CN117858727A - 抑制成熟肝细胞转分化的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种抑制成熟肝细胞转分化的组合物或可治疗胆管癌的组合物，另一个目的是提供筛选抑制成熟肝细胞转分化的物质或治疗胆管癌的物质的方法。提供了一种抑制成熟肝细胞转分化的组合物或用于治疗胆管癌的组合物，所述组合物包括NF‑κB诱导激酶抑制剂(NIK抑制剂)。还提供了一种筛选抑制成熟肝细胞转分化的物质或治疗胆管癌的物质的方法，所述方法包括测量NF‑κB诱导激酶活性的步骤。本发明的组合物减轻了TRAF3‑NIK轴的失调，所述TRAF3‑NIK轴的失调参与成熟肝细胞转分化以及胆管癌的发展和恶化。

Description

抑制成熟肝细胞转分化的组合物
技术领域
本发明涉及成熟肝细胞转分化的抑制和胆管癌的治疗。
背景技术
胆管癌占原发性肝癌的15％，其数量仅次于肝细胞癌(非专利文献1)。胆管癌通常在其恶化后发现，并且对化疗具有耐药性，因此占世界上癌症相关死亡的2％(非专利文献2)。胆管癌致病机制的阐明可能促进其治疗，但胆管癌发生的机制有许多不清楚的地方。此外，作为胆管癌起源细胞的可能候选细胞包括存在于肝脏中的肝内胆管细胞、成熟肝细胞和肝脏祖细胞，但尚未得出明确结论。从胆管癌的序列分析中已经鉴定了几种癌基因(非专利文献3)，但是可以开发药物的治疗靶点的数量很少，因此可能需要寻找新的治疗靶点。
转座子插入突变筛选方法作为在各种癌中鉴定癌基因的方法已被报道(非专利文献4)。本发明的发明人基于转座子插入突变筛选方法(包括使用肝特异性Pten缺陷小鼠)研究了各种肝癌的癌基因(非专利文献5)。此外，本发明的发明人基于相同的方法对具有胆管部分的肝癌进行了基因组分析，并观察到Traf3基因中最常见的失活突变。因此，本发明人认为Traf3的失活与肝细胞的转分化和肝内胆管癌的发展有关(非专利文献6)。
引用列表
非专利文献
非专利文献1：Rizvi S等人，Nat Rev Clin Oncol.2018；15(2):95-111。
非专利文献2：Banales JM等人，Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2020；17(9):557-88。
非专利文献3：Farshidfar F等人，Cell Rep.2017；19(13):2878-80.
非专利文献4：Kodama T等人，Gastroenterology.2016；151(2):324-37e12。
非专利文献5：Kodama T等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2016；113(24):E3384-93。
非专利文献6：Shiode Yuto等人，the 57th Annual Meeting of the JapanSociety of Hepatology,WS9-10,2021。
发明内容
技术问题
本发明的目的是阐明成熟肝细胞转分化的机制，以提供有助于治疗和研究与肝细胞转分化相关的疾病(以胆管癌为代表的疾病)及开发其治疗药物的组合物和方法。
问题的方案
本发明的发明人为了实现上述目的进行了研究，结果发现NF-κB诱导激酶(下文也称为“NIK”)抑制剂可以抑制成熟肝细胞的转分化。因此，发明人完成了本发明。此外，本发明人发现NIK活性的测量能够筛选抑制成熟肝细胞转分化的物质。因此，发明人完成了本发明。也就是说，本发明包括以下方面。
1.一种用于抑制成熟肝细胞转分化的组合物，包含NF-κB诱导激酶抑制剂。
2.根据上述第1项所述的组合物，其中所述组合物抑制成熟肝细胞向胆管细胞的转分化。
3.根据上述第2项所述的组合物，其中所述胆管细胞是增殖性胆管细胞。
4.根据上述第1项所述的组合物，其中所述组合物是用于治疗胆管癌的组合物。
5.根据上述第4项所述的组合物，其中所述胆管癌是肝内胆管癌。
6.根据上述第4或5项所述的组合物，其中所述胆管癌是低TRAF3表达胆管癌或高NIK表达胆管癌。
7.根据上述第1至3项中任一项所述的组合物，其中所述组合物是研究试剂。
8.根据上述第1至7项中任一项所述的组合物，其中NF-κB诱导激酶抑制剂是抑制NF-κB诱导激酶的酶活性的低分子量化合物。
9.根据上述第8项所述的组合物，其中所述低分子量化合物是由下式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中：
环A是单环或稠合双环；
A1为N或CR1；
A2为N或CR2；
A3为N或CR3；
A4为N；和
A1至A4中的一个或两个分别为N，
其中：
R1为H或与R2一起形成环的基团；
R2选自H、C1-C6烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6烷氧基、NRaRb、含杂原子的3-11元环、与R1一起形成环的基团和与R3一起形成环的基团，其中每个R2任选地被Rc取代；并且
R3选自H、卤素和与R2一起形成环的基团，
其中：
R1和R2一起形成的环选自C3-C7环烷基、苯基和含杂原子的3-11元环，其中所述环任选地被Rd取代；并且
R2和R3一起形成的环是C3-C6环烷基或含杂原子的3-6元环，任选地被Rd取代，并且
其中：
Ra选自H和C1-C6烷基；
Rb选自H、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、含杂原子的3-11元环和C1-C6烷基，任选地被C1-C6烷氧基取代；
Rc选自卤素、OH、C(O)(C1-C6烷基)、含杂原子的3-11元环和C1-C6烷基，任选地被C1-C6烷氧基取代；且
Rd选自卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
10.根据上述第9项所述的组合物，其中A1为CH，A2为COCH3，A3为CH，并且A4为N。
11.根据上述第1项至第7项中任一项所述的组合物，其中所述NF-κB诱导激酶抑制剂是核酸，所述核酸抑制NF-κB诱导激酶的mRNA的翻译。
12.一种用于治疗胆管癌的组合物，其包含NF-κB诱导激酶抑制剂。
13.根据上述第12项所述的组合物，其中所述胆管癌是低TRAF3表达的胆管癌或高NIK表达的胆管癌。
14.一种筛选抑制成熟肝细胞转分化的物质的方法，包括测量NF-κB诱导激酶的活性的步骤。
15.一种筛选用于治疗胆管癌的物质的方法，包括测量NF-κB诱导激酶的活性的步骤。
16.一种抑制成熟肝细胞转分化的方法，包括施用NIK抑制剂。
17.一种治疗胆管癌的方法，包括施用NIK抑制剂。
18.NIK抑制剂在制备用于抑制成熟肝细胞转分化的组合物中的用途。
19.NIK抑制剂在制备用于治疗胆管癌的组合物中的用途。
发明的有益效果
包含NIK抑制剂的本发明的组合物可以抑制成熟肝细胞的转分化，以治疗与成熟肝细胞转分化相关的疾病。本发明的组合物可以抑制增殖性胆管细胞的发生，并降低该细胞的增殖能力，从而治疗胆管癌。本发明的组合物可以减轻TRAF3-NIK轴的失调，所述TRAF3-NIK轴参与成熟肝细胞的转分化和胆管癌的发展和恶化。一种治疗癌症(包括控制成熟肝细胞的转分化信号)的方法，是一种新的癌症治疗方法。本发明组合物的给药具有优异的治疗效果，并且在很大程度上有助于许多患者的治疗，因为所述给药是基于胆管癌的致病机制的治疗。
本发明包含NIK抑制剂的组合物可用于研究成熟肝细胞的转分化。
一种筛选靶向NIK的药物的方法有助于开发一种新的治疗药物，所述NIK参与成熟肝细胞转分化以及胆管癌细胞发生和增殖，所述治疗药物能够对与成熟肝细胞的转分化相关的疾病进行因果治疗，所述疾病以胆管癌为代表。
附图说明
图1A显示了在肝特异性Pten缺失转座子插入突变小鼠(肝-SB/Pten小鼠)的肝内胆管细胞癌(ICC)和混合型肝癌(肝细胞癌和胆管细胞癌的混合癌)中鉴定的trunk驱动基因。选择读序为50或更多的转座子插入位点，并鉴定了10个基因。所述图片显示，在这些基因中，Traf3是最重要的突变基因，具有最高的中值读序。图1B是代表转座子插入Traf3基因座的位点的遗传图谱的图解。每个箭头表示一个转座子插入。
图2是显示施用他莫昔芬(TAM)12周后HDKO小鼠、CDKO小鼠和WT小鼠肝脏表型的HE染色图和KRT19染色图。比例尺对应于50μm。术语“HDKO”是指肝细胞特异性Pten/Traf3双敲除小鼠(H-Traf3/PtenDKO)。术语“CDKO”是指胆管细胞特异性Pten/Traf3双敲除小鼠(C-Traf3/PtenDKO)。术语“WT”是指野生型小鼠(没有通过TAM进行Cre诱导的小鼠)。
图3是施用TAM 12周后HDKO小鼠和CDKO小鼠的肝脏的图像。所述术语“HDKO”是指肝细胞特异性Pten/Traf3双敲除小鼠(H-Traf3/PrenDKO)。所述术语“CDKO”是指胆管细胞特异性Pten/Traf3双敲除小鼠(C-Traf3/PrenDKO)。
