CN117866808A - 一种生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及土壤修复技术领域，公开了一种生物菌剂及其制备方法和应用。本发明提供了阿氏芽孢杆菌在土壤中镉和砷治理中的应用。一种生物菌剂，为负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭。通过将生物炭与微生物联合使用，可以利用其孔隙结构和大的表面积，为微生物提供庇护所；为微生物提供养分，减少与本土微生物的竞争；能够将养分释放到环境中，提高土壤肥力，促进植物生长；还能强化生物炭自身的有毒有害元素去除能力。本发明提供的生物菌剂制备方法简单，成本低。本发明提供的生物菌剂应用于污染土壤的修复时，能有效修复As和Cd复合污染的土壤，有效降低土壤有毒有害元素的生物利用率，改善作物生长状况，同时改良土壤的生物学功能，增加土壤酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及土壤修复技术领域，特别涉及一种生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
土壤中有毒有害元素含量超标对土壤结构、植物生长以及土壤中的微生物菌群代谢影响较大。如土壤中的砷(As)和镉(Cd)，对植物有毒性，会导致作物生长异常，产量下降，品质降低，还会通过食物链对人类健康构成风险，因此，修复有毒有害元素污染土壤至关重要。
钝化材料可以降低土壤中有毒有害元素的有效性，减少作物对有毒有害元素的吸收。但现有的钝化材料在修复污染土壤时，大多只能钝化一种有毒有害元素，如修复砷(As)和镉(Cd)复合污染的土壤时，一种钝化材料无法同时降低两种元素的含量；同时，钝化材料还会对土壤质量产生负面影响，如造成土壤板结、结构变差，从而使农作物营养品质下降等等。因此，亟需开发一种既能同时钝化土壤中的多种有毒有害元素，又能保持并优化土壤功能，提升污染土壤修复效率的钝化剂，保持或提升作物的营养品质，以实现有毒有害元素土壤污染地区农业的可持续发展。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的之一在于提供阿氏芽孢杆菌在土壤中镉和砷治理中的应用；本发明的目的之二在于提供一种生物菌剂；本发明的目的之三在于提供这种生物菌剂的制备方法；本发明的目的之四在于提供这种生物菌剂的应用。生物炭含有丰富的表面官能团和矿物质，可通过多种方式吸附/结合重金属等有毒有害元素，但其单独使用效率较低；微生物可以通过多种机制转化重金属或其他有毒有害元素，且大多具有选择性去除特性。本发明通过将生物炭与微生物联合使用，制备一种既能钝化土壤中的重金属等有毒有害元素，又能保持并优化土壤功能，以及提高植物抗有毒有害元素能力的菌剂。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面提供了阿氏芽孢杆菌在土壤中镉和砷治理中的应用。
本发明的第二方面提供了一种生物菌剂，所述生物菌剂为负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭。
优选地，所述生物炭为果壳生物炭；进一步优选地，所述生物炭包括椰壳生物炭、杏壳生物炭、枣壳生物炭中的至少一种。
优选地，所述生物炭的粒径为0.1～0.2mm；进一步优选地，所述生物炭的粒径为0.125～0.18mm。
本发明的第三方面提供了本发明第二方面所述生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将阿氏芽孢杆菌菌液与生物炭混合，即得所述生物菌剂。
优选地，所述制备阿氏芽孢杆菌菌液的具体步骤为：将菌株接种于溶菌肉汤(LB)培养基，培养条件为35～39℃、160～200rpm、10～14h，离心分离得到菌体，再用无菌生理盐水洗净，通过紫外分光光度计调节得到菌液。
优选地，所述培养的条件为36～38℃、170～190rpm、11～13h；进一步优选地，所述培养的条件为37℃、180rpm、12h。
优选地，所述离心的温度为2～6℃；进一步优选地，所述离心的温度为3～5℃；更进一步优选地，所述离心的温度为4℃。
优选地，所述离心的频率为6000～10000rpm；进一步优选地，所述离心的频率为7000～9000rpm；更进一步优选地，所述离心的频率为8000rpm。
优选地，所述离心的时间为3～7min；进一步优选地，所述离心的时间为4～6min；更进一步优选地，所述离心的时间为5min。
优选地，所述阿氏芽孢杆菌菌液的OD值为OD600＝(1～2)；进一步优选地，所述阿氏芽孢杆菌菌液的OD值为OD600＝1.5。
