CN117843805A - 抗体分子、核酸分子、药物组合物以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗体领域,具体涉及一抗体分子、核酸分子、药物组合物以及应用。本发明的抗体分子为二价单域抗体,是由第一单域抗体(1‑C11)和第二单域抗体(1‑H9)通过linker偶联获得;所述的第一单域抗体的重链CDR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1‑3;所述的第二单域抗体的重链CDR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4‑6。该二价单域抗体具有良好的亲和能力和阻断效果,稳定性强,有望用于炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤的诊断和治疗。
Description
技术领域
本发明属于抗体领域,具体涉及一种抗体分子、核酸分子、药物组合物以及应用。
背景技术
多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物,比单价抗体具有更高的抗原亲和力;多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物,能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位,比单价抗体具有更高的抗原识别能力,对比其他单抗、单抗联用,双抗表现出高的有效性、更低的耐药性、新功能赋予的更广的适用范围、以及较单抗联用预期更低的毒性。
链错配问题是双特异性抗体药物研发特有的技术难点,也是双抗药物开发最初遇到的挑战之一。天然抗体由四条多肽链组成,分子量较大的两条称为重链(H链),分子量较小的两条链称为轻链(L链)。在单抗结构中,两条重链和轻链的氨基酸组成完全相同,四条链组合后仅有一种结构。但双抗与单抗不同,双抗研发是通过共表达两条不同的重链和两条不同的轻链,来实现可以同时特异性结合2个不同抗原的目的,因此在四条链组装的过程中,2条重链和2条轻链可随机产生16种可能的结构组合,即便将其中互为镜像的结构合并后,仍然有10种不同的抗体结构,但其中只有一种是目标产物。况且这10种不同双抗产物的生化特性极为相似,因此从中分离出目标产物的难度极大。这种情况在单抗生产中不常见,也是造成双抗产量低、有杂质蛋白、生产成本较高的根本原因。
单域抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区,却具有非常好的稳定性,不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘,甚至聚集成聚体。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性,是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。
单域抗体因具有结构简单,分子量较小,结构稳定,易于表达等优势,并且单域抗体只含有一个重链可变区,可以避免四聚体制备双抗过程中重链与轻链的错配,实现双功能单域抗体的通用性设计,不需要像传统双抗的复杂的设计和生产工艺,有效克服了双抗药物原本的局限性。
IL-17A是一种主要由活化的T细胞产生的致炎细胞因子,作用于下游效应细胞介导多种生理过程,如炎症反应、凝血过程和骨重塑等,与机体多种疾病密切相关。IL-17A表达过量时将导致脊柱关节炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、炎症性肠病等多种疾病的发生发展。对于这类疾病临床可用的特效药物较少,传统治疗存在起效较慢、依从性差等缺点。IL-17A缺失或者抗体中和IL-17A,可以有效的抑制多种自身免疫病病理程度,但是单抗药物结构复杂、稳定性相对较差,在使用中需要反复大剂量注射才能达到一定的效果。因此,亟需开发一种稳定性高、亲和力强,有望用于自身免疫病诊断和治疗的二价单域抗体类的药物。
为了解决上述问题,本发明提供了种抗IL-17A的二价单域抗体,该二价单域抗体是由两个单域抗体通过linker(连接子)串联而成。该二价抗体制备容易,具有较好的亲和力和阻断效果,稳定性强。
本发明人致力于抗IL-17A抗体开发,基于筛选出的9个单域抗体(已另案申请),进行进一步的技术开发,获得了12个亲和力、阻断效果和稳定性相对提升的单域抗体组合,基于专利法单一性的相关规定,对12个不同单域抗体组合分别请求保护。
本发明是针对上述12个单域抗体组合抗体之一所进行的专利申请。
本发明人还基于以上,开发了基因修饰干细胞技术以及后续的应用技术,基于专利法单一性的相关规定,对3个不同的基因修饰干细胞以及3项不同的应用分别请求保护。
为便于理解本申请技术方案,可选地参阅本项目其他专利申请文件。
发明内容
本发明中,单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此,单域抗体包含单个互补决定区。单域抗体为仅有重链的抗体,该抗体天然不包含轻链,衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。单域抗体可以衍生自任何物种,包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如,天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样,单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域,该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。
