实施方案中，从环形模板线性化单底链DNA。单底链DNA模板通常包括启动子序列，例如噬菌体启动子序列，以促进IVT。使用单底链DNA和顶链启动子互补寡核苷酸制备RNA的方法是本领域已知的。示例性方法包括但不限于，使DNA底链模板与顶链启动子互补寡核苷酸(例如，T7启动子互补寡核苷酸、T3启动子互补寡核苷酸或SP6启动子互补寡核苷酸)退火，然后使用对应于启动子序列的RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)进行IVT。

IVT方法也可使用双链DNA模板进行。例如，在一些实施方案中，通过使用本领域可用的链延伸技术延伸互补寡核苷酸以产生互补DNA链，来制备双链DNA模板。在一些实施方案中，使含有启动子序列和编码一个或多个目的表位的序列的单底链DNA模板与顶链启动子互补寡核苷酸退火，并进行类似PCR的过程以延伸顶链，从而产生双链DNA模板。另选地或另外地，使含有与底链启动子序列互补且与编码一个或多个目的表位的序列互补的序列的顶链DNA与底链启动子寡核苷酸退火，并进行类似PCR的过程以延伸底链，从而产生双链DNA模板。在一些实施方案中，类似PCR的循环的数目为1至20个循环，例如3至10个循环。在一些实施方案中，双链DNA模板完全或部分通过化学合成方法来合成。双链DNA模板可如本文所述进行体外转录。

“在转录控制下”(在本文中也用作“指导……的表达”)或其任何语法变体是本领域熟知的术语，并且表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录和任选的翻译取决于其与有助于转录起始或促进转录的元件的可操作性的连接。

“可操作地连接”是指多核苷酸以允许它们在细胞中起作用的方式排列。

本文所用的术语“调控序列”、“表达控制元件”或“启动子”意指可操作地连接到待转录或复制的靶多核苷酸并促进该靶多核苷酸的表达或复制的多核苷酸。

启动子是表达控制元件或调控序列的示例。启动子可以位于基因或其他多核苷酸的5'或上游，其提供调控基因转录的控制点。在一些实施方案中，本文所用的启动子对应于RNA聚合酶。在进一步的实施方案中，本文使用的启动子包含T7启动子、或SP6启动子或T3启动子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。WO2001009377A1中提供了合适的启动子的非限制性示例。

“RNA聚合酶”是指产生多核糖核苷酸序列的酶，其与预先存在的模板多核苷酸(DNA或RNA)互补。在一些实施方案中，RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶，任选地是T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶。合适的聚合酶的非限制性示例在US10526629B2中进一步详述。

在一些实施方案中，术语“载体”意指保留感染和转导非分裂细胞和/或缓慢分裂细胞并任选地整合到靶细胞的基因组中的能力的重组载体。载体的非限制性示例包括质粒、纳米颗粒、脂质体、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方案中，质粒载体可由可商购获得的载体制备。在其他实施方案中，病毒载体可根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等产生。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是质粒。在一个实施方案中，载体是纳米颗粒，任选地是聚合物纳米颗粒或脂质纳米颗粒。

既含有启动子又含有多核苷酸可以可操作地连接到其中的克隆位点的载体是本领域熟知的。此类载体能够在体外或体内转录RNA，并且可以从诸如Stratagene(美国加利福尼亚州拉荷亚)和Promega Biotech(威斯康星州麦迪逊)的来源商购获得。为了优化表达和/或体外转录，可能需要去除、添加或改变克隆的5'和/或3'非翻译部分，以消除额外的、潜在的不适当的翻译起始密码子或可能在转录或翻译水平干扰或降低表达的其他序列。另选地，可将共有核糖体结合位点直接插入起始密码子的5'以增强表达。

“质粒”是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在许多情况下，它是环状的和双链的。质粒提供了在微生物群体内水平基因转移的机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择性优势。质粒可以运载在竞争性环境生态位中提供对天然存在的抗生素的抗性的基因，或另选地，产生的蛋白质可以在类似的环境下作为毒素发挥作用。许多质粒可商购获得用于此类用途。将待复制的基因插入到质粒的拷贝中，该质粒含有使细胞对特定抗生素具有抗性的基因和多克隆位点(MCS或多接头)，该多克隆位点是含有若干个常用限制性位点的短区域，使得DNA片段便于在该位置插入。质粒的另一个主要用途是制备大量的蛋白质。在这种情况下，研究人员培养含有运载目的基因的质粒的细菌。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素抗性一样，它也可以被诱导以从插入的基因产生大量蛋白质。这是一种廉价且简单的大规模生产基因或其编码的蛋白质的方法。

“病毒载体”定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含将在体内、离体或体外递送至宿主细胞中的多核苷酸。如本领域技术人员所知，存在6类病毒。DNA病毒构成I类和II类。RNA病毒和逆转录病毒构成其余的类别。III类病毒具有双链RNA基因组。IV类病毒具有正单链RNA基因组，基因组本身用作mRNA。V类病毒具有用作mRNA合成的模板的负单链RNA基因组。VI类病毒具有正单链RNA基因组，但不仅在复制中而且在mRNA合成中都具有DNA中间体。逆转录病毒以RNA的形式运载其遗传信息；然而，一旦病毒感染细胞，RNA就被逆转录成DNA形式，该DNA形式被整合到感染细胞的基因组DNA中。所整合的DNA形式被称为原病毒。病毒载体的示例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等。甲病毒载体，诸如基于塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)的载体和基于辛德毕斯(Sindbis virus)病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见Schlesinger和Dubensky(1999年)Curr.Opin.Biotechnol.，第5卷：第434-439页和Ying等人(1999年)Nat.Med.，第5卷(第7期)：第823-827页。如本文所用，感染复数(MOI)是指在感染期间每个细胞添加的病毒颗粒的数量。

逆转录病毒诸如γ逆转录病毒和/或慢病毒包含(a)含有脂质和糖蛋白的包膜，(b)载体基因组，其为递送至靶细胞的RNA(通常为在5'末端包含帽子并且在3'末端包含两侧为LTR的polyA尾的二聚体RNA)，(c)衣壳，和(d)蛋白质，诸如蛋白酶。美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列有助于整合到靶细胞基因组中。该专利教导了每个逆转录病毒基因组包含被称为gag、pol和env的基因，这些基因编码毒粒蛋白和酶。这些基因两端的两侧是被称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是通过位于病毒基因组5'末端的psi序列发生的。LTR本身是相同的序列，可以分为三个元件，这三个元件被称为U3、R和U5。U3来源于RNA的3'末端独有的序列。R来源于RNA两端重复的序列，并且U5来源于RNA的5'末端独有的序列。这三个元件的大小可在不同的逆转录病毒中有很大的差异。对于病毒基因组，poly(A)添加(终止)的位点在右侧LTR中的R和U5之间的边界。U3含有前病毒的大部分转录控制元件，包括对细胞，并且在一些情况下对病毒转录激活蛋白有响应的启动子和多条增强子序列。

关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，该RT含有介导基因组复制的DNA聚合酶、相关RNase H和整合酶(IN)。

为了产生病毒载体颗粒，载体RNA基因组由编码其的DNA构建体在宿主细胞中表达。未被载体基因组编码的颗粒的组件由在宿主细胞中表达的另外的核酸序列(“包装系统”，其通常包括gag/pol和env基因中的一者或两者)以反式(trans)方式提供。产生病毒载体颗粒所需的一组序列可通过瞬时转染引入宿主细胞，或者它们可整合到宿主细胞基因组中，或者它们可以混合方式提供。所涉及的技术是本领域技术人员已知的。

本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指与该名称相关并且属于细小病毒科(Parvoviridae)依赖性细小病毒属(dependoparvovirus)的病毒类别的成员。已知该病毒的多种血清型适用于基因递送；所有已知的血清型可以感染来自各种组织类型的细胞。至少11种按顺序编号的AAV血清型是本领域已知的。用于本文公开方法的非限制性示例性血清型包括11种血清型中的任一种，例如AAV2、AAV8、AAV9或变体或合成血清型，例如AAV-DJ和AAV PHP.B。AAV颗粒包含三种主要病毒蛋白：VP1、VP2和VP3，另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一个实施方案中，AAV是指血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV PHP.B或AAV rh74。这些载体是可商购获得的，或者已经在专利或技术文献中描述过。

基因递送载体还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白-DNA复合物。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本文公开的方法中。除了将多核苷酸递送至细胞或细胞群之外，可以通过非限制性蛋白转染技术将本文所述的蛋白直接引入该细胞或细胞群，另选地，可以增强本文公开的蛋白的表达和/或促进其活性的培养条件是其他非限制性技术。

本文所用的术语“调控序列”、“表达控制元件”或“启动子”意指可操作地连接到待转录和/或复制的靶多核苷酸并促进该靶多核苷酸的表达和/或复制的多核苷酸。启动子是表达控制元件或调控序列的示例。启动子可以位于基因或其他多核苷酸的5'或上游，其提供调控基因转录的控制点。聚合酶II和III是启动子的示例。

聚合酶II或“pol II”启动子催化DNA的转录，以合成mRNA以及大多数shRNA和微RNA的前体。pol II启动子的示例是本领域已知的，并且包括但不限于磷酸甘油酸激酶(“PGK”)启动子；EF1-α；CMV(最小巨细胞病毒启动子)；以及来自逆转录病毒载体和慢病毒载体的LTR。

增强子是增加靶序列表达的调控元件。“启动子/增强子”是含有能够提供启动子和增强子两种功能的序列的多核苷酸。例如，逆转录病毒的长末端重复序列含有启动子和增强子两种功能。增强子/启动子可以是“内源”或“外源”或“异源”的。“内源”增强子/启动子是与基因组中的给定基因天然连接的增强子/启动子。“外源”或“异源”增强子/启动子是通过遗传操作(即，分子生物学技术)与基因并置的增强子/启动子，使得该基因的转录由连接的增强子/启动子指导。

“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应形成通过核苷酸残基的碱基之间的氢键稳定的复合物的反应。氢键可通过沃森-克里克碱基配对、霍格斯坦结合(Hoogsteinbinding)或任何其他序列特异性方式出现。复合物可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单条自杂交链或这些物质的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，诸如PCR反应的启动或核酶对多核苷酸的酶切。

杂交反应可在不同“严格度”的条件下进行。通常，低严格度杂交反应在约40℃下在10×SSC或相等离子强度/温度的溶液中进行。中等严格度杂交通常在约50℃下在6×SSC中进行，并且高严格度杂交反应通常在约60℃下在1×SSC中进行。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的非限制性示例为通常在细胞中存在的温度、离子强度、pH和Mg²⁺浓度。

严格杂交条件的示例包括：约25℃至约37℃的温育温度；约6×SSC至约10×SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及约4×SSC至约8×SSC的洗涤溶液。中等杂交条件的示例包括：约40℃至约50℃的温育温度；约9×SSC至约2×SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5×SSC至约2×SSC的洗涤溶液。高严格条件的示例包括：约55℃至约68℃的温育温度；约1×SSC至约0.1×SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。通常，杂交温育时间为5分钟至24小时，具有1个、2个或更多个洗涤步骤，并且洗涤温育时间为约1分钟、2分钟或15分钟。SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。应当理解，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。

当杂交以反向平行构型在两个单链多核苷酸之间发生时，反应被称为“退火”，并且这些多核苷酸被描述为“互补的”。如果杂交可以在第一多核苷酸的一条链和第二多核苷酸的一条链之间发生，则双链多核苷酸可以与另一多核苷酸“互补”或“同源”。“互补性”或“同源性”(一个多核苷酸与另一个多核苷酸互补的程度)可根据普遍接受的碱基配对规则就预期彼此形成氢键的相反链中的碱基比例定量。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较可出于比较的目的而被比对的每条序列中的位置来确定。当所比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列具有的匹配或同源位置数量的函数。“不相关”或“非同源”序列与本公开的序列中的一条序列具有小于40％的同一性，或另选地小于25％的同一性。在一些实施方案中，两个多肽或多核苷酸之间的同一性是根据它们的全长，或根据两者的较短序列，或根据两者的较长序列计算的。

多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一条序列具有一定百分比(例如70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指当比对时，在比较两条序列时，碱基(或氨基酸)的百分比相同。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域已知的软件程序来确定，例如Ausubel等人编著(2007年)“Current Protocols inMolecular Biology.”中所述的软件程序。优选地，使用默认参数进行比对。一种比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，程序为BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可参见以下互联网地址：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，最后一次访问日期为2021年8月1日。

在一些实施方案中，本文所公开的多核苷酸是RNA或其类似物。在一些实施方案中，本文所公开的多核苷酸是DNA或其类似物。在一些实施方案中，本文所公开的多核苷酸是DNA和RNA的杂交体或其类似物。

在一些实施方案中，参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物编码由参考物编码的相同序列。在一些实施方案中，参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物任选地在高严格度条件下与参考物、互补参考物、反向参考物或反向互补参考物杂交。

另外地或另选地，等效核酸、多核苷酸或寡核苷酸是与参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸具有至少70％序列同一性、或至少75％序列同一性、或至少80％序列同一性、或另选地至少85％序列同一性、或另选地至少90％序列同一性、或另选地至少92％序列同一性、或另选地至少95％序列同一性、或另选地至少97％序列同一性、或另选地至少98％序列、或另选地至少99％序列同一性的核酸，或者另选地，等效核酸在高严格度条件下与参考多核苷酸或其互补物杂交。在一方面，等效物必须编码相同的蛋白质或蛋白质的功能等效物，其任选地可以通过本文所述的一种或多种测定来鉴定。另外地或另选地，多核苷酸的等效物将编码与参考或亲代多核苷酸具有相同或相似功能的蛋白质或多肽。

术语“转导”是指将外源核苷酸序列导入细胞的过程。在一些实施方案中，这种转导通过病毒载体或非病毒载体进行。

“可检测标记”、“标记”、“可检测标志物”或“标志物”可互换使用，包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质(包括酶)。可检测标记也可连接到本文所述的多核苷酸、多肽、蛋白质或组合物。

如本文所用，术语“标记”或可检测标记意指可直接或间接检测的化合物或组合物，例如N末端组氨酸标签(N-His)、磁活性同位素(例如¹¹⁵Sn、¹¹⁷Sn和¹¹⁹Sn)、非放射性同位素(诸如¹³C和¹⁵N)、多核苷酸或蛋白质(诸如抗体)，其直接或间接地缀合至待检测的组合物以生成“标记的”组合物。该术语还包括与多核苷酸缀合的序列，其会在插入序列表达时提供信号，诸如绿色荧光蛋白(GFP)等。标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。标记可适用于小规模检测或更适用于高通量筛选。因此，合适的标记包括但不限于磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质(包括酶)。标记可以简单地检测，或者其可以被定量。简单检测的应答通常包括其存在仅被确认的应答，而定量的应答通常包括具有可定量的(例如，可以数值报告的)值(诸如强度、极化或其他性质)的应答。在发光或荧光测定中，可以使用与实际参与结合的检测组分结合的发光团或荧光团直接生成可检测的响应，或者使用与另一(例如，报告物或指示物)组分结合的发光团或荧光团间接生成可检测的响应。产生信号的发光标记的示例包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光响应通常包括发光信号的变化或出现。用于发光标记测定组分的合适方法和发光团是本领域已知的，并且例如描述于Haugland,Richard P.(1996年)“Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals”(第6版)。发光探针的示例包括但不限于水母发光蛋白和荧光素酶。

如本文所用，术语“免疫缀合物”包含与第二药剂缔合或连接的抗体或抗体衍生物，该第二药剂诸如细胞毒性剂、可检测药剂、放射性药剂、靶向性药剂、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、半合成抗体或多特异性抗体。

合适的荧光标记的示例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、茋、荧光黄、Cascade Blue^TM和德州红。其他合适的光学染料描述于Haugland,Richard P.(1996年)“Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals”(第6版)。

在一些实施方案中，荧光标记被官能化以促进共价连接到存在于细胞或组织的表面之中或之上的细胞组分，诸如细胞表面标志物。合适的官能团包括但不限于异硫氰酸酯基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤，所有这些都可用于将荧光标记连接到第二分子上。荧光标记的官能团的选择将取决于与接头、药剂、标志物或第二标记剂的连接位点。

如本文所用，纯化标记或标志物是指可用于纯化标记所缀合的分子或组分的标记，诸如表位标签(包括但不限于Myc标签、人流感血凝素(HA)标签、FLAG标签)、亲和标签(包括但不限于谷胱甘肽-S转移酶(GST)、多组氨酸(His)标签、钙调蛋白结合蛋白(CBP)或麦芽糖结合蛋白(MBP))或荧光标签。

“选择标志物”是指在选择性培养方案中生长的细胞的存活或生长所必需的蛋白质或编码该蛋白质的基因。典型的选择标志物包括编码赋予对选择性药剂(诸如抗生素、除草剂或其他毒素)的抗性的蛋白质的序列。选择标志物的示例包括赋予对抗生素(诸如壮观霉素、链霉素、四环素、氨苄西林、卡那霉素、G 418、新霉素、博来霉素、潮霉素、氨甲蝶呤、麦草畏、草铵膦或草甘膦)的抗性的基因。

术语“培养”是指细胞或生物体在各种培养基上或各种培养基中进行的体外或离体繁殖。应当理解，在培养物中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全相同(即，在形态学、遗传学或表型上)。

在一些实施方案中，本文所公开的细胞是真核细胞或原核细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是细胞系，诸如人胚肾293细胞(HEK 293细胞或293细胞)、293T细胞或a549细胞。

“宿主细胞”不仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境的影响在后代中发生，所以这种后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语的范围内。宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细胞系，诸如人胚肾293细胞(HEK 293细胞或293细胞)、293T细胞或a549细胞。

“真核细胞”包括除原核生物界之外的所有生命界。它们可以通过膜结合细胞核容易地区分。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或生物体，其细胞通过内膜和细胞骨架组织成复杂结构。最具特征性的膜结合结构是细胞核。除非特别列举，否则术语“宿主”包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性示例包括猿、犬、牛、猪、鼠、大鼠、禽、爬行类动物和人。

“原核细胞”通常缺乏细胞核或任何其他膜结合细胞器，并且被分成细菌和古细菌两个领域。另外，这些细胞没有染色体DNA，其遗传信息是在一个被称为质粒的环状环中。细菌细胞非常小，大约为动物线粒体的大小(直径约1-2μm，长10μm)。原核细胞有三种主要形状：杆状、球形和螺旋形。不同于真核生物那样经过复杂的复制过程，细菌细胞通过二分裂进行分裂。示例包括但不限于芽孢杆菌属细菌、大肠杆菌细菌和沙门氏菌属细菌。

“组合物”意在指活性剂与另一种惰性(例如可检测药剂或标记)或活性化合物或组合物(诸如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等)的组合，并且包括药学上可接受的载剂。

载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和其他寡糖；衍生糖，诸如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，它们可以单独或组合存在，单独或组合的含量以重量或体积计为1％-99.99％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。代表性氨基酸组分(其也可以起缓冲作用)包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也在本技术的范围内，其示例包括但不限于单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)和肌醇。

本文所公开的组合物可以是药物组合物。“药物组合物”意在包括活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物适用于体外、体内或离体诊断或治疗用途。

“药学上可接受的载体”是指可用于本文所公开的组合物中的任何稀释剂、赋形剂或载体。药学上可接受的载剂包括离子交换剂；氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白，诸如人血清白蛋白；缓冲物质，诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物；水、盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐；胶态二氧化硅；三硅酸镁；聚乙烯吡咯烷酮；基于纤维素的物质；聚乙二醇；羧甲基纤维素钠；聚丙烯酸酯；蜡；聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物；聚乙二醇；和羊毛脂。合适的药物载体描述于“Remington'sPharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Company，该领域的标准参考文献中。它们可以根据预期的施用形式(即口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等)，并依照常规的药物实践进行选择。

如本文所用，术语“赋形剂”是指与药物活性成分一起配制，为长期稳定、增加固体制剂体积的目的或为了使最终剂型中的活性成分具有治疗性增强(诸如促进药物吸收、降低粘度或增强溶解度)而加入的天然或合成物质。

根据本公开使用的组合物可以剂量单位形式包装，以便于施用和剂量均匀。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理学上分离的单位，每个单位含有经计算产生与其施用(即，适当的途径和方案)相关的期望响应的预定量的组合物。根据治疗次数和单位剂量，施用量取决于所需的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于从业人员的判断，并且对于每个个体是独特的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目标(症状缓解与治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在配制后，溶液以与剂量制剂相容的方式并以治疗或预防有效的量施用。制剂易于以各种剂型施用，诸如本文所述的可注射溶液的类型。

单位剂量、剂型或方案可根据给定多核苷酸、载体、细胞、组合物或试剂盒的IC50确定，用于中和针对SARS-CoV-2多肽或多核苷酸(优选SARS-CoV-2刺突蛋白)的活性。“IC50”是指50％抑制所需的多核苷酸、载体、细胞、组合物或试剂盒的浓度。另选地，可根据给定多核苷酸、载体、细胞、组合物或试剂盒的EC50确定有效量。“EC50”是指在体内获得50％最大中和作用所需的血浆浓度。

本文所用的组合意指组合物的各活性成分单独配制以组合使用，并且可以特定剂量或不以特定剂量单独包装。组合的活性成分可以同时或依次施用。

四支链组氨酸-赖氨酸(HK)肽聚合物H2K4b已被证明是大分子量DNA质粒的良好载体(Leng等人，Nucleic Acids Res，2005年；第33卷：第e40页)，但是是相对低分子量的siRNA的不良载体(Leng等人，J Gene Med，2005年；第7卷：第977-986页)。H2K4b的两种富含组氨酸的肽类似物，即H3K4b和H3K(+H)4b，被证明是siRNA的有效载体(Leng等人，J GeneMed，2005年；第7卷：第977-986页。Chou等人，Biomaterials，2014年；第35卷：第846-855页)，而H3K(+H)4b的有效性似乎略高(Leng等人，Mol Ther，2012年；第20卷：第2282-2290页)。此外，siRNA的H3K4b载体在体外和体内诱导细胞因子的程度显著高于H3K(+H)4bsiRNA多聚复合物(polyplex)(Leng等人，Mol Ther，2012年；第20卷：第2282-2290页)。合适的HK多肽描述于WO/2001/047496、WO/2003/090719和WO/2006/060182中，这些专利中的每一篇的内容整体并入本文。这些多肽具有赖氨酸主链(三个赖氨酸残基)，其中赖氨酸侧链ε-氨基基团和N-末端与各种HK序列偶联。HK多肽载体可通过本领域熟知的方法合成，包括例如固相合成。

发现这种组氨酸-赖氨酸肽聚合物(“HK聚合物”或“HKP”)作为mRNA载体出人意料地有效，并且它们可以单独或与脂质体组合使用以提供mRNA进入靶细胞的有效递送。与PEI和其他载体类似，最初的结果表明HK聚合物运载和释放核酸的能力不同。然而，因为HK聚合物可在肽合成仪上可再现地制备，所以它们的氨基酸序列可容易地改变，从而实现RNA结合和释放的精细控制，以及含有HK聚合物与RNA的多聚复合物的稳定性(Chou等人，Biomaterials，2014年；第35卷：第846-855页。Midoux等人，Bioconjug Chem，1999年；第10卷：第406-411页。Henig等人，Journal of American Chemical Society，1999年；第121卷：第5123-5126页)。当mRNA分子与一种或多种HKP载体混合时，组分自组装成纳米颗粒。