优选地，所述生物炭与阿氏芽孢杆菌菌液的固液比为1g:(8～12)mL；进一步优选地，所述生物炭与阿氏芽孢杆菌菌液的固液比为1g:(9～11)mL；更进一步优选地，所述生物炭与阿氏芽孢杆菌菌液的固液比为1g:10mL。
优选地，所述生物炭与阿氏芽孢杆菌菌液混合后，在35～39℃、160～200rpm条件下处理20～30h，离心分离，得到生物菌剂。
优选地，所述生物炭与阿氏芽孢杆菌菌液混合后，在36～38℃、170～190rpm条件下处理22～28h；更进一步优选地，37℃、180rpm条件下处理24h。
优选地，所述离心的温度为2～6℃；进一步优选地，所述离心的温度为3～5℃；更进一步优选地，所述离心的温度为4℃。
优选地，所述离心的频率为6000～10000rpm；进一步优选地，所述离心的频率为7000～9000rpm；更进一步优选地，所述离心的频率为8000rpm。
优选地，所述离心的时间为3～7min；进一步优选地，所述离心的时间为4～6min；更进一步优选地，所述离心的时间为5min。
本发明的第四方面提供了本发明第二方面所述的生物菌剂在污染土壤修复，以及在提高植物抗砷和镉胁迫中的应用。
优选地，所述污染土壤存在砷和镉污染。
优选地，所述污染土壤中，砷的含量大于等于30mg/kg。
优选地，所述污染土壤中，镉的含量大于等于0.3mg/kg。
优选地，所述生物菌剂与污染土壤的质量比为1:(20～50)；进一步优选地，所述生物菌剂与污染土壤的质量比为1:(30～40)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明提供了阿氏芽孢杆菌在土壤中镉和砷治理中的新应用。
2)生物炭来源丰富、成本低，含有丰富的表面官能团和矿物质，可通过多种方式吸附/结合重金属等有毒有害元素。本发明将生物炭与微生物联合使用，可以利用其孔隙结构和大的表面积，为微生物提供庇护所；为微生物提供养分，减少与本土微生物的竞争；能够将养分释放到环境中，提高土壤肥力，促进植物生长；还能强化生物炭自身的有毒有害元素去除能力。
3)本发明提供的生物菌剂制备方法简单，成本低。
4)本发明提供的生物菌剂应用于污染土壤的修复时，能有效修复As和Cd复合污染的土壤，有效降低土壤有毒有害元素的生物利用率，改善作物生长状况，同时改良土壤的生物学功能，增加土壤酶活性。
附图说明
图1为添加不同菌剂后土壤中As(a)、Cd(b)的形态变化图；
图2为盆栽实验中空心菜株高(a)、可食用部分鲜/干重(b)和As、Cd的富集情况(c)；
图3为盆栽实验中空心菜可溶性糖(a)、纤维素(b)、维生素C(c)和蛋白质(d)的含量变化。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
本发明实施例中所用的阿氏芽孢杆菌为阿氏芽孢杆菌B8W22(NCBI编号：NR_115953.1)，该菌经过北京奥维森基因科技有限公司测序鉴定确认为阿氏芽孢杆菌，以下简称B10菌株。
以下实施例中所用空心菜种子均采购于山东省潍坊市寿禾种业有限公司。选取采购得到的空心菜种子中表面光滑、饱满、无损坏的种子，将空心菜种子用纱布包裹，在无菌环境下分别于75％的乙醇溶液中浸泡5min，5％次氯酸钠溶液中浸泡5min充分消毒，然后用无菌水冲洗5次后使用。
以下实施例中所用果壳生物炭购买自上海麦克林生化科技有限公司，货号为N871988-5kg。
以下实施例中所用土壤均来源自江西省上新余市仙女湖区观巢铅锌矿周边(27°86.336’N，114°88.750’E)，土壤的理化参数如表1所示。根据《中国农业土壤质量标准》(GB15618-2018)，农业土壤中总As标准限量为30mg/kg，总Cd标准限量为3.5mg/kg。
表1实施例所用土壤的理化参数
| 理化参数 | 实施例所用土壤 |
| As(mg/kg) | 99 |
| Cd(mg/kg) | 3.5 |
| pH | 6.93±0.04 |
| 阳离子交换容量CEC(cmol/kg) | 8.77±0.66 |
| 有机质含量(g/kg) | 10.6±0.51 |
| 脲酶活性(mg NH4+-N/g土壤/24h) | 0.31±0.04 |
| 脱氢酶活性(μg TPF/g土壤/h) | 2.63±0.28 |
| 过氧化氢酶活性(mL 0.1M KMnO4/g土壤/20min) | 18.13±0.32 |
实施例1
制备负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭菌剂(BBC)
1)将果壳生物炭(BC)采用粉碎机粉碎，并通过0.15mm筛。
2)将B10菌株接种于溶菌肉汤(LB)培养基，37℃、180rpm条件下培养12h，4℃、8000rpm条件下离心分离5min得到菌体，再用0.85％无菌生理盐水洗净，通过紫外分光光度计调节得到菌液(OD600＝1.5)。
