CN117849018A - 一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测b族维生素的方法及试剂盒 - Google Patents
一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测b族维生素的方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法及试剂盒，属于定量检测技术领域。本发明使用过量的硼氢化钠作为还原剂来防止纳米银颗粒表面的动态氧化。B族维生素分子结构中存在含有N‑氨基结构，可以吸附在暴露的纳米银颗粒的表面，在还原剂过量的稳定溶胶系统中获得了稳定的初始拉曼信号。本发明引入Ca2+，去除多余的硼酸盐离子，并诱导特异性吸附B族维生素分子的纳米银颗粒聚集，形成热点，进一步显著增强B族维生素分子的拉曼信号；利用不同维生素分子的特征图谱，可实现不同维生素分子的特异性识别，使用峰值强度可定量获得维生素的分子浓度和单个维生素分子在混合维生素中的含量，表现出良好的线性关系。
Description
技术领域
本发明涉及定量检测技术领域，特别涉及一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法及试剂盒。
背景技术
B族维生素是一组人体必需的水溶性有机分子，也是众多执行能量代谢、DNA和蛋白质合成等基本功能和其他关键功能的酶的辅助因子。B族维生素作为一种必需的营养物质在体内既不产生也不储存，需要从外部获取。B族维生素的需要量很小，但在调节新陈代谢和能量转换中起着关键作用。因此，维生素的检测对人类健康、食品营养价值评价、药品质控等方面至关重要。
传统的维生素检测方法(如紫外分光光度法)成本较低，能够对化合物分子中电子转换产生的光谱进行定性和定量的底物分析，但样品预处理复杂耗时，产物的颜色不稳定。例如荧光分光光度计法主要是通过氧化剂氧化维生素，再用反应试剂形成含氮环缩合产物，最后通过荧光分光光度计来测量含氮环缩合产物，虽然该方法简单灵敏，但应用范围有限。高效液相色谱法(HPLC)和微生物法也常用于检测维生素。HPLC是基于被分离组分在流动相和固定相中的溶解度不同的原理，样品预处理简单，分离速度快，但设备相对复杂昂贵。此外，某些维生素对色谱预处理的要求较高，微量测定受限。微生物法是基于特定细菌在没有某种特定维生素时就不能生长的原理，通过细菌繁殖或代谢物的数量来测定维生素。虽然微生物法价格便宜，操作性强，适合测定微量维生素的含量，但检测周期长，批量检测结果重复性差，误差大。因此，需要一种新的维生素检测方法来解决上述传统检测方法的局限性，如步骤复杂、检测周期长、干扰因素多、准确性差、灵敏度低等问题。
表面增强拉曼技术(SERS)是分子光谱研究的关键，具有灵敏度高、分子结构信息丰富、样品制备简单、水信号干扰小等优点。SERS目前已被广泛用于生物分子检测。然而，维生素分子结构独特，固态拉曼信号弱，水溶液中的维生素是一种惰性分子，难以检测拉曼信号，一般的增强底物不能增强拉曼信号。因此传统方法并不能获取维生素的拉曼图谱。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法及试剂盒，本发明提供的检测方法能够在没有拉曼探针标记的情况下实现B族维生素的灵敏、准确、定量检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法，包括以下步骤：
将硝酸银、过量的硼氢化钠与水混合，进行还原反应，得到纳米银颗粒；
将待测液体与所述纳米银颗粒的水分散液混合，加入Ca2+溶液，得到供试液；
对所述供试液进行拉曼光谱测试，获得拉曼信号特征峰值强度；
根据所述拉曼信号特征峰值强度和预定的标准曲线获得待测液体中B族维生素的含量；所述标准曲线为拉曼信号特征峰值强度与B族维生素浓度的线性关系曲线。
优选的，所述B族维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B4、维生素B7和维生素B9中的一种或几种。
优选的，所述硝酸银与硼氢化钠的质量比为1～3:1。
优选的，所述还原反应的时间为30～40min。
优选的，所述纳米银颗粒的粒径为35～48nm。
优选的，所述待测液体与纳米银颗粒的水分散液的体积比为1～2:1。