本发明中,抗IL-17A的二价单域抗体即抗IL-17A的双价单域抗体不仅包括完整的二价单域抗体,还包括所述抗IL-17A的二价单域抗体的片段、衍生物和类似物。其中,片段、衍生物和类似物含义相同,均是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与Fc标签形成的融合蛋白)。
本发明中,CDR(complementarity-determining regions,CDR)叫做互补决定区或互补决定簇。它位于免疫球蛋白的超变区,超变区是抗体的抗原结合位,与抗原决定簇的结构互补。一般包括CDR1、CDR2、CDR3。本领域技术人员应当理解的是,除非另有规定,否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本公开请求保护的范围是基于IMGT定义规则所示出的序列,但是根据其他CDR定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
本发明中,可变区指免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。
本发明中,序列同源性表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度,并且通常表示为百分数。优选地,同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此,具有完全相同序列的两个拷贝具有100%同源性。在一些实施例中,与前述序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列,例如,包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,也可以实现发明目的。这些变异形式包括但并不限于:一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。实际上,在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时,技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代,在取代情况下,所述取代将优选为保守氨基酸取代。所述保守氨基酸,其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代,并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的,例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代:(a)极性带负电残基及其不带电酰胺:Asp、Asn、Glu、Gln;(b)极性带正电残基:His、Arg、Lys;(c)芳香族残基:Phe、Trp、Tyr;(d)脂肪族非极性或弱极性残基:Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下:Asp被Glu取代;Asn被Gln或His取代;Glu被Asp取代;Gln被Asn取代;His被Asn或Gln取代;Arg被Lys取代;Lys被Arg、Gln取代;Phe被Met、Leu、Tyr取代;Trp被Tyr取代;Tyr被Phe、Trp取代;Ala被Gly或Ser取代;Ser被Thr取代;Thr被Ser取代;Gly被Ala或Pro取代;Met被Leu、Tyr或Ile取代;Leu被Ile或Val取代;Ile被Leu或Val取代;Val被Ile或Leu取代;Cys被Ser取代。另外,本领域技术人员知晓,单域抗体的创造性体现在CDR1-3区,而框架区序列FR1-4并非是不可改变的,FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明中,Fc融合抗体是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型重组蛋白,其不仅保留了功能蛋白分子的活性,还具有一些抗体的性质,如通过结合相关Fc受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。其中,Fc片段是指由IgA、IgD及gG的CH2和CH3结构域,或者由IgE及IgM的CH2、CH3和CH4结构域通过铰链区的组成的多肽。
本发明中,人源化抗体是指将目标抗体(如动物抗体)的重链可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体,或将目标抗体的互补决定区(CDR1-3序列)移植至人抗体的可变区内,得到的抗体,或将目标抗体根据人抗体骨架区(FR1-4)的特征进行氨基酸的突变后获得的抗体。人源化抗体可用合成法或定点突变法。
本发明中,重组蛋白是指应用重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质。重组蛋白工程先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因(gene of interest,GOI),连接到适合的表达载体,导入到特定的宿主细胞,利用宿主细胞的遗传系统,表达出有功能的蛋白质分子。重组蛋白试剂可应用于生物药、细胞免疫治疗及诊断试剂的研发和生产中。其中重组蛋白药物是生物药物的重要组成成分,可应用于医疗领域,包括细胞因子类、抗体治疗性疫苗、激素及酶等。
本发明中,真核细胞指含有真核(被核膜包围的核)的细胞。其染色体数在一个以上,能进行有丝分裂。还能进行原生质流动和变形运动。而光合作用和氧化磷酸化作用则分别由叶绿体和线粒体进行。除细菌和蓝藻的细胞以外,所有的动物细胞以及植物细胞都属于真核细胞。
本发明中,原核细胞是组成原核生物的细胞。这类细胞主要特征是没有以核膜为界的细胞核,也没有核仁,只有拟核。进化地位较低。细胞器只有核糖体,有细胞膜,成分与真核细胞不同。细胞较小,没有成型的细胞核,没有染色体,DNA不与蛋白质结合。
