CN117849340A - 可溶性因子簇在早期神经梅毒检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可溶性因子簇在早期神经梅毒检测中的应用。具体地说，本发明涉及一种用于早期神经梅毒脑脊膜型神经梅毒与脑脊膜血管型神经梅毒检测的试剂盒，其包括用于对选自IL‑15、IL‑27、IFN‑α和EGF中的可溶性因子簇的可溶性因子的脑脊液浓度进行测定的因子检测试剂。本发明还涉及选自IL‑15、IL‑27、IFN‑α和EGF中的两种以上的可溶性因子组成的可溶性因子簇在制备用于早期神经梅毒检测的产品中的应用以及基于所述可溶性因子簇的、用于检测所述早期神经梅毒的风险判断系统。本发明能够对所述早期神经梅毒进行及时准确的检测，以期实现所述早期神经梅毒的早期诊断、早日治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及可溶性因子簇在早期神经梅毒检测中的应用。
背景技术
神经梅毒是指苍白密螺旋体(Treponema pallidum)苍白亚种(又称梅毒螺旋体)引起的中枢神经系统(central nervous system,CNS)感染，是最严重的梅毒并发症。
梅毒螺旋体早期即可侵入脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)、脑脊膜及血管系统，表现为无症状脑脊膜型神经梅毒、有症状脑脊膜型神经梅毒、脑脊膜血管型神经梅毒。脑脊膜型神经梅毒(MNS，meningeal neurosyphilis)亦称梅毒性脑脊膜炎，以脑脊膜弥漫性炎症为特征的神经梅毒；脑脊膜血管型神经梅毒(MVNS，meningovascularneurosyphilis)亦称梅毒性血管炎，是以脑脊膜血管弥漫性炎症为特征的神经梅毒，两者都属于早期神经梅毒。脑脊膜炎可能造成脑积水以及小、中或大型血管动脉炎即梅毒性血管炎，从而导致脑或脊髓缺血或梗死。梅毒性血管炎是梅毒性脑脊膜炎的病程延续，往往重叠存在，很难完全区分开来。早期神经梅毒临床表现复杂多样，与其他神经系统疾病症状类似，致使神经梅毒的诊断较为困难，易误诊、漏诊，导致严重不良后果。
由于目前神经梅毒诊断无金标准，主要依赖于对患者病史、症状、体征、实验室指标、电生理、神经心理及神经影像等进行综合分析，需要排除其他神经系统疾病，是排他性诊断，无法实现早期准确诊断，容易漏诊、误诊、误治。为此，早期识别、早期准确地诊断神经梅毒，对患者的临床治愈和改善生活质量显得尤为重要。
但是，目前还没有将MNS或MVNS与其他梅毒区分开的准确的早期检测方法，因此无法实现对MNS或MVNS这两型神经梅毒的早期识别，无法判断神经梅毒病程是否为早期，无法实现早期精准治疗，无法评估预后。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明在第一方面提供了一种用于早期神经梅毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括用于对可溶性因子簇中的可溶性因子的脑脊液浓度进行测定的因子检测试剂；所述可溶性因子簇包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF(表皮细胞生长因子)中的至少两种、至少三种或全部四种；所述早期神经梅毒为MNS或MVNS。
本发明在第二方面提供了可溶性因子簇在制备用于早期神经梅毒检测的产品中的应用，所述可溶性因子簇由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种组成。
本发明在第三方面提供了用于梅毒患者患有早期神经梅毒的风险的判断系统，所述判断系统包括检测模块、计算模块和判断模块；其中：
所述检测模块用于获取可溶性因子簇中每一个可溶性因子的脑脊液浓度；所述计算模块用于根据所述脑脊液浓度计算可溶性因子簇积分；所述判断模块包括存储有判断规则的可读载体；
所述判断规则为：当计算模块计算得到的可溶性因子簇积分高于截断值(在本文中有时称为cutoff值或cutoff)时，判断为所述梅毒患者具有患有所述早期神经梅毒的风险高；反之，则判断为所述梅毒患者具有患有所述早期神经梅毒的风险低；
所述可溶性因子簇包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种，优选由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种组成；
所述早期神经梅毒为MNS或MVNS。
本发明相对于现有技术具有如下技术优势：本发明提供了一种能够对早期神经梅毒MNS或MVNS进行准确检测的技术方案，从而实现对MNS或MVNS的及时准确的检测，为MNS或MVNS的早期诊断、早日提供针对性治疗及预后评估提供了准确且可靠的解决方案。
