CN117844940A - 一种凡纳滨对虾快长性状的分子标记、检测引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凡纳滨对虾快长性状的分子标记、检测引物及应用。该快长性状显著相关的SNP分子标记位于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第308bp位点(即DAN4‑like细胞壁蛋白编码基因dan4内部P2638位点)处，该位点的基因型包括G/G、A/A、G/A型。SNP位点为A/A纯合基因型的对虾个体具有明显快的生长速度，SNP位点为G/G纯合基因型的对虾个体具有相对慢的生长速度，SNP位点为G/A杂合基因型的对虾个体具有中等的生长速度。本发明的SNP分子标记和分子标记检测引物可用于群体生长性状特征的评估，也可用于潜在具有生长优势性状对虾个体的挑选。
Description
技术领域
本发明属于水产动物育种领域，具体涉及一种凡纳滨对虾快长性状的分子标记、检测引物及应用。
背景技术
凡纳滨对虾，又称南美白对虾。种业是农业的“芯片”，凡纳滨对虾种业对于支撑整个对虾养殖产业的发展至关重要。
对虾快速生长可以显著地降低养殖成本以及养殖周期长带来的病害爆发、灾害气候等紧急风险，因此对虾的快长性状一直是对虾新品种选育的主体性状。近十余年，已经培育出14个南美白对虾新品种(截止2023年2月)，但现有的凡纳滨对虾新品种均采用群体或家系选育的技术路线获得，分子标记辅助育种技术在凡纳滨对虾新品种选育中的应用还十分少见。
单核苷酸多态性(SNP)属于第三代分子标记，SNP在所有生物的基因组中含量丰富,突变率较低，随着测序技术的广泛普及以及成本大幅降低，SNP广泛用于遗传多样性、系统发育分析、种系鉴定、遗传疾病相关基因以及遗传育种的研究。SNP分子标记已经在陆生动植物的育种中得到了较多的应用，但是在对虾育种领域应用还十分有限。
专利CN109971865A公开了一种与凡纳滨对虾体重性状显著相关的SNP标记和应用，但未公布SNP标记所在序列的位置以及相关的基因。生长是多基因控制的复杂数量性状，因此需要持续挖掘与对虾生长相关的功能基因以及与优势生长性状相关的SNP分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种凡纳滨对虾快长性状的分子标记、检测引物及应用。采用本发明的检测引物能快速鉴定凡纳滨对虾快长性状显著相关的SNP分子标记，根据SNP分子标记的基因型快速筛选生长更迅速的后备亲本，有利于缩短快速生长凡纳滨对虾品系的选育周期，为提升凡纳滨对虾子代的生长速度提供技术支持。
为实现上述目的，本发明采用技术方案如下：
一种凡纳滨对虾快长性状显著相关的SNP分子标记，位于DAN4-like细胞壁蛋白编码基因(dan4，基因ID：LOC113802606)内部P2638位点(dan4-2638)，SNP分子标记通过全基因组关联分析(GWAS)获得，该位点的基因型包括G/G、A/A、G/A型，其中G/G、A/A为纯合基因型，G/A为杂合基因型。
具体的，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列第308bp位为SNP位点(对应上述的dan4-2638位点)，该碱基R为A或G。
一种凡纳滨对虾快长性状显著相关的SNP分子标记的检测引物，其序列为：
dan4-2638F：5'-GGTCCAGAAGGAAGTGTAGTCT-3'(如SEQ ID NO.2所示)；
dan4-2638R：5'-CTCTTCCGTCTCTGGTGATGA-3'(如SEQ ID NO.3所示)。
dan4-2638F/dan4-2638R检测引物的PCR扩增片段长度为549bp，该扩增片段均在外显子内。
一种试剂盒，其包含上述的检测引物dan4-2638F/dan4-2638R。
另一方面，本发明还提供上述的SNP分子标记、检测引物或试剂盒在检测凡纳滨对虾快长性状中的应用。
所述SNP分子标记位于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第308bp位点处，该SNP位点的基因型为A/A纯合、G/G纯合和G/A杂合；所述SNP位点为A/A纯合基因型的对虾个体具有明显快的生长速度，所述SNP位点为G/G纯合基因型的对虾个体具有相对慢的生长速度，所述SNP位点为G/A杂合基因型的对虾个体具有中等的生长速度。
另一方面，本发明还提供一种基于该SNP分子标记和检测引物的凡纳滨对虾快长性状品种选育方法，包括以下步骤：
(1)提取待测凡纳滨对虾基因组DNA；
(2)利用检测引物dan4-2638F/dan4-2638R对待测凡纳滨对虾基因组DNA进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行测序，根据测序峰图对凡纳滨对虾快长性状相关的SNP分子标记进行分型；