本发明中,表达载体是指在克隆载体基本骨架上,加入一些表达元件(如启动子、终止子等)后,使得插入的外源DNA(目的基因)在宿主细胞内能够进行复制、转录及翻译的一类载体。
本发明中,宿主细胞也叫受体细胞。受体细胞有原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞(最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。原核受体细胞中,最常用的宿主细胞是大肠杆菌。
本发明中,药学上可接受的辅料指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂;是除活性成分以外,在安全性方面已进行了合理的评估,且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外,还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能,是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。
本发明中,EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50%of maximaleffect),即能引起50%最大效应(在本文中为“结合IL-17A能力”)的浓度。
本发明中,IC50是指半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration),即能引起50%最大抑制效应(在本文中为“抑制IL-17A和其受体IL-17RA结合的能力”)的浓度。
一方面,本发明提供了一种抗体,所述的抗体包含下述(1)和(2):
(1)第一单域抗体,所述的第一单域抗体的氨基酸序列包含序列如SEQ ID NO.1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3;和/或与SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列;
(2)第二单域抗体,所述的第二单域抗体的氨基酸序列包含序列如SEQ ID NO.4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6;和/或与SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
具体地,所述抗体的氨基酸序列包含通过在SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰或取代中的至少一种方式获得的氨基酸序列。
进一步具体地,所述抗体的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸差异的氨基酸序列。
具体地,所述第一单域抗体或第二单域抗体还包括用于连接重链可变区的至少4个重链框架区。
进一步具体地,所述重链框架区包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体;
优选地,包含部分或全部选自骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体;
进一步优选地,包含部分或全部选自羊驼源的抗体重链框架区或其变体。
又一方面,本发明提供了一种抗体,所述的抗体包含下述(1)和(2):
(1)第一单域抗体,所述的第一单域抗体的结构为:
FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4;
(2)第二单域抗体,所述的第二单域抗体的结构为:
FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8。
具体地,所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.1-3相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸差异的氨基酸序列;
所述的HCDR4、HCDR5和HCDR6选自如SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.4-6相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列;
所述的FR1、FR2、FR3和FR4选自如SEQ ID NO.7-10所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.7-10相比具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列;
所述的FR5、FR6、FR7和FR8选自如SEQ ID NO.11-14所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.11-14相比具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列;
进一步具体地,所述的氨基酸差异通过在SEQ ID NO.1-3和SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和或取代中的至少一种方式实现。
优选地,所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述的HCDR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述的HCDR5的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示;所述的HCDR6的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