3)将果壳生物炭与菌液混合(固液比1g:10mL)，并放置在恒温振荡培养箱(180rpm，37℃)中24h，离心(4℃，8000rpm，5min)，所得沉淀物冷冻干燥，得到负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭菌剂，称为BBC。
对比例1
制备海藻酸钠包埋负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭菌剂(EBC)
1)将果壳黄金炭(BC)采用粉碎机粉碎，并通过0.15mm筛。
2)将B10菌株接种于溶菌肉汤(LB)培养基，37℃、180rpm条件下培养12h，4℃、8000rpm条件下离心分离5min得到菌体，再用0.85％无菌生理盐水洗净，通过紫外分光光度计调节得到菌液(OD600＝1.5)。
3)将生物炭与菌液混合(固液比1g:10mL)，并放置在恒温振荡培养箱(120rpm，30℃)中2小时。之后，加入等体积的2％(w/v)海藻酸钠溶液并充分混合，得到胶体溶液。
4)将步骤3)所得胶体溶液缓慢滴入4％(w/v)无菌CaCl2溶液中，完全凝胶化后，将所得菌剂用0.85％无菌生理盐水洗涤2次，风干，所得固体物质命名为EBC。
对比例2
制备细菌冻干粉(B10)
将B10引入LB培养基中，并置于振荡培养箱(180rpm，37℃)中生长12h，离心(8000rpm，5min)后所得沉淀物用0.85％的无菌生理盐水洗涤2次，冷冻干燥后所得产物即为纯细菌冻干粉，命名为B10。
不同菌剂对污染土壤中As、Cd的修复效果测试实验
1.实验方法：
实验组总共设立5个，分别为对照组(CK)、仅加入生物炭组(BC)、仅加入B10细菌冻干粉组(B10)、负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭组(BBC)和海藻酸钠包埋负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭组(EBC)，每个实验组设有3个平行实验。实验步骤如下：
称取100g As、Cd复合污染土壤于玻璃小瓶中，将以上4种菌剂分别以3％(w/w)的比例添加到小瓶中，在室温下在摇床上180rpm摇动24h，使土壤与菌剂充分混合。随后，加入去离子水搅拌混匀，用塑料膜封口，并扎多个小孔以保证玻璃小瓶内外空气自由流通。定期加入去离子水，使含水量保持在土壤最大田间持水量的70％，室温下孵育14周。第14周取样，根据改进的BCR连续提取方法(RAURET G,LPEZ-SNCHEZ JF,SAHUQUILLO A,etal.Improvement of the BCR three-step sequential extraction procedure prior tothe certification of new sediment and soil reference materials[J].J EnvironMonit,1999,1(1):57.DOI:10.1039/a807854h)对收集的土壤样本进行分析，以确定As、Cd组分的形态。所得样品通过电感耦合-等离子质谱(ICP-MS)测定。
2.实验结果：
图1为添加不同菌剂后土壤中As(a)、Cd(b)的形态变化图。由图1可知，在未处理土壤中，主要的As组分是残渣态，主要的Cd组分是弱酸可提取态。复合污染土壤中施用BBC后，土壤中As残渣态分数增加了2.55％，相应的可氧化态分数减少了1.39％；土壤中Cd酸可溶态分数减少了27.29％，残渣态分数增加了9.46％。表明本发明制备的负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭菌剂BBC能够有效降低土壤中有效态As、Cd含量，同步钝化As与Cd，提高稳定态As、Cd含量，使其向生物毒性及迁移性较小的方向转化。
不同菌剂对空心菜生长及As、Cd积累影响的盆栽实验
1.实验方法：
将1.2kg风干土壤与不同的菌剂混合，以获得以下实验组：仅污染土壤(CK)，BC(3％，w/w)，B10(3％，w/w)，BBC(3％，w/w)，EBC(3％，w/w)，每个处理制备3个重复。添加土壤改良剂后，需要搅拌并翻动土壤使其尽量混合均匀，将土壤在自然环境中平衡7周，并保持70％的含水量以模拟实际条件。每个花盆中种5粒空心菜，随后将空心菜盆栽放置于自然光下，每天浇水。