附图说明
图1显示梅毒患者的脑脊液(CSF)中由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的全部四个可溶性因子组成的可溶性因子簇积分(DeSFS4)与梅毒类型的相关性。其中，各类型梅毒患者数量如下：潜伏梅毒(LS)(n＝29)、无症状神经梅毒(ANS)(n＝30)、眼梅毒(OS)(n＝9)、脑脊膜型神经梅毒(MNS)(n＝8)、脑脊膜血管型神经梅毒(MVNS)(n＝4)和麻痹性痴呆(PD)(n＝32)；P值使用Mann-Whitney检验计算。MNS/MVNS表示由MNS患者和MVNS患者组成的组；non-MNS/MVNS表示由MNS患者和MVNS的患者之外的其他非MNS或MVNS组成的组。纵坐标为DeSFS4积分值。
图2显示了梅毒患者CSF临床参数与DeSFS4的相关性热图，采用Spearman秩和检验评估CSF参数(即白细胞计数(wbc)、蛋白、神经丝蛋白轻链(NF-L)、新喋呤)水平与DeSFS4之间的相关性。其中各类型梅毒患者数量如下：LS(n＝29)、ANS(n＝30)、OS(n＝9)、MNS(n＝8)、MVNS(n＝4)和PD(n＝32)。相关系数的大小由圆圈的大小及圈内所示数字表示。
图3显示了早期神经梅毒患者受试者工作特征曲线(ROC，receiver operatingcharacteristic curve)曲线分析结果，其中显示区分MNS/MVNS患者和非MNS/MVNS患者的DeSFS4的表现。其中，各类型梅毒患者数量如下：LS(n＝29)、ANS(n＝30)、OS(n＝9)、MNS(n＝8)、MVNS(n＝4)和PD(n＝32)。其中，Sensitivity表示敏感性；Specificity表示特异性。
具体实施方式
如上所述，本发明在第一方面提供了一种用于早期神经梅毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括用于对可溶性因子簇中的可溶性因子的脑脊液浓度进行测定的因子检测试剂；所述可溶性因子簇包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种；所述早期神经梅毒为MNS或MVNS。
本发明人经过研究发现，可以基于包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种可溶性因子的可溶性因子簇的脑脊液浓度或由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种可溶性因子组成的可溶性因子簇的脑脊液浓度，可以将早期神经梅毒MNS或MVNS与其他梅毒(例如LS、ANS、OS和PD等)区分开，因此可以用于对所述早期神经梅毒进行检测。
本发明对因子检测试剂的具体类型没有特别限制，只要能够对可溶性因子的脑脊液浓度进行定量检测即可。例如，所述试剂盒可以包括用于对可溶性因子簇中的每一个可溶性因子在脑脊液中的浓度进行测定的因子检测试剂，例如抗相应可溶性因子的抗体(如单克隆抗体)或抗体对(如由包被抗体和检测抗体组成的抗体对)。
在一些优选的实施方式中，所述可溶性因子簇由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种组成。即，所述可溶性因子簇可以由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种组成，或者由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少三种组成，或者由IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的全部四种组成。
因此，对于从IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中选择哪几个可溶性因子进行组合构成可溶性因子簇进行可溶性因子簇积分计算，本发明没有特别的限制，只要该簇积分能够用于将所述早期神经梅毒与其他类型的神经梅毒区分开即可。
所述可溶性因子簇积分(DeSFS)绘制的ROC曲线的曲线下面积(AUC)应当为0.7以上，优选为0.8以上，更优选为0.85以上，并且p值应当小于0.05，优选小于0.01，更优选小于0.001。本领域人员有能力基于本申请公开的内容，基于例如成本、敏感性或准确度等因素考虑，从IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中选择特定的可溶性因子组合组成可溶性因子簇来求算出能够将所述早期神经梅毒与其他类型的梅毒区分开的DeSFS。