图4是在施用TAM 12周后HDKO小鼠和WT小鼠的肝脏的X-gal染色和KRT19染色的图像。比例尺对应于50μm。▲为正常肝细胞和胆管增殖部分之间的边界。所述术语“HDKO”是指肝细胞特异性Pten/Traf3双敲除ROSA26-Cre报告小鼠(H-Traf3/Pten-DKO/Rosa26-LacZ)。所述术语“WT”是指野生型小鼠(没有通过TAM进行Cre诱导的小鼠)。
图5显示通过单细胞RNA测序对HDKO(H-Traf3/PtenDKO)小鼠的肝脏的肝细胞分化为肝内胆管细胞的过程的检查结果。图5A示出了t-SNE图，其中将具有相同转录组图谱的细胞按颜色分组。在图5B中，t-SNE图显示为WT衍生的细胞(蓝点)和HDKO衍生的细胞(红点)。仅在HDKO小鼠中存在的大的肝细胞群被黑框包围。图5C是t-SNE图，用于显示WT衍生的细胞(蓝点)。图5D是t-SNE图，用于显示HDKO衍生的细胞(红点)。
图6示出了t-SNE图和Monocle拟时分析。每个点为一个拟时。蓝点表示较短的时间推移，红点表示较长的时间推移。在灰度图中，蓝色点表示为黑点，黄绿色到绿色点表示为深灰色点，橙色到黄色点表示为浅灰色点。
图7显示了肝脏类器官衍生细胞的Krt19基因表达水平。肝脏类器官衍生细胞是通过以下方式获得的细胞：将表达GFP的慢病毒或表达CRE的慢病毒引入由Traf3/Pten-floxed小鼠的肝脏产生的肝脏类器官；然后在分化为肝细胞的条件下培养所得物。所述术语“GFP Hep”是指引入表达GFP的慢病毒的类器官衍生细胞(WT细胞)。所述术语“Cre Hep”是指引入表达CRE的慢病毒的类器官衍生的肝细胞(Traf3/Pten缺陷细胞)。每组n＝3。*P＜0.05。
图8显示了用于示出胆管细胞标志物KRT19在引入siRNA的TRAF3/PTEN敲减的HepG2细胞(以下也称为“HepG2”)或原代人肝细胞(以下称为“PHH”)中的基因表达水平的图。术语“NC”是指引入对照siRNA的HepG2或PHH。所述术语“PTKD#1”和“PTKD#2”各自意指其中PTEN和TRAF3被Pten siRNA和Traf3 siRNA敲减的HepG2或PHH。图8A是TRAF3/PTEN敲减HepG2的图。图8B是TRAF3/PTEN敲减PHH的图。在图8A和图8B的每一个中，每组n＝4。*P＜0.05。
图9显示了引入siRNA的TRAF3/PTEN敲减HepG2的细胞生长曲线。横坐标轴的单位是时间(小时)。术语“NC”是指引入对照siRNA的HepG2。术语“PTKD#1”和“PTKD#2”各自意指其中PTEN和TRAF3被Pten siRNA和Traf3siRNA敲减的HepG2。每组n＝8。*P＜0.05。
图10显示了肝或肝细胞中的Map3k14(NIK)基因表达水平和蛋白质印迹。术语“WT”是指野生型小鼠。术语“HDKO”是指肝细胞特异性Pten/Traf3双敲除小鼠(H-Traf3/PtenDKO)。术语“GFP-Hep”是指引入表达GFP的慢病毒的肝类器官衍生细胞(WT细胞)。术语“CRE-Hep”是指引入表达CRE的慢病毒的肝类器官衍生细胞(Traf3/Pten缺陷细胞)。术语“NC”是指引入对照siRNA的HepG2或PHH。术语“PTKD#1”和“PTKD#2”各自意指其中PTEN和TRAF3被Pten siRNA和Traf3 siRNA敲减的HepG2或PHH。图10A显示了在施用TAM 2周后HDKO小鼠中的Map3k14基因表达水平，n＝3，并且*P＜0.05。图10B显示了施用TAM 12周后HDKO小鼠中的Map3k14基因表达水平，n＝4，并且*P＜0.05。图10C显示了GFP-Hep和CRE-Hep中的Map3k14基因表达水平，每组n＝3，并且*P＜0.05。图10D显示了在TRAF3/PTEN敲减的HepG2(左)或PHH(右)中的Map3k14基因表达水平，每组n＝4，并且*P＜0.05。图10E是TRAF3/PTEN敲减HepG2或PHH中NIK和ACTB的蛋白质印迹。
图11显示了通过敲减TRAF3和PTEN而引起的HepG2或PHH中胆管细胞标志物KRT19表达量增加被NIK活性抑制所抑制。术语“NC”是指引入阴性对照siRNA的HepG2或PHH。术语“PTKD”是指其中PTEN和TRAF3被Pten siRNA和Traf3 siRNA敲减的HepG2或PHH。术语“PTKDNIKSMI”是指NIKSMI抑制其NIK活性的PTKD。图11A显示了添加或不添加NIKSMI的PTKD(HepG2)中的KRT19基因表达水平，每组n＝4，并且*P＜0.05。图11B显示了添加或不添加NIKSMI的PTKD(PHH)中的KRT19基因表达水平，每组n＝4，并且*P＜0.05。图11C是添加或不添加NIKSMI的PTKD(HepG2)的蛋白质印迹(TRAF3、PTEN、KRT19、P100、P52和ACTB)。图11D是添加或不添加NIKSMI的PTKD(PHH)的蛋白质印迹(TRAF3、PTEN、KRT19、P100、P52和ACTB)。
图12显示了通过敲减TRAF3和PTEN，在HepG2中胆管细胞标志物KRT19表达量增加被NIK活性抑制所抑制。术语“NC”是指引入阴性对照siRNA的HepG2。术语“PTKD”是指其中PTEN和TRAF3被Pten siRNA和Traf3 siRNA敲减的HepG2。术语“PTKD NIK抑制剂#1”是指其NIK活性被NIK抑制剂#1抑制的PTKD。术语“PTKD NIK抑制剂#2”是指其NIK活性被NIK抑制剂#2抑制的PTKD。术语“PTKD NIK抑制剂#3”是指其NIK活性被NIK抑制剂#3抑制的PTKD。各组n＝3，*P＜0.05。图12A显示了KRT19基因的表达水平。图12B显示PTEN基因的表达水平。图12C显示了TRAF3基因的表达水平。图12D是蛋白质印迹(P100、P52和ACTB)。
图13显示了通过敲减TRAF3和PTEN，在HepG2或PHH中胆管细胞标志物KRT19表达量增加被NIK敲减所抑制。术语“NC”是指引入对照siRNA的HepG2或PHH。所述术语“PTKD”是指其中PTEN和TRAF3被Pten siRNA和Traf3 siRNA敲除的HepG2或PHH。术语“PTKDNIK#1”和“PTKDNIK#2”是指通过引入NIK siRNA(分别为NIK KD#1和NIK KD#2)敲减NIK的PTKD。图13A显示了引入或不引入NIK-siRNA的PTKD(HepG2)中的KRT19基因表达水平，每组n＝4，并且*P＜0.05。图13B显示了引入或不引入NIK-siRNA的PTKD(PHH)中的KRT19基因表达水平，每组中n＝4，并且*P＜0.05。图13C是引入或不引入NIK-siRNA的PTKD(HepG2)的蛋白质印迹(TRAF3、PTEN、KRT19、P100、P52、NIK和ACTB)。图13D是引入或不引入NIK-siRNA的PTKD(PHH)的蛋白质印迹(TRAF3、PTEN、KRT19、P100、P52、NIK和ACTB)。
图14显示了用于显示通过敲减TRAF3和PTEN而引起的HepG2增殖速率增加被NIK活性抑制或NIK敲减所阻断的图。横坐标轴的单位是时间(小时)。术语“NC”是指引入对照siRNA的HepG2。术语“PTKD”是指其中PTEN和TRAF3被Pten siRNA和Traf3 siRNA敲除的HepG2。术语“PTKDNIKSMI”是指其NIK活性因添加NIKSMI而受到抑制的PTKD。术语“PTKDNIK#1”和“PTKDNIK#2”是指通过引入NIK siRNA(分别为NIKKD#1和NIKKD#2)敲减NIK的PTKD。图14A显示细胞增殖速率的增加被NIK活性抑制所阻断。图14B显示细胞增殖速率增加被NIK敲减所阻断。各组n＝8，*P＜0.05。
图15显示了施用NIKSMI的DKO(L-Traf3/PentnDKO)小鼠的肝脏的染色图像和用于显示其胆管标志物表达水平的图。图15A显示了DKO小鼠和施用NIKSMI的DKO小鼠的肝脏的HE染色图和KRT19染色图。比例尺对应于50μm。图15B显示了DKO小鼠和施用NIKSMI的DKO小鼠的肝脏的KRT19基因表达水平。各组n＝5，*P＜0.05。
图16显示了从肝内胆管癌患者切除的癌症组织的HE-染色图和免疫组织学染色图，以及用于显示每个组织的TRAF3染色强度和NIK染色强度之间的相关性的图。图16A的上图示出具有低TRAF3表达量和高NIK表达量的癌症组织的图像，其下图示出了具有高TRAF3表达量和低NIK表达量的癌症组织的图像。比例尺对应于50μm。图16B示出了染色强度之间的相关性，并且示出了TRAF3表达量和NIK表达量之间的负相关性。