优选的，所述Ca2+溶液的浓度为0.01M；
所述纳米银颗粒的水分散液与Ca2+溶液的体积比为4～8:1。
优选的，所述拉曼光谱测试的参数包括：
优选的，所述B族维生素的最低检测限为5ng/mL。
本发明提供了一种检测B族维生素的试剂盒，包括纳米银颗粒，Ca2+溶液，所述纳米银颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将硝酸银、过量的硼氢化钠与水混合，得到纳米银颗粒。
本发明提供了一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法，包括以下步骤：将硝酸银、过量的硼氢化钠与水混合，进行还原反应，得到纳米银颗粒；将待测液体与所述纳米银颗粒的水分散液混合，加入Ca2+溶液，得到供试液；对所述供试液进行拉曼光谱测试，获得拉曼信号特征峰值强度；根据所述拉曼信号特征峰值强度和预定的标准曲线获得待测液体中B族维生素的含量；所述标准曲线为拉曼信号特征峰值强度与B族维生素浓度的线性关系曲线。本发明通过使用过量的硼氢化钠作为还原剂来防止纳米银颗粒表面的动态氧化，构成还原剂过量的稳定溶胶增强底物(简写为AgBONPs或Ag@BO)。B族维生素分子结构中存在含有N-氨基结构(氨基自由基)，可以吸附在暴露的纳米银颗粒的表面，在还原剂过量的稳定溶胶系统中获得了稳定的初始拉曼信号。本发明引入Ca2+，去除多余的硼酸盐离子，并诱导特异性吸附B族维生素分子的纳米银颗粒聚集，形成热点，进一步显著增强B族维生素分子的拉曼信号。利用不同维生素分子的特征图谱，可实现不同维生素分子的特异性识别，本发明能够在没有标记的情况下分析各种B族维生素分子的图谱并获得信噪比且可重复的研究。使用峰值强度可定量获得维生素的分子浓度和单个维生素分子在混合维生素中的含量，表现出良好的线性关系。本发明提供的“表面-热点”两步增强法可以提高底物的稳定性和灵敏度，准确捕捉微弱的拉曼活动，为B族维生素分子图谱信息跟踪检测提供有力保障，并为维生素食品、药品和疾病的分析提供了一种有效的新方法。
同时，本发明提供的基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法操作简单，不需要复杂的前处理，实际操作性强。
附图说明
图1为基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的示意图；
图2为不同条件下纳米银颗粒的TEM图像；
图3为不同条件下纳米银颗粒的DLS图像；
图4为不同聚合剂的SERS检测结果；
图5为六种维生素(B1、B2、B3、B4、B7和B9)的SERS信号；
图6为通过SERS信号强度量化维生素浓度的变化结果；
图7为不同血液、唾液和尿液浓度下的维生素B4的SERS光谱；
图8为不同血液、唾液和尿液浓度下的维生素B2的SERS光谱。
具体实施方式
本发明提供了一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法，具体的为非诊断目的的检测方法，包括以下步骤：
将硝酸银、过量的硼氢化钠与水混合，进行还原反应，得到纳米银颗粒；
将待测液体与所述纳米银颗粒的水分散液混合，加入Ca2+溶液，得到供试液；
对所述供试液进行拉曼光谱测试，获得拉曼信号特征峰值强度；
根据所述拉曼信号特征峰值强度和预定的标准曲线获得待测液体中B族维生素的含量；所述标准曲线为拉曼信号特征峰值强度与B族维生素浓度的线性关系曲线。
在本发明中，所述B族维生素优选包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B4、维生素B7和维生素B9中的一种或几种。在本发明中，所述维生素B1、B2、B3、B4、B7、B9的结构式如下：
本发明将硝酸银、过量的硼氢化钠与水混合，进行还原反应，得到纳米银颗粒。在本发明中，所述过量的硼氢化钠指的是硼氢化钠的摩尔量高于硝酸银的摩尔量，使硝酸银充分发生还原反应。在本发明中，所述硝酸银与硼氢化钠的质量比优选为1～3:1，更优选为1:1。
在本发明中，所述混合优选为：先将硼氢化钠与水搅拌混合，再加入硝酸银溶液。
在本发明中，所述硼氢化钠与水的质量比优选为0.01:200。在本发明中，所述搅拌的速率优选为850r/min，时间优选为5min。