如本文所述，有利地，HK聚合物包含与三赖氨酸氨基酸核心连接的四条短肽支链。肽支链由组氨酸和赖氨酸氨基酸组成，呈不同的构型。这些组氨酸-赖氨酸肽聚合物(HK聚合物)的一般结构如式I所示，其中R表示肽支链，并且K为氨基酸L-赖氨酸。

在式I中，其中K为L-赖氨酸，并且R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为组氨酸-赖氨酸肽。在本发明的HK聚合物中，R_1-4支链可以相同或不同。当R支链“不同”时，该支链的氨基酸序列不同于聚合物中其他R支链中的每一条R支链。用于本发明的式I所示的HK聚合物中的合适的R支链包括但不限于以下R支链R_A-R_J：

R_A＝KHKHHKHHKHHKHHKHHKHK-(SEQ ID NO:38)

R_B＝KHHHKHHHKHHHKHHHK-(SEQ ID NO:39)

R_C＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK-(SEQ ID NO:40)

R_D＝kHHHkHHHkHHHHkHHHk-(SEQ ID NO:41)

R_E＝HKHHHKHHHKHHHHKHHHK-(SEQ ID NO:42)

R_F＝HHKHHHKHHHKHHHHKHHHK-(SEQ ID NO:43)

R_G＝KHHHHKHHHHKHHHHKHHHHK-(SEQ ID NO:44)

R_H＝KHHHKHHHKHHHKHHHHK-(SEQ ID NO:45)

R_I＝KHHHKHHHHKHHHKHHHK-(SEQ ID NO:46)

R_J＝KHHHKHHHHKHHHKHHHHK-(SEQ ID NO:47)

可用于mRNA组合物的特定HK聚合物包括但不限于其中R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者相同并选自R_A-R_J的HK聚合物(表1)。这些HK聚合物分别称为H2K4b、H3K4b、H3K(+H)4b、H3k(+H)4b、H-H3K(+H)4b、HH-H3K(+H)4b、H4K4b、H3K(1+H)4b、H3K(3+H)4b和H3K(1,3+H)4b。在这10个示例中的每一者中，大写字母“K”表示L-赖氨酸，并且小写字母“K”表示D-赖氨酸。与H3K4b相比，额外的组氨酸残基在支链序列中加下划线。HK聚合物的命名如下：

1)对于H3K4b，支链中的主要重复序列是-HHHK-(SEQ ID NO:49)，因此“H3K”是该名称的一部分；“4b”是指支链的数量；

2)在H3K4b及其类似物的每条支链中有四个-HHHK-(SEQ ID NO:49)基序；第一HHHK基序(SEQ ID NO:49)(“1”)最接近赖氨酸核心；

3)H3K(+H)4b是H3K4b的类似物，其中在H3K4b的第二HHHK基序(SEQ ID NO:49)(基序2)中插入一个额外的组氨酸；

4)对于H3K(1+H)4b和H3K(3+H)4b肽，在第一(基序1)和第三(基序3)基序中分别存在额外的组氨酸；

5)对于H3K(1,3+H)4b，在支链的第一和第三基序中都存在两个额外的组氨酸。

表1

聚合物	支链序列	序列标识符
			H2K4b	R_A＝KHKHHKHHKHHKHHKHHKHK-	(SEQ ID NO:38)
	4 3 2 1＝
			H3K4b	R_B＝KHHHKHHHKHHHKHHHK-	(SEQ ID NO:39)
H3K(+H)4b	R_C＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK-	(SEQ ID NO:40)
			H3k(+H)4b	R_D＝kHHHkHHHkHHHHkHHHk-	(SEQ ID NO:41)
H-H3K(+H)4b	R_E＝HKHHHKHHHKHHHHKHHHK-	(SEQ ID NO:42)
			HH-H3K(+H)4b	R_F＝HHKHHHKHHHKHHHHKHHHK-	(SEQ ID NO:43)
H4K4b	R_G＝KHHHHKHHHHKHHHHKHHHHK-	(SEQ ID NO:44)
			H3K(1+H)4b	R_H＝KHHHKHHHKHHHKHHHHK-	(SEQ ID NO:45)
H3K(3+H)4b	R_I＝KHHHKHHHHKHHHKHHHK-	(SEQ ID NO:46)
			H3K(1,3+H)4b	R_J＝KHHHKHHHHKHHHKHHHHK-	(SEQ ID NO:47)

可以进行本领域熟知的方法，包括凝胶阻滞测定、肝素置换测定和流式细胞术，以评估含有HK聚合物加脂质体的不同制剂在成功递送mRNA方面的性能。合适的方法描述于例如Gujrati等人，Mol.Pharmaceutics，第11卷：第2734-2744页(2014年)和等人，MolTher Nucleic Acids.，第7卷：第1-10页(2017年)。

也可以使用技术(Millipore Sigma)来检测细胞对mRNA的摄取。这些灵光(smart flare)是具有附着序列的珠子，当识别细胞中的RNA序列时，这些珠子产生可用荧光显微镜分析的荧光增加。

其他方法包括测量mRNA的蛋白质表达，例如，编码荧光素酶的mRNA可用于测量转染效率。参见例如，He等人(J Gene Med.，2021年2月；第23卷(第2期)：第e3295页)，其证明了使用荧光素酶模型HKP和脂质体制剂递送mRNA的有效性。

在如上所述的荧光素酶模型中，H3K(+H)4b和DOTAP(阳离子脂质)的组合在运载mRNA进入MDA-MB-231细胞的能力方面出人意料地具有协同作用(H3K(+H)4b/脂质体相对于脂质体，P＜0.0001)。该组合作为mRNA载体的有效性是单独的聚合物和阳离子脂质载体的约3倍和8倍。并非所有HK肽都表现出与DOTAP脂质的协同活性。例如，H3K4b和DOTAP的组合作为荧光素酶mRNA的载体的有效性比DOTAP脂质体低。除了DOTAP，可以与HK肽一起使用的其他阳离子脂质包括Lipofectin(ThermoFisher)、Lipofectamine(ThermoFisher)和DOSPER。

在如上所述的荧光素酶模型中，H3k(+H)4b的D-异构体(其中支链中的L-赖氨酸被D-赖氨酸取代)是最有效的聚合物载体(H3k(+H)4b相对于H3K(+H)4b，P＜0.05)。mRNA的D-异构体/脂质体载体的有效性分别是单独的H3k(+H)4b和脂质体载体的近4倍和10倍。尽管D-H3k(+H)4b/脂质组合比L-H3K(+H)4b/脂质组合的有效性略高，但该比较在统计学上并无差异。

H3K4b和H3K(+H)4b都可用作体外核酸的载体，参见例如Leng等人，JGene Med，2005年；第7卷：第977-986页；和Chou等人，Cancer Gene Ther，2011年；第18卷：第707-716页。尽管有这些先前的发现，H3K(+H)4b在荧光素酶模型中作为mRNA载体明显优于其他类似物(表2)。

表2

尤其在不同重量比(HK:mRNA)条件下，其mRNA转染效率均高于H3K4b。在4:1的比例下，MDA-MB-231细胞中H3K(+H)4b的荧光素酶表达是H3K4b的10倍高，无明显的细胞毒性。此外，由于H3K4b和H3K(+H)4b中组氨酸的百分比(按重量计)分别为68.9％和70.6％，缓冲能力似乎不是它们转染差异的重要因素。

凝胶阻滞测定显示HK聚合物延迟了mRNA的电泳迁移率。肽与mRNA重量比越高，阻滞效应越强。然而，在2:1的比例下，H3K(+H)4b完全阻滞mRNA，而H3K4b未完全阻滞mRNA。这表明H3K(+H)4b可形成更稳定的多聚复合物，这有利于其成为mRNA递送的合适载体的能力。

用肝素置换测定进一步证实H3K(+H)4b肽更紧密地结合mRNA。将各种浓度的肝素加入到由mRNA和HK形成的多聚复合物中，并观察到，特别是在较低肝素浓度下，H3K4b聚合物比H3K(+H)4b聚合物更容易释放mRNA。这些数据表明H3K(+H)4b能结合mRNA并比H3K4b形成更稳定的多聚复合物。

利用青色素-5标记的荧光素酶mRNA，使用流式细胞术比较MDA-MB-231细胞对H3K4b和H3K(+H)4b多聚复合物的摄取。在不同的时间点(1小时、2小时和4小时)，H3K(+H)4b多聚复合物比H3K4b多聚复合物更有效地被导入细胞。与这些结果相似，荧光显微镜显示，位于酸性内体小泡中的H3K(+H)4b多聚复合物明显多于H3K4b多聚复合物(H3K4b相对于H3K(+H)4b，P＜0.001)。有趣的是，不与细胞内小泡重叠的不规则形状的H3K4b多聚复合物可能是胞外的，并且未观察到H3K(+H)4b多聚复合物。

已知HK聚合物和阳离子脂质(即DOTAP)均显著且独立地增加质粒转染。参见例如，Chen等人，Gene Ther，2000年；第7卷：第1698-1705页。因此，研究了这些脂质与HK聚合物一起是否增强了mRNA转染。值得注意的是，H3K(+H)4b和H3k(+H)4b载体是比DOTAP脂质体显著更好的mRNA载体。H3K(+H)4b和DOTAP脂质的组合在运载mRNA进入MDA-MB-231细胞的能力方面具有协同作用。该组合作为mRNA载体的有效性分别是单独的聚合物和脂质体载体的约3倍和8倍(H3K(+H)4b/脂质相对于脂质体或H3K(+H)4b)。值得注意的是，并非所有HK肽都表现出与DOTAP脂质的活性提高。H3K4b和DOTAP载体的组合作为荧光素酶mRNA的载体的有效性比DOTAP脂质体低。发现DOTAP和H3K(+H)4b载体的组合在它们运载mRNA进入细胞的能力方面是协同的。参见例如，He等人，J Gene Med.，2020年11月10日：第e3295页。

在一些实施方案中，载体诸如NKP纳米颗粒还包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质是可电离的阳离子脂质，并且非阳离子脂质是中性脂质，并且固醇是胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。

在一些实施方案中，载体是脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，LNP具有约50nm至约200nm的平均直径。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒载体/制剂通常包含脂质，特别是可电离的阳离子脂质，例如本文所公开的SM-102、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)或二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，LNP载体/制剂还包含中性脂质、固醇(诸如胆固醇)和能够降低颗粒聚集的分子，例如PEG或PEG修饰的脂质(本文也称为聚乙二醇化脂质(PEGylated lipid))。另外的示例性脂质纳米颗粒组合物和其制备方法描述于例如Semple等人(2010年)Nat.Biotechnol.，第28卷：第172-176页；Jayarama等人(2012年)Angew.Chem.Int.Ed.，第51卷：第8529-8533页；和Maier等人(2013年)MolecularTherapy，第21卷：第1570-1578页，这些文献中的每一篇的内容通过引用方式全文并入本文。

在一个实施方案中，本文所用的术语“疾病”或“病症”是指SARS-CoV-2感染、诊断患有SARS-CoV-2感染的状态、疑似患有SARS-CoV-2感染的状态或处于患有SARS-CoV-2感染的高风险中的状态。在一个实施方案中，本文所用的术语“疾病”或“病症”是指有症状SARS-CoV-2感染、诊断患有有症状SARS-CoV-2感染的状态、疑似患有有症状SARS-CoV-2感染的状态或处于患有有症状SARS-CoV-2感染的高风险中的状态。

在一个实施方案中，本文所用的术语“疾病”或“病症”是指COVID-19、诊断患有COVID-19的状态、疑似患有COVID-19的状态或处于患有COVID-19的高风险中的状态。在一个实施方案中，本文所用的术语“疾病”或“病症”是指有症状COVID-19、诊断患有有症状COVID-19的状态、疑似患有有症状COVID-19的状态或处于患有有症状COVID-19的高风险中的状态。

如本文所用，术语“动物”是指活的多细胞脊椎动物生物体，即包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、猕猴等)、家养动物(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、蝙蝠、大鼠、兔、豚鼠)。

术语“受试者”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指动物，通常指哺乳动物。任何合适的哺乳动物都可通过本文所述的方法进行治疗。哺乳动物的非限制性示例包括人、非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、猕猴等)、家养动物(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、蝙蝠、兔、豚鼠)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者患有或被诊断患有或疑似患有疾病。

如本文所用，受试者的疾病的“治疗”是指(1)防止症状或疾病发生于易患或尚未表现出疾病症状的受试者；(2)抑制疾病或阻止其发展；或(3)改善或引起疾病或疾病症状的消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益或期望的结果可包括一种或多种，但不限于，一种或多种症状的缓解或改善、病症(包括疾病)程度的减轻、病症(包括疾病)状态的稳定(即，不恶化)、病症(包括疾病)的延迟或减缓、进展、病症(包括疾病)的改善或缓和、状态和缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。在一方面，治疗不包括预防。

在一些实施方案中，如本文所用，术语“治疗”意指改善疾病，以便减轻、改善或消除其病因、其进展、其严重性或其症状中的一种或多种症状，或以其他方式有益地改变受试者的疾病。提及患者的“治疗”意在包括预防。治疗本质上也可以是先占的，即，治疗可包括预防暴露于疾病或处于疾病风险中的受试者的疾病。疾病的预防可涉及完全防止疾病，例如在预防病原体感染的情况下，或者可涉及预防疾病进展。例如，疾病的预防可能并不意味着在任何水平上完全排除与疾病相关的任何影响，而是可能意味着预防疾病的症状到临床显著的水平或可检测的水平。疾病的预防还可指预防疾病进展到疾病的晚期阶段。

“免疫应答”广义上是指淋巴细胞对外来物质的抗原特异性应答。术语“免疫原”和“免疫原性的”是指具有引发免疫应答能力的分子。所有免疫原都是抗原，但不是所有抗原都是免疫原性的。本文公开的免疫应答可以是体液(通过抗体活性)或细胞介导的(通过T细胞活化)。该应答可以在体内或体外发生。本领域技术人员将理解，多种大分子(包括蛋白质、核酸、脂肪酸、脂质、脂多糖和多糖)具有免疫原性的潜力。技术人员还将理解，编码能够引发免疫应答的分子的核酸必然编码免疫原。技术人员还将理解，免疫原不限于全长分子，还可包括部分分子。

如本文所用，“病毒载量”，在一些实施方案中也称为“病毒负荷”、“病毒滴度”、“病毒水平”或“病毒表达”，是病毒感染的严重程度的量度，并且可通过估计受感染生物体、相关体液或生物样品中的病毒量来计算。

如本文所用，生物样品或样品从受试者获得。示例性样品包括但不限于细胞样品、组织样品、活检组织、液体样品诸如血液和生物来源的其他液体样品，包括但不限于前鼻拭子、眼部液体(房水和玻璃体液)、外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper'sfluid)或预射精液、女性潮射液、汗液、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、腹水、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕液、阴道分泌物/冲洗液、滑液、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液或脐带血。

在一些实施方案中，样品可以是上呼吸道样本，诸如鼻咽(NP)样本、口咽(OP)样本、鼻中鼻甲拭子、鼻前孔(鼻拭子)样本、或鼻咽洗液/抽吸物或鼻洗液/抽吸物(NW)样本。

在一些实施方案中，样品包括来自受试者的流体，包括但不限于血液或血液制品(例如，血清、血浆等)、脐带血、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如，支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜)、女性生殖道的洗液、尿液、粪便、痰液、唾液、鼻粘液、前列腺液、灌洗液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、母乳、乳腺液等或它们的组合。在一些实施方案中，液体生物样品是血浆或血清样品。本文所用的术语“血液”是指来自受试者的血液样品或制剂。该术语涵盖全血、血液制品或血液的任何级分，诸如常规定义的血清、血浆、血沉棕黄层等。在一些实施方案中，术语“血液”是指外周血。血浆是指用抗凝剂处理的血液离心所得的全血级分。血清是指在血液样品凝固之后剩余的流体的水样部分。流体样品通常根据医院或诊所通常遵循的标准方案来收集。对于血液，通常收集适量的外周血(例如，3毫升至40毫升)，并且可在制备之前或之后根据标准方法储存。

术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的物质或混合物。作为非限制性示例，佐剂可包括双十八烷基二甲基溴化铵、双十八烷基二甲基氯化铵、双十八烷基二甲基磷酸铵或双十八烷基二甲基乙酸铵(DDA)和分枝杆菌的总脂质提取物的非极性级分或所述非极性级分的一部分(参见例如，US 8,241,610)。在另一个实施方案中，合成的纳米载体可包含至少一种多核苷酸和佐剂。作为非限制性示例，包含多核苷酸和佐剂的合成性纳米载体可通过WO2011150240和US20110293700中描述的方法配制，这些专利中的每一篇通过引用方式全文并入本文。

术语“接触”意指两者或更多者之间的直接或间接结合或相互作用。直接相互作用的具体示例是结合。间接相互作用的具体示例是一个实体作用于中间分子，该中间分子进而作用于第二个提及的实体。本文所用的接触包括溶液中、固相中、体外、离体、细胞中和体内。体内接触可称为施用。

多核苷酸、载体、细胞或载体或其他药剂以及含有细胞或载体或其他药剂的组合物的“施用”或“递送”可在整个治疗过程中以一个剂量连续地或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而变化。可进行单次或多次施用，其中剂量水平和模式由治疗医师选择，或者在动物的情况下，由治疗兽医选择。在一些实施方案中，施用或其语法上的变化也指具有特定间隔的多于一个剂量。在一些实施方案中，该间隔是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或更长。在一些实施方案中，一个剂量重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。合适的剂量制剂和施用药剂的方法是本领域已知的。还可确定施用途径，并且确定最有效的施用途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的、治疗的受试者的健康状况或疾病阶段和靶细胞或组织而变化。施用途径的非限制性示例包括吸入、肌内施用、鼻腔施用、口服施用、腹膜内施用、输注、注射和局部施用。在优选的实施方案中，施用途径是吸入或肌内施用。在一些实施方案中，施用是在特定时间段内输注(例如至受试者的外周血)，该特定时间段诸如约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时或更长。

术语“施用”应包括但不限于通过口服、肠胃外(例如，肌内、腹膜内、静脉内、脑室内(ICV)、鞘内、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)、通过吸入喷雾、鼻腔、阴道、直肠、舌下、尿道(例如，尿道栓剂)或局部施用途径(例如，凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等)施用，并且可单独或一起配制成含有常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂和适合于每种施用途径的媒介物的合适的剂量单位制剂。本公开不受施用途径、制剂或给药方案限制。

在一些实施方案中，本文所公开的RNA、多核苷酸、载体、细胞或组合物以有效量施用。“有效量”是足以产生有益或期望结果的量。有效量可在一次或多次施用、应用或给药中施用。此类递送取决于许多变量，包括使用单个剂量单位的时间、治疗剂的生物利用度、施用途径等。然而，应当理解，本文所公开的治疗剂对于任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，这些因素包括所采用的具体药剂的活性，药剂的生物利用度，施用途径，动物的年龄及其体重，动物的一般健康、性别、饮食，施用时间，排泄速率，药物组合以及治疗的特定病症的严重程度和施用形式。通常，人们将希望施用特定量的药剂，该特定量能有效达到与体内发现有效的浓度相当的血清水平。这些考虑以及有效的制剂和施用方法是本领域熟知的，并且描述于标准教科书中。

如本文所用，术语“RL-007”和“RL007”指通过混合终浓度为6.25mM的SM-102、1.25mM的DSPC、4.815mM的胆固醇和0.1875mM的DMG-PEG2000(即，50:10:38:1.5的摩尔比)制备的脂质纳米颗粒制剂或混合物。术语“RL-007疫苗”、“RL007疫苗”、“RL-007mRNA疫苗”或“RL007 mRNA疫苗”指包含RL-007载体、或另选地基本上由其组成、或还进一步由其组成的疫苗。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包含RL-007，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

实施本公开的模式

RNA

本文的公开内容提供了编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其片段(诸如免疫原性片段)的核糖核酸(RNA)或DNA。S蛋白或片段包含至少一个非天然存在的氨基酸突变，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，该片段或免疫原性片段包含S蛋白或其等效物的受体结合结构域(RBD)(诸如对应于(例如，比对于)SEQ ID NO:1的aa 319至aa 541的片段)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，受体结合结构域(RBD)指来自病毒的短免疫原性片段，该片段与特定内源性受体序列结合以进入靶细胞。在一些实施方案中，RBD是指“刺突”糖蛋白的一部分，该部分需要与内源性受体相互作用以促进膜融合并递送至细胞质。在一些实施方案中，本文所用的RBD包含SEQ ID NO:1的aa 319至aa 541所示的多肽或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该片段或免疫原性片段为至少约5个氨基酸长，或至少约8个氨基酸长，或至少约10个氨基酸长，或至少约15个氨基酸长，或至少约20个氨基酸长，或至少约25个氨基酸长，或至少约30个氨基酸长，或至少约40个氨基酸长，或至少约50个氨基酸长，或至少约60个氨基酸长，或至少约70个氨基酸长，或至少约80个氨基酸长，或至少约100个氨基酸长，或至少约125个氨基酸长，或至少约150个氨基酸长，或至少约160个氨基酸长，或至少约170个氨基酸长，或至少约180个氨基酸长，或至少约190个氨基酸长，或至少约200个氨基酸长，或至少约250个氨基酸长，或至少约300个或更长；并且任选地包含S蛋白的RBD或其等效物、基本上由其组成或还进一步由其组成。。免疫原性片段可用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答，或者减少或抑制SARS-CoV-2与其受体诸如ACE2的结合，或两者，并且非免疫原性片段可用作本文提供的测定中的对照。

在一些实施方案中，该至少一个非天然存在的氨基酸突变包含弗林蛋白酶样切割位点中的突变，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，弗林蛋白酶样切割位点包含RRAR(SEQ ID NO:48)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在再进一步的实施方案中，本文所公开的S蛋白或其片段中的弗林蛋白酶样切割位点对应于(例如，比对于)SEQ ID NO:1的氨基酸(aa)682至aa 685。在一些实施方案中，该至少一个非天然存在的氨基酸突变包含以下项中的一者或多者，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成：作为与SEQ ID NO:1的R682对应的氨基酸的丝氨酸(S)(R682S)、作为与SEQ ID NO:1的R683对应的氨基酸的S(R683S)、作为与SEQ ID NO:1的R685对应的氨基酸的甘氨酸(G)(R685G)、作为与SEQ ID NO:1的R682对应的氨基酸的G(R682G)。在一些实施方案中，该至少一个非天然存在的氨基酸突变包含R682S和R685G，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，突变的弗林蛋白酶样切割位点稳定本文所公开的S蛋白或其片段。