图17显示了显示肝内胆管癌切除后患者的无病生存率和总生存率的曲线图。图17A显示了基于TRAF3染色强度的无病生存率。图17B显示了基于TRAF3染色强度的总体存活率。图17C显示了基于NIK染色强度的无病生存率。图17D显示了基于NIK染色强度的总体存活率。
图18显示人胆管癌细胞系HuCCT1的蛋白质印迹和细胞生长曲线，其中NIK通过引入siRNA而被敲减。横坐标轴的单位是时间(小时)。术语“NC”是指引入对照siRNA的HuCCT1。术语“NIK KD#1”和“NIK KD#2”是指HuCCT1，其中NIK通过引入siRNA而被敲除(分别为NIKKD#1和NIK KD#2)。图18A是NIK的蛋白质印迹。图18B是细胞生长曲线。各组n＝8，*P＜0.05。
图19显示了人胆管癌细胞系HuCCA1的蛋白质印迹和细胞生长曲线，其中NIK通过引入siRNA而被敲除。横坐标轴的单位是时间(小时)。术语“NC”是指引入对照siRNA的HuCCA1。术语“NIK KD#1”和“NIK KD#2”是指HuCCA1，其中NIK通过引入siRNA而被敲减(分别为NIK KD#1和NIK KD#2)。图19A是NIK的蛋白质印迹。图19B是细胞生长曲线。各组n＝8，*P＜0.05。
图20显示了人胆管癌细胞系KKU213的蛋白质印迹和细胞生长曲线，其中NIK通过引入siRNA而被敲除。横坐标轴的单位是时间(小时)。术语“NC”是指引入KKU213的对照siRNA。术语“NIK KD#1”和“NIK KD#2”是指KKU213，其中NIK通过引入siRNA而被敲除(分别为NIK KD#1和NIK KD#2)。图20A是NIK的蛋白质印迹。图20B是细胞生长曲线。各组n＝8，*P＜0.05。
图21显示了人胆管癌细胞系的细胞生长曲线，所述人胆管癌细胞系的NIK活性通过添加9μM或15μM的NIKSMI而被抑制。横坐标轴的单位是时间(小时)。各组n＝8，*P＜0.05。图21A对应于HuCCT1。图21B对应于HuCCA1。图21C对应于KKU213。
图22显示了通过添加20μM的NIK抑制剂#1、NIK抑制剂#2或NIK抑制剂#3中的任一种来抑制其NIK活性的人胆管癌细胞系的细胞生长曲线。横坐标轴的单位是时间(小时)。各组n＝8，*P＜0.05。图22A对应于HuCCT1。图22B对应于HuCCA1。图22C对应于KKU213。
图23示出了通过向接受HuCCT1细胞的皮下移植的NOG小鼠口服施用NIKSMI而获得的结果。术语“NIKSMI(+)”是指口服施用NIKSMI的小鼠。术语“NIK SMI(-)”是指施用溶剂的小鼠。图23A示出了肿瘤大小，每组中n＝7，并且*P＜0.05。图23B示出了肿瘤组织中对细胞增殖能力标志物Ki67呈阳性的细胞数量，每组n＝7，并且*P＜0.05。
图24示出了通过将HuCCT1细胞皮下移植到NOG小鼠而获得的结果，其中HuCCT1通过慢病毒引入了shRNA。术语“NC”是指将引入阴性对照shRNA的HuCCT1细胞移植到其中的小鼠。术语“NIKKD”是指将引入NIK shRNA的HuCCT1细胞移植到其中的小鼠。图24A显示了肿瘤大小，每组n＝7，并且*P＜0.05。图24B示出了对细胞增殖能力标志物Ki67呈阳性的细胞的数量，每组n＝7，并且*P＜0.05。
具体实施方式
本发明的组合物包含NF-κB诱导激酶(NIK)抑制剂。NIK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为Map3k14。NIK是一种在非经典NF-κB信号通路中发挥重要作用的酶。
用作本发明组合物的活性成分的NIK抑制剂只需要是抑制NIK功能的物质，并且该抑制剂不受限制。其实例包括：抑制NIK活性的物质；抑制NIK的mRNA翻译成蛋白质的物质；抑制NIK基因转录的物质；蛋白质敲减物质；抗NIK抗体；和产生NIK的酶抑制剂。
抑制NIK功能的物质只需要是抑制NIK的活性的物质，并且该物质不受限制。该物质优选为低分子量化合物。其实例包括炔醇衍生物和氰基吲哚啉衍生物，其具体实例包括WO 2015/025026 A1、WO 2018/037059 A1、Brightbill HD等人Nat Commun.2018；9(1):179.和WO 2017/125530 A1中所述化合物。优选的化合物是，例如，由下式(I)表示的化合物：
其中
环A是单环或稠合双环；
A1为N或CR1；
A2为N或CR2；
A3为N或CR3；
A4为N；和
A1至A4中的一个或两个各自为N，
其中：
R1为H或与R2一起形成环的基团；
R2选自H、C1-C6烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6烷氧基、NRaRb、含杂原子的3-11元环、与R1一起形成环的基团和与R3一起形成环的基团，其中每个R2任选地被Rc取代；和
R3选自H、卤素和与R2一起形成环的基团，
其中：
R1和R2一起形成的环选自C3-C7环烷基、苯基和含杂原子的3-11元环，其中所述环任选地被Rd取代；和
R2和R3一起形成的环是C3-C6环烷基或含杂原子的3-6元环，任选地被Rd取代，以及
其中：
Ra选自H和C1-C6烷基；
Rb选自H、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、含杂原子的3-11元环和C1-C6烷基，任选地被C1-C6烷氧基取代；
Rc选自卤素、OH、C(O)(C1-C6烷基)、含杂原子的3-11元环和C1-C6烷基，任选地被C1-C6烷氧基取代；和
Rd选自卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
A2优选地为CR2。R2优选为C1-C6烷氧基，更优选为甲氧基。
优选的化合物是，例如，其中A1为CH，A2为COCH3，A3为CH，A4为N的化合物。特别优选的化合物是，例如，由下式(II)表示的(R)-6-(3-((3-羟基-1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)乙炔基)苯基)-4-甲氧基吡啶甲酰胺(以下也称为NIK的小分子抑制剂(“NIKSMI”))。
抑制NIK的mRNA翻译成蛋白质的核酸优选为RNA。所述RNA的实例包括短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义RNA和核酶。所述RNA的优选实例包括shRNA和siRNA。RNA的更优选的实例如下所述。
shRNA(TRCN0000010542)
5’-CCGG-CTCAGGACTCACGTAGCATTA-CTCGAG-TAATGCTACGTGAGTCCTGAG-TTTTT-3′(SEQ ID NO:1)
siRNA
NIK KD#1
有义链5′CAAACGCAAAGAGCAAGAATT 3′(SEQ ID NO:2)
反义链5′UUCUUGCUCUUUGCGUUUGCA3′(SEQ ID NO:3)
NIK KD#2
有义链5′GCAAAGAGCAAGAACCAAATT 3′(SEQ ID NO:4)
反义链5′UUUGGUUCUUGCUCUUUGCGT 3′(SEQ ID NO:5)
用于蛋白质敲除的物质的实例包括蛋白水解靶向嵌合分子(PROTAC)和特异性和非遗传IAP依赖性蛋白质消除剂(SNIPER)，它们各自是通过将NIK的配体和E3泛素连接酶的配体彼此连接而获得的嵌合化合物。这些化合物中的每一种都可以将E3主动添加到作为靶蛋白的NIK中以促进NIK的分解。
本发明的组合物抑制成熟肝细胞的转分化。本文使用的术语“成熟肝细胞”是指具有产生白蛋白能力的肝细胞，并且是指表达成熟肝细胞标志物(例如Alb)的细胞。人们认为成熟的肝细胞不会转分化为任何其他细胞。然而，最近有人提出，成熟肝细胞具有可转化为任何其他细胞的可塑性(Nishikawa等人，第109届日本病理学学会年会)。本发明中的成熟肝细胞优选为TRAF3表达减少的成熟肝细胞，更优选TRAF3和PTEN表达减少的成熟肝细胞。
成熟肝细胞的转分化是指成熟肝细胞转换(转化)为另一种细胞，例如转分化为胆管细胞、成纤维细胞、免疫细胞或窦状内皮细胞。所述组合物适当地抑制成熟肝细胞向胆管细胞的转分化。所述组合物更适合抑制成熟肝细胞转分化为胆管上皮细胞。本发明的组合物更适合抑制成熟肝细胞转分化为增殖性胆管细胞。胆管细胞表达细胞角蛋白19(KRT19)。
与成熟肝细胞转分化相关的疾病是，例如胆管癌。
肝内胆管细胞、成熟肝细胞、肝祖细胞等已被认为是胆管癌起源细胞的候选者。然而，本发明的发明人已经发现，成熟的肝细胞是胆管癌的起源。本发明的组合物可以抑制成熟肝细胞的转分化以治疗胆管癌。