(4)选择基因型为A/A纯合的对虾个体作为亲本，进行交配产生下一代育种群体。
具体步骤为：
采用海洋动物基因组提取试剂盒(天根生化，中国)进行对虾组织基因组DNA的提取，提取的基因组DNA洗脱于50μL ddH2O中，-20℃保存。
配制常规的PCR扩增体系(50μL)，其中：对虾基因组DNA模板1μL，2×PrimeSTAR高保真DNA聚合酶25μL(TaKaRa,中国)，上游引物dan4-2638F(10μM)1μL，下游引物dan4-2638R(10μM)1μL，ddH2O 22μL。
PCR产物扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10sec，56℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增产物递交测序公司(上海生工，中国)进行常规PCR产物测序，测序文件以BioEdit软件打开。如dan4-2638位点测序结果为单峰A，则为A/A纯合基因型，dan4-2638位点测序结果为单峰G，则为G/G纯合基因型，dan4-2638位点测序结果为双峰，则为G/A杂合基因型。
dan4-2638位点为A/A纯合基因型的对虾个体具有明显快的生长速度，dan4-2638位点为G/G纯合基因型的对虾个体具有相对慢的生长速度，dan4-2638位点为G/A杂合基因型的对虾个体具有中等的生长速度。
另一方面，本发明还提供上述的SNP分子标记、检测引物或试剂盒在凡纳滨对虾育种中的应用。
本发明的SNP分子标记和分子标记检测引物可用于群体生长性状特征的评估，本发明的SNP分子标记和分子标记检测引物也可用于潜在具有生长优势性状对虾个体的挑选，直接用于亲本的培育。
附图说明
图1为凡纳滨对虾基因组dan4-2638位点所在区域的PCR扩增产物电泳图。M：DNAMarker DL 2000；1-4：4尾对虾的dan4-2638位点扩增产物电泳结果；C：以ddH2O为阴性对照模板。
图2为凡纳滨对虾基因组dan4-2638位点基因型鉴定结果(序列反向互补)。A：A/A纯合基因型；B：G/G纯合基因型；C：G/A杂合基因型。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
凡纳滨对虾快长性状显著相关SNP分子标记的获得：
(1)凡纳滨对虾样品采集及性状分级
采集不同养殖场及市场来源的对虾样品，同一批虾中，如果大小差异明显，作为可以取样的批次，每一批取对虾50尾，以体长表征生长速度性状(GW)，按体长将每一批次内的虾分为快速、较快、一般、慢四个等级，共采集以体长表征生长差异性状的对虾75尾。另外采集弧菌感染性状(AB)分级样品75个，肝肠孢虫感染性状(EH)分级样品75个、肝胰腺指数(EI)分级样品75个，总计300个样品。
(2)全基因关联分析挖掘快长性状相关SNP
对300个样品进行DNA提取，提取DNA后进行常规二代测序文库构建和测序(北京百迈客生物科技有限公司)，测序结果与凡纳滨对虾参考基因组进行比较，采用GATK(V3.4.6)软件进行SNP和InDel查找，基于次要等位基因频率和位点完整度过滤SNP位点，保留高一致性、确性SNP位点，结合EMMAX软件，采用混合线性模型进行关联分析，性状关联分析候选位点使用Bonrroni校正(北京百迈客生物科技有限公司)。
(3)快长性状相关分子标记挖掘
根据GWAS分析的性状关联的SNP位点的P值大小进行排列，筛选与快长性状显著相关的独特SNP位点，从中再筛选位于基因启动子区的SNP和基因内部引起氨基酸编码突变的SNP，结果发现DAN4-like细胞壁蛋白编码基因(dan4，基因ID：LOC113802606)内部P2638位点(dan4-2638)与对虾快长性状显著相关(P<0.05)，GWAS分析结果显示，dan4-2638位点为A/A纯合基因型的对虾个体具有更快的生长速度，dan4-2638位点为G/G纯合基因对虾个体具有相对较慢的生长速度，dan4-2638位点为G/A杂合基因型的对虾个体生长速度中等。
实施例2
凡纳滨对虾快长性状相关dan4-2638位点基因型检测引物设计：
以dan4基因(LOC113802606)序列为依据，采用Primer 6.0进行dan4-2638位点PCR扩增引物的设计，引物设计以下要求：
1)dan4-2638位点位于设计扩增序列的近中间位置，避免扩增和测序误差；
2)扩增片段长度介于400-600bp；
3)扩增引物锚定位点均位于外显子区域；
4)扩增产物条带单一，特异性强。
通过引物设计和PCR扩增检验，最终发现dan4-2638F/dan4-2638R可以获得最佳的PCR扩增结果。dan4-2638F/dan4-2638R引物组合的序列如下：