空心菜在种植45天后收获。收获的空心菜样品用无菌水洗涤以去除附着的土壤和灰尘，在测量高度、根长和生物量(地上部分鲜重、干重)后，将根和地上部分分离以进行进一步测定。植物根浸入5mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液中，以去除根表面结合的金属离子。一部分样品的根和地上部分在105℃下持续烘干5分钟和70℃持续48小时，直到干重恒定，保存于4℃用于有毒有害元素含量测定。一部分新鲜的地上部分立即用于营养指标，即蛋白质、可溶性糖、维C和纤维素的测定。此外，通过轻轻摇动从蔬菜根冠收集根际土壤，用于测定土壤理化性质及酶活。
2.实验结果：
图2为盆栽实验中空心菜株高(a)、可食用部分鲜/干重(b)和As、Cd的富集情况(c)。
由图2可知，与CK相比，在添加了B10、BC、BBC和EBC的污染土壤中生长的空心菜植株表现出了明显的增长，地上和地下部分的长度、鲜重和干重都有所增加。表明这些处理对空心菜植株在土壤As、Cd胁迫下的生长具有积极作用。尤其是在BBC处理中观察到了最大的生物量增加，地上部分的鲜重和干重分别增加了59.60％和138.06％。此外，B10、BC、BBC和EBC的处理可以显著的降低空心菜地上部分的As、Cd含量。其中BBC最有效，与CK相比，BBC使得空心菜地上部分As含量降低了67.11％和56.06％，地上部分Cd含量降低了70.89％和64.85％。可见，本申请提供的负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭菌剂能够促进空心菜生长，减少土壤中种植的空心菜中可食用的茎和叶部位的有毒有害元素含量。
图3为盆栽实验中空心菜可溶性糖(a)、纤维素(b)、维生素C(c)和蛋白质(d)的含量变化。由图3可知，BBC处理组更显著的提升了空心菜的营养指标，可溶性糖、纤维素、维生素C和蛋白质分别较CK组提升了203.13％、34.72％、54.51％和118.78％。可见，本申请提供的负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭菌剂能够提高空心菜营养指标。
表2为不同处理对土壤理化性质及酶活的影响。由表2可知，与CK相比，BBC处理组的土壤阳离子交换容量(CEC)和土壤有机质(OM)提高了53.30％和325％，脲酶、脱氢酶和过氧化氢酶的活性也分别较CK组提高了174％、109％和16％，表明本申请提供的负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭菌剂BBC能够改善土壤的性质。
表2不同处理对土壤理化性质及酶活的影响
本发明提供的负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭生物菌剂，应用于污染土壤的修复时，可以降低As和Cd共污染土壤中元素的生物有效性，实现As与Cd的同步钝化，在3％的添加剂量下的空心菜种植中，可以有效的减少As、Cd在空心菜可食用部分的富集，并提高空心菜的营养品质，以及显著改善土壤功能。可见，本发明提供的生物菌剂既能钝化土壤中的有毒有害元素，又能保持并优化土壤功能，有利于实现有毒有害元素土壤污染地区农业的可持续发展。
Claims (10)
1.阿氏芽孢杆菌在土壤中镉和砷治理中的应用。
2.一种生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂为负载有阿氏芽孢杆菌的生物炭。
3.根据权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述生物炭为果壳生物炭；所述生物炭的粒径为0.1～0.2mm。
4.权利要求2～3任一项所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将阿氏芽孢杆菌菌液与生物炭混合，即得所述生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述阿氏芽孢杆菌菌液的OD值为OD600＝(1～2)。
6.根据权利要求4所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述生物炭与阿氏芽孢杆菌菌液的固液比为1g:(8～12)mL。
7.权利要求2～3任一项所述的生物菌剂在污染土壤修复中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述污染土壤存在砷和镉污染；所述污染土壤中，砷的含量大于等于30mg/kg；镉的含量大于等于0.3mg/kg。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物菌剂与污染土壤的质量比为1:(20～50)。
10.权利要求2～3任一项所述的生物菌剂在提高植物抗砷和镉胁迫中的应用。
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