在本说明书中，胆管癌的治疗包括缓解和减轻胆管癌的症状、抑制其恶化、延缓其进展和抑制其复发。
胆管癌是一种发生在胆管中的恶性肿瘤(癌症)，分为发生在肝内胆管中的“肝内胆管癌”和发生在肝外胆管的“肝外胆管癌”。本发明的组合物可以适当地治疗肝内胆管癌。
本发明的组合物可以适当地治疗具有低TRAF3表达量的胆管癌。可选地，所述组合物可以适当地治疗具有高NIK表达量的胆管癌。在本发明中已经发现，患有具有低TRAF3表达量胆管癌的患者具有不良预后，并且患有具有高NIK表达量的胆管癌的患者也具有不良预后。本发明的组合物可用于治疗可能具有不良预后的患者。TRAF3是一种信号分子，属于TNF受体相关因子(TRAF)家族。
当检查患有胆管癌的患者的胆管癌组织或周围肝组织中的TRAF3的量，并且TRAF3量低于指定值时，施用本发明的组合物能够进行适当的治疗。此外，当检查患有胆管癌的患者的胆管癌组织或周围肝组织中的NIK量，并且NIK量高于指定值时，施用本发明的组合物能够适当地治疗胆管癌。
本发明的组合物可以包含两种或多种活性成分。所述组合物可包含任何其它癌症治疗药物，或可包含除癌症治疗药物之外的药物。本发明的组合物可以与任何其他胆管癌治疗药物组合使用。
本发明的组合物可包含NIK抑制剂和药学上可接受的载体。
作为这种载体，通常使用药物制剂的载体，例如赋形剂(例如：糖衍生物，如甘露醇或山梨醇；淀粉衍生物，如玉米淀粉或马铃薯淀粉；或纤维素衍生物，如结晶纤维素)、润滑剂(例如：硬脂酸金属盐，如硬脂酸镁；或滑石粉)，粘合剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、崩解剂(例如，纤维素衍生物，如羧甲基纤维素或羧甲基纤维素钙)、水、防腐剂(例如：对氧基苯甲酸酯，如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯；或醇，如氯丁醇或苄醇)，pH调节剂(例如无机酸，例如盐酸、硫酸或磷酸，有机酸，例如乙酸、琥珀酸、富马酸或苹果酸，或其盐)和稀释剂(例如注射用水)可以单独混合或作为其混合物混合。本发明的组合物包括通过将活性成分溶解在水中而获得的液体制剂。
作为本发明的活性成分的NIK抑制剂在根据需要与上述载体混合后，可以以片剂、颗粒、胶囊、粉末、溶液制剂、悬浮液制剂或乳液制剂等剂型口服施用。此外，所述抑制剂可以以如栓剂、注射剂、静脉滴注、透皮剂、透粘膜剂或吸入剂的剂型肠外施用。
将本发明的活性成分配制成上述剂型，然后施用于需要该成分的受试者，如人或动物，优选人。
本发明活性成分的剂量和施用次数可根据症状的严重程度、患者的年龄、体重和性别以及药物的种类、剂型和施用途径等条件适当变化。当将活性成分施用于人时，其剂量例如如下：所述成分以约0.001mg/kg体重至约10mg/kg体重，优选约0.01mg/kg体重至约5mg/kg体重，特别优选以约0.03mg/kg体重至3mg/kg体重的量肠外施用，例如皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内或直肠内施用；并且所述成分以约0.001mg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约0.01mg/kg体重至50mg/kg体重，特别优选约0.1mg/kg体重至约30mg/kg体重的量口服施用。此外，施用次数可以是每天一次或多次，例如每天一次至三次、每天一次或两次、或每天一次。
本发明的活性成分可以根据已知方法生产。
本发明的组合物可以是研究试剂。本发明的组合物可在研究成熟肝细胞的转分化中用作抑制成熟肝细胞转分化的试剂。
本申请还涉及筛选抑制成熟肝细胞转分化的物质的方法的发明，所述方法包括测量NIK活性的步骤。本申请还涉及筛选用于治疗胆管癌的物质的方法的发明，所述方法包括测量NIK活性的步骤。
本发明的筛选方法是通过测定NIK抑制活性，从例如化合物库的化合物中筛选抑制成熟肝细胞转分化的物质的方法，或筛选用于治疗胆管癌的物质的方法。
本发明的筛选方法优选包括使受试物质和NIK相互接触的步骤。
测量NIK活性的方法不受限制，可以是已知的方法。
受试物质可以是化合物库中的化合物，所述化合物库可以是已知的，也可以是未知的。已知化合物库的实例包括：通过收集已经作为食品(例如，美国食品药物管理局(FDA))或药物(例如，欧洲药品管理局(EMEA))获得批准的化合物而获得的化合物库(例如，PRESTWICK CHEMICAL LIBRARY)(这是专利期限已到期的化合物的集合)；以及通过收集尚未获得食品或药物等批准的化合物而获得的化合物库。
本发明的筛选方法可以进一步包括基于测量的NIK活性来分选化合物的步骤。
通过本发明的筛选方法获得的化合物可以是与成熟肝细胞转分化相关的疾病的治疗药物，或胆管癌的治疗药物。此外，通过本发明的筛选方法获得的化合物可以是研究试剂。
现在，通过实施例更具体地描述本发明。然而，本发明不限于此。
实施例
在试验实施例1至试验实施例8中，使用以下材料和试验方法。
<人样本>
福尔马林固定和石蜡包埋的人肝内胆管细胞癌(ICC)组织收集自2011年至2018年间在大阪大学医学研究生院胃肠外科接受手术切除的43名肝内胆管癌患者。这些样本是经大阪大学医院机构研究委员会批准获得的。此外，还获得了相关患者的书面知情同意书。所有实验都是在相关指南和规定的基础上进行的。
<小鼠>
在每个试验中，使用了：Alb-Cre/+；T2Onc2/+；Rosa26-lsl-SB11/+；Pten fl/fl小鼠，Alb-Cre/+；Traf3 fl/fl小鼠，Alb-Cre/+；Pten fl/fl；Traf3 fl/fl小鼠，Alb-CreERT2/+；Pten fl/fl；Traf3 fl/fl小鼠，K19-CreERT2/+；Pten fl/fl；Traf3 fl/fl小鼠，Alb-CreERT2/+；Pten fl/fl；Traf3 fl/fl；ROSA26R/+小鼠，K19-CreERT2/+；Pten fl/fl；Traf3 fl/fl；ROSA26R/+小鼠和Alb-Cre/+；Pten fl/fl；Traf3 fl/fl；Mlkl fl/fl小鼠。在异种移植物试验中使用NOG小鼠。所有小鼠都被安置在无特定病原体设施的通风架中的微隔离器中，并定期喂食。Alb-Cre、K19-Cre ERT2、Pten fl/fl和ROSA26R小鼠从Jackson实验室获得。产生Alb-Cre ERT2小鼠的方法如先前报告中所述(SchulerM等，Genesis.2004；39(3):167-172)。Traf3 fl/fl小鼠从Robert Brink教授(Garvan医学研究所)处获得。Mlkl fl/fl小鼠从James Murphy教授(Walter and Eliza Hall医学研究所)处获得。T2Onc2和Rosa26lsl SB11小鼠从国家癌症研究所获得。NOG小鼠从实验动物中央研究所获得。所有实验均按照相关指南和规定进行。
<细胞系>
从JCRB细胞库获得人肝癌细胞系HepG2和人胆管癌细胞系HuCCT1、HuCCA1和KKU213。将HepG2和KKU213细胞在达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(DMEM；NacalaiTesque股份有限公司，日本)中培养，该培养基已添加10％热灭活的胎牛血清(FCS；Gibco，美国)。HuCCT1细胞在含有10％FCS的RPMI培养基(Nacalai Tesque股份有限公司，日本)中培养。HuCCA1细胞在添加了10％FCS的D-MEM/Ham's F-12(含有L-谷氨酰胺和酚红)(WakoPure Chemical Industries股份有限公司，日本)中培养。所有细胞均在37℃的CO2培养箱中培养。用胰蛋白酶(Nacalai Tesque股份有限公司，日本)分离细胞，并进行传代。对这些细胞进行支原体常规检查。
<序列、读取序列处理和公共插入位点分析>
在先前的报告(1)中，通过使用splink HiSeq方法映射转座子插入位点。通过使用gCIS鉴定候选癌症基因(2))，并通过先前报告(1)中的方法进行转座子驱动因子分析。(1)Kodama T等人，Proc Natl Acad Sci USA.2018；115(44):E10417-E10426。(2)Kodama T等人，Gastroenterology.2016；151(2):324-37e12。
<原代人类肝细胞的回收>