另外地或另选地，该至少一个非天然存在的氨基酸突变包含作为与以下对应的氨基酸的脯氨酸(P)：SEQ ID NO:1的F817(F817P)、SEQ ID NO:1的A892(A892P)、SEQ ID NO:1的A899(A899P)、SEQ ID NO:1的A942(A942P)、SEQ ID NO:1的K986(K986P)或SEQ ID NO:1的V987(V987P)中的任一者或多者(诸如，任何两者、或任何三者、或任何四者、或任何五者、或所有六者)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该至少一个非天然存在的氨基酸突变包含K986P和V987P，或另选地基本上由其组成，还进一步由其组成。这两个突变在本文中称为S2P。在一些实施方案中，该至少一个非天然存在的氨基酸突变包含F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P，或另选地基本上由其组成，还进一步由其组成。这六个突变在本文中称为“S-HexaPro”或“S6P”。在一些实施方案中，包含S2P或S6P突变的S蛋白或片段(诸如其免疫原性片段)与没有S2P或S6P突变的那些相比具有一种或多种以下性质：体内或体外或两者的表达水平增加；较高的稳定性，诸如室温、加热下或冻融后的稳定性；或保持蛋白质构象。

在一些实施方案中，该至少一个非天然存在的氨基酸突变包含以下项中的一者或多者，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成：作为与SEQ ID NO:1的R682对应的氨基酸的丝氨酸(S)(R682S)、作为与SEQ ID NO:1的R685对应的氨基酸的甘氨酸(G)(R685G)、作为与SEQ ID NO:1的F817对应的氨基酸的脯氨酸(P)(F817P)、作为与SEQ IDNO:1的A892对应的氨基酸的P(A892P)、作为与SEQ ID NO:1的A899对应的氨基酸的P(A899P)、作为与SEQ ID NO:1的A942对应的氨基酸的P(A942P)、作为与SEQ ID NO:1的K986对应的氨基酸的P(K986P)或作为与SEQ ID NO:1的V987对应的氨基酸的P(V987P)。

不希望受理论的束缚，S蛋白或其片段包含突变的弗林蛋白酶样切割位点，并且S2P或S6P突变显示出优于不含这些突变的那些、或仅包含突变的弗林蛋白酶样切割位点的那些、或仅包含S2P或S6P的那些的优点(诸如，体内和体外更高的表达水平，或更好的稳定性，或两者)。在一些实施方案中，包含两个突变组的优点是协同的。

在一些实施方案中，S蛋白或其片段来源于天然存在的SARS-CoV-2变体，诸如α变体、β变体、δ变体或γ变体。例如，可将本文所公开的至少一个非天然存在的氨基酸突变工程化为S蛋白变体或其片段，诸如α变体、β变体、δ变体或γ变体，从而得到突变的S蛋白或其片段。

在进一步的实施方案中，S蛋白或其片段来源于嵌合SARS-CoV-2S蛋白。嵌合S蛋白包含第一天然存在的S变体，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成，该第一天然存在的S变体的一个或多个氨基酸或连续片段被第二天然存在的S变体的对应氨基酸或连续片段取代。

在一些实施方案中，S蛋白或其片段还包含在天然存在的SARS-CoV-2变体(诸如δ变体)中发现的一种或多种突变。在一些实施方案中，该一个或多个突变包括以下项中的一者或两者，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成：作为与SEQ ID NO:1的N440对应的氨基酸的赖氨酸(K)(N440K)，或作为与SEQ ID NO:1的E484对应的氨基酸的K(E484K)。另外地或另选地，该一个或多个突变包括以下项，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成：作为与SEQ ID NO:1的T19对应的氨基酸的精氨酸(R)(T19R)、作为与SEQ ID NO:1的V70对应的氨基酸的苯丙氨酸(F)(V70F)、作为与SEQ ID NO:1的T95对应的氨基酸的异亮氨酸(I)(T95I)、作为与SEQ ID NO:1的G142对应的氨基酸的天冬氨酸(D)(G142D)、作为与SEQ ID NO:1的E156对应的缺失(E156Δ)、作为与SEQ ID NO:1的F157对应的缺失(F157Δ)、作为与SEQ ID NO:1的R158对应的氨基酸的G(R158G)、作为与SEQ ID NO:1的A222对应的氨基酸的缬氨酸(V)(A222V)、作为与SEQ ID NO:1的W258对应的氨基酸的亮氨酸(L)(W258L)、作为与SEQ ID NO:1的K417对应的氨基酸的天冬酰胺(N)(K417N)、作为与SEQ IDNO:1的K417对应的氨基酸的R(L452R)、作为与SEQ ID NO:1的T478对应的氨基酸的K(T478K)、作为与SEQ ID NO:1的D614对应的氨基酸的G(D614G)、作为与SEQ ID NO:1的P681对应的氨基酸的R(P681R)或作为与SEQ ID NO:1的D950对应的氨基酸的N(D950N)。在一些实施方案中，该一个或多个突变包括T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该一个或多个突变包括T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G和D950N，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该一个或多个突变包括T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该一个或多个突变包括T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、N440K、L452R、T478K、E484K、D614G、P681R和D950N，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，S蛋白包含SEQ ID NO:5的多肽或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的等效物保留SEQ IDNO:5的突变，即T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、R682S、R685G、D950N、K986P和V987P。在进一步的实施方案中，RNA或DNA包含编码SEQ IDNO:5的多核苷酸或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，S蛋白包含SEQ ID NO:6的多肽或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:6的等效物保留SEQ IDNO:6的突变，即T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、R682S、R685G、D950N、K986P和V987P。在进一步的实施方案中，RNA或DNA包含编码SEQ ID NO:6的多核苷酸或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，S蛋白包含SEQ ID NO:7的多肽或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:7的等效物保留SEQ IDNO:7的突变，即T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G。在进一步的实施方案中，RNA包含SEQ ID NO:9的多核苷酸或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:9的等效物仍然编码SEQ ID NO:7或其等效物。

在一些实施方案中，S蛋白包含SEQ ID NO:10的多肽或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:10的等效物保留SEQ IDNO:10的突变，即T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G。在进一步的实施方案中，RNA或DNA包含编码SEQ ID NO:10的多核苷酸或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，S蛋白包含SEQ ID NO:11的多肽或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:11的等效物保留SEQ IDNO:11的突变，即T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G。在进一步的实施方案中，RNA包含SEQ ID NO:13的多核苷酸或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:13的等效物仍然编码SEQ ID NO:11或其等效物。

在一些实施方案中，S蛋白包含SEQ ID NO:14的多肽或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:14的等效物保留SEQ IDNO:14的突变，即T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、E484K、N440K、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G。在进一步的实施方案中，RNA包含SEQ ID NO:16的多核苷酸或其等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:16的等效物仍然编码SEQ ID NO:14或其等效物。在一方面，RNA包含SEQ ID NO:55中公开的序列或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:9、13或16中任一者的等效物由在等效物的全长上约35％至约70％的GC含量组成。

在一些实施方案中，等效物与全长参考序列至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或更多相同。

在一些实施方案中，RNA还包含3'UTR。在进一步的实施方案中，3'UTR包含SEQ IDNO:18、22或24中的任一者，或另选地基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，RNA还包含5'UTR。在进一步的实施方案中，5'UTR包含SEQ IDNO:20或26，或另选地基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，RNA还包含polyA尾。在进一步的实施方案中，polyA尾包含SEQID NO:27、28或30中的任一者。

在一些实施方案中，RNA还包含5'帽子。在进一步的实施方案中，该5'帽子包含5'CleanCap，或另选地由其组成，或还进一步由其组成。该结构使用起始加帽三聚体产生天然存在的5'帽子结构。

在一些实施方案中，RNA包含任选地从5'至3'的5'UTR、编码本文所公开的S蛋白或片段的编码序列、3'UTR和polyA，或另选地基本上由其组成，或由其组成。在进一步的实施方案中，RNA包含SEQ ID NO:32或52，或另选地基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)。还提供了编码这些RNA的DNA分子及其互补序列。

在一些实施方案中，RNA是经化学修饰的。在进一步的实施方案中，该修饰包括将尿苷(U)残基修饰为N1-甲基-假尿苷残基，或另选地基本上由其组成，或由其组成。另外地或另选地，该修饰包括将U残基修饰为假尿苷残基，或另选地基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的残基被化学修饰。

在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷或假尿苷。在进一步的实施方案中，RNA中至少约50％、或至少约70％、或约100％的尿苷残基是N1-甲基假尿苷或假尿苷。

在一些实施方案中，在体外转录期间尿苷残基中的全部或一些尿苷残基被假尿苷替换。这种修饰在细胞中稳定mRNA免于酶促降解，导致mRNA翻译效率增强。所用的假尿苷可以是N1-甲基-假尿苷，或本领域熟知的其他修饰，诸如N6-甲基腺苷(m6A)、肌苷、假尿苷、5-甲基胞苷(m5C)、5-羟甲基胞苷(hm5C)和N1-甲基腺苷(m1A)。任选地，修饰在整个mRNA中进行。技术人员将认识到，其他修饰的RNA残基可用于稳定蛋白质的三维结构并增加蛋白质翻译。

不希望受理论的束缚，编码天然存在的S蛋白的RNA激活内体RNA感应途径，诸如TLR3、TLR7和TLR8(Toll样受体)，从而诱导先天免疫，进而抑制了刺突蛋白翻译。此外，分泌的IFN-β通过激活下游细胞凋亡途径与细胞表面上表达的同源受体结合而引起肿瘤细胞死亡。然而，表达本文所公开的突变S蛋白的优化RNA避免了这一缺点，因此呈现出提高的翻译效率(先天免疫)，进而抑制了刺突蛋白翻译。在一些实施方案中，可将优化RNA施用于有需要的受试者，从而在体内表达突变的S蛋白。在进一步的实施方案中，表达的S蛋白可在受试者中诱导免疫应答，进而预防或治疗本文所公开的SARS-CoV-2感染。另外地或另选地，优化RNA在体外表达突变的S蛋白，并且任选地，这种表达的S蛋白可在体外激活免疫细胞。然后，激活的免疫细胞可用于治疗有需要的受试者。

在另一方面，提供了产生严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的方法。在一些实施方案中，该方法是体外方法。该方法包括在适用于表达S蛋白或其免疫原性片段的条件下培养如本文公开的细胞，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，本文的方法还包括分离S蛋白或其免疫原性片段。在一些实施方案中，该细胞是本文所公开的宿主细胞。

另外，提供了一种筛选候选药物的方法，该候选药物任选地在受试者中或在受试者的细胞上或在两者上减少或抑制SARS-CoV-2与其受体诸如ACE2的结合。该方法包括从本文所公开的RNA表达刺突(S)蛋白或其免疫原性片段，以及在存在或不存在候选药物或存在不同浓度的候选药物的情况下，测量表达的S蛋白或其免疫原性片段与SARS-CoV-2受体诸如ACE2之间的结合，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，与没有候选药物相比，在候选药物存在的情况下表达的S蛋白或其免疫原性片段与SARS-CoV-2受体之间的结合较少，表明候选药物降低或抑制了SARS-CoV-2与其受体的结合。在一些实施方案中，表达的S蛋白或其免疫原性片段与SARS-CoV-2受体之间结合的降低，而候选药物的浓度增加，表明候选药物降低或抑制了SARS-CoV-2与其受体的结合。在一些实施方案中，S蛋白或其免疫原性片段在测量步骤中在宿主细胞中表达。另外地或另选地，受体诸如ACE2在测量步骤中在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，受体诸如ACE2在测量步骤中从宿主细胞分离，在其他实施方案中，S蛋白或其免疫原性片段在测量步骤中从宿主细胞分离。在一些实施方案中，分离的S蛋白或其免疫原性片段或分离的受体还包含可检测标记诸如荧光蛋白。在进一步的实施方案中，S蛋白或其免疫原性片段与受体之间的结合使用基于荧光的测定诸如荧光显微镜或荧光激活细胞分选(FACS)进行

在又一方面，提供了选择编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的RNA的方法。该方法包括将RNA转导到细胞中，在适用于表达RNA的条件下培养细胞，并测量细胞分泌的IFN-α或IFN-β或两者，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该方法还包括：如果与编码野生型S蛋白或其免疫原性片段的RNA相比，没有IFN-α或IFN-β或两者的分泌，或IFN-α或IFN-β或两者的分泌较少，则选择该RNA。在一些实施方案中，IFN-α或IFN-β或两者都使用酶联免疫吸附测定进行测量。

多核苷酸、载体、细胞和相关方法

在一方面，提供了编码本文所公开的RNA的多核苷酸或其互补多核苷酸。在一些实施方案中，该多核苷酸选自：脱氧核糖核酸(DNA)、RNA、DNA和RNA的杂交体或它们中每一者的类似物。

在一些实施方案中，本公开提供了编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的多核苷酸，该S蛋白或其免疫原性片段包含至少一个非天然存在的氨基酸突变。这种多核苷酸的非限制性示例包含SEQ ID NO:55的序列，或另选地基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开提供了编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的多核苷酸，该刺突(S)蛋白或其免疫原性片段包含至少一个非天然存在的氨基酸突变，其中该多核苷酸包含SEQ ID NO:52的序列，或另选地基本上由其组成，或由其组成。

在进一步的方面，提供了包含本文所公开的多核苷酸、或另选地基本上由其组成、或由其组成的载体。在一些实施方案中，该多核苷酸是包含SEQ ID NO:53的序列、或另选地基本上由其组成、或由其组成的载体。

在一些实施方案中，该载体还包含与多核苷酸可操作地连接以指导其转录的调控序列。在一些实施方案中，该调控序列适用于体外转录系统。在进一步的实施方案中，该调控序列包含启动子，或另选地基本上由其组成，或由其组成。在更进一步的实施方案中，该启动子是RNA聚合酶启动子，任选地是噬菌体RNA聚合酶启动子。在一些实施方案中，该启动子包含T7启动子或SP6启动子或T3启动子，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，该T7启动子包含TAATACGACTCACTATAA(SEQ ID NO:51)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该调控序列适用于在细胞中表达本文所公开的RNA。在进一步的实施方案中，该调控序列包含启动子或增强子或两者，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，该载体还包含与多核苷酸可操作地连接以指导其复制的调控序列。在进一步的实施方案中，该调控序列包含以下项中的一者或多者：复制起点或引物退火位点、启动子或增强子，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，RNA或多核苷酸或载体还包含选自可检测标志物、纯化标志物或选择标志物的标志物。

在一些实施方案中，该载体是非病毒载体，任选地质粒或脂质体或胶束。在一些实施方案中，该质粒包含SEQ ID NO:33或其等效物，或另选地基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，该载体是病毒载体，任选地腺病毒载体、或腺相关病毒载体、或逆转录病毒载体、或慢病毒载体、或植物病毒载体。

在一些实施方案中，本文所公开的多核苷酸或载体适用于产生(诸如转录或表达或复制)本文所公开的RNA。这种产生可以是体内的或体外的。例如，多核苷酸或载体可用于在体外产生或复制RNA。然后将这种RNA任选地与合适的药学上可接受的载体一起施用于有需要的受试者。另选地，多核苷酸或载体可用作细胞疗法，并任选地与合适的药学上可接受的载体一起直接施用于有需要的受试者。在进一步的实施方案中，基因疗法可另外将其他预防剂或治疗剂递送至受试者。

在另一方面，包含以下项中的一者或多者的细胞：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸或本文所公开的载体。在一些实施方案中，该细胞是原核细胞，任选地是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。在一些实施方案中，该细胞是真核细胞，任选地是哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。在一些实施方案中，该细胞是人胚肾293细胞(HEK 293细胞或293细胞)或293T细胞。

在一些实施方案中，本文所公开的细胞适用于产生(诸如转录或表达)本文所公开的RNA。这种产生可以是体内的或体外的。例如，细胞可用于在体外产生RNA。然后将这种RNA任选地与合适的药学上可接受的载体一起施用于有需要的受试者。另选地，细胞可用作细胞疗法，并任选地与合适的药学上可接受的载体一起直接施用于有需要的受试者。在进一步的实施方案中，细胞疗法可另外将其他预防剂或治疗剂递送至受试者。

在又一方面，提供了包含载体(任选地，药学上可接受的载体)和以下项中的一者或多者的组合物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体或本文所公开的细胞。

在一些实施方案中，该组合物还包含另外的预防剂或治疗剂。

在一些实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂适用于预防或治疗本文所公开的SARS-CoV-2相关疾病。在进一步的实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂包括：抗病毒剂，任选地瑞德西韦、洛匹那韦、利托那韦、伊维菌素、达菲或法匹拉韦；抗炎剂，任选地地塞米松、托珠单抗、kevzara、colcrys、羟氯喹、氯喹或激酶抑制剂；来自从SARS-CoV-2感染中恢复的受试者的恢复期血浆；与SARS-CoV-2结合的抗体，任选地巴尼韦单抗、埃特司韦单抗、卡西瑞单抗或伊德维单抗；或抗生素，任选地阿奇霉素，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，该另外的预防剂适用于预防与SARS-CoV-2无关的疾病。例如，该另外的预防剂包括用于另一种冠状病毒诸如SARS-CoV或MERS-CoV的疫苗，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。另外地或另选地，该另外的预防剂包括用于另一种病毒的疫苗，诸如流感(flu)疫苗、乳头瘤病毒疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、水痘疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、轮状病毒疫苗，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该另外的预防剂包含用于细菌或其他病原体的疫苗，诸如白喉疫苗、b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)疫苗、百日咳疫苗、肺炎球菌疫苗、破伤风疫苗或脑膜炎球菌疫苗，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该另外的预防剂包含用于非感染性疾病诸如癌症的疫苗，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，该组合物还包含佐剂。

在一方面，提供了产生本文所公开的RNA的方法。在一些实施方案中，该方法包括在适用于表达和/或复制RNA的条件下培养本文所公开的细胞，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，RNA通过质粒DNA(pDNA)载体递送系统产生。在更进一步的实施方案中，质粒载体可适用于mRNA疫苗生产。常用的质粒包括pSFV1、pcDNA3和pTK126，它们都是可商购获得的。一种独特的mRNA表达系统是pEVL(参见，Grier等人，Mol Ther Nucleic Acids.，19；5:e306(2016))。

在一些实施方案中，该方法包括在适用于表达RNA的条件下，使本文所公开的多核苷酸或本文所公开的载体与RNA聚合酶、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、鸟苷-5'-三磷酸(GTP)和三磷酸尿苷(UTP)或经化学修饰的UTP接触，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，通过使用RNA聚合酶(T7、T3或SP6)和不同核苷的混合物，在线性体外转录(IVT)系统中从包含噬菌体启动子、UTR和编码序列的线性DNA模板产生RNA。在一些实施方案中，该方法还包括分离RNA。在进一步的实施方案中，该方法还包括存储RNA。

制剂和相关方法

在一方面，提供了一种组合物，该组合物包含本文所公开的RNA和药学上可接受的载体，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括聚合物纳米颗粒，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，聚合物纳米颗粒包含组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，HKP包含选自SEQ ID NO:34-47的侧链。不希望受理论的束缚，与不含纳米颗粒的RNA相比，组合物中的RNA具有更高的稳定性。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体还包含脂质。在进一步的实施方案中，脂质包括任选可电离的阳离子脂质。在更进一步的实施方案中，阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA(MC3)或二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)或两者。在一些实施方案中，脂质还包括以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体包含脂质纳米颗粒(LNP)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，LNP包含以下项中的一者或多者：8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在更进一步的实施方案中，LNP还包含以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。

在一些实施方案中，辅助脂质包括以下项中的一者或多者：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、(2R)-3-(十六烷酰氧基)-2-{[(9Z)-十八-9-烯酰基]氧基}丙基2-(三甲基氮杂铵)乙基磷酸酯(POPC)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

如本文所用，术语“RL-007”和“RL007”指通过混合终浓度为6.25mM的SM-102、1.25mM的DSPC、4.815mM的胆固醇和0.1875mM的DMG-PEG2000(即，50:10:38:1.5的摩尔比)制备的可电离的脂质等效物。术语“RL-007疫苗”、“RL007疫苗”、“RL-007mRNA疫苗”或“RL007 mRNA疫苗”指包含RL-007载体、或另选地基本上由其组成、或还进一步由其组成的疫苗。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包含RL-007，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，其中胆固醇包括植物胆固醇或动物胆固醇或两者，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质包括以下项中的一者或多者：PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)、任选地PEG2000-DMG((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在进一步的方面，提供了一种产生组合物的方法，该组合物包含本文所公开的RNA和HKP，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。该方法包括使RNA与HKP接触，从而使RNA和HKP自组装成纳米颗粒，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，接触步骤中HKP和RNA的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，接触步骤中HKP和RNA的质量比为约2.5:1。在另一个实施方案中，接触步骤中HKP和RNA的质量比为约4:1。

在一些实施方案中，该方法还包括使HKP和RNA与阳离子脂质接触。在进一步的实施方案中，阳离子脂质包含Dlin-MC3-DMA(MC3)或DOTAP(二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷)或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在再进一步的实施方案中，接触步骤中阳离子脂质和RNA的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，接触步骤中RNA和阳离子脂质的质量比为约1:1。因此，接触步骤中HKP、RNA和阳离子脂质的质量比可基于HKP与RNA之间的比和RNA与阳离子脂质之间的比来计算。例如，如果HKP与RNA的比为约4:1并且RNA与阳离子脂质的比为约1:1，则HKP与RNA与阳离子脂质的比为约4:1:1。

在一个实施方案中，在无核酸酶的水中制备HKP(+H)储备溶液(10mg/mL)。将浓缩的储备溶液在水中稀释至2.5mg/mL。在1mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中制备mRNA工作溶液(1mg/mL)。mRNA/HKP(+H)多聚复合物通过使用微流体混合器(microfluidics)将等体积的2.5mg/mL HKP(+H)和1mg/mL mRNA混合而形成。HKP(+H)与mRNA的质量比是2.5:1。使用前将mRNA/HKP(+H)多聚复合物在室温下温育30分钟。为了制备所有基于肽的多聚复合物，在其转染或注射之前用Zetasizer(Malvern Panalytical)测定大小。

在一些实施方案中，该药物包含聚合物纳米颗粒或脂质纳米颗粒、或基本上由其组成、或还进一步由其组成，该聚合物纳米颗粒或脂质纳米颗粒两者均包含阳离子脂质(诸如本文所公开的那些阳离子脂质中的一种或多种)、辅助脂质(诸如本文所公开的那些辅助脂质中的一种或多种)、胆固醇(诸如本文所公开的那些胆固醇中的一种或多种)和聚乙二醇化脂质(诸如本文所公开的那些聚乙二醇化脂质中的一种或多种)。在进一步的实施方案中，聚合物纳米颗粒还包含HKP。在一些实施方案中，阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的质量比为约1:1:1:1:1。

在一些实施方案中，阳离子脂质和辅助脂质的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，阳离子脂质和辅助脂质的质量比为约1:1。

在一些实施方案中，阳离子脂质和胆固醇的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，阳离子脂质和胆固醇的质量比为约1:1。

在一些实施方案中，阳离子脂质和聚乙二醇化脂质的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，阳离子脂质和聚乙二醇化脂质的质量比为约1:1。

阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的质量比可由本领域技术人员基于如本文所公开的阳离子脂质和辅助脂质、阳离子脂质和胆固醇以及阳离子脂质和聚乙二醇化脂质的比来计算。

在一些实施方案中，LNP包含SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一个实施方案中，SM-102、DSPC、胆固醇和PEG200-DMG的质量比为约1:1:1:1，并且/或者其中SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG的摩尔比为约50:10:38.5:1.5。

在一些实施方案中，本文提供的质量比可用另一参数(诸如摩尔比、相对于总重量的重量百分比、相对于总体积的组分重量或相对于总摩尔量的摩尔百分比)替代。已知组分及其分子量，本领域技术人员将不难将质量比转化为摩尔比或其他等同参数。

在进一步的方面，提供了一种产生组合物的方法，该组合物包含本文所公开的RNA和LNP，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。该方法包括使RNA与LNP接触，从而使RNA和LNP自组装成纳米颗粒，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，该接触步骤在微流体混合器中进行，该微流体混合器任选地选自狭缝叉指型微混合器或交错鱼骨型微混合器(SHM)。在一个实施方案中，该微流体混合器是NanoAssemblr Ignite。

在一些实施方案中，该组合物还包含另外的预防剂或治疗剂，诸如本文所公开的那些预防剂或治疗剂。如本文所用，术语“预防剂或治疗剂”包含核酸(例如，mRNA)、化合物、多肽、抗体、其抗原结合部分、组合物、载体、抗原、宿主细胞和/或包含抗原、宿主细胞和/或另外的治疗剂(例如，制剂)的任何药学上可接受的组合物，基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂适用于预防或治疗本文所公开的SARS-CoV-2相关疾病。在一些实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂包含抗病毒剂、疫苗或有效剂量的用于针对SARS-CoV-2的疫苗接种、预防和治疗的核酸，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂适用于预防或治疗SARS-CoV-2天然存在的变体，诸如α、β、γ、δ和/或奥密克戎变体。在一些进一步的实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂适用于预防或治疗SARS-CoV-2天然存在的变体及其后代谱系。如本文所用，SARS-CoV-2天然存在的变体的后代谱系是一组具有共同祖先的密切相关的病毒，所有这些病毒都会引起COVID-19。SARS-CoV-2天然存在的变体的后代谱系包括但不限于αB.1.1.7和Q谱系；βB.1.351；γP.1；δB.1.617.2和AY谱系；εB.1.427和B.1.429；ηB.1.525；ιB.1.526；κB.1.617.1；μB.1.621、B.1.621.1；ζP.2；和/或奥密克戎B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5谱系。

在进一步的实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂包括：抗病毒剂，任选地瑞德西韦、洛匹那韦、利托那韦、伊维菌素、达菲或法匹拉韦；抗炎剂，任选地地塞米松、托珠单抗、kevzara、colcrys、羟氯喹、氯喹或激酶抑制剂；来自从SARS-CoV-2感染中恢复的受试者的恢复期血浆；与SARS-CoV-2结合的抗体，任选地巴尼韦单抗、埃特司韦单抗、卡西瑞单抗或伊德维单抗；或抗生素，任选地阿奇霉素，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂适用于预防与SARS-CoV-2无关的疾病。例如，该另外的预防剂或治疗剂包含用于另一种冠状病毒诸如SARS-CoV或MERS-CoV的疫苗，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。另外地或另选地，该另外的预防剂或治疗剂包含用于另一种病毒的疫苗，诸如流感(flu)疫苗、乳头瘤病毒疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、水痘疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、轮状病毒疫苗，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂包含用于细菌或其他病原体的疫苗，诸如白喉疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、百日咳疫苗、肺炎球菌疫苗、破伤风疫苗或脑膜炎球菌疫苗，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该另外的预防剂或治疗剂包含用于非感染性疾病诸如癌症的疫苗，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

治疗方法

在一方面，提供了用于预防或治疗本文所公开的疾病的方法。另外地或另选地，提供了一种用于以下项中的一者或多者的方法：(a)预防受试者患有有症状SARS-CoV-2感染；(b)预防受试者在SARS-CoV-2感染后住院；(c)预防受试者在SARS-CoV感染后需要重症监护(诸如在重症监护病房(ICU))或呼吸机或两者都需要；(d)在有需要的受试者中诱导对SARS-CoV-2的免疫应答；(e)在有需要的受试者中减少SARS-CoV-2或其S蛋白与其受体(诸如血管紧张素转化酶2(ACE2))的结合；(f)治疗感染有SARS-CoV-2的受试者；或(g)在有需要的受试者中减少SARS-CoV-2病毒载量。

宿主中和抗体阻断SARS-CoV-2或其S蛋白与其受体诸如ACE2的结合，导致中和的病毒和减少的SARS-CoV-2病毒载量。病毒载量是病毒感染的严重程度的量度，并且可通过估计受感染生物体、相关体液或生物样品中的病毒量来直接计算。病毒载量的定量通常可通过利用噬菌斑减少中和测定(PRNT)来进行。PRNT是一种血清学试验，它利用特异性抗体中和病毒的能力，进而防止病毒在细胞单层中形成噬菌斑。该测定包括将恒定量的病毒与被测血清样本的稀释液混合，随后将混合物铺板到针对单个病毒的合适细胞系的细胞上。噬菌斑形成单位的浓度可通过几天后形成的噬菌斑数量来确定。添加染料以使噬菌斑可视化，并将单个板中的噬菌斑数量除以病毒体的原始数量来计算中和百分比。根据病毒的不同，噬菌斑形成单位(p.f.u.)通过显微镜观察、荧光抗体或与受感染细胞反应的特定染料来测量。中和滴度可计算为最低稀释度的倒数，该最低稀释度导致p.f.u.(噬菌斑形成单位)相对于阴性对照血清减少超过50％(PRNT50)或减少超过90％(PRNT90)。从两个完全接种的受试者收集的血清和从未接种的受试者收集的血清可分别用作阳性对照和阴性对照。

因此，受试者中诱导的免疫应答包括诱导增加的中和抗体滴度、增加的脾细胞Th1-细胞因子水平(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2-细胞因子水平(IL-4、IL-5、IL-13)和/或诱导减少的病毒载量。本公开提供了在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法。在一些实施方案中，该方法包括向该受试者施用有效剂量的本文所公开的RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物，从而在该受试者中诱导对SARS-CoV-2抗原具有特异性的免疫应答，其中相对于未接种的受试者中的中和抗体滴度，疫苗接种后受试者中的中和抗体滴度增加。在一些实施方案中，相对于未接种的受试者中的中和抗体滴度，疫苗接种后受试者中的中和抗体滴度增加1log至10log。在一些实施方案中，相对于未接种的受试者中的中和抗体滴度，疫苗接种后受试者中的中和抗体滴度增加1log、2log、3log、4log、5log或10log。

在其他实施方案中，通过测量受试者中的脾细胞Th1-细胞因子水平(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2-细胞因子水平(IL-4、IL-5、IL-13)来评估免疫应答。在一些实施方案中，该方法包括向该受试者施用有效剂量的本文所公开的RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物，从而在该受试者中诱导对SARS-CoV-2抗原具有特异性的免疫应答，其中相对于未接种的受试者中的中和抗体滴度，疫苗接种后受试者中的脾细胞Th1-细胞因子水平(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和/或Th2-细胞因子水平(IL-4、IL-5、IL-13)增加。

该方法包括向该受试者施用任选地有效量的以下项中的任一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞或本文所公开的组合物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。

在一些实施方案中，该方法还包括治疗有需要的受试者，诸如向受试者施用另外的预防剂或治疗剂。

在一些实施方案中，当用RNA或组合物施用时，该受试者未患有SARS-CoV-2感染。在一些实施方案中，SARS-CoV-2感染可使用常规方法诊断，诸如核酸扩增试验(NAAT)、抗原试验或抗体试验。SARS-CoV-2的NAAT特异性地鉴定包含病毒的遗传物质的RNA(核糖核酸)序列，包括但不限于逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或等温扩增(诸如切口核酸内切酶扩增反应(NEAR)、转录介导的扩增(TMA)、环介导的等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)或链置换扩增(SDA))。抗原试验是检测特定病毒抗原存在的免疫测定，这意味着当前的病毒感染。更多细节可见于www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antigen-tests-guidelines.html，最后一次评估日期为2021年8月1日。抗体或血清学试验寻找血液中抗SARS-CoV-2的抗体，并且通常用于指示过去的感染或成功的疫苗接种。然而，IgM抗体在感染后可持续数周至数月，但其持续时间似乎比IgG短；因此，检测到IgM可能表明近期感染。更多细节可见于www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.html，最后一次评估日期为2021年8月1日。

在一些实施方案中，受试者处于患有本文所公开的疾病诸如SARS-CoV-2感染的风险中。在一些实施方案中，受试者没有暴露于SARS-CoV-2。在一些实施方案中，受试者处于暴露于SARS-CoV-2的风险中。

在一些实施方案中，受试者在感染SARS-CoV-2后比其他人更有可能患重病。例如，他们在感染后可能需要住院治疗、重症监护或呼吸机，或者死亡。在一些实施方案中，该受试者超过65岁。在一些实施方案中，该受试者超过45岁。在一些实施方案中，该受试者患有以下医学病症中的一种或多种：癌症、慢性肾病、慢性肺病(诸如慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘(中度至重度)、间质性肺病、囊性纤维化或肺动脉高压)、痴呆或其他神经系统疾病、糖尿病(1型或2型)、唐氏综合征、心脏病(诸如心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌病或高血压)、HIV感染、免疫受损状态(免疫系统减弱)、肝病、超重、肥胖症、妊娠、镰状细胞病、地中海贫血、吸烟(目前的或以前的)、实体器官或造血干细胞移植、中风或脑血管疾病(诸如影响脑部血流的疾病)或物质使用障碍。

在一些实施方案中，通过吸入施用。在进一步的实施方案中，RNA或组合物在施用之前或期间通过雾化器吸入系统雾化。在更进一步的实施方案中，该雾化器系统是用于全呼吸道药物递送的便携式雾化器。

在一些实施方案中，通过皮下注射施用。在一些实施方案中，通过肌内注射施用。在一些实施方案中，通过腹膜内注射(i.p)施用。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物可以是气雾剂、分散体、溶液或悬浮液的形式，并且可以配制用于吸入、肌内、口服、舌下、口腔、肠胃外、鼻、皮下、皮内或局部施用。本文所用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌内或鞘内注射或输注技术等。

如本文所用，本文所公开的RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物的有效剂量是在待施用的受试者中产生保护性免疫应答所需的剂量。在本文中，保护性免疫应答是预防或改善受SARS-CoV-2或其假病毒攻击的受试者的疾病的免疫应答。本文所公开的RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物可施用一次或多次。对疫苗免疫应答的初始测量可通过测量接受RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物的受试者中的抗体的产生来进行。以这种方式测量抗体产生的方法也是本领域熟知的，是预防、抑制疾病状态的发生或治疗(在一定程度上减轻症状，优选地所有症状)所需的剂量。药学上有效的剂量取决于疾病的类型、所用的组合物、施用途径、所治疗的哺乳动物的类型、所考虑的具体哺乳动物的物理特性、同时给药以及医学领域技术人员将认识到的其他因素。通常，根据配制的组合物的效力，施用量为0.1mg/kg至100mg/kg体重/天的活性成分。在一些实施方案中，将有效剂量的本文所公开的RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物施用两次。在一些实施方案中，有效剂量的本文所公开的RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物以至少21天、至少28天、至少35天、至少42天、至少49天、至少56天或至少64天的间隔施用两次

在进一步的方面，提供了一种吸入系统，该吸入系统包括本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体或本文所公开的组合物和雾化器，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，雾化器是用于全呼吸道药物递送的便携式雾化器。

在一些实施方案中，RNA组合物可以足以递送0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg至0.005mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至25mg/kg受试者体重每天的剂量水平施用，每天、每周、每月等一次或多次，以获得期望的治疗或预防效果。期望的剂量可每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每2个月一次、每三个月一次、每6个月一次等递送。在某些实施方案中，可使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)递送期望的剂量。当采用多次施用时，可使用诸如本文所述的分开给药方案。在一些实施方案中，RNA组合物可以足以递送0.0005mg/kg至0.01mg/kg，例如约0.0005mg/kg至约0.0075mg/kg，例如约0.0005mg/kg、约0.001mg/kg、约0.002mg/kg、约0.003mg/kg、约0.004mg/kg或约0.005mg/kg的剂量水平施用。在一些实施方案中，RNA组合物可以足以递送0.025mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至0.750mg/kg或0.025mg/kg至1.0mg/kg的剂量水平施用一次或两次(或更多次)。

在一些实施方案中，RNA组合物可以有效剂量水平施用。如本文所提供的，RNA的有效剂量可以是约10μg至500pg，以单剂量或多剂量(例如，加强剂量)施用。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含约10μg RNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含约20μg RNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含约30μgRNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含约40μg RNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含约50μg RNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含约100μg RNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含至少25pg RNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含少于100μg RNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含100μg或更少的RNA。在一些实施方案中，单剂量的疫苗组合物(例如，施用一次、两次、三次或更多次)包含约250μg RNA。

在一些实施方案中，施用于受试者的RNA总量为约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约100μg、约200μg、约250μg或约500μg mRNA。在一些实施方案中，施用于受试者的RNA总量为约50μg。在一些实施方案中，施用于受试者的RNA总量为约100μg。在一些实施方案中，施用于受试者的RNA总量为约250μg。在一些实施方案中，施用于受试者的RNA总量为约500μg。

在一些实施方案中，RNA组合物可以总剂量为或足以递送总剂量为0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg的剂量水平施用两次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后或第0天和10年后)。本公开涵盖较高和较低的施用剂量和施用频率。例如，RNA组合物可以施用三次或四次。

试剂盒

在一方面，提供了用于本文所公开的方法的试剂盒。

在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的组合物或本文所公开的吸入系统，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，试剂盒适用于本文所公开的治疗方法。

在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞、本文所公开的组合物、HKP或脂质，任选地阳离子脂质，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，试剂盒适用于产生本文所公开的RNA或组合物的方法。

在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书、本文所公开的多核苷酸或载体、RNA聚合酶、ATP、CTP、GTP和UTP或经化学修饰的UTP，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，试剂盒适用于产生本文所公开的RNA或组合物的体外方法。

包括以下实施例以说明本公开的一些实施方案。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。

实施例

实施例1：RNA合成：

合成本文所公开的测试RNA，例如通过体外转录(IVT)，使用本文所公开的载体和本领域技术人员可获得的IVT试剂盒(诸如，来自ThermoFisher Scientific的MAXIscript^TMT7转录试剂盒)，然后通过在含有10mM HEPES(pH 7.2)、0.1mM EDTA、125mMNaCl、16％乙醇和纤维素纤维的含乙醇的层析缓冲液中将dsRNA选择性结合到纤维素并离心来纯化。在该过程后几乎90％的dsRNA被除去。参见，例如Baiersdorfer等人，2019年，MolTher Nucleic Acids.，2019年4月15日；第15卷：第26-35页。污染物也可使用FPLC和HPLC除去，参见例如Kariko等人，2011年，Nucleic Acids Res.，2011年11月；第39卷第21期：第e142页。

实施例2：肽(HK聚合物)的制备

HK肽聚合物在马里兰大学生物聚合物核心设施在Rainin Voyager合成仪(亚利桑那州图森(Tucson,AZ))上合成的。

实施例3：体外制剂制备

PNI-Genvoy脂质纳米颗粒(LNP)制剂：使用Genvoy平台配制脂质纳米颗粒，其中PNI NanoAssemblr(Precision NanoSystems，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市(Vancouver,British Columbia,Canada))作为体外和体内试验的阳性对照。

HKP(+H)制剂版本1：在无核酸酶的水中制备HKP(+H)储备溶液(10mg/mL)。将浓缩的储备溶液在水中稀释至2.5mg/mL。在1mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中制备mRNA工作溶液(1mg/mL)。mRNA/HKP(+H)多聚复合物通过使用微流体混合器(microfluidics)将等体积的2.5mg/mL HKP(+H)和1mg/mL mRNA混合而形成。HKP(+H)与mRNA的质量比是2.5:1。使用前将mRNA/HKP(+H)多聚复合物在室温下温育30分钟。为了制备所有基于肽的多聚复合物，在其转染或注射之前用Zetasizer(Malvern Panalytical)测定大小。

HKP(+H)制剂版本2：在无核酸酶的水中制备HKP(+H)储备溶液(10mg/mL)。将浓缩的储备溶液在水中稀释到4mg/mL。在1mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中制备mRNA工作溶液(1mg/mL)。mRNA/HKP(+H)多聚复合物通过将等体积的4mg/mL HKP(+H)和1mg/mL mRNA混合而形成。HKP(+H)与mRNA的质量比是4:1。使用前将mRNA/HKP(+H)多聚复合物在室温下温育30分钟。在转染或注射之前用Zetasizer(Malvern Panalytical)测定每种基于肽的多聚复合物的大小。

HKP(+H)/DOTAP制剂(混合后的DOTAP)：在不含核酸酶的水中制备HKP(+H)储备溶液(10mg/mL)。将浓缩的储备溶液在水中稀释到4mg/mL。DOTAP(Sigma-Aldrich)在缓冲水溶液中为1mg/mL。在1mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中制备mRNA工作溶液(1mg/mL)。首先，mRNA/HKP(+H)多聚复合物通过将等体积的4mg/mL HKP(+H)和1mg/mL mRNA混合而形成。mRNA/HKP(+H)多聚复合物在室温下温育30分钟。接着，将相同体积的DOTAP与HKP(+H)溶液加入mRNA/HKP(+H)多聚复合物中。HKP(+H)/DOTAP与mRNA的质量比是4:1:1。使用前将mRNA/HKP(+H)/DOTAP纳米颗粒在室温下温育30分钟。

HKP(+H)/MC3或HKP(+H)/DOTAP制剂(预混合的MC3或DOTAP)：在不含核酸酶的水中制备HKP(+H)储备溶液(10mg/mL)。将浓缩的储备溶液在水中稀释到4mg/mL。DOTAP或MC3在缓冲水溶液中为1mg/mL。在1mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中制备mRNA工作溶液(1mg/mL)。等体积的HKP(+H)和MC3以4:1的质量比预混合，并将相同体积的mRNA与HKP(+H)溶液加入预混合的HKP(+H)/MC3中。通过混合预混合的4mg/mL HKP(+H)/1mg/mL MC3和1mg/mL mRNA形成mRNA/HKP(+H)/MC3纳米颗粒。HKP(+H)/MC3与mRNA的质量比是4:1:1。使用前将mRNA/HKP(+H)/MC3纳米颗粒在室温下温育30分钟。

HKP(+H)/PLA NP制剂：在无核酸酶的水中制备HKP(+H)储备溶液(10mg/mL)。将浓缩的储备溶液在水中稀释到4mg/mL。在水中制备聚-L-乳酸(PLA)纳米颗粒(5mg/mL)。在1mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中制备mRNA工作溶液(1mg/mL)。将等体积的HKP(+H)和mRNA以4:1的质量比混合。mRNA/HKP(+H)多聚复合物在室温下温育30分钟，然后将相同体积的PLA纳米颗粒与HKP(+H)溶液加入mRNA/HKP(+H)纳米颗粒中，以使mRNA/HKP(+H)多聚复合物吸附在PLA纳米颗粒表面上。HKP(+H)/PLA与mRNA的质量比是4:5:1。使用前将mRNA/HKP(+H)/PLA纳米颗粒在室温下温育30分钟。

表6：根据下表制备脂质和RNA工作溶液。

简言之，用70％乙醇彻底清洁工作区。每种脂质的4x储备溶液在100％乙醇中制备，并在-20℃下储存直至使用。通过按1:1:1:1的比率混合下列各组分来制备脂质工作溶液(终浓度为12.5mM)：可电离的阳离子脂质((十七烷基-9-基8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸酯})SM-102等效物、辅助脂质(诸如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3磷酸胆碱(DSPC))、胆固醇和PEG2000-DMG(即，1-单甲氧基聚乙二醇-2,3-二肉豆蔻基甘油与平均分子量2000的聚乙二醇)。在配制缓冲液(50mM柠檬酸钠pH4.0)中制备RNA工作溶液。RNA浓度取决于脂质浓度、流速比和N/P比。

制备RNA和脂质纳米颗粒：打开NanoAssemblr Ignite，并从主菜单中选择“快速运行”。通过选择字段、从下拉菜单中选择值或用屏幕键盘输入数字然后点击复选标记，如图1所示设置参数。打开Ignite的盖，确保筒适配器安装在筒槽的“L”入口上，箭头朝上，然后从包装中取出NxGen^TM筒，并插入筒槽中。升高旋转块直到看到筒鲁尔接口。将至少1.5mL制备的RNA工作溶液吸入3mL注射器中。必要时使用钝针。取出针头，清除注射器中的气泡，并使用柱塞将液体推进至尖端。避免了注射器尖端的滴落。将注射器插入到Ignite筒的“C”入口中，顺时针扭转以接合鲁尔锁。必要时使用钝针将至少0.5mL制备的脂质工作溶液吸入1mL注射器中。取出针头，清除注射器中的气泡，并使用柱塞将液体推进至尖端。避免了注射器尖端的滴落。将注射器插入到Ignite筒的“R”入口中。旋转块返回到向下位置。确保两个15mL锥形管的样品开关臂安装到位。15mL锥形收集管标有“RNA-LNP”，并推入标有“样品”的夹子中。另一个管标有“废物”，并推入标有“废物”的夹子中。关闭Ignite盖，并点击屏幕上的“下一步”。确认对话框中的参数和信息。按下“开始”按钮。Ignite^TM的推动器随后将流体注入微流体筒中。将制剂收集在标有“RNA-LNP”的管中。在电机自身定位回到原位之后，屏幕指示何时打开盖是安全的。一旦安全便打开盖，取出标有“RNA-LNP”的锥形收集管，并立即放在一边进行表征和进一步处理。升高旋转块，从Ignite^TM中取出注射器并丢弃。使旋转块返回到向下位置，取出NxGen筒并丢弃。为了制作另外的样品，点击后退“<”按钮返回“快速运行”屏幕，并且除了初始快速运行设置步骤之外，重复本段中描述的步骤。

为了表征配制的脂质纳米颗粒(LNP)，在制备后，将25μL-50μL的样品级分与650μL的超纯水(Invitrogen)混合，并在Zetasizer(Malvern Instruments Inc.)上测量强度平均粒度(Z-平均值)。

将样品级分立即转移到Slide-a-lyzer G2透析盒(10000MWCO，Thermo FischerScientific Inc.)中，并在4℃下用PBS(pH 7.4)透析过夜。

LNP制剂使用Amicon超离心过滤器(EMD Millipore，Billerica，MA，USA)浓缩，通过0.22μm过滤器(Acrodisc)并在4℃(PBS)下储存。