在本发明中，所述硝酸银溶液的质量浓度优选为5×10-6g/mL。
在本发明中，所述还原反应优选在室温、搅拌的条件下进行，所述搅拌的速率优选为850r/min。在本发明中，所述还原反应的时间优选为30～40min，更优选为35～40min。
所述还原反应后，本发明优选对所得还原反应产物进行离心，离心后弃去上清液备用。在本发明中，所述离心的速率优选为5500rpm。
在本发明中，所述纳米银颗粒的粒径优选为35～48nm，具体优选为40.55±0.777nm。
本发明将待测液体与所述纳米银颗粒的水分散液混合，加入Ca2+溶液，得到供试液。在本发明中，所述待测液体优选为食品或药品的水溶液、血清、尿液和唾液中的一种或几种。在本发明中，所述待测液体中B族维生素的浓度优选为10～50μg/mL。
在本发明中，所述待测液体与纳米银颗粒的水分散液的体积比优选为1～2:1；
在本发明中，所述待测液体与所述纳米银颗粒的水分散液混合的时间优选为1min。
在本发明中，所述Ca2+溶液中的可溶性钙盐优选为CaCl2。在本发明中，所述Ca2+溶液的浓度优选为0.01M，所述纳米银颗粒的水分散液与Ca2+溶液的体积比优选为4～8:1，更优选为6:1。
得到所述供试液后，本发明对所述供试液进行拉曼光谱测试，获得拉曼信号特征峰值强度。在本发明中，所述拉曼光谱测试的参数优选包括：
本发明根据所述拉曼信号特征峰值强度和预定的标准曲线获得待测液体中B族维生素的含量；所述标准曲线为拉曼信号特征峰值强度与B族维生素浓度的线性关系曲线。在本发明中，所述标准曲线的获得方法，优选包括以下步骤：
提供梯度已知浓度的B族维生素水溶液；
以所述梯度已知浓度的B族维生素水溶液作为待测液体，将所述梯度已知浓度的B族维生素水溶液分别与所述纳米银颗粒的水分散液混合，加入Ca2+溶液，制备供试液；对所述供试液进行拉曼光谱测试，获得梯度已知浓度的B族维生素水溶液对应的拉曼信号特征峰值强度，以B族维生素水溶液的浓度为横坐标，以拉曼信号特征峰值强度为纵坐标，绘制标准曲线。
在本发明中，所述梯度已知浓度的B族维生素水溶液的浓度优选为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL。
在本发明中，所述B族维生素的最低检测限为5ng/mL，所述B族维生素的线性检测范围为10μg/mL～50μg/mL。
在本发明中，当需要去确定未知具体的B族维生素浓度时，优选加入内标。
在本发明中，基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的示意图如图1所示。
本发明提供了一种检测B族维生素的试剂盒，包括纳米银颗粒，Ca2+溶液，所述纳米银颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将硝酸银、过量的硼氢化钠与水混合，得到纳米银颗粒。
在本发明中，所述纳米银颗粒的制备方法与上文相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法及试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中，维生素类药物购自Biobio-technology(上海)有限公司。硼氢化钠(99.99％)购自默克化工技术(上海)有限公司；人工尿和人工唾液购自Dong wan Chuangfeng自动化技术有限公司；使用超纯水稀释维生素，浓度为50μg/mL。所有实验中使用的水是电阻率为18MΩ*cm的超纯水。检测体液中的维生素时，称量需要量的维生素并将其溶解在不同的体液中。测试条件与纯水中的维生素的测试条件相同。除非另有说明，否则测试是在纯水中进行的。
实施例1
(1)首先将0.02g硼氢化钠溶于400mL纯水，以850r/min的速度搅拌5分钟。然后，加入准备好的硝酸银溶液(将0.02g硝酸银溶于10mL的溶液中)，以同样的速度搅拌40分钟。最后，以5500rpm的速度离心，弃去上清液备用，得到纳米银颗粒Ag@BONPs作为强化底物。
(2)提取20μL强化底物与20μL浓度为50μg/mL的维生素B2溶液样品混合，加入5μL0.01M的Ca2+离子溶液(CaCl2溶液)，得到Ag@BOCNPs+B2样品。参照此法，制备Ag@BONPs+B2样品(不加CaCl2溶液)、Ag@BOCNPs样品(不加维生素B2溶液)。