根据先前报告(Hasegawa M等人，Biochem Biophys Res Commun.2011；405(3):405-410)的方案产生人肝细胞嵌合小鼠。向每只高度免疫功能受损的NOG小鼠(TK-NOG)施用更昔洛韦，每只小鼠的肝脏中表达了单纯疱疹病毒1型胸苷激酶转基因以诱导肝损伤，然后移植人肝细胞。如先前报告(Murai K等人，Sci Rep.2020；10(1):941)中所述，通过使用两步胶原酶-蛋白酶回流法，从每个具有90％或更高嵌合肝率的人肝细胞嵌合小鼠中收集原代人肝细胞。通过FACS识别，人类肝细胞占收集的细胞的90％或更多。将这些细胞铺在胶原包被的培养皿上并进行培养。
<细胞的遗传操纵>
分别用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific股份有限公司，美国)或Lipofeclamine 2000(Thermo Fisher Scientific股份有限公司，美国)和Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific股份有限公司，USA)将siRNA或质粒转染到细胞中。siRNA的转染如下进行：将细胞以100000个细胞/mL的浓度分散；将10μM的siRNA以1μL的比例混合到100μL的Opti-MEM中，并将混合物静置5分钟；然后将3μL的RNAiMAX混合到混合物中，并整体静置15分钟，然后施用到先前分散的细胞的上清液中。此外，在24小时后更换培养基。
<类器官的产生>
小鼠肝脏类器官是根据先前报告的方案产生的(Broutier L等人，NatProtoc.2016；11(9)：1724-1743)。将生成的小鼠肝脏类器官与Matrigel混合，并将混合物在37℃下在培养基[添加了B27(Gibco，美国)和N2(Gibco，美国)、1.25μM N-乙酰半胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries有限公司，日本)、10mM烟酰胺(Merck股份有限公司，美国)、50ng/mL EGF(Gibco，美国)、50ng/mL HGF(PeproTech，美国)、100ng/mL FGF10(PeproTech，美国)，10μM毛喉素(Wako Pure Chemical Industries有限公司，日本)，0.5μMA83-01(Merck股份有限公司，美国)的Ad-DMEM Ad-DMEM/F12，以及10％Rspol对照培养基]中培养。培养产物以1:4至1:8的浓度每3天传代一次。Y-27632(Wako Pure ChemicalIndustries有限公司，日本)在类器官传代后添加到初始培养物中。通过使用慢病毒将基因引入每个类器官中。将类器官和慢病毒混合，将混合物铺在24孔板上，在32℃和600g下离心1小时，然后在37℃下孵育5小时。用嘌呤霉素筛选细胞。在选择两周后，将类器官传代并用于实验。用分化培养基[添加了B27(Gibco，美国)和N2(Gibco，美国)、1.25μMN-乙酰半胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries有限公司，日本)、50ng/mL EGF(Gibco，美国)、100ng/mL FGF10(PeproTech，美国)、0.5μMA83-01(Merck股份有限公司，美国)，10μM DAPT(Merck股份有限公司，美国)和25ng/mL BMP4(Wako Pure Chemical Industries有限公司，日本)的Ad-DMEM Ad-DMEM/F12]将类器官分化成肝细胞。将类器官在培养基中培养3天，然后将培养基改为分化培养基连续9天。此外，将类器官在分化培养基中培养3天，所述分化培养基已添加3μM地塞米松(Merck股份有限公司，美国)。
<免疫印迹>
蛋白质印迹的程序如先前的报告所述(Tanaka S等人，Hepatology.2016；64(6):1994-2014)。通过使用裂解缓冲液制备细胞和动物组织的蛋白质提取物，所述裂解缓冲液中添加了蛋白酶抑制剂(Nacalai Tesque股份有限公司，日本)和磷酸酶抑制剂(NakalaiTesqu股份有限公司，日本)。在用于检测NIK的蛋白质印迹中，在蛋白质回收前4小时以5μM的浓度施用MG-132(ChemScene，美国)。以下抗体用于免疫检测：TRAF3(1:1000细胞信号，#4729)、PTEN(1:1000，Cell Signaling，#9188)、KRT19(1:50000，Abcam，#ab52625)、p100/p52(1:1000，Cell Signaling，#4882)、NIK(1:1000，Cell Signaling，#4994)和β-肌动蛋白(1:10000，Sigma-Aldrich有限责任公司，#A5316)。使用抗小鼠IgG、HRP-linked whole Absheep(Cytiva，日本)或抗兔IgG、HRP-linked whole Ab donkey(Cytiva，日本)作为二抗，并用SuperSignal(商标)West Pico PLUS化学发光底物(Thermo Fisher Scientific股份有限公司，美国)进行发光分析。
<免疫染色>
用二甲苯和乙醇对组织病理学切片进行脱蜡。苏木精和伊红进行HE染色。在免疫染色中，通过在抗原修复液(Target Retrieval Solution，Dako，美国)中加热进行抗原活化，然后用牛血清白蛋白封闭，使用一抗反应并在4℃下过夜。将冷冻切片在室温下干燥，并用BSA(Nacalai Tesque股份有限公司，日本)封闭，然后通过使用VECTASTAIN ABC兔IgG试剂盒(Vector Laboratories股份有限公司，美国)中的一抗进行反应。在染色反应中使用DAB底物试剂盒(Vector Laboratories股份有限公司，美国)。在免疫染色中使用以下抗体：KRT19(1:500Abcam，ab52625)、TRAF3(1:1000Abcam，ab217033)、NIK(1:400NovusBiologicals，NBP2-23603)、p-RIP3K(1:100Genentech)和KI67(1:1000Cell Signaling，#12202S)。在LacZ染色中，冷冻切片在室温下干燥，然后用0.2％戊二醛(Nacalai Tesque股份有限公司，日本)固定10分钟。之后，将切片用PBS洗涤三次，并在室温下在含X-gal的β-半乳糖苷酶底物(Takara Bio股份有限公司，日本)中孵育过夜。之后，用PBS洗涤细胞三次，并用核染色红(nuclear stain red，ScyTek Laboratories股份有限公司，美国)对细胞核染色。用ImageJ(Fiji)计数肿瘤中Ki67阳性细胞的数量。TRAF3或NIK的免疫染色得分通过将染色强度(从0到3)乘以染色面积(％)来计算。根据TRAF3或NIK的中位免疫染色评分，将人类ICC患者分为两组，并评估其无病生存期(DFS)或总生存期(OS)。
<RNA分离和qPCR>
用RNeasyMini试剂盒(QIAGEN N.V.，荷兰)从细胞系和人肝组织中提取总RNA。然后，用ReverTra-Ace qPCR反转录试剂盒(Toyobo有限公司，东京)反转录1μg总RNA以合成互补DNA。通过使用TaqMan基因表达测定分析以下每个基因的mRNA表达：人GAPDH(Hs02758991)、人TRAF3(Hs00936781)、人PTEN(Hs02621230)、人KRT19(Hs00761767)、人NIK(Hs01089753)、小鼠Gapdh(Mm09999915)、小鼠Traf3(Mm00495752)、小鼠Pten(Mm0477208)、小鼠Krt19(Mm004 92980)、小鼠NIK(Mm04 44166)和小鼠Alb(Mm 00802090)。将人的基因表达量和小鼠的基因表达量归一化为GAPDH的表达量。
<批量RNA测序>
根据制造商的说明书，用TruSeq Stranded mRNA文库制备试剂盒(Illumina股份有限公司，美国)制备文库。使用HiSeq 3000平台以75bp单通道模式进行测序。用TopHat2.1.1版本将测序读序映射到小鼠参考基因组序列(mm10)。用Cufflinks 2.2.1版本计算每千碱基外显子片段/百万映射片段(FPKM)。
<单细胞RNA测序>