dan4-2638F：5'-GGTCCAGAAGGAAGTGTAGTCT-3'(如SEQ ID NO.2所示)；
dan4-2638R：5'-CTCTTCCGTCTCTGGTGATGA-3'(如SEQ ID NO.3所示)。
dan4-2638F/dan4-2638R引物组合的PCR扩增片段长度为549bp(序列如SEQ IDNO.1所示)，该扩增片段均在外显子内。
>From 2331to 2879(SEQ ID NO.1所示序列)
GGTCCAGAAGGAAGTGTAGTCTCAGAACCAAATGGATTACTGCATTCCTCAGATCCAGGCAAATCGTCCACTGACCTTGCTGAATTCCTAAACTTGGACGGCTCTGTGGCTTCAGGATCGAGCAGAGTAGGAGCTGAAGAACCTGAAGGAATCCTGCCTCCTAGACCAAACGGATTCACAGAACCTCCAAATTCTGCTGATGTCAGGTCTGGCTCTCCTGAAAGCCTTCCCTTGTTGGATGAAGGAAGGAAGGCGTCCTCCATAGGTTTGGATTGTTCTGGCGAGCTTATGACTAGTTCGAAACCCARTGCATTAAAGTCGTCAGAGAAAACGGACGAATTAGAACATGAACTTAGAATCGAGAGAAGCAACACGAACCTCTTCGACATTGAAAAGGTTATAAATACCAACAGTGAGACGTCCACGAGAGAAAACCTTCCAAGATCATCACCAACTACAGAGGCTTCGCTCGGTGATGCCATCGTACAGTCAGACATCGAAAAAGCTAACGTCGACGCGCAGGAACTTTCATCACCAGAGACGGAAGAG。
与凡纳滨对虾快长性状相关的SNP分子标记位于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第308bp位点(即dan4-2638位点)处，该位点的碱基R为A或G，基因型为G/G、A/A或G/A型。
实施例3
凡纳滨对虾快长性状相在dan4-2638位点基因型的PCR及测序检测：
利用上述dan4-2638F/dan4-2638R引物组合进行分子标记位点基因的检测，包含以下步骤：
(1)对虾基因组提取
剪取对虾附肢末端或取粪样，采用海洋动物基因组提取试剂盒(天根生化，中国)进行对虾基因组DNA提取。
(2)PCR扩增体系配制
配制常规的PCR扩增体系(50μL)，其中：对虾基因组DNA模板1μL，2×PrimeSTAR高保真DNA聚合酶25μL(TaKaRa，中国)，上游引物dan4-2638F(10μM)1μL，下游引物dan4-2638R(10μM)1μL，ddH2O 22μL。
(3)PCR扩增
PCR产物扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10sec，56℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。
(4)PCR产物测序及结果判读
凡纳滨对虾基因组dan4-2638位点所在区域的PCR扩增产物电泳图如图1所示。
PCR扩增产物递交测序公司(上海生工，中国)进行常规PCR产物测序，测序文件以BioEdit软件打开。如dan4-2638位点测序结果为单峰A，则为A/A纯合基因型，dan4-2638位点测序结果为单峰G，则为G/G纯合基因型，dan4-2638位点测序结果为双峰，则为G/A杂合基因型。凡纳滨对虾基因组dan4-2638位点基因型鉴定结果如图2所示。
实施例4
凡纳滨对虾快长性状相关dan4-2638位点分子标记验证：
收集同批次具有明显大小差异性状的凡纳滨对虾75尾，75尾对虾的体重表型数据如表1所示，根据统计结果可知，所有样品的体重均值(15.76±3.52)g，变异系数为22.34％，最大体重23.44g，最小体重8.90g。
以体重表征生长速度，75尾对虾按体重分为三种生长速度等级：快长(W≥17g)，一般(17g＞W≥14g)，慢长(14g＞W≥8g)。根据表1所知快长、一般、慢长三种生长速度等级的对虾体重均值分别是19.27g、15.58g、11.17g，由此可以看出快长、一般、慢长三种生长速度的对虾样本间生长性状差异明显。
表1具有生长速度差异性状75尾凡纳滨对虾体重统计数据(n＝75)
采用实施例2的检测引物dan4-2638F/dan4-2638R和实施例3的基因型检测方法对75尾具有大小差异性状的凡纳滨对虾dan4-2638位点基因型进行了检测，检测结果如表2所示：
表2具有大小差异性状的75尾凡纳滨对虾dan4-2638位点基因型统计数据(n＝75)
*粗体：划分为一般生长速度等级的对虾具有A/A纯合基因型；下划线：划分为快长等级的对虾具有G/A杂合基因型；斜体加粗：划分为快长等级的对虾具有G/G杂合基因型。