在另一些优选的实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于检测脑脊液蛋白和/或脑脊液白细胞的补充检测试剂。采用补充检测试剂进行检测的目的主要是对因子检测试剂的检测结果进行进一步的确认，所述试剂盒是否包括所述补充检测试剂可以根据具体情况由专业技术人员确定。优选的是，所述补充检测试剂可以为用于选自VDRL检测、USR检测、TRUST检测、RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测、pNF-H检测、NF-L检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂。
本发明在第二方面提供了可溶性因子簇在制备用于早期神经梅毒检测的产品中的应用，所述可溶性因子簇包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种，所述早期神经梅毒为MNS或MVNS。
本发明对所述产品的具体类型没有特别的限制，只要能够基于所述可溶性因子簇中的可溶性因子的脑脊液浓度，或者能够基于所述可溶性因子簇中的可溶性因子的脑脊液浓度计算得到可溶性因子簇积分，对所述早期神经梅毒进行检测即可。例如，所述产品可以为容纳有所述因子检测试剂的试剂盒、负载有所述因子检测试剂的检测芯片、或负载有所述因子检测试剂的检测阵列。
在一些优选的实施方式中，所述可溶性因子簇由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种组成。即，所述可溶性因子簇可以由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种组成，或者由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少三种组成，或者由IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的全部四种组成。
在另一些优选的实施方式中，所述检测可以为用于诊断目的的检测，也可以为用于筛查目的的检测，还可以为用于分型目的的检测，还可以用于判断神经梅毒病程目的的检测，或者为上述的两种或更多种目的进行的检测。
在另一些优选的实施方式中，所述检测基于可溶性因子簇积分，所述可溶性因子簇积分根据所述可溶性因子簇中的可溶性因子的脑脊液浓度计算得到。
在另一些优选的实施方式中，所述可溶性因子簇积分通过包括如下步骤的方法计算得到：
(1)对所述可溶性因子簇中的每一个可溶性因子在脑脊液中的浓度进行归一化处理，得到归一化后可溶性因子的数值；
(2)基于所述归一化后可溶性因子的数值，计算可溶性因子簇中的可溶性因子归一化数值的中位数，得到可溶性因子簇积分。
在另一些优选的实施方式中，步骤(1)包括如下子步骤：
(11)计算每个可溶性因子的脑脊液浓度的第95个百分位数(the95thpercentile)；
(12)使用第95个百分位数的值替换等于或大于第95个百分位数的值；
(13)将数据归一化为1.0的最大值。
本发明对可溶性因子簇积分的计算方法没有特别的限制，可以使用本领域常规使用的程序或软件进行。例如，所有分析均可以使用R程序(https://cran.r-project.org/)、SPSS(IBM Corporation，New York，NY，USA)和/或GraphPad Prism 7(GraphPad Software，La Jolla，CA，USA)进行。当然，上述统计分析也可以使用本领域已知的其他软件如Excel或SAS等进行。
在一些更具体的实施方式中，所述可溶性因子簇积分通过包括如下步骤的方法进行：
(21)数据的预处理
使用R包对原始数据进行预处理即归一化。所述归一化可以通过如下方式进行：计算每个可溶性因子的脑脊液浓度的第95个百分位数；使用第95个百分位数的值替换等于或大于第95个百分位数的值；将数据归一化的最大值设为1.0。
(22)关键可溶性因子的筛选
使用R包对所有可溶性因子(例如实施例中的45个)进行组间差异分析。所述组间差异分析可以通过如下方式进行：基于多因素方差分析构建各组拟合模型(例如构建六组(包括LS、ANS、MNS、MVNS、PD和OS)的拟合模型)。使用Tukey的“Honest SignificantDifference”方法对每个配对组进行组间比较。两项测试(即上述多因素方差分析和Tukey组间比较)的显著性水平均设定为p≤0.05。在任何配对组之间没有显示出显著差异的可溶性因子将从后续分析中剔除。鉴定出所有差异表达的关键可溶性因子(DeSF)(例如实施例中的33个可溶性因子)。
(23)组间关键可溶性因子表达谱相似性分析
使用R包中apply函数，分别计算六组患者的每个可溶性因子的中位数，得到6组患者的差异表达的可溶性因子表达谱。所述表达谱相似性分析使用R包中cor.test函数对上述6组患者的差异表达的可溶性因子表达谱进行分析，参数为默认参数，得到各组患者的差异表达的可溶性因子表达谱的相似性系数。