对小鼠进行门静脉穿刺，并通过两步胶原酶法使其肝脏回流。将25毫升预灌注液以6mL/min的速度注射到每个肝脏中。随后，将溶解有胶原酶的灌注溶液(Merck股份有限公司，美国)以3mL/min注入其中，并通过以50g离心1分钟回收肝细胞。接下来，将剩余的组织切成小块，并在溶解有胶原酶(Merck股份有限公司，美国)和透明质酸酶(Sigma-Aldrich有限责任公司，美国)的溶液中于37℃搅拌40分钟，然后以50g离心1分钟。取出沉淀，然后将上清液以350g离心4分钟，然后回收NPC级分。将肝细胞和NPC级分以1:1的比例混合，并将混合物溶解在分选缓冲液中，然后根据制造商的说明书用BD Rhapsody(商标)Cartridge试剂盒(BD公司，美国)进行处理。用MGIEasy通用库转换试剂盒(App-A)(MGITech有限公司，中国)将Rhapsody库转换为DNBSEQ的库。在DNBSEQ-G400RS(MGITech有限公司，中国)平台上以2×100bp双端模式进行测序。从WT小鼠的14393个细胞和DKO小鼠的10083个细胞获得读序。这些读序用SeqGeq(BD公司，美国)进行分析。合并两只小鼠的数据片段，然后排除具有小读序的不良条件细胞。因此，保留了10364个细胞。用Seurat 3.2版本通过t-SNE分析这些细胞的所有基因，同时参数“％基因”、“％细胞”和“困惑度(Perplexity)”分别设置为5％、10％和30。将细胞分成15个簇。
<对小鼠施用AAV>
将AAV质粒pAAV2/8和pHelper(宾夕法尼亚大学)转染到HEK细胞中，并用AAVproConcentrator(Takara Bio股份有限公司，日本)浓缩回收的病毒上清液。用AAVpro滴定试剂盒(Takara Bio股份有限公司，日本)测量病毒浓度。通过尾静脉注射将病毒以每只小鼠1×1011的量施用于其肝脏。
<细胞增殖测定>
将肝细胞或胆管癌细胞接种在96孔板上，并根据制造商的说明书用IncuCyte(商标)S1(SartoriusAG，德国)分析其细胞增殖。
<异种移植实验>
为了产生异种移植物肿瘤，将5×106个HuCCT1细胞与Matrigel以1:1的比例混合，并将混合物皮下注射到每只NOG小鼠中。将小鼠随机分配到对照组或当它们的肿瘤大小达到100mm3至300mm3时用NIKSMI(Genentech股份有限公司，USA)处理的组。NIKSMI以200mg/kg的剂量口服施用于每只小鼠，每天两次，持续14天。在此期间，每3天测量一次肿瘤的直径，并使用以下方程计算每个肿瘤的大小。
肿瘤体积＝(小直径)2×(大直径)/2
此外，通过使用慢病毒用阴性对照shRNA或NIK-shRNA感染HuCCT1细胞，并用嘌呤霉素对感染的细胞进行选择。将总共5×106个细胞与Matrigel以1:1的比例混合，并将混合物皮下注射到每只NOG小鼠中。在移植3周后开始测量小鼠的肿瘤直径，并通过与上述相同的方法测量它们的肿瘤体积。
<量化与统计分析>
数据表示为平均值±标准差。所有数据都经过了适当的统计检验。两组之间的比较是通过正态分布变量的非配对双尾T检验进行的，或者通过非正态分布变量的Mann-Whiteney的U检验进行的。三组间比较采用Tukey法。Kaplan-Meier法和对数秩检验用于分析OS或DFS的差异。χ方检验用于检验临床数据与TRAF3或NIK免疫染色强度之间的关系。小于0.05的差异P被认为是显著的。用于Mac的Prism 8.4.2版本[GraphPad Prism，研究资源识别码(RRID)：SCR_002798，(GraphPad，美国)]和JMP 13(RRID:SCR_014242，SAS研究所，美国)用于分析。
<试验实施例1:转座子插入突变筛选法鉴定胆管癌抑制基因Traf3>
我们先前已经表明，转座子插入突变显著加速肝特异性Pten敲除(KO)小鼠中的肝癌发生(HorieY等人，J Clin Invest.2004；113(12)：1774-1783)。为了鉴定通过转座子插入突变的基因(所述基因与胆管癌的发生有关)，从肝脏特异性Pten缺乏转座子插入突变小鼠(肝脏-SB/Pten小鼠)的肝脏中选择20种肝癌(肝内胆管癌，或肝内胆管细胞癌和肝细胞癌的混合型癌症)，每个肝癌具有通过管形态和KRT19染色识别的胆管癌成分。通过使用splink HiSeq方法对转座子插入位点进行PCR扩增(Mann KM等人，Nat Biotechnol.2016；34(9):962-972.)，并测定它们的序列。鉴定了369549个转座子插入位点(每个肿瘤平均18477个插入位点)，并且通过使用称为gCIS方法的基因中心共同插入位点方法(Kodama T等人，Proc Natl Acad Sci U.S.2018；115(44)：E10417-E10426)鉴定了405个重要候选癌症基因(CCG)。我们之前已经表明，在肿瘤发生的初始阶段作用的Trunk驱动子可以通过关注具有高序列读序的转座子插入位点来鉴定(Kodama T等人，Proc Natl Acad SciU.S.2018；115(44)：E10417-E10426)。通过分析鉴定了10个Trunk驱动子，并且驱动子外的Traf3被鉴定为具有最高中值读序的最重要的突变基因(图1A)。Traf3中的大多数转座子插入位于反义取向的编码区中(图1B)。我们的突变转座子被设计为只有在反义方向插入时才能使基因失活。因此，这些数据有力地表明，转座子介导的Traf3功能丧失突变可能与肝内胆管癌的发生有关。
<试验实施例2：肝特异性Traf3/Pten缺失诱导胆管细胞增殖并促进肝内胆管癌的发展>
为了验证转座子诱变筛选的结果，通过在白蛋白基因启动子(Alb-Cre)的控制下使用表达Cre重组酶的小鼠来产生肝特异性Traf3缺陷小鼠。肝特异性Traf3敲除小鼠(L-Traf3KO)以预期的孟德尔比例出生，生长正常。然而，这些小鼠在24周龄时均表现出KRT19阳性肝内胆管细胞的增殖。每个L-Traf3KO小鼠的肝脏中的KRT19表达水平显著高于野生型(WT)小鼠。这些数据表明，肝脏中TRAF3的缺失诱导了胆管细胞的增殖。鉴于上述情况，构建了肝特异性Traf3/Pten缺陷小鼠(L-Traf3/PrenDKO)。这些小鼠中的每只在6周龄时都显示出肝脏肿大，组织学上显示出其肝脏中的胆管细胞显著过度生长，并且显示出KRT19表达水平的显著增加。大多数L-Traf3/Pten-DKO小鼠早在出生后约8周至约12周的年龄死亡。所有长寿的L-Traf3/Pten-DKO小鼠在24周龄时各自在其肝脏中具有多个肿瘤。同时，L-Traf3KO小鼠、肝特异性Pten敲除(L-PtenKO)小鼠和WT小鼠均未显示出这些表型。大多数形成的肿瘤被两名病理学家诊断为肝内癌，因为它们的KRT19阳性和胆管结构异常。这些数据表明，TRAF3失活诱导了参与肝内胆管癌发展的胆管细胞的增殖。
<试验实施例3：肝内胆管癌由Traf3/Pten缺陷肝细胞发展>
为了分析TRAF3在肝中胆管癌发生中的作用，特异性敲除了在白蛋白或角蛋白19启动子的控制下分别表达他莫昔芬(TAM)诱导的Cre重组酶的每只小鼠(Alb-CreERT2或K19-CreERT2)的成年肝中肝细胞或胆管细胞的Traf3和Pten。将TAM(500mg/kg)或溶剂腹膜内施用于这些小鼠中的每只(在6周龄时)。施用溶剂的小鼠被用作对照WT小鼠。肝细胞特异性Traf3/Pten双敲除小鼠(H-Traf3/Pten-DKO，HDKO)在施用TAM 12周后显示肝脏肿大和肝内胆管细胞过度生长(包括KRT19表达水平的增加)。同时，胆管细胞特异性Traf3/Pten双敲除小鼠(C-Traf3/Pten-DKO，CKDO)即使在6周龄时施用TAM 24周后也没有显示出任何这些特征(图2)。在施用TAM 12周后，H-Traf3/Pten-DKO小鼠发展出多个肝内胆管癌(图3)。肝细胞特异性Traf3/Pten删除与肝特异性Trap3/Pten缺陷小鼠(L-Traf3/PtenDKO)的表型相似。
我们研究了这些小鼠肝内胆管癌细胞的起源，发现这些肿瘤的Traf3/Pten表达水平显著低于野生型肝组织。上述表明肝内胆管癌可能起源于H-Traf3/Pten-DKO小鼠的Traf3/Pten缺陷肝细胞。鉴于上述，用ROSA26 Cre报告小鼠进行谱系分析(Rosa26-LacZ，Soriano P.Nat Genet.1999；21(1):70-71)，所述小鼠表达Cre的组织中表达β-半乳糖苷酶(LacZ)。为此，通过将Rosa26-LacZ小鼠分别与H-Traf3/Pten-DKO小鼠或C-Traf3/Pten-DKO小鼠杂交来产生H-Traf3/Pten-DKO/Rosa26-LacZ小鼠或C-Trap3/Pten-DKO/Rosa26-LacZ小鼠。
给这些小鼠中每只施用TAM12周后，评估小鼠的LacZ染色阳性。在C-Traf3/Pten-DKO/Rosa26-LacZ小鼠中，胆管细胞为LacZ阳性，但包括肝细胞在内的其他细胞类型为阴性。因此，认识到K19-CreERT2小鼠通过施用TAM在胆管细胞中表达Cre重组酶。相反，在H-Traf3/Pten-DKO/Rosa26-LacZ小鼠中，肝细胞对LacZ染色呈阳性，而正常胆管细胞呈阴性。因此，已经认识到Alb-CreERT2小鼠通过施用TAM表达肝细胞特异性Cre重组酶。重要的是，在H-Traf3/Pten-DKO/Rosa26-LacZ小鼠中，KRT19阳性的增殖性胆管细胞和肝内胆管癌对LacZ染色呈阳性(图4)。因此，其强烈表明增殖性胆管细胞和肝内胆管癌起源于Traf3/Pten缺陷型肝细胞。