还收集样品级分并测量粒度(透析后粒度)。

使用Quant-it Ribogreen测定试剂盒(Thermo Fischer Scientific)测量最终mRNA浓度和包封率(EE)。

实施例4：mRNA的体外转染

为了证实RNA的正确蛋白表达，将本文所公开的EGFP mRNA或测试的RNA瞬时转染入人胚肾293T细胞(293T细胞)。简言之，将4.8×10⁵个细胞铺板到含有2ml DMEM(10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素(ThermoFisher Scientific))的6孔板中。24小时后，当细胞70％-90％汇合时，使用Lipofectamine MessengerMAX转染试剂(ThermoFisherScientific)且根据手册方案将EGFR mRNA或测试RNA转染到293T细胞中。将转染的293T细胞培养两天，然后测量体外蛋白质表达。

还检测了本文所公开的各种制剂/载体携带EGFP mRNA或测试RNA进入靶宿主细胞诸如人胚肾293细胞(HEK 293细胞)的能力。简言之，将4.8×10⁵个细胞铺板到含有2mlDMEM(10％胎牛血清和青霉素-链霉素(ThermoFisher Scientific))的6孔板中。24小时后，当细胞70％-90％汇合时，向每个孔加入本文所公开的含有EGFP mRNA或测试RNA的制剂/载体。将293T细胞培养两天，然后测量体外蛋白质表达。

实施例5：体外蛋白质表达测量

免疫荧光分析：转染后两天，使用Cytation5细胞成像多模式读取器(Biotek，Winooski，VT)通过免疫荧光成像测量蛋白质表达。

细胞裂解液制备：转染后两天，吸出培养基，在冰上用冰冷的PBS洗涤细胞。加入含有蛋白酶抑制剂(ThermoFisher Scientific)的冰冷裂解缓冲液(RIPA，ThermoFisherScientific)，并将细胞在4℃下温育30分钟。然后使用细胞刮刀收获细胞并通过超声处理裂解。4℃下以10,000g离心20分钟沉淀细胞碎片，并将上清液转移至新鲜的微量离心管中。通过用于蛋白质印迹的Bradford或BCA蛋白质测定来确定裂解物的蛋白质浓度。

蛋白质印迹：简言之，在凝胶的每个孔中，将20μg-50μg蛋白质与4XSDS样品缓冲液(ThermoFisher Scientific)、10X还原缓冲液(ThermoFisher Scientific)和另外的ddH₂O(ThermoFisher Scientific)混合，总上样体积为25μl/孔。通过在95℃下加热5分钟使混合物变性，冷却至室温并离心，然后上样到NUPAGE^TM4％-12％Bis-Tris凝胶(ThermoFisherScientific)上。电泳分离后，将凝胶从盒中取出，并使用IBLOT^TM2干印迹系统(ThermoFisher Scientific)转移。将转移的膜用TBST中的5％脱脂奶粉在室温(RT)下封闭1小时，与一抗在4℃下温育过夜，用TBST(TBS中的0.05％Tween20)缓冲液洗涤三次，并与二抗在RT下温育1小时，该二抗是HRP缀合的小鼠IgG(H+L)二抗(ThermoFisher Scientific，A24512)。转移膜然后通过Pierce ECL蛋白质印迹底物(ThermoFisher Scientific)显影，并使用化学发光成像系统成像。

在一些实施方案中，一抗特异性识别并结合SARS-CoV-2的S蛋白或其片段，诸如S2蛋白或S蛋白的RBD或两者。因此，评估测试RNA对其蛋白质产物的表达。在进一步的实施方案中，进行蛋白质印迹的上样对照。例如，除了一抗特异性识别并结合β-肌动蛋白之外，使用如上所述的蛋白质印迹测试相同的样品。在上样对照中发现各组之间的蛋白质水平基本上相似。

合成、纯化具有不同polyA尾的RNA，诸如40聚体polyA(本文称为“polyA 40”)或60-60polyA(参见“polyA 60”)，将其转染到细胞，并测试蛋白质表达。简言之，通过TwistBioscience合成包含β-球蛋白5'UTR和3'UTR、蓝色荧光蛋白2(BFP2)编码序列和不同合成polyA尾的DNA构建体。在进一步的实施方案中，DNA构建体还包含质粒主链，该质粒主链包含卡那霉素选择标志物、pUC57主链和T7启动子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，以使质粒具有体外转录(IVT)能力。IVT如前所述进行。将RNA转染到HEK293T细胞中，并使用BioTek的Citation 5显微镜观察蓝色荧光蛋白(BFP)的荧光强度。结果示于图2中。图2A至图2C中每个图的上图提供了显示BFP荧光的代表性图像，而图2A至图2C中每个图的下图提供了对应的明场图像。

另外，合成、纯化含有各种UTR(诸如，本文所公开的β-球蛋白UTR或SYS UTR)的RNA，将其转染到细胞，并测试蛋白质表达。简言之，通过Twist Bioscience合成包含不同5'UTR和BFP2的DNA构建体。这些构建体还包含质粒主链，该质粒主链包含卡那霉素选择标志物、pUC57主链和T7启动子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，以使质粒具有体外转录(IVT)能力。一旦制备和纯化了质粒，便如前所述进行IVT。使用MessengerMax转染试剂(Thermofisher)将RNA转染到HEK293T细胞中，并使用来自BioTek的Citation 5显微镜测量BFP荧光强度。在各个时间点比较不同的5'UTR。参见图3。误差条表示3次重复的标准偏差。

实施例6：与人ACE2的结合

进一步研究由本文所公开的测试RNA表达的S蛋白、其变体和/或突变体与其在人细胞(诸如人ACE2)上的受体之间的结合。例如，将用测试RNA转染并表达S蛋白、其变体和/或突变体的细胞(诸如HEK293T(目录号CRL-3216，ATCC)或a549(目录号CCL-185，ATCC))与用荧光蛋白(诸如FITC)直接或间接标记的人ACE2一起温育。任选地洗涤温育的细胞以除去未结合的ACE2。进行流式细胞术，并定性地测量每个细胞的平均荧光强度(MFI)。MFI越高，ACE2与细胞的结合越多，表明ACE2与细胞表达的S蛋白、其变体和/或突变体之间的结合越强(诸如，显示更高的结合亲和力)。

实施例7：体内动物模型及注射

进行体内研究。简言之，将6-8周大的雌性BALB/C随机分入各组，每组4只小鼠，并用含有不同制剂的30μg EGFP mRNA肌内注射入右侧腹部。使用上述相同的制剂，还制备了用于体内分析以及抗体滴度测量和结合的测试RNA。

在第28天，进行第二次加强注射，在第35天收集血清，并通过免疫测定(ELISA)进行分析以测量抗体滴度。

实施例8：体内动物模型。

其他合适的动物模型可用于研究本文所公开的制剂/载体中的测试RNA，并评估其用于本文所公开的方法中的效率，以及用于单独疗法或与其他可能的疗法诸如抗炎疗法组合的疗法的效率。

在一个示例中，本文使用任选地在组织特异性启动子(例如，上皮细胞的Krt18启动子；K18-hACE2小鼠)或通用启动子(巨细胞病毒增强子，随后是鸡β-肌动蛋白启动子)或内源小鼠Ace2启动子下表达人ACE2的经基因修饰动物模型。所有这些小鼠都易受SARS-CoV-2感染，但是它们在人ACE2表达上的差异导致了轻度至致死疾病的致病范围。在一些实施方案中，动物是小鼠。另选的动物模型包括叙利亚仓鼠，其ACE2与人显著相似，并被认为易受SARS-CoV-2感染；雪貂；和非人灵长类动物。

在用SARS-CoV-2或其假病毒攻击之前或同时，将RNA组合物诸如本文所公开的制剂/载体中的测试RNA施用于动物。RNA组合物的施用重复至少一次或两次。RNA组合物的第二次施用间隔约两周或约三周进行。未用SARS-CoV-2或假病毒攻击的动物用作阴性对照，而用SARS-CoV-2或假病毒攻击但未治疗的动物用作阳性对照。使用另外的对照，诸如用本领域已知的SARS-CoV-2疫苗处理的动物，诸如得自Pfizer-BioNTech的BNT162b2、得自Moderna的mRNA-1273或得自Johnson&Johnson'sJanssen的JNJ-78436735，并用SARS-CoV-2或假病毒攻击。

在施用RNA组合物后，监测病毒载量、肺部病理、免疫细胞向肺部的浸润、细胞因子释放、体重、皮毛、姿势、呼吸窘迫(诸如呼吸困难)、嗜睡与否、鼻涕、哮喘、口咽部粘液堆积、打喷嚏、稀便等，以评估效果。

实施例9：确认用修饰的或未修饰的SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗候选物转染的A549细胞的I型干扰素分泌(IFN-α和IFN-β)。

进行实验以测试病毒RNA感应途径是否激活用SARS-CoV-2刺突mRNA(SBI)转染的A549细胞中的先天免疫，导致IFN-β的产生和随后SARS-CoV-2S蛋白翻译的抑制。相同的实验设置应用于表达SARS-CoV-2S蛋白(野生型或包含S2P或S6P突变)的RNA，诸如，编码野生型SARS-CoV-2S蛋白的RNA(标记为“SARS-CoV-2刺突WT(SBI)”)；编码野生型SARS-CoV-2S蛋白的RNA，其中该RNA的所有尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为假尿苷，进一步任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷(标记为“SARS-CoV-2刺突WT(100％修饰)”)；编码在K986P和V987P处突变的野生型的SARS-CoV-2S蛋白的RNA，其中该RNA的至少一个尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为假尿苷，进一步任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷(标记为“SARS-CoV-2刺突S2P WT”)；编码在D614G、K986P和V987P处突变的野生型的SARS-CoV-2S蛋白的RNA，其中该RNA的至少一个尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为假尿苷，进一步任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷(标记为“SARS-CoV-2刺突S2P D614G”)；编码在D614G处突变的野生型的SARS-CoV-2S蛋白的RNA，其中该RNA的至少一个尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为假尿苷，进一步任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷(标记为“SARS-CoV-2刺突D614G WT”)；编码在F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P处突变的野生型的SARS-CoV-2S蛋白的序列优化RNA，其中该RNA的至少一个尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为假尿苷，进一步任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷(标记为“SARS-CoV-2刺突S6P(RNAimmune)”)；编码在南非首次鉴定且进一步在F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P处突变的SARS-CoV-2S蛋白的β变体的RNA，其中该RNA的至少一个尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为假尿苷，进一步任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷(标记为“SARS-CoV-2刺突S6P_SA”)；编码在南非首次鉴定且进一步在F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P处突变的SARS-CoV-2S蛋白的β变体的序列优化RNA，其中该RNA的至少一个尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为假尿苷，进一步任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷(标记为“SARS-CoV-2刺突S6P_SA_GS”)；或编码SARS-CoV-2S蛋白的RBD的RNA，其中该RNA的至少一个尿苷残基被化学修饰，任选地被化学修饰为假尿苷，进一步任选地被化学修饰为N1-甲基假尿苷(标记为“RBD”)。参见下表中的更多细节。在进一步的实施方案中，野生型SARS-CoV-2S蛋白包含SEQ ID NO:1所示的多肽，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。

表7

另外，相同的实验设置应用于本文所公开的制剂/载体中的测试RNA。

材料和方法

用编码以下之一的RNA瞬时转染293T细胞，并以约1:3的RNA和脂质比例配制：SARS-CoV-2刺突WT(SBI)、SARS-CoV-2刺突WT(100％修饰)、SARS-CoV-2刺突S2P WT、SARS-CoV-2刺突S2P D614G，SARS-CoV-2刺突D614G WT、SARS-CoV-2刺突S6P(RNAimmune)、SARS-CoV-2刺突S6P_SA、SARS-CoV-2刺突S6P_SA_GS或RBD。

将2ml A549细胞以2.5×10⁵个细胞的密度铺板在12孔板中。将细胞在5％CO₂培养箱中于37°℃温育24小时。将RNA(1μg)在50μl Opti-MEM-I中稀释。还稀释7.5μl的Lipofectamine MessengerMAX(Invitrogen，目录号LMRNA008)，并在RT下温育10分钟。将稀释的mRNA混合物加入稀释的脂质中。在RT下进行温育5分钟。将mRNA-脂质复合物加入到细胞中，并在5％CO₂培养箱中于37°℃温育24小时。

使用VeriKine人IFN-αELISA试剂盒(目录号41100，pbl assay science)进行检测IFN-α的ELISA。将1ml培养上清液转移到新的管中，并以3000rpm离心5分钟。然后将培养上清液转移至新管中,并在-80°℃下储存直至使用。

生成标准曲线：构建高灵敏度标准曲线12.5pg/ml-500pg/ml或扩展范围标准曲线156pg/ml-5000pg/ml。对六个聚丙烯管(S1-S6)贴标签并用250μl稀释缓冲液填充。使用聚丙烯吸头将人IFN-α标准品加入S6中并轻轻混合。每次稀释之间更换吸头。从S6中取出250μl并加入S5中。对S4-S1进行了相同的连续稀释。所有稀释液冷藏直至使用(图4)。

使用VeriKine人IFN-βELISA试剂盒(目录号41410，pbl assay science)进行检测IFN-β的ELISA。将1ml培养上清液转移到新的管中，并以3000rpm离心5分钟。然后将培养上清液转移至新管中,并在-80°℃下储存直至使用。

生成标准曲线：对七个聚丙烯管贴标签(S1–S7)。使用聚丙烯吸头，将250μl标准稀释液加入每个管中，但S7不同，其中加入了492.5μl标准稀释液。将10μl人IFN-β标准品加入90μl标准稀释液中。将7.5μl预稀释标准品加入S7中并充分混合。将250μl S7转移至S6中并充分混合。对重置的S5-S1进行相同的连续稀释。所有稀释液均搁置直至使用。

确定测试所需数量样品所需的微孔板条的数量，加上运行空白和标准品所需的孔的适当数量。向每个孔加入100μl干扰素标准品、空白或样品，盖上封板膜并温育1小时。1小时后，倒空板的内容物，仅用稀释的洗涤缓冲液洗涤孔一次。向每个孔加入100μl稀释的抗体溶液，盖上封板膜并温育1小时。1小时后，倒空板的内容物，并用稀释的洗涤缓冲液洗涤孔三次。向每个孔加入100μl稀释的HRP溶液，盖上封板膜并温育1小时。在此温育期间，将TMB底物溶液温热至RT(22℃-25℃)。1小时后，倒空板的内容物，并用稀释的洗涤缓冲液洗涤孔四次。向每个孔加入100μl TMB底物溶液，并在RT(22℃-25℃)下于暗处温育15分钟。在温育期间不使用封板膜。在TMB温育15分钟后，向每个孔加入100μl终止溶液。使用微孔板读取器，在加入终止溶液后5分钟内测定450nm处的吸光度。

在一些实施方案中，例如使用如上所述的转染方法，用本文所公开的制剂/载体中的测试RNA瞬时转染293T细胞。例如，使用如上所述的方法测量转染细胞的IFN-α和IFN-β释放。

结果

为了评估IFN-α和IFN-β从A549细胞的分泌，如本文所述进行ELISA。对代表性的所得ELISA板拍照并示于图4中，而结果如图5至图6所示进一步定量。数据表明，仅从A549细胞分泌的干扰素-α(IFN-α或IFN-Alpha)转染未修饰的SARS-CoV-2刺突mRNA(SBI)，并且从A549细胞分泌的干扰素-β(IFN-β或IFN-Beta)转染未修饰的SARS-CoV-2刺突mRNA(SBI)、S2P WT、D614G WT和S6P_SA。

结论

仅从A549细胞分泌的干扰素-α转染未修饰的SARS-CoV-2刺突mRNA(SBI)。从A549细胞分泌的干扰素-β转染编码SARS-CoV-2刺突WT(SBI)、或SARS-CoV-2刺突S2P WT、或SARS-CoV-2刺突D614G WT、或SARS-CoV-2刺突S6P_SA的未修饰RNA。因此，不希望受理论的束缚，在用编码SARS-CoV-2刺突WT(SBI)的未修饰RNA转染的A549细胞中观察到的刺突蛋白表达的缺乏(数据未示出)可能由抑制刺突蛋白翻译的强cGAS-STING途径(先天免疫)的激活引起。

实施例10：在K18-hACE2小鼠中评估针对SARS-CoV-2的SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗的免疫原性和功效。

从美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)购买了总共四十(40)只六至八周龄(6-8)雌性K18-hACE2小鼠。所有动物实验都由Noble Life Science与乔治梅森大学(GMU)合作进行。该研究在没有直接参与质量保证的情况下进行，但遵守适用的NLS SOP，并遵循GMU生物医学研究实验室动物护理和使用委员会(IACUC)的指导方针和批准。经过一段适应期后，将小鼠分成四(4)组，每组由十(10)只小鼠组成。表3示出了SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020攻击的剂量组。表4示出了ARS-CoV-2B.1.1617.2δ变体的剂量组。在第0天和第14天，第一组(1)中的动物用溶媒肌内接种，第二组(2)、第三组(3)和第四组(4)中的小鼠用递增剂量的代表性RL-007mRNA疫苗制剂肌内接种，该疫苗制剂根据实施例3制备且包含SEQID NO:52。该疫苗制剂被命名为“RV-1730”，并使用RL-007载体。在第-1、13和27天从小鼠收集血液，并将血清样品用于噬菌斑减少中和试验(PRNT)。在第28天，用5.5×10⁴PFU/小鼠SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020野生型变体(NLS-GMU-WB2-042121)(图8A和图8B)或1.5×10⁴PFU/小鼠SARS-CoV-2B.1.1617.2δ变体(图8C和图8D)鼻内攻击动物。在攻击后十三(13)天内，每天监测所有小鼠的死亡率、体重、体温，并对其临床不适症状进行评分。将临床严重程度评分＞10或较攻击前体重下降＞20％的小鼠人道安乐死并记录为非存活者。攻击后十三(13)天对所有存活的小鼠实施安乐死。从安乐死的小鼠中收获一部分肺组织，置于10％福尔马林中，并运送到Histoserv以便通过H&E染色进行组织病理学测定。

表3：SARS-CoV-2/人/ITA/INMI1/2020攻击研究的剂量组

表4：ARS-CoV-2B.1.1617.2δ变体的剂量组

在攻击后十四(14)天内，每天监测小鼠的死亡率、临床不适症状、体重和体温。基于GMU-IACUC批准的动物研究临床监测表(表5)，每天记录每只小鼠的临床痛苦严重程度评分。简言之，每天记录每只个体小鼠的四个(4)可观察表型类别1)外观、2)活动性、3)态度、4)呼吸窘迫和体重的0(正常)至3(严重患病)的评分。将累积评分为10或更高的小鼠人道安乐死。

表5.临床严重程度评分矩阵

使用噬菌斑减少中和滴定(PRNT)评估在研究的第-1、13和27天收集的血清样本的中和滴度。测试前，通过在56℃下温育30分钟将所有血清热灭活。在EMEM中制备每种血清的六个连续两倍稀释液。稀释液范围为1:4至1:3200，并根据不同时间点和处理组的中和活性增加进行调整。将二十五微升(25μL)的每种稀释液与25μL的SARS-CoV-2B.1.1617.2δ变体BEI：NR-55672病毒原液组合，混合并于37℃温育一(1)小时。从前一晚接种在12孔板中的Vero-E6细胞中除去上清液，并在每个孔中更换为300μL Eagle最低必需培养基(EMEM)。将温育的病毒+稀释的血清混合物添加至Vero E6单层的顶部，并且将板在37℃/5％CO₂下温育1小时。在温育期间每10-15分钟摇动一次板。温育一小时后，将1.5ml含有1:1比例的2XEMEM和0.6％琼脂糖的覆盖层加入到板中。琼脂糖在室温下固化后，将板在37℃/5％CO₂下温育72小时。温育后，向每个孔中加入0.5ml 10％甲醛，加至琼脂糖顶部，并在室温下温育过夜从而固定细胞。轻轻地除去琼脂糖调色板(palette)，并加入0.5ml 1％结晶紫将细胞单层染色10至15分钟。染色后，用水洗涤板以除去过量的染色溶液，并对每种病毒稀释液手动计数噬菌斑。中和滴度计算为最低稀释度的倒数，该最低稀释度导致p.f.u.(噬菌斑形成单位)相对于阴性对照血清减少超过50％(PRNT₅₀)或减少超过90％(PRNT₉₀)。从两个完全接种的雄性收集的人血清和从未处理小鼠收集的血清可分别用作阳性对照和阴性对照。

结果：用RL-007免疫的所有小鼠(第2、3和4组小鼠)在用SARS-CoV-2攻击后没有表现出临床症状严重程度的增加。相反，在SARS-CoV-2攻击后，第1组小鼠表现出临床症状严重程度的急剧增加(图7)。SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗显示对第2、3或4组小鼠体重没有影响(图8A)。与在SARS-CoV-2攻击后至少四天表现出体重下降的对照(第1组)小鼠相比，在SARS-CoV-2攻击后所有免疫小鼠中施用了SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗的小鼠(第2、3和4组小鼠)在体重上没有表现出变化(图8B)。在用SARS-CoV-2B.1.1617.2δ变体进行病毒攻击后观察到类似的趋势(图8C和图8D)。小鼠体温遵循类似的趋势，其中SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗免疫的小鼠在SARS-CoV-2攻击后的几天内显示稳定的体温，而对照小鼠在病毒攻击后至少五天经历体温降低(图9)。所有接种SARS-CoV-2刺突mRNA的小鼠在SARS-CoV-2攻击后存活至少长达13天(图10)。10％的对照小鼠在攻击后存活至少8天(图10)。在免疫后至少13(图11A和图11B)天和27(图11C和图11D)天观察到高中和抗体滴度。

结论：这些数据表明，本文所提供的SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗能够预防受试者出现有症状SARS-CoV-2感染的症状(例如，临床症状严重程度、体温变化和/或体重变化)或患有有症状SARS-CoV-2感染。如本文所证明的，用SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗进行的免疫能够在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答，这通过例如在免疫至少13天或至少27天的时间段之后增加针对SARS-CoV-2的中和抗体滴度来实现。因此，所提供的SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗可治疗感染了SARS-CoV2的受试者，并降低受试者的SARS-CoV-2病毒载量。

实施例11：鼻道和肺组织中的病毒滴度。

收集安乐死的每只小鼠的一部分右肺组织，并将其置于10％福尔马林中。从ABSL3中取出用福尔马林固定的肺组织样品，并运送到Histoserv(19526Amaranth Dr，Germantown，MD 20874)进行组织病理学测定。将在攻击后第3天被指定用于安乐死的每只小鼠的一部分肺组织置于细胞培养基中，以分析肺组织中的病毒滴度。在病毒攻击后三(3)天，测定每组的五(5)只小鼠的鼻道和肺组织中的病毒滴度。通过吸入异氟烷麻醉小鼠，并从每只小鼠收集总体积为100mL的无菌鼻洗涤缓冲液中的鼻洗液，用于测定上呼吸道中的病毒复制和脱落(pfu/mL)。在重度麻醉下对小鼠进行人道安乐死，并收集肺组织。将来自右肺叶的组织置于组织培养基中，匀浆，并用于测定下呼吸道中的病毒滴度。在EMEM中制备每种鼻洗液或肺匀浆的连续十倍稀释液。从前一晚接种在12孔板中的Vero-E6细胞中除去上清液，并在每个孔中更换为300μL稀释的鼻洗液或肺匀浆。将板在37℃/5％CO₂下温育1小时。在温育期间每10-15分钟摇动一次板。温育一小时后，将1.5mL含有1:1比例的2X EMEM和0.6％琼脂糖的覆盖层加入到板中。琼脂糖在室温下固化后，将板在37℃/5％CO₂下温育72小时。温育后，通过向琼脂糖顶部的每个孔中加入0.5mL 10％甲醛并在室温下温育过夜来固定细胞。轻轻地除去琼脂糖调色板，并加入0.5ml 1％结晶紫将细胞单层染色10至15分钟。染色后，用水洗涤板以除去过量的染色溶液，并对每种病毒稀释液手动计数噬菌斑。病毒滴度计算为pfu/mL。