(24)可溶性因子簇的确定
所述聚类分析可以通过如下方式进行：使用R包中hclust函数对各组(例如上述6组)患者的所有差异表达的关键可溶性因子(例如上述的33个可溶性因子)进行聚类分析(参数设置：method＝complete)(例如下文实施例中明确了33个差异表达的关键可溶性因子可聚类为3个可溶性因子簇)。
(25)可溶性因子簇积分的计算
根据表达差异的所有可溶性因子的聚类分析结果，使用R包中apply函数，分别计算每个患者的可溶性因子簇积分(例如实施例中的3个可溶性因子簇积分)：可溶性因子簇积分(SFS)即为每簇中所包含的可溶性因子归一化水平的中位数数值。
在一些实施方式中，在计算出可溶性因子簇积分之后，还可以进一步进行如下步骤(26)至(28)：
(26)可溶性因子簇积分组间差异的检测
使用R程序(https://cran.r-project.org/)、SPSS(IBM Corporation，New York，NY，USA)和/或GraphPad Prism 7(GraphPad Software，La Jolla，CA，USA)对各组间可溶性因子簇积分的差异进行统计分析。对于正态分布的数据，数据以平均值±标准差表示，而对于非正态分布数据，数据则以中位数(四分位间距)表示。p值≤0.05被认为具有统计学意义。
(27)可溶性因子簇积分与临床参数相关性的评价
使用R包中cor函数完成了DeSFs积分与临床参数(白细胞计数(wbc)、蛋白、神经丝蛋白轻链(NF-L)和新喋呤)之间的相关性评估。相关性通过斯皮尔曼方法(Spearman，在数据为非正态分布数据的情况下选用)或皮尔森方法(Pearson，在数据为正态分布数据的情况下选用)进行检测。使用“ggcorrplot”R包绘制了DeSFs积分与临床参数的相关性热图。
(28)ROC分析
使用R程序(https://cran.r-project.org/)、SPSS(IBM Corporation，New York，NY，USA)和/或GraphPad Prism 7(GraphPad Software，La Jolla，CA，USA)进行ROC分析，从而评估该积分的诊断准确性。ROC曲线下面积(AUC)被用于单个差异表达的可溶性因子、可溶性因子簇积分或临床参数辨别能力的评价。
本发明在第三方面提供了用于梅毒患者患有早期神经梅毒的风险的判断系统，所述判断系统包括检测模块、计算模块和判断模块；其中：
所述检测模块用于获取可溶性因子簇中每一个可溶性因子的脑脊液浓度；所述计算模块用于根据所述浓度计算可溶性因子簇积分；所述判断模块包括存储有判断规则的可读载体；
所述判断规则为：当计算模块计算得到的可溶性因子簇积分高于阳性截断值时，判断为所述梅毒患者患有所述早期神经梅毒的风险高；反之，则判断为所述梅毒患者患有所述早期神经梅毒的风险低；
所述可溶性因子簇包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种；
所述早期神经梅毒为MNS或MVNS。
在一些优选的实施方式中，所述可溶性因子簇由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种组成。即，所述可溶性因子簇可以由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种组成，或者由优选至少三种、更优选全部四种组成。
在一些优选的实施方式中，所述系统还包括至少一个存储器，其用于存储所述第一可溶性因子簇和/或所述第二可溶性因子簇中的脑脊液浓度数据集(如本发明实施例中针对所述患者所测定的脑脊液浓度数据集)。在一些实施方式中，所述至少存储器还可以存储基于所述脑脊液浓度计算得到的可溶性因子簇积分的cutoff值。当获得一份所选取的可溶性因子簇中的可溶性因子的待判断的脑脊液浓度数据后，即可将该脑脊液浓度数据与原先存储的n份脑脊液浓度数据一起构成新的n+1份脑脊液浓度数据集，由此可以基于该n+1份脑脊液浓度数据集计算簇积分，然后可以将该簇积分与对应的cutoff进行比较。在一些实施方式中，所述至少一个存储器还可以存储基于脑脊液浓度计算可溶性因子簇积分的算法以供所述计算模块在对积分进行计算时调用。
在一些实施方式中，所述cutoff值是预先录入的固定的cutoff，例如所述第一可溶性因子簇积分的cutoff值和/或所述第二可溶性因子簇积分的cutoff值。
在一些实施方式中，所述cutoff值是不断优化的cutoff值。在这种情况下，所述系统例如可以具有不断学习的能力。例如，在根据录入到所述存储器中的新的脑脊液浓度并完成所述风险判断后，将符合收录标准(例如该新的脑脊液浓度被确定来自实施例所述的六组类型之一)的新的脑脊液浓度数据合并到原先存储的脑脊液浓度数据集中，基于该新的数据集计算出新的cutoff值以代替原先的cutoff值。于是，随着数据的增加(亦即样本量的增加)，cutoff越来越精确，从而使得准确率越来越高。