具体地,所述的第一单域抗体和第二单域抗体的氨基酸序列直接连接或通过连接子间接连接。
进一步具体地,所述的连接子为(GGGGS)n,其中n选自1、2、3、4、5或6;优选地,所述的连接子为(GGGGS)3。
具体地,所述的抗体的连接顺序选自下述(1)-(3)中的一种:
(1)所述的第一单域抗体和第二单域抗体以任选的顺序连接;
(3)第一单域抗体和第二单域抗体按照从N端到C端的顺序连接;
(3)第一单域抗体和第二单域抗体按照从C端到N端的顺序连接。
具体地,所述的抗体为抗IL-17A抗体。
又一方面,本发明提供了一种重组蛋白,所述的重组蛋白包含前述的抗体。
具体地,所述的重组蛋白还包含协助其表达和/或分泌,或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。
进一步具体地,所述的生物活性多肽或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。
进一步具体地,所述的Fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体;
优选地,所述免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG抗体,例如IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3Fc或IgG4 Fc,优选IgG1 Fc。
又一方面,本发明提供了一种抗体制剂,所述的抗体制剂包括下述(1)和(2):
(1)前述的抗体或重组蛋白;
(2)药学上可接受的载剂。
具体地,所述的药学上可接受的载剂包括但不限于:缓冲液、无菌水或表面活性剂。
又一方面,本发明提供了一种试剂盒,所述的试剂盒包括前述的抗体或重组蛋白或抗体制剂;
具体地,所述试剂盒还包括装载所述抗体制剂的容器。
具体地,所述的试剂盒还包括但不限于:固相载体、检测标记、检测底物和/或缓冲液。
进一步具体地,所述的固相载体可以是一种具有亲和性的材料,可以将特异性抗体固定在表面上。
所述的检测标记可以是酶标记物,所述的酶标记物是一种能够与抗体结合的酶,用于检测抗体与抗原的结合情况。
所述的检测底物可以是酶标记物的反应产物,能够在酶催化下产生可测量的信号。
又一方面,本发明提供了一种药物偶联物,所述的药物偶联物包括下述(1)和(2):
(1)前述的抗体或重组蛋白;
(2)与(1)偶联的偶联部分。
又一方面,本发明提供了一种分离的核酸分子,所述的核酸分子编码前述的抗体或重组蛋白。
又一方面,本发明提供了一种表达载体,所述的表达载体包含前述的核酸分子。
又一方面,本发明提供了一种药物组合物,所述的药物组合物包含前述的抗体或重组蛋白或抗体制剂或药物偶联物或核酸分子或表达载体;
具体地,所述药物组合物还包括至少一种药学上可接受的辅料。
优选地,所述的药学上可接受的辅料选自聚山梨酯、组氨酸、蔗糖、精氨酸、氯化钠、蛋氨酸、醋酸盐、海藻糖、脯氨酸、山梨醇、磷酸钠、泊洛沙姆188、乙二胺四乙酸、柠檬酸、甘露醇、谷氨酸盐、甘氨酸、柠檬酸钠、琥珀酸钠和/或乳酸。
又一方面,本发明提供了前述的抗体或重组蛋白或抗体制剂或药物偶联物或药物组合物在下述(1)-(3)用途中的至少一种:
(1)制备检测试剂或试剂盒;
(2)制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物;
(3)制备预防和/或治疗癌症的药物。
具体地,所述的试剂盒还包括但不限于:固相载体、检测标记、检测底物和/或缓冲液。
进一步具体地,所述的固相载体可以是一种具有亲和性的材料,可以将特异性抗体固定在表面上。
所述的检测标记可以是酶标记物,所述的酶标记物是一种能够与抗体结合的酶,用于检测抗体与抗原的结合情况。
所述的检测底物可以是酶标记物的反应产物,能够在酶催化下产生可测量的信号。
具体地,所述的自身免疫性疾病包括但不限于:白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎;
优选地,所述自身免疫性疾病可以是斑块状银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎或狼疮性肾炎。
具体地,所述的癌症包括但不限于:基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。
具体地,所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地,所述的药学上可接受的辅料选自聚山梨酯、组氨酸、蔗糖、精氨酸、氯化钠、蛋氨酸、醋酸盐、海藻糖、脯氨酸、山梨醇、磷酸钠、泊洛沙姆188、乙二胺四乙酸、柠檬酸、甘露醇、谷氨酸盐、甘氨酸、柠檬酸钠、琥珀酸钠和/或乳酸。
具体地,所述的药物剂型包括但不限于:仅液体溶液、冻干粉、仅预充式注射器以及预充式注射器、冻干粉,片剂、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂。
具体地,所述的给药途径包括但不限于:眼内注射、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、鼻吸入和口服。
又一方面,本发明提供了一种用于非诊断目的的体外检测样品中的IL-17A的方法,所述的方法包括以下步骤:
S1、前述的抗体或重组蛋白或抗体制剂或药物偶联物与待测样品相接触;
S2、检测抗原-抗体复合物;
S3、判读结果。
又一方面,本发明提供了一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法,所述的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的前述的抗体或重组蛋白或抗体制剂或药物偶联物。