结果和结论：图13示出了用SARS-CoV-2攻击后13天收获的代表性肺组织的组织病理学图像。基于总肺评分、间质性肺炎和血管套确定组织病理学评分(图12)。当与野生型小鼠相比时，用SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗免疫的小鼠对于三种测量的每种测量具有低的平均组织病理学评分，表明SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗提供了针对SARS-CoV-2感染引起的组织水平症状和损伤发作的保护。

实施例12：用RL007免疫的血清的免疫原性。

为了评估SARS-CoV-2δ变体RV-1730在小鼠中的免疫原性，将幼稚的6至8周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5-8只小鼠的组，并通过皮内注射RL007(每只小鼠1μg、5μg、10μg和20μg)来接种。所有小鼠以21天的间隔免疫两次。在第一次免疫后14天和35天，每次免疫前通过尾部放血或心脏穿刺采血。在4℃下使血液凝结过夜，然后通过在4℃下以10,000xg离心10分钟收获血清。将样品在4℃下储存直至进一步分析。为了测定S1-特异性血清IgG滴度和RBD-特异性血清IgG滴度，MaxiSorp板(BioLegend)用100μl重组S1或RBD(1μg/ml)的碳酸钠缓冲液在4℃包被过夜。用PBS-T洗涤孔3次，并将板用200μl封闭缓冲液在RT下温育2小时。用PBS-T洗涤3次后，将板用100μl血清在RT下温育2小时。用PBS-T洗涤板5次，并与HRP缀合的二抗在RT下温育1小时。最后，用PBS-T洗涤板5次，并用100μl 1×TMB底物温育板10分钟。通过加入100μl 1N-HCl终止反应，并使用Cytation7在450nm处读取。对于终点IgG滴度的倒数，将2倍连续稀释的血清加入固定有不同刺突蛋白的孔中。所有程序均与上述相同。

结果和结论：在第一剂和第二剂免疫后观察到RL007免疫的血清针对不同变体刺突蛋白的终点IgG滴度增加(图17)。因此，SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗能够在受试者中诱导针对不同的SARS-CoV-2变体刺突蛋白的免疫应答，这通过例如在第一剂和第二剂免疫至少14天或至少35天的时间段后增加针对SARS-CoV-2的IgG滴度。

实施例13：测定用RL007免疫的血清的中和抗体滴度。

为了测定中和抗体的滴度，我们首先生成了SARS-CoV-2-假病毒颗粒。简言之，按照先前描述的用于SARS-CoV 1、2的方案且经过一些修改，在HEK293T(目录号CRL-3216，ATCC)细胞中生成用SARS-CoV-2刺突蛋白构建体假型化的鼠白血病病毒(MLV)颗粒。所有质粒DNA均使用ZymoPURE II质粒小量制备试剂盒(目录号D4201，Zymo Research)纯化。简言之，将8百万个HEK293T细胞接种到10cm组织培养皿(目录号sc-251460，Santa Cruz)中，该组织培养皿含有16ml DMEM(目录号25-500，Genesee Scientific)+10％FBS(目录号35-010-CV，Corning Life Sciences)且不含任何抗生素。在第2天，使用Lipofectamine 3000试剂(目录号L3000015，ThermoFisher)并用8μg pTG-Luc、6μg pCMV-MLVgag-pol和不同变体的6μgpcDNA3.1-SARS-CoV-2-刺突-C19转染细胞。将细胞再培养48小时。将上清液收集到50ml Falcon管中并以290×g离心7分钟。然后使用合适的注射器将上清液(假型化病毒溶液)通过0.45μm过滤器(目录号sc-358814，Santa Cruz)。然后将假型化病毒溶液等分到冷冻管中并在-80℃下储存。每个10cm的细胞培养皿产生约16ml SARS-CoV-2-PP。使用HEK293-ACE2细胞系(由Codex BioSolutions生产)对SARS-CoV-2-PP进行了质量控制测试。对于采用假病毒的中和测定，通过在56℃下温育血清30分钟来热灭活血清。感染前一天，将7.5×10³个HEK293-ACE2细胞接种到预涂有聚D赖氨酸(目录号3439-100-1，Trevigen,Inc)的384孔白色透明板(目录号353963，Corning Life Sciences)的15μl培养基(DMEM+10％FetalClone II血清，目录号SH3006603，Fisher Scientific)中。将细胞板置于CO₂培养箱(37℃)中。在第2天，将待测血清在96孔复合板上的培养基中稀释。将65μl SARS-CoV-2MLV假病毒颗粒(pp)与26μl上述制备的测试样品混合，并在37℃下温育1小时。在除去384孔细胞板的每个孔中的培养基之后，向每个孔中加入17.5μl的每种血清-pp混合物。将板在4℃下以54xg离心15分钟，然后向每个孔中加入另外的7.5ml培养基。用萤火虫荧光素酶测定试剂盒(CB-80552-010，Codex BioSolutions Inc)测量荧光素酶活性。基于在GraphPadPrism中的曲线拟合计算IC₅₀值(数据归一化为感染性百分比)。

结果和结论：在第一剂和第二剂免疫后，测量了针对SARS-CoV-2假病毒颗粒的中和抗体滴度。基于曲线拟合计算IC₅₀值。观察到菌株特异性中和。曲线和IC₅₀值在图18A、图18B、图19A和图19B中示出。图20中列出了所提供的每种中和测定条件的IC₅₀值。这些数据表明，本文所提供的SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗能够例如通过在第一剂和第二剂免疫至少14或35天后增加针对SARS-CoV-2的中和抗体滴度，在感染了SARS-CoV-2的受试者中诱导针对不同SARS-CoV-2变体刺突蛋白的免疫应答。

实施例14：细胞内细胞因子染色。

收集小鼠的脾脏，并在补充有10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基(R10培养基)中处理成单细胞悬浮液。使用RBC裂解缓冲液(KD Medical)裂解红细胞，并重悬于R10培养基中以终止裂解。对脾细胞进行计数并将每孔200,000个细胞加入96孔板中。然后用2μg PepMix^TMSARS-CoV-2(刺突B.1.617.2/δ)(JPT Peptide TechnologiesGmbH)或单独培养基(作为阴性对照)在37℃下刺激细胞72小时。将板离心，收集上清液并在-80℃冷冻用于细胞因子检测。上清液稀释2倍后，使用基于多重珠的技术(Luminex)测定且用Luminex100/200仪器(Luminex)，通过鼠11-plex试剂盒对分泌的细胞因子进行测量和分析。

结果和结论：72小时后，通过离心收获培养上清液并测量分泌的Th1-细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2-细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)。用SARS-CoV-2S蛋白刺激增加了在所有经SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗处理的小鼠中Th1-细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2-细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的分泌(图14)。这些数据表明，本公开的SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗通过例如诱导针对SARS-CoV-2感染的细胞因子释放，在感染了SARS-CoV-2的受试者中诱导针对SARS-CoV-2的平衡Th1/Th2免疫应答。

实施例15：对脾细胞的IFN-γELISPOT分析。

收集小鼠的脾脏，并在补充有10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基(R10培养基)中处理成单细胞悬浮液。使用RBC裂解缓冲液(KD Medical)裂解红细胞，并重悬于R10培养基中以终止裂解。在6孔板中计数脾细胞，每孔200,000个细胞，并将其加入到小鼠IFN-g ELISpotPLUS(HRP)试剂盒的板(Mabtech)中。然后用2μg PepMix^TMSARS-CoV-2(刺突B.1.617.2/δ)(JPT Peptide Technologies GmbH)或单独培养基(作为阴性对照)在37℃下刺激细胞16小时。按照制造商的说明书显影斑点。斑点通过Cytation7定量，并如图15A所示。

结果和结论：与未接种的对照小鼠相比，来自SARS-CoV-2刺突mRNA接种的小鼠的细胞中存在增加量的IFN-γ斑点(图15B和图15C)。这些数据表明，本公开的SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗可通过例如增加受试者中的IFN-γ水平，在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答。

实施例16：记忆T细胞的Th1/Th2细胞因子分析。

用对应于S蛋白的肽库(S1和S2)重新刺激后，用Th1/Th2细胞因子11-plex小鼠procartaplex试剂盒评估来自RV-1730免疫小鼠的脾细胞的培养上清液的分泌细胞因子。简言之，加强后九周，从每组5只小鼠中分离出脾细胞，并在蛋白质转运抑制剂混合物的存在下用不含来自SARS-CoV-2S蛋白的肽或重叠肽库重新刺激。16小时后，进行细胞内细胞因子染色(ICS)以定量CD4⁺和CD8⁺T细胞应答。没有肽存在时的细胞因子表达被视为背景，并从每个个体小鼠的S1和S2肽库测量的应答中减去。

结果和结论：与未接种的对照小鼠相比，在SARS-CoV-2刺突mRNA接种的小鼠的脾细胞的培养上清液中，CD4⁺/IFN-γ和CD8⁺/IFN-γT细胞应答增加(图16)。本公开的SARS-CoV-2刺突mRNA疫苗可通过例如增加受试者中的CD4⁺/IFN-γ和CD8⁺/IFN-γT细胞应答，在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答。RV-1730通过SARS-CoV-2刺突蛋白肽进行离体刺激，诱导强大的中和活性和CD8 T细胞应答、平衡的Th1/Th2抗体同种型应答以及从T细胞的细胞因子释放。这种诱导强细胞免疫应答的广谱有效性提供了独特的能力，不仅使用RV-1730对抗当前/现有的SARS-CoV-2变体及其后代谱系，而且还实现了用RV-1730对抗未来可能出现的任何新的相关SARS-CoV-2变体。

表8：序列

SEQ ID NO:1，S蛋白的氨基酸序列：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

SEQ ID NO:2，包含D614G(以带下划线的粗体字体标记)和S6P突变(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P，以带下划线的粗斜体字体标记)的S蛋白的氨基酸序列：

SEQ ID NO:3，编码SEQ ID NO:2的非优化DNA序列：

ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGGTGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTTCGCGGGCAGGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCACCTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTCCTGCATTACAAATACCATTTCCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACACCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACCCACCTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAA

SEQ ID NO:4，编码SEQ ID NO:2的非优化RNA序列：

AUGUUUGUUUUUCUUGUUUUAUUGCCACUAGUCUCUAGUCAGUGUGUUAAUCUUACAACCAGAACUCAAUUACCCCCUGCAUACACUAAUUCUUUCACACGUGGUGUUUAUUACCCUGACAAAGUUUUCAGAUCCUCAGUUUUACAUUCAACUCAGGACUUGUUCUUACCUUUCUUUUCCAAUGUUACUUGGUUCCAUGCUAUACAUGUCUCUGGGACCAAUGGUACUAAGAGGUUUGAUAACCCUGUCCUACCAUUUAAUGAUGGUGUUUAUUUUGCUUCCACUGAGAAGUCUAACAUAAUAAGAGGCUGGAUUUUUGGUACUACUUUAGAUUCGAAGACCCAGUCCCUACUUAUUGUUAAUAACGCUACUAAUGUUGUUAUUAAAGUCUGUGAAUUUCAAUUUUGUAAUGAUCCAUUUUUGGGUGUUUAUUACCACAAAAACAACAAAAGUUGGAUGGAAAGUGAGUUCAGAGUUUAUUCUAGUGCGAAUAAUUGCACUUUUGAAUAUGUCUCUCAGCCUUUUCUUAUGGACCUUGAAGGAAAACAGGGUAAUUUCAAAAAUCUUAGGGAAUUUGUGUUUAAGAAUAUUGAUGGUUAUUUUAAAAUAUAUUCUAAGCACACGCCUAUUAAUUUAGUGCGUGAUCUCCCUCAGGGUUUUUCGGCUUUAGAACCAUUGGUAGAUUUGCCAAUAGGUAUUAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUUCUAUUAAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUUACAGAUGCUGUAGACUGUGCACUUGACCCUCUCUCAGAAACAAAGUGUACGUUGAAAUCCUUCACUGUAGAAAAAGGAAUCUAUCAAACUUCUAACUUUAGAGUCCAACCAACAGAAUCUAUUGUUAGAUUUCCUAAUAUUACAAACUUGUGCCCUUUUGGUGAAGUUUUUAACGCCACCAGAUUUGCAUCUGUUUAUGCUUGGAACAGGAAGAGAAUCAGCAACUGUGUUGCUGAUUAUUCUGUCCUAUAUAAUUCCGCAUCAUUUUCCACUUUUAAGUGUUAUGGAGUGUCUCCUACUAAAUUAAAUGAUCUCUGCUUUACUAAUGUCUAUGCAGAUUCAUUUGUAAUUAGAGGUGAUGAAGUCAGACAAAUCGCUCCAGGGCAAACUGGAAAGAUUGCUGAUUAUAAUUAUAAAUUACCAGAUGAUUUUACAGGCUGCGUUAUAGCUUGGAAUUCUAACAAUCUUGAUUCUAAGGUUGGUGGUAAUUAUAAUUACCUGUAUAGAUUGUUUAGGAAGUCUAAUCUCAAACCUUUUGAGAGAGAUAUUUCAACUGAAAUCUAUCAGGCCGGUAGCACACCUUGUAAUGGUGUUGAAGGUUUUAAUUGUUACUUUCCUUUACAAUCAUAUGGUUUCCAACCCACUAAUGGUGUUGGUUACCAACCAUACAGAGUAGUAGUACUUUCUUUUGAACUUCUACAUGCACCAGCAACUGUUUGUGGACCUAAAAAGUCUACUAAUUUGGUUAAAAACAAAUGUGUCAAUUUCAACUUCAAUGGUUUAACAGGCACAGGUGUUCUUACUGAGUCUAACAAAAAGUUUCUGCCUUUCCAACAAUUUGGCAGAGACAUUGCUGACACUACUGAUGCUGUCCGUGAUCCACAGACACUUGAGAUUCUUGACAUUACACCAUGUUCUUUUGGUGGUGUCAGUGUUAUAACACCAGGAACAAAUACUUCUAACCAGGUUGCUGUUCUUUAUCAGGGUGUUAACUGCACAGAAGUCCCUGUUGCUAUUCAUGCAGAUCAACUUACUCCUACUUGGCGUGUUUAUUCUACAGGUUCUAAUGUUUUUCAAACACGUGCAGGCUGUUUAAUAGGGGCUGAACAUGUCAACAACUCAUAUGAGUGUGACAUACCCAUUGGUGCAGGUAUAUGCGCUAGUUAUCAGACUCAGACUAAUUCUCCUUCGCGGGCAGGUAGUGUAGCUAGUCAAUCCAUCAUUGCCUACACUAUGUCACUUGGUGCAGAAAAUUCAGUUGCUUACUCUAAUAACUCUAUUGCCAUACCCACAAAUUUUACUAUUAGUGUUACCACAGAAAUUCUACCAGUGUCUAUGACCAAGACAUCAGUAGAUUGUACAAUGUACAUUUGUGGUGAUUCAACUGAAUGCAGCAAUCUUUUGUUGCAAUAUGGCAGUUUUUGUACACAAUUAAACCGUGCUUUAACUGGAAUAGCUGUUGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGUUUUUGCACAAGUCAAACAAAUUUACAAAACACCACCAAUUAAAGAUUUUGGUGGUUUUAAUUUUUCACAAAUAUUACCAGAUCCAUCAAAACCAAGCAAGAGGUCACCUAUUGAAGAUCUACUUUUCAACAAAGUGACACUUGCAGAUGCUGGCUUCAUCAAACAAUAUGGUGAUUGCCUUGGUGAUAUUGCUGCUAGAGACCUCAUUUGUGCACAAAAGUUUAACGGCCUUACUGUUUUGCCACCUUUGCUCACAGAUGAAAUGAUUGCUCAAUACACUUCUGCACUGUUAGCGGGUACAAUCACUUCUGGUUGGACCUUUGGUGCAGGUCCUGCAUUACAAAUACCAUUUCCUAUGCAAAUGGCUUAUAGGUUUAAUGGUAUUGGAGUUACACAGAAUGUUCUCUAUGAGAACCAAAAAUUGAUUGCCAACCAAUUUAAUAGUGCUAUUGGCAAAAUUCAAGACUCACUUUCUUCCACACCAAGUGCACUUGGAAAACUUCAAGAUGUGGUCAACCAAAAUGCACAAGCUUUAAACACGCUUGUUAAACAACUUAGCUCCAAUUUUGGUGCAAUUUCAAGUGUUUUAAAUGAUAUCCUUUCACGUCUUGACCCACCUGAGGCUGAAGUGCAAAUUGAUAGGUUGAUCACAGGCAGACUUCAAAGUUUGCAGACAUAUGUGACUCAACAAUUAAUUAGAGCUGCAGAAAUCAGAGCUUCUGCUAAUCUUGCUGCUACUAAAAUGUCAGAGUGUGUACUUGGACAAUCAAAAAGAGUUGAUUUUUGUGGAAAGGGCUAUCAUCUUAUGUCCUUCCCUCAGUCAGCACCUCAUGGUGUAGUCUUCUUGCAUGUGACUUAUGUCCCUGCACAAGAAAAGAACUUCACAACUGCUCCUGCCAUUUGUCAUGAUGGAAAAGCACACUUUCCUCGUGAAGGUGUCUUUGUUUCAAAUGGCACACACUGGUUUGUAACACAAAGGAAUUUUUAUGAACCACAAAUCAUUACUACAGACAACACAUUUGUGUCUGGUAACUGUGAUGUUGUAAUAGGAAUUGUCAACAACACAGUUUAUGAUCCUUUGCAACCUGAAUUAGACUCAUUCAAGGAGGAGUUAGAUAAAUAUUUUAAGAAUCAUACAUCACCAGAUGUUGAUUUAGGUGACAUCUCUGGCAUUAAUGCUUCAGUUGUAAACAUUCAAAAAGAAAUUGACCGCCUCAAUGAGGUUGCCAAGAAUUUAAAUGAAUCUCUCAUCGAUCUCCAAGAACUUGGAAAGUAUGAGCAGUAUAUAAAAUGGCCAUGGUACAUUUGGCUAGGUUUUAUAGCUGGCUUGAUUGCCAUAGUAAUGGUGACAAUUAUGCUUUGCUGUAUGACCAGUUGCUGUAGUUGUCUCAAGGGCUGUUGUUCUUGUGGAUCCUGCUGCAAAUUUGAUGAAGACGACUCUGAGCCAGUGCUCAAAGGAGUCAAAUUACAUUACACAUAA

SEQ ID NO:5，包含以下突变的S蛋白的氨基酸序列：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N的δ变体突变；S2P(K986P和V987P)；和弗林蛋白酶样切割位点突变(R682S和R685G)：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.

SEQ ID NO:6，包含以下突变的S蛋白的氨基酸序列：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、D950N的δ变体突变；S2P(K986P和V987P)；和弗林蛋白酶样切割位点突变(R682S和R685G)。与SEQ ID NO:5相比，它缺乏P681R突变：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.

SEQ ID NO:7，包含以下突变的S蛋白的氨基酸序列：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N的δ变体突变；S6P(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P)；和弗林蛋白酶样切割位点突变(R682S和R685G)。与SEQ ID NO:5相比，它还包含F817P、A892P、A899P和A942P的突变：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.

SEQ ID NO:8，编码SEQ ID NO:7的优化DNA序列：

ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGCCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAAATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGA

SEQ ID NO:9，编码SEQ ID NO:7的优化RNA序列：

AUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUCAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUUCCUCCAGCCUACACAAACUCUUUUACACGGGGCGUGUACUAUCCUGACAAGGUGUUCCGGUCCAGCGUGCUGCACUCAACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUCACCUGGUUCCACGCCAUCCACGUGUCUGGCACCAAUGGCACAAAGCGAUUCGAUAACCCCGUGCUGCCUUUCAACGACGGCGUGUACUUUGCCUCCAUCGAGAAGUCCAACAUCAUCCGGGGCUGGAUCUUCGGGACCACACUGGAUAGCAAGACCCAGUCUCUGCUGAUCGUAAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCUUUCCUCGAUGUGUACUACCACAAGAACAACAAGUCUUGGAUGGAAUCGGGCGUGUAUAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAAUACGUGAGCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAACAAGGCAAUUUUAAGAACCUGAGAGAAUUCGUGUUCAAAAAUAUAGACGGCUAUUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUUAAUCUGGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCAGCGCCCUCGAACCUCUGGUGGACCUGCCAAUCGGCAUCAACAUUACAAGAUUCCAGACGCUGCUCGCUCUGCACAGAUCUUACCUGACCCCUGGCGACAGCAGCAGCGGCUGGACCGCCGGCGCCGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUUCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACUGAUGCCGUGGAUUGCGCCCUGGACCCUCUGUCCGAAACCAAAUGUACACUGAAGUCUUUUACCGUGGAAAAAGGAAUCUACCAGACUUCCAACUUCCGGGUGCAGCCGACCGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCUAACAUCACAAACCUGUGCCCCUUUGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCUAGCGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGAUUACAGCGUGCUGUACAAUAGCGCCUCUUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGAUCUGUGUUUUACAAACGUGUAUGCCGACUCAUUCGUAAUCAGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCUCCUGGACAGACAGGCAAAAUCGCGGACUACAACUAUAAGCUGCCUGAUGACUUCACAGGAUGUGUGAUCGCAUGGAACUCCAAUAACCUCGACAGCAAGGUGGGCGGAAAUUACAAUUACCGCUACAGACUGUUUAGAAAGAGCAAUCUGAAACCUUUCGAGAGAGACAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGCAGCAAGCCCUGUAACGGCGUCGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUCCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCAUGCUCCUGCUACAGUGUGUGGUCCUAAGAAGAGCACCAACCUGGUUAAGAACAAGUGCGUGAAUUUUAACUUCAAUGGACUGACCGGAACCGGCGUGCUGACCGAAAGCAACAAGAAAUUCCUGCCUUUUCAGCAGUUUGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGAUCCACAAACCCUGGAAAUCCUGGACAUCACACCUUGCUCAUUUGGAGGGGUGUCGGUGAUCACACCUGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGAGUGAAUUGUACCGAGGUCCCCGUGGCCAUUCACGCCGACCAGCUGACCCCUACCUGGCGGGUGUACUCCACCGGCUCUAACGUAUUCCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGCGCAGAACACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCUAUCGGAGCCGGGAUCUGCGCUAGCUACCAGACCCAGACAAACUCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGUGGCCAGCCAGUCUAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAAAACAGCGUUGCCUACAGCAACAAUUCUAUCGCCAUCCCUACAAACUUCACCAUCUCCGUGACCACCGAGAUCCUGCCUGUCAGCAUGACAAAGACCAGCGUAGACUGCACAAUGUACAUCUGCGGAGAUUCCACCGAGUGUAGUAACCUCCUGCUGCAAUACGGAUCUUUCUGUACUCAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUUGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGUUUUCGCCCAGGUUAAGCAGAUCUACAAAACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGAGGCUUUAACUUCUCCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAACAGUACGGCGAUUGCCUGGGAGACAUCGCCGCUAGAGAUCUAAUUUGCGCCCAAAAGUUUAACGGCCUGACAGUGCUGCCUCCACUGCUGACAGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCUGGUACCAUCACAUCUGGCUGGACCUUUGGCGCCGGCCCCGCCCUCCAGAUCCCUUUCCCCAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAAAACCAGAAACUGAUCGCCAACCAGUUCAAUAGCGCGAUCGGCAAAAUCCAGGAUAGCCUCAGCUCUACACCCAGCGCUCUUGGCAAGCUGCAAAACGUGGUGAACCAGAAUGCCCAGGCCCUUAACACCCUGGUGAAGCAGCUAUCCUCUAAUUUCGGUGCCAUCAGCAGCGUGCUGAAUGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCUGAGGCCGAAGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGAAGACUGCAGAGCCUGCAAACCUACGUGACCCAGCAACUGAUCCGGGCCGCAGAAAUCCGGGCCUCCGCUAACCUGGCCGCUACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGUCAAAGCAAGCGCGUGGACUUCUGUGGAAAAGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCUCCACACGGCGUGGUGUUCCUGCAUGUGACUUACGUGCCUGCCCAGGAAAAGAACUUCACCACCGCCCCUGCCAUUUGUCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCCGGGAAGGCGUGUUUGUGUCUAACGGAACACACUGGUUUGUGACUCAAAGAAACUUCUACGAGCCACAGAUCAUCACCACAGAUAACACCUUCGUCAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAAUACUGUGUACGACCCCCUGCAGCCAGAGCUCGAUUCUUUCAAAGAGGAACUGGAUAAGUACUUCAAGAACCACACAUCCCCCGACGUCGACCUGGGCGAUAUCAGCGGCAUUAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAAAUCGAUAGACUGAACGAGGUGGCAAAGAACCUGAAUGAGUCCCUGAUUGACCUGCAAGAGCUCGGGAAGUACGAGCAGUAUAUCAAGUGGCCUUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCGGGCCUGAUCGCCAUCGUUAUGGUGACGAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGUUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGUUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCUGUGCUGAAGGGCGUUAAGCUGCACUACACCUGA

SEQ ID NO:10，包含以下突变的S蛋白的氨基酸序列：T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G和D950N的δ变体突变；S6P(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P)；和弗林蛋白酶样切割位点突变(R682S和R685G)。与SEQ ID NO:7相比，它缺乏P681R突变：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.