下文将通过实施例对本发明进行举例说明，但是这些实施例仅出于说明目的，本发明的保护范围不限于下文提供的实施例。
实施例
1.受试者概况
在本发明的实施例中提及的患者都是本发明人在首都医科大学附属北京地坛医院于2016年8月至2019年9月期间招募了到的患者，这些患者包括29名潜伏梅毒患者和83名神经梅毒患者，这112名患者均无艾滋病。梅毒的诊断是通过梅毒特异性抗体试验TPPA测试证实的。其中，潜伏梅毒患者、无症状神经梅毒患者、有症状神经梅毒患者、脑脊膜型神经梅毒患者和脑脊膜血管型神经梅毒患者的判断标准如下：
A.潜伏梅毒(LS)的判断标准：
(1)有梅毒感染史；
(2)血清非梅毒螺旋体试验阳性；
(3)血清梅毒螺旋体试验阳性；
(4)无神经系统受损症状和体征；
(5)CSF未见异常。
B.无症状神经梅毒(ANS)的判断标准：
(1)有梅毒感染史；
(2)血清梅毒螺旋体试验阳性；
(3)无神经系统受损症状和体征；
(4)CSF VDRL(TRUST)试验阳性；或CSF VDRL(TRUST)试验阴性，同时CSF梅毒螺旋体试验阳性或CSF白细胞>5个/μl或CSF蛋白>45mg/dl。
C.有症状神经梅毒(SNS)的判断标准：
(1)有梅毒感染史；
(2)血清梅毒螺旋体试验阳性；
(3)有神经系统受损症状和体征；
(4)CSF VDRL(TRUST)试验阳性；或CSF VDRL(TRUST)试验阴性，同时CSF梅毒螺旋体试验阳性或CSF白细胞>5个/μl或CSF蛋白>45mg/dl。
D.脑脊膜型神经梅毒(MNS)的判断标准：
符合C中有症状神经梅毒(SNS)的判断标准且临床表现为发热、头痛、恶心、呕吐、视乳头水肿、颈项强直、脑膜刺激征阳性等脑膜炎症状，可伴有视力下降、复视、上睑下垂、面瘫、听力下降等颅神经受损症状，或者偏瘫、失语、癫痫发作、大小便失禁等症状。头MRI增强可见脑膜强化。
E.脑脊膜血管型神经梅毒(MVNS)的判断标准：
符合C中有症状神经梅毒(SNS)的判断标准且临床表现为短暂性脑缺血发作(TIA)、脑梗死、脑出血、静脉窦血栓、蛛网膜下腔出血，且除梅毒感染外，无其他导致卒中的病因。
本发明人根据2014年欧洲梅毒管理指南将这些患者分为如下6组：潜伏梅毒LS(n＝29)、无症状神经梅毒ANS(n＝30)、脑脊膜型神经梅毒(MNS)(n＝8)、脑脊膜血管型神经梅毒(MVNS)(n＝4)、麻痹性痴呆(PD)(n＝32)和眼梅毒(OS)(n＝9)。
本发明的实施获得了首都医科大学附属北京地坛医院伦理委员会的批准，并且所有参与者都提供了经签署的知情同意书。
2.样品采集
收集CSF样本作为常规诊断检查的一部分。腰椎穿刺术后，留取2mL CSF样本。通过在1500rpm下离心10分钟来提取CSF的上清液，并在-80℃下储存直至分析。
3.脑脊液新喋呤和脑脊液NF-L的测定
根据制造商的说明，使用商业酶联免疫吸附测定试剂盒(IBL,Hamburg,Germany)测量CSF新喋呤和NF-L的浓度。使用微孔板读取器(Spectra Max M2，England)在450nm处测量光密度。CSF新喋呤水平以nmol/L表示，NF-L水平以pg/mL表示。
4.脑脊液可溶性因子浓度的测定
为了比较可溶性因子的浓度，本发明人采用Luminex xMAP方法(ProcartaPlexHuman Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel 1(45plex)96tests，AffymetrixeBioscience Ltd.,Hatfield,United Kingdom)，按照制造商的说明，检测六组患者CSF中的45种可溶性因子，这些可溶性因子(有时称为可溶性蛋白)包括：
(1)29种细胞因子：IL-1RA、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(或称CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ、脑源性神经营养因子(BDNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)和白血病抑制因子(LIF)；
(2)8种趋化因子：生长调节癌基因α(GRO-α，或称CXCL1)、MCP-1(或称CCL2)、巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α，或称CCL3)、MIP-1β(或称CCL4)、调节激活正常T细胞表达和分泌的细胞因子(RANTES，或称CCL5)、IFN-γ诱导蛋白10(IP-10，或称CXCL10)、嗜酸性粒细胞趋化蛋白(Eotaxin，或称CCL11)和基质细胞衍生因子1α(SDF-1α，或称CXCL12)；