为了确认肝内胆管细胞来源于Traf3/Pten缺陷型肝细胞，通过任何其他方法从成年肝细胞中选择性删除Traf3和Pten。通过尾静脉高压注射将甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子控制下的Cre重组酶表达载体导入Traf3/Pten-floxed小鼠的成熟肝细胞或腺病毒相关载体(AAV8)(Yanger K等人，Cell Stem Cell.2014；15(3):340-349)。这些小鼠的每一只中，肝内胆管癌在Cre递送16周后以高外显率恶化，肿瘤组织中Traf3/Pten的表达水平与周围肝组织的表达水平相比显著降低。
上述结果表明肝内胆管癌起源于Traf3/Pten缺陷型肝细胞。
<试验实施例4：单细胞RNA测序揭示Traf3/Pten缺陷型肝细胞向胆管细胞的转分化>
为了进一步研究Traf3/Pten缺陷型肝细胞发展为肝内胆管细胞的过程，在施用TAM 12周后，对从H-Traf3/Pten-DKO小鼠和对照WT同窝出生的小鼠获得的肝细胞进行单细胞RNA测序。基于先前报道的细胞类型标志物的表达来注释t-SNE聚类中每个聚类的细胞类型。t-SNE聚类鉴定了两种小鼠共有的各种肝细胞类型，包括肝细胞(簇3、6和15)、内皮细胞(簇8)和各种免疫细胞(簇10至14)，以及仅存在于H-Traf3/Pten-DKO小鼠中的大肝细胞群(簇1、2、4、5、7和9)(图5)。
H-Traf3/Pten-DKO小鼠特有的那些簇不仅各自表达肝细胞标志物(Alb、Apoa1和Ass1)，而且还表达胆管细胞标志物(Spp1、Sox9和Onecut1)。此外，通过Monocle算法进行拟时分析。结果，其表明共表达这些肝细胞标志物和胆管细胞标志物的肝细胞从正常肝细胞转分化(图6)。
<试验实施例5:TRAF3/PTEN抑制促进小鼠肝类器官、人肝细胞和人肝癌细胞系中肝细胞向胆管细胞的转分化>
目的是在肝细胞谱系细胞中通过Traf3/Pten删除进行肝细胞转分化的体内表型的体外再现。为此，首先，根据先前报告中的方法(Broutier L等人，Nat Protoc.2016；11(9)：1724-1743)，从Traf3/Pten floxed小鼠的肝脏产生类器官。将表达GFP或Cre的慢病毒载体引入肝类器官中以产生WT或Traf3/Pten缺陷型的肝类器官。在分化为肝细胞的条件下培养这些类器官中的每一个，然后评估胆管细胞标志物的表达水平。肝类器官来源的Traf3/Pten缺陷型细胞显示出明显高于肝类器官源细胞(WT)的KRT19表达水平(图7)。
评估TRAF3/PTEN抑制对原代人肝细胞(以下也称为“PHH”)和人肝癌细胞系HepG2细胞(以下称为“HepG2”)中胆管标志物表达的影响。PHH和HepG2分别是具有白蛋白产生能力的成熟肝细胞。用siRNA分别敲减HepG2和PHH的TRAF3和PTEN。术语“PDKD#1”是指将siRNATraf3#2和Pten#1引入其中的HepG2(以下也称为“PTKD#1HepG2”)或PHH(以下也称“PTKD#1PHH”)。术语“PTKD#2”是指将siRNATraf3#2和Pten#3引入其中的HepG2(下文中也称为“PTKD#2HepG2”)或PHH(下文中称为“PTKD#2PHH”)。所有siRNA均从Thermo FisherScientific股份有限公司获得。每种siRNA的序列如下所示。
Traf3#2
有义链5′GGAUAAUUGCUGCAAGAGATT 3′(SEQ ID NO:6)
反义链5′UCUCUUGCAGCAAUUAUCCTT 3′(SEQ ID NO:7)
Pten#1
有义链5′GCAUACGAUUUUAAGCGGATT 3′(SEQ ID NO:8)
反义链5′UCCGCUUAAAAUCGUAUGCAG 3′(SEQ ID NO:9)
Pten#3
有义链5′GGUUUUCGAGUCCUAAUUATT 3′(SEQ ID NO:10)
反义链5′UAAUUAGGACUCGAAAACCTT 3′(SEQ ID NO:11)
在这些细胞中的每一个中的TRAF3/PTEN抑制显著增加了KRT19的表达(图8)。此外，TRAF3/PTEN抑制显著增加了HepG2细胞的增殖速率(图9)。这些数据表明，TRAF3/PTEN失活是肝细胞转分化为增殖性胆管细胞的驱动力。
<试验实施例6:Traf3/Pten失活通过NIK激活诱导肝细胞向增殖性胆管细胞的转分化>
进行了鉴定肝细胞转分化为胆管细胞的分子机制的尝试。从H-Traf3/Pten-DKO小鼠和WT同窝出生的小鼠收集施用TAM2周后的肝组织。施用TAM 2周后的时间点是肝脏中的胆管细胞没有明显过度生长的时间点，并且可以观察到Traf3/Pten水平显著降低。我们已经检测了已知参与胆管增殖的信号通路的活性，如Hippo信号通路、JNK通路或Hedgehog信号通路。然而，在H-Traf3/Pten-DKO小鼠的肝脏中，没有一种途径失调。然而，我们发现RIPK3的磷酸化(SeehawerM等人，Nature.2018；562(7725):69-75)是坏死性凋亡的重要介质，最近已被证明与肝细胞来源的胆管癌的发展有关。此外，作为L-Traf3/Pten-DKO小鼠肝脏坏死性凋亡执行者的MLKL被基因删除。然而，基因删除并没有改变肝脏的表型。
鉴于上述情况，我们对这些肝组织进行了RNA序列分析，并研究了与野生型肝相比，DKO肝中表达量增加的基因。因此，鉴定出197个基因。其中，Map3k14(ParvatiyarK等人，Nat Commun.2018；9(1):2770)被称为NF-κB诱导激酶(NIK)，并作为TRAF3的下游分子调节非经典NF-κB信号传导，被选择用于进一步分析。我们确认了在施用TAM 12周后，在H-Traf3/Pten-DKO小鼠的肝脏中Map3k14(NIK)的表达水平显著上调(图10A和图10B)。在TRAF3和PTEN分别被敲减的上述试验实施例5中获得的小鼠肝类器官来源的细胞、人肝癌细胞系(HepG2)和原代人肝细胞(PHH)中，Map3k14(NIK)的表达水平也显著上调(图10C至图10E)。
鉴于上述情况，检验了在TRAF3和PTEN分别被敲减的人肝癌细胞系细胞(HepG2)和原代人肝细胞(PHH)中，用下式(II)表示的NIK抑制剂(NIKSMI)抑制NIK的激酶活性是否改变胆管标志物KRT19的表达增加和细胞增殖率的增加，在上述试验实施例5中已经观察到增加。
具体地，在试验实施例5中获得的PTKD#1HepG2和PTKD#1PHH中的每一个的培养开始24小时后，以9μM的浓度加入上述NIKSMI。48小时后，回收细胞，并定量KRT19的mRNA，随后进行免疫印迹。结果如图11所示。此外，在图14A中示出了细胞生长曲线。
在HepG2和PHH中的每一个中，P52的表达和KRT19的表达通过TRAF3和PTEN的敲减而增加，但这种增加被NIKSMI显著抑制(图11)。此外，NIKSMI通过敲减TRAF3和PTEN阻断了HepG2细胞增殖率的增加(图14A)。
获得均具有NIK抑制作用的低分子量化合物NIK抑制剂#1、NIK抑制剂#2和NIK抑制剂#3，并且如在上述NIKSMI中那样，检查每种化合物对KRT19表达增加的抑制作用。
具体地，在试验实施例5中获得的PTKD#1HepG2的培养开始24小时后，以20μM的浓度加入NIK抑制剂#1。48小时后，回收细胞，并定量KRT19的mRNA，随后进行免疫印迹。对于NIK抑制剂#2和NIK抑制剂#3中的每一个，类似地，对KRT19的mRNA进行定量，并进行免疫印迹。此外，观察到PTEN和TRAF3的表达均减少，并且通过对P52增加的抑制作用来分别确认NIK抑制剂#1、NIK抑制剂#2和NIK抑制剂#3的NIK抑制作用。结果如图12所示。
在HepG2中，P52的表达和KRT19的表达通过敲减TRAF3和PTEN而增加，但是NIK抑制剂#1、NIK抑制剂#2和NIK抑制剂#3均显著抑制了增加(图12)。
接下来检测用NIK的siRNA抑制NIK的表达(NIKKD#1和NIKKD#2)是否改变了TRAF3和PTEN分别被敲减的人肝癌细胞系(HepG2)和原代人肝细胞(PHH)中胆管标志物KRT19的表达增加和细胞增殖率增加，在上述试验实施例5中已经观察到增加。NIKKD#1和NIKKD#2从Thermo Fisher Scientific股份有限公司获得。siRNA的碱基序列如下所示。
NIKKD#1
有义链5′CAAACGCAAAGAGCAAGAATT 3′(SEQ ID NO:2)