SEQ ID NO:11，包含以下突变的S蛋白的氨基酸序列：T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N的δ变体突变；S6P(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P)；和弗林蛋白酶样切割位点突变(R682S和R685G)：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHFSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSVLEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGLTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.

SEQ ID NO:12，编码SEQ ID NO:11的优化DNA序列：ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACTTCTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGTCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCCTGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAcATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGA

SEQ ID NO:13，编码SEQ ID NO:11的优化RNA序列：AUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUCAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUUCCUCCAGCCUACACAAACUCUUUUACACGGGGCGUGUACUAUCCUGACAAGGUGUUCCGGUCCAGCGUGCUGCACUCAACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUCACCUGGUUCCACGCCAUCCACUUCUCUGGCACCAAUGGCACAAAGCGAUUCGAUAACCCCGUGCUGCCUUUCAACGACGGCGUGUACUUUGCCUCCAUCGAGAAGUCCAACAUCAUCCGGGGCUGGAUCUUCGGGACCACACUGGAUAGCAAGACCCAGUCUCUGCUGAUCGUAAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCUUUCCUCGAUGUGUACUACCACAAGAACAACAAGUCUUGGAUGGAAUCGGGCGUGUAUAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAAUACGUGAGCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAACAAGGCAAUUUUAAGAACCUGAGAGAAUUCGUGUUCAAAAAUAUAGACGGCUAUUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUUAAUCUGGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCAGCGUCCUCGAACCUCUGGUGGACCUGCCAAUCGGCAUCAACAUUACAAGAUUCCAGACGCUGCUCGCUCUGCACAGAUCUUACCUGACCCCUGGCGACAGCAGCAGCGGCCUGACCGCCGGCGCCGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUUCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACUGAUGCCGUGGAUUGCGCCCUGGACCCUCUGUCCGAAACCAAAUGUACACUGAAGUCUUUUACCGUGGAAAAAGGAAUCUACCAGACUUCCAACUUCCGGGUGCAGCCGACCGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCUAACAUCACAAACCUGUGCCCCUUUGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCUAGCGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGAUUACAGCGUGCUGUACAAUAGCGCCUCUUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGAUCUGUGUUUUACAAACGUGUAUGCCGACUCAUUCGUAAUCAGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCUCCUGGACAGACAGGCAACAUCGCGGACUACAACUAUAAGCUGCCUGAUGACUUCACAGGAUGUGUGAUCGCAUGGAACUCCAAUAACCUCGACAGCAAGGUGGGCGGAAAUUACAAUUACCGCUACAGACUGUUUAGAAAGAGCAAUCUGAAACCUUUCGAGAGAGACAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGCAGCAAGCCCUGUAACGGCGUCGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUCCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCAUGCUCCUGCUACAGUGUGUGGUCCUAAGAAGAGCACCAACCUGGUUAAGAACAAGUGCGUGAAUUUUAACUUCAAUGGACUGACCGGAACCGGCGUGCUGACCGAAAGCAACAAGAAAUUCCUGCCUUUUCAGCAGUUUGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGAUCCACAAACCCUGGAAAUCCUGGACAUCACACCUUGCUCAUUUGGAGGGGUGUCGGUGAUCACACCUGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGAGUGAAUUGUACCGAGGUCCCCGUGGCCAUUCACGCCGACCAGCUGACCCCUACCUGGCGGGUGUACUCCACCGGCUCUAACGUAUUCCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGCGCAGAACACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCUAUCGGAGCCGGGAUCUGCGCUAGCUACCAGACCCAGACAAACUCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGUGGCCAGCCAGUCUAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAAAACAGCGUUGCCUACAGCAACAAUUCUAUCGCCAUCCCUACAAACUUCACCAUCUCCGUGACCACCGAGAUCCUGCCUGUCAGCAUGACAAAGACCAGCGUAGACUGCACAAUGUACAUCUGCGGAGAUUCCACCGAGUGUAGUAACCUCCUGCUGCAAUACGGAUCUUUCUGUACUCAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUUGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGUUUUCGCCCAGGUUAAGCAGAUCUACAAAACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGAGGCUUUAACUUCUCCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAACAGUACGGCGAUUGCCUGGGAGACAUCGCCGCUAGAGAUCUAAUUUGCGCCCAAAAGUUUAACGGCCUGACAGUGCUGCCUCCACUGCUGACAGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCUGGUACCAUCACAUCUGGCUGGACCUUUGGCGCCGGCCCCGCCCUCCAGAUCCCUUUCCCCAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAAAACCAGAAACUGAUCGCCAACCAGUUCAAUAGCGCGAUCGGCAAAAUCCAGGAUAGCCUCAGCUCUACACCCAGCGCUCUUGGCAAGCUGCAAAACGUGGUGAACCAGAAUGCCCAGGCCCUUAACACCCUGGUGAAGCAGCUAUCCUCUAAUUUCGGUGCCAUCAGCAGCGUGCUGAAUGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCUGAGGCCGAAGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGAAGACUGCAGAGCCUGCAAACCUACGUGACCCAGCAACUGAUCCGGGCCGCAGAAAUCCGGGCCUCCGCUAACCUGGCCGCUACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGUCAAAGCAAGCGCGUGGACUUCUGUGGAAAAGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCUCCACACGGCGUGGUGUUCCUGCAUGUGACUUACGUGCCUGCCCAGGAAAAGAACUUCACCACCGCCCCUGCCAUUUGUCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCCGGGAAGGCGUGUUUGUGUCUAACGGAACACACUGGUUUGUGACUCAAAGAAACUUCUACGAGCCACAGAUCAUCACCACAGAUAACACCUUCGUCAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAAUACUGUGUACGACCCCCUGCAGCCAGAGCUCGAUUCUUUCAAAGAGGAACUGGAUAAGUACUUCAAGAACCACACAUCCCCCGACGUCGACCUGGGCGAUAUCAGCGGCAUUAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAAAUCGAUAGACUGAACGAGGUGGCAAAGAACCUGAAUGAGUCCCUGAUUGACCUGCAAGAGCUCGGGAAGUACGAGCAGUAUAUCAAGUGGCCUUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCGGGCCUGAUCGCCAUCGUUAUGGUGACGAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGUUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGUUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCUGUGCUGAAGGGCGUUAAGCUGCACUACACCUGA

SEQ ID NO:14，包含以下突变的S蛋白的氨基酸序列：T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N的δ变体突变；E484K的β变体突变；N440K的变体突变；S6P(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P)；和弗林蛋白酶样切割位点突变(R682S和R685G)：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHFSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSVLEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGLTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT.

SEQ ID NO:15，编码SEQ ID NO:14的优化DNA序列：

ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACTTCTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGTCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCCTGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAcATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAAGCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCAAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGA

SEQ ID NO:16，编码SEQ ID NO:14的优化RNA序列：

AUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUCAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUUCCUCCAGCCUACACAAACUCUUUUACACGGGGCGUGUACUAUCCUGACAAGGUGUUCCGGUCCAGCGUGCUGCACUCAACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUCACCUGGUUCCACGCCAUCCACUUCUCUGGCACCAAUGGCACAAAGCGAUUCGAUAACCCCGUGCUGCCUUUCAACGACGGCGUGUACUUUGCCUCCAUCGAGAAGUCCAACAUCAUCCGGGGCUGGAUCUUCGGGACCACACUGGAUAGCAAGACCCAGUCUCUGCUGAUCGUAAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCUUUCCUCGAUGUGUACUACCACAAGAACAACAAGUCUUGGAUGGAAUCGGGCGUGUAUAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAAUACGUGAGCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAACAAGGCAAUUUUAAGAACCUGAGAGAAUUCGUGUUCAAAAAUAUAGACGGCUAUUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUUAAUCUGGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCAGCGUCCUCGAACCUCUGGUGGACCUGCCAAUCGGCAUCAACAUUACAAGAUUCCAGACGCUGCUCGCUCUGCACAGAUCUUACCUGACCCCUGGCGACAGCAGCAGCGGCCUGACCGCCGGCGCCGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUUCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACUGAUGCCGUGGAUUGCGCCCUGGACCCUCUGUCCGAAACCAAAUGUACACUGAAGUCUUUUACCGUGGAAAAAGGAAUCUACCAGACUUCCAACUUCCGGGUGCAGCCGACCGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCUAACAUCACAAACCUGUGCCCCUUUGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCUAGCGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGAUUACAGCGUGCUGUACAAUAGCGCCUCUUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGAUCUGUGUUUUACAAACGUGUAUGCCGACUCAUUCGUAAUCAGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCUCCUGGACAGACAGGCAACAUCGCGGACUACAACUAUAAGCUGCCUGAUGACUUCACAGGAUGUGUGAUCGCAUGGAACUCCAAUAAGCUCGACAGCAAGGUGGGCGGAAAUUACAAUUACCGCUACAGACUGUUUAGAAAGAGCAAUCUGAAACCUUUCGAGAGAGACAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGCAGCAAGCCCUGUAACGGCGUCAAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUCCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCAUGCUCCUGCUACAGUGUGUGGUCCUAAGAAGAGCACCAACCUGGUUAAGAACAAGUGCGUGAAUUUUAACUUCAAUGGACUGACCGGAACCGGCGUGCUGACCGAAAGCAACAAGAAAUUCCUGCCUUUUCAGCAGUUUGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGAUCCACAAACCCUGGAAAUCCUGGACAUCACACCUUGCUCAUUUGGAGGGGUGUCGGUGAUCACACCUGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGAGUGAAUUGUACCGAGGUCCCCGUGGCCAUUCACGCCGACCAGCUGACCCCUACCUGGCGGGUGUACUCCACCGGCUCUAACGUAUUCCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGCGCAGAACACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCUAUCGGAGCCGGGAUCUGCGCUAGCUACCAGACCCAGACAAACUCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGUGGCCAGCCAGUCUAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAAAACAGCGUUGCCUACAGCAACAAUUCUAUCGCCAUCCCUACAAACUUCACCAUCUCCGUGACCACCGAGAUCCUGCCUGUCAGCAUGACAAAGACCAGCGUAGACUGCACAAUGUACAUCUGCGGAGAUUCCACCGAGUGUAGUAACCUCCUGCUGCAAUACGGAUCUUUCUGUACUCAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUUGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGUUUUCGCCCAGGUUAAGCAGAUCUACAAAACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGAGGCUUUAACUUCUCCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAACAGUACGGCGAUUGCCUGGGAGACAUCGCCGCUAGAGAUCUAAUUUGCGCCCAAAAGUUUAACGGCCUGACAGUGCUGCCUCCACUGCUGACAGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCUGGUACCAUCACAUCUGGCUGGACCUUUGGCGCCGGCCCCGCCCUCCAGAUCCCUUUCCCCAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAAAACCAGAAACUGAUCGCCAACCAGUUCAAUAGCGCGAUCGGCAAAAUCCAGGAUAGCCUCAGCUCUACACCCAGCGCUCUUGGCAAGCUGCAAAACGUGGUGAACCAGAAUGCCCAGGCCCUUAACACCCUGGUGAAGCAGCUAUCCUCUAAUUUCGGUGCCAUCAGCAGCGUGCUGAAUGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCUGAGGCCGAAGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGAAGACUGCAGAGCCUGCAAACCUACGUGACCCAGCAACUGAUCCGGGCCGCAGAAAUCCGGGCCUCCGCUAACCUGGCCGCUACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGUCAAAGCAAGCGCGUGGACUUCUGUGGAAAAGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCUCCACACGGCGUGGUGUUCCUGCAUGUGACUUACGUGCCUGCCCAGGAAAAGAACUUCACCACCGCCCCUGCCAUUUGUCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCCGGGAAGGCGUGUUUGUGUCUAACGGAACACACUGGUUUGUGACUCAAAGAAACUUCUACGAGCCACAGAUCAUCACCACAGAUAACACCUUCGUCAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAAUACUGUGUACGACCCCCUGCAGCCAGAGCUCGAUUCUUUCAAAGAGGAACUGGAUAAGUACUUCAAGAACCACACAUCCCCCGACGUCGACCUGGGCGAUAUCAGCGGCAUUAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAAAUCGAUAGACUGAACGAGGUGGCAAAGAACCUGAAUGAGUCCCUGAUUGACCUGCAAGAGCUCGGGAAGUACGAGCAGUAUAUCAAGUGGCCUUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCGGGCCUGAUCGCCAUCGUUAUGGUGACGAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGUUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGUUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCUGUGCUGAAGGGCGUUAAGCUGCACUACACCUGA

SEQ ID NO:17，3'UTR的DNA序列：

GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC

SEQ ID NO:18，3'UTR的RNA序列：

GCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGC

SEQ ID NO:19，β-球蛋白5'UTR的DNA序列：

ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC

SEQ ID NO:20，β-球蛋白5'UTR的RNA序列：

ACAUUUGCUUCUGACACAACUGUGUUCACUAGCAACCUCAAACAGACACC

SEQ ID NO:21，SYS UTR 2.0的DNA序列：

GGCGCTCGAGCAGGTTCAGAAGGAGATCAAAAACCCCCAAGGATCAAACGCCACC

SEQ ID NO:22，SYS UTR 2.0的RNA序列：

GGCGCUCGAGCAGGUUCAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAACGCCACC

SEQ ID NO:23，SYS UTR 1.0的DNA序列：

GGGCGCTCGAGCAGGTTCAGAAGGAGATCAAAAACCCCCAAGGATCAAAC

SEQ ID NO:24，SYS UTR 1.0的RNA序列：

GGGCGCUCGAGCAGGUUCAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAAC

SEQ ID NO:25，SYS4 5'UTR的DNA序列：

GGCGCACGAGCAGGGAGAGAAGGAGATCAAAAACCCCCAAGGATCAAACGCCACC

SEQ ID NO:26，SYS4 5'UTR的RNA序列：

GGCGCACGAGCAGGGAGAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAACGCCACC

SEQ ID NO:27，polyA 40的DNA和RNA序列：

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:28，polyA 60的DNA和RNA序列：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:29，polyA信号HSV的DNA序列：

CGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTC

SEQ ID NO:30，polyA信号HSV的RNA序列：

CGGCAAUAAAAAGACAGAAUAAAACGCACGGUGUUGGGUCGUUUGUUC

SEQ ID NO:31，示例性5'UTR-δC S6P-3'UTR-polyA的DNA序列：

GGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGCCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAAATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCAATAGGCCGAAATCGGCAAGCGCGATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:32，示例性5'UTR-δC S6P-3'UTR-polyA的RNA序列：

GGACAUUUGCUUCUGACACAACUGUGUUCACUAGCAACCUCAAACAGACACCGCCACCAUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUCAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGAGAACAAGAACACAGCUUCCUCCAGCCUACACAAACUCUUUUACACGGGGCGUGUACUAUCCUGACAAGGUGUUCCGGUCCAGCGUGCUGCACUCAACCCAAGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUCACCUGGUUCCACGCCAUCCACGUGUCUGGCACCAAUGGCACAAAGCGAUUCGAUAACCCCGUGCUGCCUUUCAACGACGGCGUGUACUUUGCCUCCAUCGAGAAGUCCAACAUCAUCCGGGGCUGGAUCUUCGGGACCACACUGGAUAGCAAGACCCAGUCUCUGCUGAUCGUAAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCUUUCCUCGAUGUGUACUACCACAAGAACAACAAGUCUUGGAUGGAAUCGGGCGUGUAUAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAAUACGUGAGCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAACAAGGCAAUUUUAAGAACCUGAGAGAAUUCGUGUUCAAAAAUAUAGACGGCUAUUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUUAAUCUGGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCAGCGCCCUCGAACCUCUGGUGGACCUGCCAAUCGGCAUCAACAUUACAAGAUUCCAGACGCUGCUCGCUCUGCACAGAUCUUACCUGACCCCUGGCGACAGCAGCAGCGGCUGGACCGCCGGCGCCGCCGCUUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUUCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACUGAUGCCGUGGAUUGCGCCCUGGACCCUCUGUCCGAAACCAAAUGUACACUGAAGUCUUUUACCGUGGAAAAAGGAAUCUACCAGACUUCCAACUUCCGGGUGCAGCCGACCGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCUAACAUCACAAACCUGUGCCCCUUUGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCUAGCGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGAUUACAGCGUGCUGUACAAUAGCGCCUCUUUCAGCACCUUCAAAUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGAUCUGUGUUUUACAAACGUGUAUGCCGACUCAUUCGUAAUCAGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCUCCUGGACAGACAGGCAAAAUCGCGGACUACAACUAUAAGCUGCCUGAUGACUUCACAGGAUGUGUGAUCGCAUGGAACUCCAAUAACCUCGACAGCAAGGUGGGCGGAAAUUACAAUUACCGCUACAGACUGUUUAGAAAGAGCAAUCUGAAACCUUUCGAGAGAGACAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGCAGCAAGCCCUGUAACGGCGUCGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGCAGAGCUACGGCUUCCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCAUGCUCCUGCUACAGUGUGUGGUCCUAAGAAGAGCACCAACCUGGUUAAGAACAAGUGCGUGAAUUUUAACUUCAAUGGACUGACCGGAACCGGCGUGCUGACCGAAAGCAACAAGAAAUUCCUGCCUUUUCAGCAGUUUGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGAUCCACAAACCCUGGAAAUCCUGGACAUCACACCUUGCUCAUUUGGAGGGGUGUCGGUGAUCACACCUGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGAGUGAAUUGUACCGAGGUCCCCGUGGCCAUUCACGCCGACCAGCUGACCCCUACCUGGCGGGUGUACUCCACCGGCUCUAACGUAUUCCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGCGCAGAACACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCUAUCGGAGCCGGGAUCUGCGCUAGCUACCAGACCCAGACAAACUCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGUGGCCAGCCAGUCUAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAAAACAGCGUUGCCUACAGCAACAAUUCUAUCGCCAUCCCUACAAACUUCACCAUCUCCGUGACCACCGAGAUCCUGCCUGUCAGCAUGACAAAGACCAGCGUAGACUGCACAAUGUACAUCUGCGGAGAUUCCACCGAGUGUAGUAACCUCCUGCUGCAAUACGGAUCUUUCUGUACUCAGCUGAACAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUUGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGUUUUCGCCCAGGUUAAGCAGAUCUACAAAACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGAGGCUUUAACUUCUCCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAACAGUACGGCGAUUGCCUGGGAGACAUCGCCGCUAGAGAUCUAAUUUGCGCCCAAAAGUUUAACGGCCUGACAGUGCUGCCUCCACUGCUGACAGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCUGGUACCAUCACAUCUGGCUGGACCUUUGGCGCCGGCCCCGCCCUCCAGAUCCCUUUCCCCAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAAAACCAGAAACUGAUCGCCAACCAGUUCAAUAGCGCGAUCGGCAAAAUCCAGGAUAGCCUCAGCUCUACACCCAGCGCUCUUGGCAAGCUGCAAAACGUGGUGAACCAGAAUGCCCAGGCCCUUAACACCCUGGUGAAGCAGCUAUCCUCUAAUUUCGGUGCCAUCAGCAGCGUGCUGAAUGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCCCCUGAGGCCGAAGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGAAGACUGCAGAGCCUGCAAACCUACGUGACCCAGCAACUGAUCCGGGCCGCAGAAAUCCGGGCCUCCGCUAACCUGGCCGCUACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGUCAAAGCAAGCGCGUGGACUUCUGUGGAAAAGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGAGCGCUCCACACGGCGUGGUGUUCCUGCAUGUGACUUACGUGCCUGCCCAGGAAAAGAACUUCACCACCGCCCCUGCCAUUUGUCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCCGGGAAGGCGUGUUUGUGUCUAACGGAACACACUGGUUUGUGACUCAAAGAAACUUCUACGAGCCACAGAUCAUCACCACAGAUAACACCUUCGUCAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAAUACUGUGUACGACCCCCUGCAGCCAGAGCUCGAUUCUUUCAAAGAGGAACUGGAUAAGUACUUCAAGAACCACACAUCCCCCGACGUCGACCUGGGCGAUAUCAGCGGCAUUAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAAAUCGAUAGACUGAACGAGGUGGCAAAGAACCUGAAUGAGUCCCUGAUUGACCUGCAAGAGCUCGGGAAGUACGAGCAGUAUAUCAAGUGGCCUUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCGGGCCUGAUCGCCAUCGUUAUGGUGACGAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGUUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGUUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCUGUGCUGAAGGGCGUUAAGCUGCACUACACCUGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCCAAUAGGCCGAAAUCGGCAAGCGCGAUCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:33，质粒DNA序列：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTTAATACGACTCACTATAAGGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGAGAACAAGAACACAGCTTCCTCCAGCCTACACAAACTCTTTTACACGGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTCCGGTCCAGCGTGCTGCACTCAACCCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCTGGCACCAATGGCACAAAGCGATTCGATAACCCCGTGCTGCCTTTCAACGACGGCGTGTACTTTGCCTCCATCGAGAAGTCCAACATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGGACCACACTGGATAGCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTAAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCTTTCCTCGATGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCTTGGATGGAATCGGGCGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAATACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAAGGCAATTTTAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTCAAAAATATAGACGGCTATTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATTAATCTGGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCAGCGCCCTCGAACCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAGACGCTGCTCGCTCTGCACAGATCTTACCTGACCCCTGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACTGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAAACCAAATGTACACTGAAGTCTTTTACCGTGGAAAAAGGAATCTACCAGACTTCCAACTTCCGGGTGCAGCCGACCGAGAGCATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCTAGCGTGTACGCCTGGAATAGAAAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGATTACAGCGTGCTGTACAATAGCGCCTCTTTCAGCACCTTCAAATGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACAAACGTGTATGCCGACTCATTCGTAATCAGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGACAGACAGGCAAAATCGCGGACTACAACTATAAGCTGCCTGATGACTTCACAGGATGTGTGATCGCATGGAACTCCAATAACCTCGACAGCAAGGTGGGCGGAAATTACAATTACCGCTACAGACTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAACCTTTCGAGAGAGACATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCAAGCCCTGTAACGGCGTCGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACAGTGTGTGGTCCTAAGAAGAGCACCAACCTGGTTAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACCGGAACCGGCGTGCTGACCGAAAGCAACAAGAAATTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGATCCACAAACCCTGGAAATCCTGGACATCACACCTTGCTCATTTGGAGGGGTGTCGGTGATCACACCTGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGGAGTGAATTGTACCGAGGTCCCCGTGGCCATTCACGCCGACCAGCTGACCCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACCGGCTCTAACGTATTCCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGCGCAGAACACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGAGCCGGGATCTGCGCTAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCAGAAGCAGAGCCGGAAGCGTGGCCAGCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAAAACAGCGTTGCCTACAGCAACAATTCTATCGCCATCCCTACAAACTTCACCATCTCCGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCAGCATGACAAAGACCAGCGTAGACTGCACAATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGTAGTAACCTCCTGCTGCAATACGGATCTTTCTGTACTCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTTGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTTTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAAACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGAGGCTTTAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCCCCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAACAGTACGGCGATTGCCTGGGAGACATCGCCGCTAGAGATCTAATTTGCGCCCAAAAGTTTAACGGCCTGACAGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCTGGTACCATCACATCTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCCGCCCTCCAGATCCCTTTCCCCATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAACTGATCGCCAACCAGTTCAATAGCGCGATCGGCAAAATCCAGGATAGCCTCAGCTCTACACCCAGCGCTCTTGGCAAGCTGCAAAACGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTTAACACCCTGGTGAAGCAGCTATCCTCTAATTTCGGTGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCTGAGGCCGAAGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGACTGCAGAGCCTGCAAACCTACGTGACCCAGCAACTGATCCGGGCCGCAGAAATCCGGGCCTCCGCTAACCTGGCCGCTACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGTCAAAGCAAGCGCGTGGACTTCTGTGGAAAAGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCTCCACACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACTTACGTGCCTGCCCAGGAAAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATTTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAAGGCGTGTTTGTGTCTAACGGAACACACTGGTTTGTGACTCAAAGAAACTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGATAACACCTTCGTCAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAATACTGTGTACGACCCCCTGCAGCCAGAGCTCGATTCTTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTCAAGAACCACACATCCCCCGACGTCGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGATAGACTGAACGAGGTGGCAAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTCGGGAAGTACGAGCAGTATATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCGGGCCTGATCGCCATCGTTATGGTGACGATCATGCTGTGCTGCATGACCAGTTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGTTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTTAAGCTGCACTACACCTGAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCAATAGGCCGAAATCGGCAAGCGCGATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTCCTCGAGATTTAAATTCGCGAGTACTATGCATATGGGCCCAATATTAATTAAGCGCTAGCACGCGTTTAAACAGGCCTCGAGGCGCGCCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA

SEQ ID NO:34，HKP侧链：KHKHKHKHK

SEQ ID NO:35，HKP侧链：HKHKHKHKHK

SEQ ID NO:36，HKP侧链：KHKHKHKHKH

SEQ ID NO:37，HKP侧链：HKHKHKHKHKH

SEQ ID NO:38，HKP侧链：KHKHHKHHKHHKHHKHHKHK

SEQ ID NO:39，HKP侧链：KHHHKHHHKHHHKHHHK

SEQ ID NO:40，HKP侧链：KHHHKHHHKHHHHKHHHK

SEQ ID NO:41，HKP侧链：KHHHKHHHKHHHHKHHHK，其中第1、5、9、14和18位氨基酸为D-氨基酸。

SEQ ID NO:42，HKP侧链：HKHHHKHHHKHHHHKHHHK

SEQ ID NO:43，HKP侧链：HHKHHHKHHHKHHHHKHHHK

SEQ ID NO:44，HKP侧链：KHHHHKHHHHKHHHHKHHHHK

SEQ ID NO:45，HKP侧链：KHHHKHHHKHHHKHHHHK

SEQ ID NO:46，HKP侧链：KHHHKHHHHKHHHKHHHK

SEQ ID NO:47，HKP侧链：KHHHKHHHHKHHHKHHHHK

SEQ ID NO:48，弗林蛋白酶样切割位点：RRAR

SEQ ID NO:49：-HHHK-

SEQ ID NO:50：RX(K/R)R

SEQ ID NO:51：TAATACGACTCACTATAA

SEQ ID NO:52：

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SEQ ID NO:53：

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等效物

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

在缺少本文未具体公开的任一个或多个要素、任一个或多个限制的情况下，可以适当地实施本文示例性描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广义地而非限制性地理解。另外，本文所采用的术语和表达已作为描述性术语而非限制性术语使用，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但应认识到，在所要求保护的本技术的范围内，各种修改是可能的。

因此，应当理解，本文提供的材料、方法和实施例是优选方面的代表，仅为示例性，并不旨在作为对本技术的范围进行限制。

应当理解，尽管本发明已经通过某些方面、实施方案和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可对这些方面、实施方案和可选特征进行修改、改进和更改，并且这些修改、改进和更改被认为在本公开的范围内。

本技术在此已被广泛地和一般地描述。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚属组也构成本技术的一部分。这包括本技术的一般描述，带有从属中删除任何主题的附带条件或否定限制，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。

此外，在根据马库什组描述本技术的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本技术也因此根据马库什组的任何单独成员或成员子组来描述。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均明确地通过引用方式全文并入，其程度如同每一者均单独以引用方式并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

其他方面在以下权利要求中阐述。

Claims

1.一种核糖核酸(RNA)，所述RNA编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段，所述刺突(S)蛋白或其免疫原性片段包含至少一个非天然存在的氨基酸突变，其中所述至少一个非天然存在的氨基酸突变包含以下项中的一者或多者：

作为与SEQ ID NO:1的R682对应的氨基酸的丝氨酸(S)(R682S)、

作为与SEQ ID NO:1的R685对应的氨基酸的甘氨酸(G)(R685G)、

作为与SEQ ID NO:1的F817对应的氨基酸的脯氨酸(P)(F817P)、

作为与SEQ ID NO:1的A892对应的氨基酸的P(A892P)、

作为与SEQ ID NO:1的A899对应的氨基酸的P(A899P)、

作为与SEQ ID NO:1的A942对应的氨基酸的P(A942P)、

作为与SEQ ID NO:1的K986对应的氨基酸的P(K986P)或

作为与SEQ ID NO:1的V987对应的氨基酸的P(V987P)、

条件是所述RNA不包含SEQ ID NO:2。

2.根据权利要求1所述的RNA，其中所述S蛋白还包含以下项中的一者或两者：

作为与SEQ ID NO:1的N440对应的氨基酸的赖氨酸(K)(N440K)或

作为与SEQ ID NO:1的E484对应的氨基酸的K(E484K)。

3.根据权利要求1或2所述的RNA，其中所述S蛋白还包含以下项中的一者或多者：

作为与SEQ ID NO:1的T19对应的氨基酸的精氨酸(R)(T19R)、

作为与SEQ ID NO:1的V70对应的氨基酸的苯丙氨酸(F)(V70F)、

作为与SEQ ID NO:1的T95对应的氨基酸的异亮氨酸(I)(T95I)、

作为与SEQ ID NO:1的G142对应的氨基酸的天冬氨酸(D)(G142D)、

与SEQ ID NO:1的E156对应的缺失(E156Δ)，

与SEQ ID NO:1的F157对应的缺失(F157Δ)，

作为与SEQ ID NO:1的R158对应的氨基酸的G(R158G)、

作为与SEQ ID NO:1的A222对应的氨基酸的缬氨酸(V)(A222V)、

作为与SEQ ID NO:1的W258对应的氨基酸的亮氨酸(L)(W258L)、

作为与SEQ ID NO:1的K417对应的氨基酸的天冬酰胺(N)(K417N)、

作为与SEQ ID NO:1的K417对应的氨基酸的R(L452R)、

作为与SEQ ID NO:1的T478对应的氨基酸的K(T478K)、

作为与SEQ ID NO:1的D614对应的氨基酸的G(D614G)、

作为与SEQ ID NO:1的P681对应的氨基酸的R(P681R)或

作为与SEQ ID NO:1的D950对应的氨基酸的N(D950N)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA，其中所述至少一个非天然存在的氨基酸突变包含R682S和R685G。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的RNA，其中所述至少一个非天然存在的氨基酸突变包含或还包含F817P、A892P、A899P、A942P、K986P或V987P中的任一者、或任何两者、或任何三者、或任何四者、或任何五者。

6.根据权利要求5所述的RNA，其中所述至少一个非天然存在的氨基酸突变包含或还包含K986P和V987P。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的RNA，其中所述至少一个非天然存在的氨基酸突变包含或还包含F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P。

8.根据权利要求1和3至6中任一项所述的RNA，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO:5的多肽或其等效物，其中SEQ ID NO:5的所述等效物保留T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、R682S、R685G、D950N、K986P和V987P的突变。

9.根据权利要求8所述的RNA，所述RNA包含编码SEQ ID NO:5的多核苷酸或其等效物。

10.根据权利要求1和3至6中任一项所述的RNA，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO:6的多肽或其等效物，其中SEQ ID NO:6的所述等效物保留T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、R682S、R685G、D950N、K986P和V987P的突变。

11.根据权利要求10所述的RNA，所述RNA包含编码SEQ ID NO:6的多核苷酸或其等效物。

12.根据权利要求1、3、4和7中任一项所述的RNA，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO:7的多肽或其等效物，其中SEQ ID NO:7的所述等效物保留T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G的突变。

13.根据权利要求12所述的RNA，所述RNA包含SEQ ID NO:9的多核苷酸或其等效物，其中SEQ ID NO:9的所述等效物编码SEQ ID NO:7或其等效物。

14.根据权利要求1、3、4和7中任一项所述的RNA，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO:10的多肽或其等效物，其中SEQ ID NO:10的所述等效物保留T19R、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、L452R、T478K、D614G、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G的突变。

15.根据权利要求14所述的RNA，所述RNA包含编码SEQ ID NO:10的多核苷酸或其等效物。

16.根据权利要求1、3、4和7中任一项所述的RNA，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO:11的多肽或其等效物，其中SEQ ID NO:11的所述等效物保留T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G的突变。

17.根据权利要求16所述的RNA，所述RNA包含SEQ ID NO:13的多核苷酸或其等效物，其中SEQ ID NO:13的所述等效物编码SEQ ID NO:11或其等效物。

18.根据权利要求1至4和7中任一项所述的RNA，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO:14的多肽或其等效物，其中SEQ ID NO:14的所述等效物保留T19R、V70F、T95I、G142D、E156Δ、F157Δ、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、E484K、N440K、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、R682S和R685G的突变。

19.根据权利要求18所述的RNA，所述RNA包含SEQ ID NO:16的多核苷酸或其等效物，其中SEQ ID NO:16的所述等效物编码SEQ ID NO:14或其等效物。

20.根据权利要求9、11、13、15、17和19中任一项所述的RNA，其中SEQ ID NO:9、13或16中任一者的所述等效物由在所述等效物的全长上约35％至约70％的GC含量组成。

21.根据权利要求8至20中任一项所述的RNA，所述等效物与全长参考序列至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或更多相同。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的RNA，所述RNA还包含3'UTR。

23.根据权利要求22所述的RNA，其中所述3'UTR包含SEQ ID NO:18、22或24中的任一者。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的RNA，所述RNA还包含5'UTR。

25.根据权利要求24所述的RNA，其中所述5'UTR包含SEQ ID NO:20或26。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的RNA，所述RNA还包含polyA尾。

27.根据权利要求26所述的RNA，其中所述polyA尾包含SEQ ID NO:27、28或30中的任一者。

28.根据权利要求1所述的RNA，所述RNA包含SEQ ID NO:32或由其组成。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的RNA，其中所述RNA是经化学修饰的，并且任选地包含以下项中的一者或多者：N1-甲基-假尿苷残基或假尿苷残基。

30.根据权利要求29所述的RNA，其中所述RNA中至少约50％、或至少约70％、或约100％的尿苷残基是N1-甲基假尿苷或假尿苷。

31.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至30中任一项所述的RNA，或其互补多核苷酸，任选地其中所述多核苷酸选自：脱氧核糖核酸(DNA)、RNA、DNA和RNA的杂交体或它们中每一者的类似物。

32.一种编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的多核苷酸，所述刺突(S)蛋白或其免疫原性片段包含至少一个非天然存在的氨基酸突变，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:55的序列或其等效物。

33.一种编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的刺突(S)蛋白或其免疫原性片段的多核苷酸，所述刺突(S)蛋白或其免疫原性片段包含至少一个非天然存在的氨基酸突变，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:52的序列或其等效物。

34.一种载体，所述载体包含根据权利要求31至33中任一项所述的多核苷酸。

35.根据权利要求34所述的载体，所述载体还包含与所述多核苷酸可操作地连接以指导其转录的调控序列。

36.根据权利要求35所述的载体，其中所述调控序列包含启动子。

37.根据权利要求36所述的载体，其中所述启动子包括：噬菌体RNA聚合酶启动子，任选地T7启动子、或SP6启动子或T3启动子。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的载体，所述载体还包含选自可检测标志物、纯化标志物或选择标志物的标志物。

39.根据权利要求34至38中任一项所述的载体，其中所述载体是非病毒载体，任选地质粒或脂质体或胶束。

40.根据权利要求39所述的载体，其中所述质粒包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:53或其等效物，或由其组成。

41.根据权利要求32至36中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体，任选地腺病毒载体、或腺相关病毒载体、或逆转录病毒载体、或慢病毒载体、或植物病毒载体。

42.一种细胞，所述细胞包含以下项中的一者或多者：根据权利要求1至30中任一项所述的RNA、根据权利要求31至33所述的多核苷酸或根据权利要求34至41中任一项所述的载体。

43.根据权利要求42所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞，任选地大肠杆菌细胞。

44.根据权利要求42所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞，任选地哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。

45.一种组合物，所述组合物包含载体和以下项中的一者或多者：根据权利要求1至30中任一项所述的RNA、根据权利要求31至33中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求34至41中任一项所述的载体或根据权利要求42至44中任一项所述的细胞。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。

47.一种产生根据权利要求1至30中任一项所述的RNA的方法，所述方法包括在适用于表达所述RNA的条件下培养根据权利要求42至44中任一项所述的细胞。

48.一种产生根据权利要求1至30中任一项所述的RNA的方法，所述方法包括在适用于表达所述RNA的条件下，使根据权利要求31至33中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求34至41中任一项所述的载体与RNA聚合酶、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、鸟苷-5'-三磷酸(GTP)和三磷酸尿苷(UTP)或经化学修饰的UTP接触。

49.根据权利要求47或48所述的方法，所述方法还包括分离所述RNA。

50.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至30中任一项所述的RNA和药学上可接受的载体。

51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含聚合物纳米颗粒，所述聚合物纳米颗粒包含组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。

52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述HKP包含选自SEQ ID NO:34-47的侧链。

53.根据权利要求51或52所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体还包含脂质。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述脂质包括阳离子脂质。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述阳离子脂质是可电离的。

56.根据权利要求51或52所述的组合物，其中所述阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA(MC3)或二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)或两者。

57.根据权利要求54至56中任一项所述的组合物，其中所述脂质还包括以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。

58.根据权利要求50所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含脂质纳米颗粒(LNP)。

59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述LNP包含以下项中的一者或多者：8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物。

60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述LNP还包含以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。

61.根据权利要求57或60所述的组合物，其中所述辅助脂质包括以下项中的一者或多者：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、(2R)-3-(十六烷酰氧基)-2-{[(9Z)-十八-9-烯酰基]氧基}丙基2-(三甲基氮杂铵)乙基磷酸酯(POPC)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

62.根据权利要求57和60至61中任一项所述的组合物，其中所述胆固醇包括植物胆固醇或动物胆固醇或两者。

63.根据权利要求57或60至62中任一项所述的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质包括以下项中的一者或多者：PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)、任选地PEG2000-DMG((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)。

64.根据权利要求57至60至63中任一项所述的组合物，其中所述LNP包含SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述SM-102、DSPC、胆固醇和PEG200-DMG的质量比为约1:1:1:1，并且/或者其中所述SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG的摩尔比为约50:10:38.5:1.5。

66.一种产生根据权利要求50至57中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括使根据权利要求1至30中任一项所述的RNA与HKP接触，从而使所述RNA和所述HKP自组装成纳米颗粒。

67.根据权利要求58或59所述的方法，其中在所述接触步骤中所述HKP和所述RNA的质量比为约10:1至约1:10，任选地2.5:1。

68.根据权利要求66或67所述的方法，所述方法还包括使所述HKP和RNA与阳离子脂质接触。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA(MC3)或DOTAP(二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷)或两者。

70.根据权利要求68或69所述的方法，其中在所述接触步骤中所述阳离子脂质和所述RNA的质量比为约10:1至约1:10，任选地1:1。

71.根据权利要求68至70中任一项所述的方法，其中在所述接触步骤中所述HKP、所述mRNA和所述阳离子脂质的质量比为约4:1:1。

72.一种产生根据权利要求50和58至65中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括使根据权利要求1至30中任一项所述的RNA与脂质接触，从而使所述RNA和所述脂质自组装成脂质纳米颗粒(LNP)。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述LNP包含以下项中的一者或多者：8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述LNP还包含以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。

75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述辅助脂质包括以下项中的一者或多者：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、(2R)-3-(十六烷酰氧基)-2-{[(9Z)-十八-9-烯酰基]氧基}丙基2-(三甲基氮杂铵)乙基磷酸酯(POPC)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述胆固醇包括植物胆固醇或动物胆固醇或两者。

77.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇化脂质包括以下项中的一者或多者：PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)、任选地PEG2000-DMG((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)。

78.根据权利要求72至77中任一项所述的方法，其中所述LNP包含SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG。

79.根据权利要求78所述的方法，其中所述SM-102、DSPC、胆固醇和PEG200-DMG的质量比为约1:1:1:1，并且/或者其中所述SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG的摩尔比为约50:10:38.5:1.5。

80.根据权利要求64至79中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在微流体混合器中进行，所述微流体混合器任选地选自狭缝叉指型微混合器或交错鱼骨型微混合器(SHM)。

81.一种方法，所述方法用于以下项中的一者或多者：

(a)预防受试者患有有症状SARS-CoV-2感染，

(b)在有需要的受试者中诱导对SARS-CoV-2的免疫应答，

(c)在有需要的受试者中减少SARS-CoV-2或其S蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合，

(d)治疗感染有SARS-CoV-2的受试者，或

(e)在有需要的受试者中减少SARS-CoV-2病毒载量，

所述方法包括向所述受试者施用以下项中的一者或多者：根据权利要求1至30中任一项所述的RNA或根据权利要求50至65中任一项所述的组合物。

82.根据权利要求79所述的方法，所述方法还包括用另外的治疗剂治疗所述受试者。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述另外的治疗剂包含以下项中的一者或多者：

抗病毒剂，任选地瑞德西韦、洛匹那韦、利托那韦、伊维菌素、达菲或法匹拉韦；

抗炎剂，任选地地塞米松、托珠单抗、kevzara、colcrys、羟氯喹、氯喹或激酶抑制剂；

来自从SARS-CoV-2感染中恢复的受试者的恢复期血浆；

与SARS-CoV-2结合的抗体，任选地巴尼韦单抗、埃特司韦单抗、卡西瑞单抗或伊德维单抗；或

抗生素，任选地阿奇霉素。

84.根据权利要求81至83中任一项所述的方法，其中当用所述RNA或所述组合物施用时，所述受试者未患有SARS-CoV-2感染。

85.根据权利要求81至84中任一项所述的方法，其中所述RNA或所述组合物在施用之前或期间通过雾化器吸入系统雾化。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述雾化器系统是用于全呼吸道药物递送的便携式雾化器。

87.根据权利要求81至84中任一项所述的方法，其中所述RNA或所述组合物通过皮下注射施用。

88.根据权利要求81至84中任一项所述的方法，其中所述RNA或所述组合物通过肌内注射施用。

89.根据权利要求81至84中任一项所述的方法，其中所述RNA或所述组合物通过腹膜内注射(i.p)施用。

90.根据权利要求81至89中任一项所述的方法，其中所述RNA或所述组合物以至少21天、至少28天、至少35天、至少42天、至少49天、至少56天或至少64天的间隔施用两次。

91.一种吸入系统，所述吸入系统包括根据权利要求1至30中任一项所述的RNA或根据权利要求50至65中任一项所述的组合物以及雾化器。

92.根据权利要求91所述的吸入系统，其中所述雾化器是用于全呼吸道药物递送的便携式雾化器。

93.一种用于根据权利要求81至90中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：根据权利要求1至30中任一项所述的RNA、根据权利要求48至63中任一项所述的组合物、或根据权利要求89或90所述的吸入系统。

94.一种用于根据权利要求47和66至80中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：根据权利要求1至30中任一项所述的RNA、根据权利要求31至33中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求34至41中任一项所述的载体、根据权利要求42至44中任一项所述的细胞、根据权利要求45或46所述的组合物、HKP或脂质，任选地阳离子脂质。

95.一种用于权利要求48或49的试剂盒，所述试剂盒包含使用说明书、根据权利要求31至33中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求34至41中任一项所述的载体、RNA聚合酶、ATP、CTP、GTP和UTP或经化学修饰的UTP。