(3)8种生长因子：表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-2)、肝细胞生长因子(HGF)、β-神经生长因子(β-NGF)、血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、胎盘生长因子(PLGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)和血管内皮生长因子(VEGF-D)。
5.统计分析
所有统计分析使用R程序(https://cran.r-project.org/)、SPSS(IBMCorporation，New York，NY，USA)或GraphPad Prism 7(GraphPad Software，La Jolla，CA，USA)进行。对于正态分布的数据，数据以平均值±标准差表示，而对于非正态分布数据，数据则以中位数(四分位间距)表示。p值≤0.05被认为具有统计学意义。
6.可溶性因子测得浓度数据的处理
(1)对所有可溶性因子浓度进行归一化处理：
(a)本发明人计算了每个因子的脑脊液浓度水平的第95个百分位数；(b)将等于或大于第95个百分位数的值替换为第95个百分位数的值；(c)将数据归一化的最大值设为1.0。
(2)关键可溶性因子的筛选
使用R包对所有45个可溶性因子进行组间差异分析：基于多因素方差分析构建了六组(包括LS、ANS、MNS、MVNS、PD和OS)的拟合模型。使用Tukey的“Honest SignificantDifference”方法对每个配对组进行组间比较。两项测试的显著性水平均设定为p≤0.05。在任何配对组之间没有显示出显著差异的可溶性因子将从后续分析中剔除。
(3)组间关键可溶性因子表达谱相似性分析
使用R包中apply函数，分别计算六组患者的每个可溶性因子的中位数，得到6组患者的差异表达的可溶性因子表达谱。所述表达谱相似性分析使用R包中cor.test函数对上述6组患者的差异表达的可溶性因子表达谱进行分析，参数为默认参数，得到各组患者的差异表达的可溶性因子表达谱的相似性系数。
(4)可溶性因子簇的确定
所述聚类分析使用R包中hclust函数对上述6组患者的所有差异表达的可溶性因子进行聚类分析(参数设置：method＝complete)。
(5)可溶性因子簇积分的计算
根据表达差异的所有可溶性因子的聚类分析结果，使用R包中apply函数，分别计算每个患者的3个可溶性因子簇积分：可溶性因子簇积分(DeSFS)即为每簇中所包含的可溶性因子归一化水平的中位数数值。
(6)可溶性因子簇积分组间差异的检测
使用R程序对各组间可溶性因子簇积分的差异进行统计分析。对于正态分布的数据，数据以平均值±标准差表示，而对于非正态分布数据，数据则以中位数(四分位间距)表示。p值≤0.05被认为具有统计学意义。
(7)可溶性因子簇积分与临床参数相关性的评价
使用R包中cor函数完成了DeSFS与临床参数(wbc、蛋白、NF-L和新喋呤)之间的相关性评估。通过斯皮尔曼相关性分析进行检测。使用“ggcorrplot”R包绘制了DeSFS与临床参数的相关性热图。
(8)ROC分析
使用SPSS软件进行ROC分析，从而评估该积分的诊断准确性。AUC被用于单个DeSF、DeSFS或临床参数辨别能力的评价。
7.结果
为了阐明神经梅毒患者神经系统的免疫反应特征，本发明人用Luminex xMAP方法(ProcartaPlex Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel 1(45plex)96tests,Affymetrix eBioscience Ltd.,Hatfield,United Kingdom)对上述112例患者的脑脊液中的45种可溶性因子的浓度进行检测。这45种可溶性因子包括29种细胞因子、8种趋化因子和8种生长因子。
在排除任何两组之间没有显著差异的12个因子后，本发明人对余下33个组间存在显著差异的可溶性因子(DeSF)(包括21种细胞因子、7种趋化因子和5种生长因子)进行了进一步的研究。通过聚类分析发现，所述33个可溶性因子可以分为3簇。其中包括IL-15、IL-27、IFN-α和EGF的可溶性因子簇的积分可以用于将早期神经梅毒MNS和MVNS患者与其他梅毒患者区分开；其他两簇的可溶性因子簇积分由于具有不同的检测作用，将另案申请。