不同条件下纳米银颗粒的TEM图像如图2所示。图2中，(a)为Ag@BONPs，(b)为Ag@BONPs+B2，(c)为Ag@BOCNPs，(d)为Ag@BOCNPs+B2。可以看出，钙离子的引入，拉近了银纳米颗粒之间的距离，同时也增大了银纳米颗粒之间的电磁场强度，更有利于扩大维生素物质的拉曼信号。
不同条件下纳米银颗粒的DLS图像如图3所示。图3中，(a)为Ag@BONPs，(b)为Ag@BONPs+B2，(c)为Ag@BOCNPs，(d)为Ag@BOCNPs+B2。由图3可以看出，(a)表明没有任何物质的原始纳米银颗粒的粒径约为40.55±0.777nm。(b)显示，当维生素B2分子被添加到纳米银颗粒中时，从粒度图中可以清楚地看到，纳米银颗粒和维生素B2分子此时有一定的结合能力，因此粒径变成49.51±0.793nm。在体系中加入钙离子后，纳米银颗粒与维生素B2分子的结合更加紧密，在(d)中显示粒径为61.48±0.725nm。此外，在原始的纳米银颗粒中加入钙离子，得到的粒径为54.63±0.761m。因此，本发明证实了纳米银颗粒表面可以与维生素分子形成一定的物理吸附，然后在钙离子的聚合下，纳米银颗粒之间的间隙进一步缩小，形成热点从而进一步扩大拉曼信号。
(3)不同聚合剂的SERS检测结果
制备含有不同聚合剂的供试液：
①AgBOMNPs：20μL的维生素溶液与20μL的AgBONPs混合，然后将混合物加入5μL浓度为0.01M的Mg2+中，直接用于维生素的SERS检测。
②AgBONNPs：20μL的维生素溶液与20μL的AgBONPs混合，然后将混合物加入5uL浓度为0.01M的Na+中，直接用于维生素的SERS检测。
③AgBOANPs：20μL的维生素溶液与20μL的AgBONPs混合，然后将混合物加入5uL浓度为0.01M的Al3+中，直接用于维生素的SERS检测。
④AgBOCNPs：20μL的维生素溶液与20μL的AgBONPs混合，然后将混合物加入5uL浓度为0.01M的Ca2+中，直接用于维生素的SERS检测。
使用WITecalpha300R共焦拉曼显微镜(WITEC，德国)测量标准SERS，激光波长、物镜、扫描时间、累计次数、激光光斑直径和激光功率分别为633nm、10x、10s、1次、1μm和15mW。
不同聚合剂的SERS检测结果如图4所示。图4中，A为不同体系中维生素B3的SERS光谱：不含维生素的Ag@BONPs的SERS光谱(灰线)，500μg/mL的B3与Ag@BONPs的SERS光谱(绿线)，50μg/mL的烟酸与Ag@BOCNPs的SERS光谱(蓝线)，固态维生素B3的拉曼光谱(红线)。B为以Ag@BOCNPs、Ag@BONNPs和Ag@BOANPs为底物的50μg/mL维生素B2的SERS光谱。C为以Ag@BOCNPs和Ag@BONNPs以及Ag@BOANPs和Ag@BOMNPs为底物的50μg/mL的维生素B9的SERS光谱。D为使用本方法(Ag@BOCNPs)测定随机20组核黄素样品(5μg/mL)的SERS光谱。
图4中，A是维生素B3在同一底物的不同条件下使用的SERS光谱，灰线代表纯增强底物。将增强底物与维生素B3(500μg/mL)以等比例混合，得到微弱的拉曼信号(绿线)，这可能是由于纳米银颗粒表面和维生素B3之间的特定吸附，因此得到了最初的增强拉曼信号。最后，加入Ca2+作为聚合剂并用于混合体系，检测到了具有良好信噪比的维生素B3分子的SERS信号(蓝线)，表明维生素B3的拉曼信号在设计的检测平台(“表面-热点”两步增强技术)中被倍数放大。最后，从纯维生素B3粉末中检测到的拉曼光谱(红线)与水溶液的拉曼光谱相似，表明Ag@BOCNPs底物可以显著增强维生素B3分子的拉曼信号，同时保留了其天然结构。
本发明提供的检测方法可以直接观察到维生素分子的结构状态：维生素B3的结构在水溶液中略有变化。固体中641cm-1和811cm-1的拉曼峰位置发生了红移。将水溶液中706cm-1和849cm-1的拉曼峰位置分配为C-H拉伸、羧酸盐(COO-)拉伸振动吸收和C-H对称摆动。1392cm-1和1034cm-1的峰位分别与羧酸酯δ(COO-)的变形和吡啶环的呼吸振动有关。此外，1599cm-1的峰位与C-H键之间的平面内拉伸振动和吡啶环的拉伸振动有关。使用维生素B2和B9分子进一步验证增强的N-氨基结构是否与Ag@BONPs底物混合，以评估该方法的可行性和通用性。