反义链5′UUCUUGCUCUUUGCGUUUGCA 3′(SEQ ID NO:3)
NIKKD#2
有义链5′GCAAAGAGCAAGAACCAAATT 3′(SEQ ID NO:4)
反义链5′UUUGGUUCUUGCUCUUUGCGT 3′(SEQ ID NO:5)
具体地，将NIK KD#1或NIK KD#2转染到试验实施例5中获得的PTKD#1HepG2和PTKD#1PHH中，以分别提供PTKDNIK#1和PTKDNIK#2。在每个细胞的培养开始72小时后，回收细胞，并定量KRT19的mRNA，随后进行免疫印迹。结果如图13所示。此外，在图14B中示出了细胞生长曲线。
在HepG2和PHH的每一个中，P52的表达和KRT19的表达通过TRAF3和PTEN的敲减而增加，但是这些增加被NIK KD#1或NIKKD#2显著抑制(图13)。此外，NIKKD#1和NIKKD#2均通过敲减TRAF3和PTEN阻断HepG2细胞增殖率的增加(图14B)。
此外，我们已经开始在L-Traf3/PrenDKO小鼠4周龄时以200mg/kg的剂量每天两次向其口服施用由式(II)表示的NIKSMI，持续14天，在6周龄时提取其肝脏，并进行肝脏的HE染色和KRT19免疫染色。NIK抑制显著抑制胆管细胞的过度生长(图15A)。通过施用NIKSMI显著抑制了L-Traf3/PrenDKO小鼠肝脏中胆管标志物KRT19的表达水平(图15B)。
这些数据表明，TRAF3和PTEN的失活通过NIK的激活诱导肝细胞转分化为增殖性胆管细胞。
<试验实施例7:TRAF3-NIK轴的失调与人肝内胆管癌的晚期和不良预后相关>
在46例肝内胆管癌手术切除患者中评估了TRAF3和NIK之间的临床相关性。首先，在肝内胆管癌组织中进行TRAF3和NIK的免疫组织学染色(图16A)，并量化它们的表达水平。在肿瘤组织中的这些表达水平之间存在负相关性(图16B)，并且该相关性表明TRAF3负调控人肝内胆管癌组织中的NIK。接下来，评估TRAF3或NIK的表达水平与临床病理因素或预后的相关性。低TRAF3表达水平或高NIK表达水平与肿瘤的晚期显著相关。重要的是，在手术切除后，每个具有低TRAF3水平或高NIK水平的患者显示出无病生存期(DFS)和总生存期(OS)显著低于每个具有高TRAF3水平和低NIK水平(图17)的患者。这些结果表明，TRAF3-NIK轴失调的人肝内胆管癌具有更高的恶性潜能。
<试验实施例8:NIK抑制对胆管癌的新治疗的潜力>
评估了靶向TRAF3-NIK轴失调的新型肝内胆管癌治疗的潜力。为此，首先，在体外用人胆管癌细胞系进行评估。
将两种NIK siRNA(NIK KD#1和NIK KD#2)引入人胆管癌细胞系HuCCT1、HuCCA1和KKU213中，以敲减MAP3K14(NIK)。结果，各胆管癌细胞的增殖被显著抑制(图18至图20)。
此外，在培养开始时，将由式(II)表示的NIKSMI以9μM或15μM的浓度添加到人胆管癌细胞系HuCCT1、HuCCA1和KKU213的细胞培养基中。结果，NIKSMI显著抑制了这些细胞的增殖(图21)。此外，分别检测NIK抑制剂#1、NIK抑制剂#2和NIK抑制剂#3对这些人胆管癌细胞增殖的抑制作用。在培养开始时以20μM的浓度加入NIK抑制剂#1、NIK抑制剂#2或NIK抑制剂#3。结果，每种NIK抑制剂都显著抑制了这些细胞的增殖(图22)。
用IncuCyte(商标)进行上述细胞增殖分析和细胞生长曲线的产生。
接下来，在体内研究施用NIKSMI的效果。
HuCCT1细胞被皮下移植到NOG小鼠中。在移植后第28天及其后，将式(II)所示的NIKSMI以200mg/kg的剂量口服施用于小鼠，每天两次，持续14天。在此期间，每3天测量一次肿瘤直径，并计算肿瘤大小。NIKSMI显著抑制源自HuCCT1细胞的异种移植物的生长(图23A)。用ImageJ计数细胞增殖能力标志物Ki67阳性的细胞数。结果，施用NIKSMI的肿瘤中Ki67阳性细胞的数量显著低于使用溶剂的肿瘤中Ki67阳性细胞的数量(图23B)。
在体内研究施用NIK shRNA的效果。将分别通过慢病毒导入NIK shRNA的HuCCT1细胞或分别导入阴性对照shRNA的HuCCT1细胞皮下移植到NOG小鼠中。在移植后第21天及其后，每3天测量一次肿瘤的直径，并计算肿瘤大小。NIK-shRNA显著抑制来源于HuCCT1细胞的异种移植物的生长(图24)。用ImageJ计数细胞增殖能力标志物Ki67阳性的细胞数。结果，引入NIK-shRNA的肿瘤中Ki67阳性细胞的数量显著低于引入阴性对照shRNA的肿瘤中的Ki67阳性的细胞的数量(图24B)。所使用的shRNA的序列如下所示。5′-CCGG-CTCAGGACTCACGTAGCATTA-CTCGAG-TAATGCTACGTGAGTCCTGAG-TTTTT-3′(SEQ ID NO:1)
这些结果表明，NIK抑制是治疗胆管癌的一种新策略。
工业实用性
本发明有助于预防、治疗、诊断和研究与成熟肝细胞和胆管癌转分化相关的疾病。

Claims (15)

1.一种用于抑制成熟肝细胞转分化的组合物，所述组合物包含NF-κB诱导激酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物抑制成熟肝细胞转分化为胆管细胞。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述胆管细胞是增殖性胆管细胞。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是用于治疗胆管癌的组合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述胆管癌是肝内胆管癌。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述胆管癌是低TRAF3表达的胆管癌或高NIK表达的胆管癌。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述组合物是研究试剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述NF-κB诱导激酶抑制剂是抑制NF-κB-诱导激酶的酶活性的低分子量化合物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述低分子量化合物是由下式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
环A是单环或稠合双环；
A1为N或CR1；
A2为N或CR2；
A3为N或CR3；
A4为N；和
A1至A4中的一个或两个各自为N，
其中：
R1为H或与R2一起形成环的基团；
R2选自H、C1-C6烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6烷氧基、NRaRb、含杂原子的3-11元环、与R1一起形成环的基团和与R3一起形成环的基团，其中每个R2任选地被Rc取代；和
R3选自H、卤素和与R2一起形成环的基团，
其中：
R1和R2一起形成的环选自C3-C7环烷基、苯基和含杂原子的3-11元环，其中所述环任选地被Rd取代；和
R2和R3一起形成的环是C3-C6环烷基或含杂原子的3-6元环，任选地被Rd取代，以及
其中：
Ra选自H和C1-C6烷基；
Rb选自H、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、含杂原子的3-11元环和C1-C6烷基，任选地被C1-C6烷氧基取代；
Rc选自卤素、OH、C(O)(C1-C6烷基)、含杂原子的3-11元环和C1-C6烷基，任选地被C1-C6烷氧基取代；和
Rd选自卤素、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中A1为CH，A2为COCH3，A3为CH，A4为N。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述NF-κB诱导激酶抑制剂是核酸，所述核酸抑制NF-κB-诱导激酶的mRNA的翻译。
12.一种用于治疗胆管癌的组合物，其包含NF-κB诱导激酶抑制剂。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述胆管癌是低TRAF3表达的胆管癌或高NIK表达的胆管癌。
14.一种筛选抑制成熟肝细胞转分化的物质的方法，包括测量NF-κB诱导激酶活性的步骤。
15.一种筛选用于治疗胆管癌的物质的方法，包括测量NF-κB诱导激酶活性的步骤。
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