表1显示了早期神经梅毒患者脑脊液中33个可溶性因子表达谱的相似性，表内所标数值为各组间可溶性因子表达谱的相似性系数。如表1所示，MNS与MVNS两组患者脑脊液中33个可溶性因子组成的表达谱呈现同一模式(相似系数高达0.91)。而MNS、MVNS分别与其他梅毒组患者的脑脊液中可溶性因子表达谱相似系数均不高。因此提示我们早期神经梅毒中MNS、MVNS患者脑脊液中33个可溶性因子表达谱基本一致，且可以将这两组与其他梅毒患者进行区分，因此后续将MNS/MVNS合并分析。
表1.组间33个可溶性因子表达谱的相似性分析。
| LS | ANS | OS | MNS | MVNS | PD | |
| MNS | 0.59 | 0.41 | 0.48 | 1 | 0.91 | 0.28 |
| MVNS | 0.48 | 0.31 | 0.43 | 0.91 | 1 | 0.18 |
图1显示了梅毒患者的脑脊液(CSF)中由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的全部四个可溶性因子组成的可溶性因子簇积分(DeSFS4)与梅毒类型的相关性。将早期神经梅毒MNS和MVNS患者合并一组后，分别计算两组3个可溶性因子簇的积分并进行组间差异比较。从图1可以看出，三簇中由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的全部四个可溶性因子组成的可溶性因子簇积分(DeSFS4)在MNS和MVNS组显著高于其他梅毒组(p<0.0001)。因此基于表1及图1结果，推测DeSFS4可能可以用于区分MNS、MVNS患者与其他梅毒患者。
图2显示了梅毒患者CSF临床参数与DeSFS4的相关性热图，采用Spearman秩和检验评估CSF参数(即白细胞计数(wbc)、蛋白、神经丝蛋白轻链(NF-L)、新喋呤)水平与DeSFS4之间的相关性。从图2可以看出，DeSFS4与NF-L浓度呈正相关(R＝0.40，p<0.001)，而NF-L是神经系统变性和感染性疾病中神经元损伤的一种广泛公认的生物标志物(参见Garland P,Morton M,Zolnourian A,Durnford A,Gaastra B,Toombs J,et al.Neurofilament lightpredicts neurological outcome after subarachnoid haemorrhage.Brain:a journalof neurology.2021；144(3):761-8)，这表明选自由IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的可溶性因子簇中的促炎细胞因子IL-15和IFN-α可能与神经系统受损程度即神经元轴突损伤程度有关。
鉴于抗炎细胞因子IL-27和生长因子EGF能够促进细胞生长、增殖和组织修复(DuR,Shen W,Liu Y,Gao W,Zhou W,Li J,et al.TGIF2promotes the progression of lungadenocarcinoma by bridging EGFR/RAS/ERK signaling to cancer cellstemness.Signal transduction and targeted therapy.2019；4:60.)，推测上述因子IL-27、EGF与MNS和/或MVNS患者的神经系统损伤部位的细胞生长、增殖和组织修复有关。
图3显示了早期神经梅毒患者受试者工作特征曲线(ROC，receiver operatingcharacteristic curve)曲线分析结果。从图3可以看出，由IL-15、IL-27、IFN-α和EGF组成的可溶性因子簇(有时简称为簇2或第2簇)的可溶性因子簇积分(即DeSFS4)(AUC显著0.7并且p值小于0.05)可以用于将MNS和MVNS与其他梅毒区分开，从而可以用于对MNS和MVNS进行准确检测。如ROC曲线和表2的数据所示，AUC高达0.833(p＝0.001)。
本发明人还分析了由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的两种、三种可溶性因子组成的簇的可溶性因子簇积分(DeSFS2-1至DeSFS2-6、DeSFS3-1至DeSFS3-4)、临床参数(CSFwbc和CSF蛋白)以及单个可溶性因子(EGF)的ROC的AUC，结果参见表2。
表2.由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的两种、三种或全部四种可溶性因子组成的可溶性因子簇的积分、临床参数CSF wbc和CSF蛋白以及EGF和IL-8的受试者工作特征曲线分析。
注：“/”表示不存在积分编号。