氨基与纳米银颗粒相互作用，被吸附在银表面，参见图2中的(b)，这种吸附可能是含有孤电子对的氨基氮和含有空位轨道的银原子之间的配位现象，发现初始的维生素B2信号。随后在混合物中加入钙离子作为阳离子聚合剂，进一步拉近纳米银颗粒与分子之间的距离，实现了拉曼信号的二次增强。这些结果表明“表面-热点”两步增强技术能够获取良好的维生素B2的SERS信号，而且该方法也通过颗粒大小得到了证明，参见图3。
维生素B2的峰带为N-C＝O、环呼吸模式、环内平面振动和C-C之间的扭曲振动，分别为606cm-1、740cm-1、1157cm-1和1323cm-1。维生素B9的峰带为C-H键的平面内弯曲、芳香环的平面内变形振动、C＝C键的平面内弯曲和吡啶环的拉伸振动，分别为1178cm-1、1377cm-1、1499cm-1和1583cm-1。图4中B和C是使用不同金属阳离子得到的维生素分子图谱。传统的金属阳离子聚合剂不能消除杂质峰信号的干扰，与传统阳离子相比，钙(灰线)的信号增强能力比钠(红线)、镁(蓝线)和铝(绿线)至少高一个数量级。
使用公式EF＝(ISERS/IRaman)×(NRaman/NSERS)计算烟酸的增强因子(EF)，ISERS是SERS光谱中1034cm-1峰的峰值强度，IRaman是烟酸固体分子中相同振动模式的峰值强度。固体分子中相同振动模式的峰值强度。为进行SERS测量，首先，将25μL的维生素溶液与25μL的AgBONPs混合。其次，将该混合物加入5μL浓度为0.01M的Ca2+中，以直接进行维生素的SERS检测。对于烟酸的固态拉曼分析，称取0.0002g烟酸固体放在拉曼激光下进行检测。这两个光谱都是在相同的条件下用633nm的激光器记录的，曝光时间被设定为20秒，只进行一次累加。选择浓度为50μg/mL的维生素B3，当加入纳米银颗粒和聚合体后，维生素B3的浓度增加到5/11μg/mL(5/11×10-3g/L)。将一定体积的待测物提取到毛细管中并置于激光下。根据设定的条件，得到拉曼光谱，1034cm-1的峰值强度为17274。SLaser＝πr2＝1.9625×10-3m2(r毛细管＝0.025m)是计算出的基底表面的激光束面积。计算产生拉曼散射的B3溶液的体积为VLaser＝2.9×10-7m3(DLaser＝1.510-4m)。因此，被激光照射的B3分子的数量计算为：NSERS＝(CSERSVSERS/M)NA＝6.4×1011(MB3＝123.11)。称取0.0002g烟酸固体，放在拉曼激光器下进行检测。在正常的拉曼检测中，被照亮的B3分子的数量NRaman＝(m/M)×NA＝4.31×1019(MB3＝123.11)。因此EF＝(ISERS×NRaman)/(IRaman×NSERS)＝(17274×4.31×1019)/(500×6.4×1011)＝2.326×109。纳米银颗粒和钙离子的联合将拉曼信号增强了9倍，并有效地防止了杂质对纳米银颗粒表面的干扰，从而使拉曼光谱更稳定。因此，本发明提供的方法可以灵敏地捕捉到维生素的特征SERS信号并具有通用性，可以实现对不同维生素B分子的检测。
六种维生素(B1、B2、B3、B4、B7和B9)的SERS信号见图5。图5中，A为维生素B1、B2和B3的SERS光谱，氨基酸浓度为50μg/mL。B为维生素B4、B7和B9的SERS光谱，氨基酸浓度为50μg/mL。C为不同浓度维生素B4的SERS光谱。D为不同浓度维生素B2的SERS光谱。
维生素B1在772cm-1和1364cm-1的特征峰分别是吡啶环的平面内弯曲和C-S键。维生素B2在740cm-1、1323cm-1和1347cm-1的特征峰分别与环状呼吸、C-H键的扭转振动和N-H键及环II和III在芳香环平面上的变形振动有关。维生素B3在1034cm-1处有一个与吡啶环呼吸有关的强峰。维生素B4在740cm-1和1338cm-1的特征峰分别与环的呼吸作用和环面的变形有关。维生素B7在684cm-1的特征峰与吡嗪环面的变形有关。维生素B9在1178cm-1、1499cm-1和1583cm-1的特征峰分别归因于吡啶环在β(C-H)和C＝C双键平面内的拉伸振动，峰位的详细归因见表1。
表1维生素的SERS光谱中出现的波段及其分配