具体地,所述的自身免疫性疾病包括但不限于:白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎;
优选地,所述自身免疫性疾病可以是斑块状银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎或狼疮性肾炎。
又一方面,本发明提供了一种预防和/或治疗癌症的方法,所述的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的前述的抗体或重组蛋白或抗体制剂或药物偶联物。
具体地,所述的癌症包括但不限于:基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。
本发明所取得的技术效果:
(1)亲和力好,可与目标蛋白结合,且结合能力均高于阳性抗体(Ixekizumab)。
(2)阻断效果好,可以阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc,且阻断效果优于阳性抗体(Ixekizumab)。
(3)稳定性强,具有较高的热变性Tm值和Tagg,稳定性高于阳性抗体(Ixekizumab)。
附图说明
图1为单域抗体1-C11和1-H9抗体表位检测结果。
图2为双价单域抗体(1-C11+1-H9)的SDS-PAGE结果。
图3为双价单域抗体(1-C11+1-H9)、Ixekizumab的抗体亲和力ELISA检测结果。
图4为双价单域抗体(1-C11+1-H9)和Ixekizumab的抗体亲和力检测结果。
图5为双价单域抗体(1-C11+1-H9)、Ixekizumab抗体阻断功能实验结果。
图6为双价单域抗体(1-C11+1-H9)稳定性实验结果。
图7为Ixekizumab稳定性实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明的主要仪器:
电转仪(Eppendorf Multiporator);
离心机(Thermo FRESCO-17);
恒温培养箱(上海精宏DNP-9052);
恒温震荡培养箱(精骐CO-O6U);
超净工作台(苏净安泰SW-CJ-1FD);
PCR仪(Applied Biosystems ABI2720);
生物安全柜(海尔,HR40-IIA2);
流式细胞仪(Thermo Attune Nxt flow cytometer);
Thermo 3111CO2培养箱;
ForteBio OCTET R2。
本发明的主要试剂:
SfiI(NEB,CAT#:R0123L);
T4 DNA ligase(TaKaRa,CAT#:2011A);
PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,CAT#:6210B);
NuHi power mix(新海生物,CAT#:NH9303);
3M醋酸钠(pH5.2-6)(Sigma,CAT#:126-96-5);
DNA片段回收试剂盒(TakaRa,CAT#:9761);
胶回收试剂盒(Qiagen,CAT#:28706);
天根质粒大抽试剂盒(天根,CAT#:DP117);
HRP-Anti-M13(iCarTab);
PE-anti-Human IgG(eBioscience,Cat#:12-4998-82);
Rabbit anti-Llama IgG(H+L)Secondary Antibody[HRP](Novus,CAT#NBP1-75095);
SS320感受态(iCarTab);
pComF噬菌体展示载体(iCarTab);
NHS-biotin(APExBIO,CAT#:A8002);
HRP-Streptavidin(Boster,CAT#:BA1088);
HRP-ProteinA(Boster,BA1080);
ProABiosensors(Sartorius,CAT#:18-5010);
PBS(Gbico,CAT#14190-250);
DMEM(Gbico,CAT#41965-062);
RPMI1640(Gbico,CAT#61870044);
FBS(VivaCell,CAT#C04001-500);
Genomic DNAPurification Kit(Lifetech,CAT#K0512);
Mouse-IL-17A-His(ACRO,CT8-M5240)。
本发明中的筛选、克隆VHH片段、构建纳米抗体所使用的引物均参照以下文献设计:
Maass DR,Sepulveda J,Pernthaner A,Shoemaker CB.Alpaca(Lama pacos)as aconvenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies(VHHs).JImmunol Methods.2007;324(1-2):13-25.
Lin,J,Gu,Y,Xu,Y et al.Characterization and applications of nanobodiesagainst Pseudomonas aeruginosa exotoxin a selected from single alpaca Bcells.Biotechnol Biotechnol Equip 2020;34:1028-37.
Studies on design of singledomain antibodies by AlpacaVHH phagelibrary and high throughput sequencing toconstruct Fab antibody purificationsystem(http:
//hdl.handle.net/10232/00030916).