从表2可以看出，除了DeSFS4之外，由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的两种或三种可溶性因子组成的簇的可溶性因子簇积分也可以用于将MNS/MVNS患者和非MNS/MVNS区分开(AUC大于0.7且p小于0.05)，即可以用于对早期神经梅毒MNS或MVNS进行检测。但是，临床参数CSF wbc、CSF蛋白、EGF和IL-8都无法将早期神经梅毒MNS或MVNS和其他类型的梅毒区分开，无法判断神经梅毒患者病程(处于疾病早期或晚期)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (11)
1.一种用于早期神经梅毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于对可溶性因子簇中的可溶性因子的脑脊液浓度进行测定的因子检测试剂；所述可溶性因子簇包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种；所述早期神经梅毒为脑脊膜型神经梅毒或脑脊膜血管型神经梅毒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述可溶性因子簇由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、三种或全部四种组成。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测脑脊液蛋白和/或脑脊液白细胞的补充检测试剂；优选的是，所述补充检测试剂为用于选自VDRL检测、USR检测、TRUST检测、RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测、pNF-H检测、NF-L检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述因子检测试剂和所述补充检测试剂独立地为抗可溶性因子的抗体或抗可溶性因子的抗体对；优选的是，所述抗体为单克隆抗体；另外优选的是，所述抗体对为由包被抗体和检测抗体组成的抗体对。
5.可溶性因子簇在制备用于早期神经梅毒检测的产品中的应用，其特征在于，所述可溶性因子簇包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种，所述早期神经梅毒为脑脊膜型神经梅毒或脑脊膜血管型神经梅毒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述可溶性因子簇由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种组成。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述检测基于可溶性因子簇积分，所述可溶性因子簇积分根据所述可溶性因子簇中的可溶性因子的脑脊液浓度计算得到。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述可溶性因子簇积分通过包括如下步骤的方法计算得到：
(1)对所述可溶性因子簇中的每一个可溶性因子在脑脊液中的浓度进行归一化处理，得到归一化后可溶性因子的数值；
(2)基于所述归一化后可溶性因子的数值，计算可溶性因子簇中的可溶性因子归一化数值的中位数，得到可溶性因子簇积分。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(1)包括如下子步骤：
(11)计算每个可溶性因子的脑脊液浓度的第95个百分位数；
(12)使用第95个百分位数的值替换为等于或大于第95个百分数位的值；
(13)将数据归一化为1.0的最大值。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为容纳有所述因子检测试剂的试剂盒、负载有所述因子检测试剂的检测芯片、或负载有所述因子检测试剂的检测阵列。
11.用于梅毒患者患有早期神经梅毒的风险的判断系统，其特征在于，所述判断系统包括检测模块、计算模块和判断模块；其中：
所述检测模块用于获取可溶性因子簇中每一个可溶性因子的脑脊液浓度；所述计算模块用于根据所述脑脊液浓度计算可溶性因子簇积分；所述判断模块包括存储有判断规则的可读载体；
所述判断规则为：当计算模块计算得到的可溶性因子簇积分高于阳性截断值时，判断为所述梅毒患者患有所述早期神经梅毒的风险高；反之，则判断为所述梅毒患者患有所述早期神经梅毒的风险低；
所述可溶性因子簇包括选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种，优选由选自IL-15、IL-27、IFN-α和EGF中的至少两种、至少三种或全部四种组成；
所述早期神经梅毒为脑脊膜型神经梅毒或脑脊膜血管型神经梅毒。
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