注：R6，嘧啶环；R，苯环；tor，扭转；scissor，剪刀状C-H振动；str，拉伸；def，变形，wag，摇摆；ip，平面内环形振动；平面外弯曲；alip-脂族链的扭曲；δ，弯曲振动；ν，拉伸振动；twist，扭曲的C-H振动；s，对称振动；as，不对称的振动。
利用本发明方法获得了不同维生素分子的特征图谱，实现了对不同维生素分子的特异性识别，表明该方法适用于维生素B的检测。随机选择两种维生素B2和B4来进一步验证该方法的灵敏度，测得维生素B2和维生素B4的检测限分别为5ng/mL和50ng/mL，参见图5中C和D。正常情况下，维持人体健康需要1～20mg的维生素B分子。结果表明，两步增强法具有高特异性和高灵敏度，可以准确检测人体内的维生素分子。
实施例2
本发明采用“表面-热点”两步增强技术，通过SERS信号强度量化维生素浓度的变化。所得结果如图6所示。图6中，A为将五组不同浓度的维生素B4(10～50μg/mL；浓度差为10μg/mL)和10μg/mL的B3混合后得到的SERS光谱。B为与混合物中维生素B4浓度变化相对应的I740/I1034的值的柱状图。C为维生素B4在酸性条件(深绿色线)、正常条件(绿色线)和碱性条件(天蓝色线)下的SERS光谱。D为维生素B2在酸性条件(深绿线)、正常条件(绿线)和碱性条件(天蓝线)下的SERS光谱。
作为内标的维生素B3(30μg/mL)在1034cm-1和849cm-1的特征峰见图6中的A。通过对五组不同浓度的维生素B4的拉曼光谱进行标准化，得到标准拉曼光谱。蓝条所覆盖的峰位相似，表明维生素B3和纳米银颗粒的结合模式不受外界同类物质的影响。绿条所覆盖部分的峰值强度随着浓度的增加而增加。五次测量结果随机取平均值进行进一步分析。绘制维生素B4浓度不同时(10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL)，B4在740cm-1的特征峰值与B3在1034cm-1的特征峰值变化(I740/I1034)，得到了一个线性关系y＝0.0649x+0.5216，R2＝0.9919，如图6中的B，其中每个误差条的阈值远远小于要区分的值。I740/I1034与维生素B4浓度成正比，表明本发明方法可以在有其他维生素干扰的情况下对待测维生素的浓度进行量化。
生物过程中涉及的物理过程和化学反应对介质中的氢离子浓度十分敏感，因此环境中的氢离子浓度可能会影响多种物质中的维生素。本发明模拟了氢离子浓度对维生素分子构象的影响。维生素B2和B4在酸性条件(pH＝2)(绿线)、正常条件(浅绿线)和碱性条件(pH＝12)(蓝线)下的拉曼光谱如图6中的C和D所示。维生素B4在酸性和正常条件下的拉曼信号是相似的，表明维生素B4在酸性条件下相对稳定。而在碱性条件下，光谱图中出现了962cm-1和1400cm-1的新峰(分别由于C-N拉伸振动和C-H不对称振动)，证实了维生素B4在pH＝12的碱性溶液(蓝线)中敏感，发生了构象变化。但维生素B2是一种两性化合物图6中D，其在碱性条件下的光谱与在中性和酸性条件下的增强拉曼信号有显著差异，因为当pH＜2时，维生素B2分子带正电，pH值在10以上时带负电。维生素B2结构中III环的氮去势导致电子在三个环形成的芳香体系范围内脱域。维生素B2中性分子和质子分子更具有共振杂化结构自由电子中氧和氮的芳香环。因此，维生素B2分子与纳米颗粒在表面层面的结合程度要好与质子的结合程度，进一步验证了两步增强法有效。
实施例3
研究表明，维生素对人类的各种功能至关重要。不同血液、唾液和尿液浓度下的维生素B4的SERS光谱如图7所示，不同血液、唾液和尿液浓度的维生素B2的SERS光谱如图8所示。图7中，A～C分别为不同血液、唾液和尿液浓度下的维生素B4的SERS光谱，D～F为使用本方法随机选取15组维生素B4在血液样品(5μg/mL)、唾液样品(50μg/mL)和尿液样品(50μg/mL)中的SERS光谱。图8中，G～J为不同血液、唾液和尿液浓度的维生素B2的SERS光谱，K～Q为使用本方法随机选取15组维生素B2样品在血液样品(50μg/mL)、唾液样品(50μg/mL)和尿液样品(50μg/mL)中的SERS光谱。