由表2可知，dan4-2638位点为A/A基因型的对虾平均体重19.23g，dan4-2638位点为G/A基因型的对虾平均体重15.97g，dan4-2638位点为G/G基因型的对虾平均体重11.90g，A/A基因型的对虾平均体重达到G/G基因型的对虾平均体重的1.62倍。30尾具有快长表型性状的对虾中，具有dan4-2638位点A/A基因型的个体达到26尾，占比达到86.7％。其中，原划分为中等生长速度的3尾具有A/A基因型对虾的体重(表2中标粗)也十分接近快长个体划分标准的阈值(W≥17g)。这些结果表明采用dan4-2638位点A/A基因型判定凡纳滨对虾是否具有快长性状潜力具有很高的准确性。dan4-2638位点为A/A纯合基因型的对虾个体具有明显快的生长速度，dan4-2638位点为G/G纯合基因型的对虾个体具有相对慢的生长速度，dan4-2638位点为G/A杂合基因型的对虾个体具有中等的生长速度。
实施例5
凡纳滨对虾快长性状相关dan4-2638位点分子标记及检测引物的应用：
收集3个不同来源的凡纳滨对虾群体G1、G2、G3，随机取样50尾，采用上述实施例3中的方法进行对虾基因组提取、PCR扩增和测序检测，检测结果表明凡纳滨对虾群体G1、G2、G3群体的dan4-2638位点A/A基因型占比分别为28％、16％、0％，因此凡纳滨对虾群体G1可作为快长的候选群体。
将凡纳滨对虾群体G1培育至成虾(≥20g)，从中选取规格大的对虾个体，逐尾收集粪样，采用上述实施例3中的方法进行对虾基因组提取、PCR扩增和测序检测，dan4-2638位点为A/A基因型的对虾个体保留，继续培育成具有快长性状的亲本。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种凡纳滨对虾快长性状显著相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列第308bp位为SNP位点，该碱基R为A或G。
2.权利要求1所述的SNP分子标记在检测凡纳滨对虾快长性状中的应用，其特征在于，所述SNP位点为A/A纯合基因型的对虾个体具有明显快的生长速度，所述SNP位点为G/G纯合基因型的对虾个体具有相对慢的生长速度，所述SNP位点为G/A杂合基因型的对虾个体具有中等的生长速度。
3.一种凡纳滨对虾快长性状显著相关的SNP分子标记的检测引物，其特征在于，所述检测引物如下所示：
dan4-2638F：5'-GGTCCAGAAGGAAGTGTAGTCT-3'；
dan4-2638R：5'-CTCTTCCGTCTCTGGTGATGA-3'。
4.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的检测引物。
5.权利要求3所述的检测引物或权利要求4所述的试剂盒在检测凡纳滨对虾快长性状中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第308bp位点处，该SNP位点的基因型为A/A纯合、G/G纯合和G/A杂合；所述SNP位点为A/A纯合基因型的对虾个体具有明显快的生长速度，所述SNP位点为G/G纯合基因型的对虾个体具有相对慢的生长速度，所述SNP位点为G/A杂合基因型的对虾个体具有中等的生长速度。
7.一种凡纳滨对虾快长性状品种的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测凡纳滨对虾基因组DNA；
(2)利用权利要求3所述的检测引物对待测凡纳滨对虾基因组DNA进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行测序，根据测序峰图对凡纳滨对虾快长性状相关的SNP分子标记进行分型；
(4)选择基因型为A/A纯合的对虾个体作为亲本，进行交配产生下一代育种群体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR的扩增体系为：50μL，包括对虾基因组DNA模板1μL，2×PrimeSTAR高保真DNA聚合酶25μL，10μM上游引物dan4-2638F 1μL，10μM下游引物dan4-2638R 1μL，ddH2O 22μL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR的扩增程序为：98℃变性2min；
98℃变性10sec，56℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。
10.权利要求1所述的SNP分子标记，权利要求3所述的检测引物或权利要求4所述的试剂盒在凡纳滨对虾育种中的应用。
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