维生素B4在血清(0.5μg/mL)、唾液(0.5μg/mL)和尿液(0.5μg/mL)中的最低检测限见图7中的A、B、C。维生素B2在血清(0.5μg/mL)、唾液(0.5μg/mL)和尿液(0.5μg/mL)中的最低检测限如图8中的G、H和J所示。传统的方法是基于特定分子维生素SERS信号的特征。因此，当没有标记时传统方法无效，而且会受到体液中其他生物大分子的影响。但目前氮氨基特异性吸附方法可以灵敏地检测到维生素分子信号，进一步证明了两步增强抗生素分子信号理论的有效性。从上述体液中采样的15组拉曼光谱见图7中的D、E、F，图8中的K、L和Q。维生素B2、B4在血液、唾液和尿液中的拉曼光谱与在水溶液中的光谱相似，表明本发明方法特异性良好。此外，多组可重复光谱表明方法稳定性高。总之，外部因素不会对方法产生影响。方法具有良好的特异性，可以准确地检测不同环境中的物质。该方法还具有较强的稳定性，从而保证了存在外部环境因素时检测维生素分子的准确性。因此，本发明提供的检测方法为体内维生素含量的测定提供了一种更为方便、准确、快速的检测方法，也为临床诊断体内维生素含量过多或过少引起的疾病提供了更准确的数据信息。
使用奶粉、果汁作为待测样品，按照本发明提供的方法同样能够获得待测样品中B族维生素的含量。
综上所述，本发明证明了由过量硼氢化钠制备的纳米银颗粒底物可以动态地吸附氨基生物大分子，从而实现了对维生素B族分子的快速检测。通过“表面-热点”两步增强法获得了惰性维生素B族分子的良好SERS信号，在水溶液中的最低检测限为5ng/mL。其次，维生素混合物中的其他维生素并不影响本方法的效果，能够准确地检测出维生素B4的具体浓度。这种方法可以敏感地捕捉体液中的目标分子信号而不受干扰。血清、唾液和尿液中维生素B2的最低检测限分别为0.5μg/mL、0.5μg/mL和50ng/mL。本方法具有较高的灵敏度和特异性，为检测食品、药品、疾病和人体中的维生素含量提供了一个简单、高效的定性和定量检测平台。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于动态纳米银颗粒两步增强拉曼技术检测B族维生素的方法，包括以下步骤：
将硝酸银、过量的硼氢化钠与水混合，进行还原反应，得到纳米银颗粒；
将待测液体与所述纳米银颗粒的水分散液混合，加入Ca2+溶液，得到供试液；
对所述供试液进行拉曼光谱测试，获得拉曼信号特征峰值强度；
根据所述拉曼信号特征峰值强度和预定的标准曲线获得待测液体中B族维生素的含量；所述标准曲线为拉曼信号特征峰值强度与B族维生素浓度的线性关系曲线。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述B族维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B4、维生素B7和维生素B9中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝酸银与硼氢化钠的质量比为1～3:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原反应的时间为30～40min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米银颗粒的粒径为35～48nm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测液体与纳米银颗粒的水分散液的体积比为1～2:1。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述Ca2+溶液的浓度为0.01M；
所述纳米银颗粒的水分散液与Ca2+溶液的体积比为4～8:1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拉曼光谱测试的参数包括：
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述B族维生素的最低检测限为5ng/mL。
10.一种检测B族维生素的试剂盒，包括纳米银颗粒，Ca2+溶液，所述纳米银颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将硝酸银、过量的硼氢化钠与水混合，得到纳米银颗粒。
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