基础实施例单域抗体的制备
1.1抗原的制备
将IL-17抗原(SEQ ID NO.6)C端添加6xHis标签,按照原核密码子优化后进行基因合成并亚克隆至pET28a载体中;经Sanger测序验证无误后,进行质粒抽提;将重组质粒转化BL21感受态,使用0.5mM IPTG诱导过夜,收集菌液裂解;使用镍柱纯化重组蛋白;通过SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度。IL-17A抗原蛋白经精纯后,纯度大于90%。
阳性对照抗体Ixekizumab制备
步骤如下:
(a)基因合成Ixekizumab重链及轻链可变区(重链可变区序列SEQ ID NO.23,轻链可变区序列SEQ ID NO.24),将重链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgG4(IgG4恒定区氨基酸序列SEQ ID NO.25)载体中,轻链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgKc(hIgKc的氨基酸序列SEQID NO.27)载体中;经Sanger测序验证无误后使用质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。
(b)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及重链与轻链表达载体,室温解冻后,用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液,温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔,分别加入50μg重链和轻链表达载体,移液枪上下吹打充分混匀后,加入300μL LVTransm,立即用移液器上下吹打混匀,室温下静置10分钟。
(c)将上述DNA/LVTransm复合物加入到100mL 293F细胞中,轻轻晃动充分混匀,将细胞置于37℃、5% CO2培养箱,130RPM继续培养。
(d)连续培养5-7天后,离心收集培养基上清,用0.45μm的滤膜过滤,滤液转至无菌离心管中,使用Protein A纯化抗体。
(e)SDS-PAGE检测目标抗体蛋白的纯度,纯度>95%;SDS-PAGE检测阳性对照抗体蛋白的纯度,纯度>95%。
通过阳性对照抗体检测重组抗原结合能力,结果显示阳性抗体与IL-17A抗原蛋白结合良好,可以用于后续免疫。
SEQ ID NO.23:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEW MGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARY DYFTGTGVYWGQGTLVTVSS;
SEQ ID NO.24:
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQ LLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFG QGTKLEIK;
SEQ ID NO.25:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;
SEQ ID NO.27:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC。
1.2动物免疫过程
采用制备的重组抗原对2只羊驼(Alpaca)进行免疫,免疫方式为皮下多点免疫,共免疫6次,间隔时间21天,最后一次免疫10天后,采集外周血,ELISA检测免疫效价。
1.2.1免疫效价检测
经6轮免疫,羊驼的免疫效价均达到要求(见表1)。
表1免疫效价检测结果
1.3抗体酵母文库构建
步骤如下:
1.3.1PBMC分离及VHH抗体片段克隆
采集100mL外周血抗凝样品,使用淋巴细胞分离液分离PBMC细胞;提取RNA,使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录,制备cDNA;PCR扩增VHH片段。
(2)单域抗体酵母展示库的构建。
1.4酵母展示库淘选和筛选过程
使用制备的IL-17A抗原,与链霉亲和素磁珠孵育,将酵母菌液加到结合了抗原的磁珠中,4℃旋转孵育60分钟对构建的酵母展示库使用链霉亲和素磁珠进行2轮磁分选。分选后酵母菌液涂SDCAA平板,挑取单克隆培养,诱导表达48h后进行流式分析。与Biotin-IL-17A-His孵育1h,二抗使用PE Streptavidin,孵育完成后进行流式检测。
根据流式检测结果,第二次磁分选后,酵母阳性率为37.9%,阳性克隆显著富集,将分选产物直接涂SDCAA平板,挑选单克隆进行流式检测。
1.5FACS筛选过程
分选后酵母菌液涂SDCAA平板,挑取单克隆培养,诱导表达48h后,与Biotin-抗原孵育,二抗使用PE-Streptavidin,孵育完成后进行流式检测。
FACS检测IL17A靶点单克隆与靶点结合情况;对测序获得的候选单域抗体氨基酸序列进行比对,挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体构建真核表达载体。
1.6抗体序列鉴定
富集阳性克隆;挑选富集后的单克降,进行Phage ELISA鉴定,并对克隆进行测序分析,获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息。如图5所示,随机挑取20个单克隆,进行测序分析,序列差异大,库多样性较好。针对候选的单域抗体CDR区域氨基酸序列信息,采用In silico方法对可能的翻译后修饰位点进行分析。
根据酵母单克隆流式检测结果,选择与IL-17A-His结合的阳性克隆提取基因组DNA,PCR获得抗体序列。
1.7抗体表达纯化过程
ELISA挑选阳性克隆,获得VHH抗体序列并进行基因合成,基因工程表达后ProteinA纯化。抗体纯度>90%。
1.8功能性实验
(1)ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合过程。
(2)单域抗体阻断功能实验。
(3)稳定性实验。
(4)单域抗体表位检测,检测结果见图1。
实施例1双价单域抗体克隆表达及纯化方法
第一单域抗体(1-C11)CDR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-3;FR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.7-10;单域抗体(1-C11)的氨基酸序列为SEQ ID NO.15;
第二单域抗体(1-H9)CDR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4-6,FR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11-14;单域抗体(1-H9)的氨基酸序列为SEQ ID NO.16。
以上两个单域抗体为不同表位,本实施例的双价单域抗体是第一单域抗体(1-C11)通过linker(GGGGSGGGGSGGGGS)与第二单域抗体(1-H9)连接(连接后的氨基酸序列为SEQ ID NO.17;对应的核酸序列为SEQ ID NO.18),再连接铰链区(SEQ ID NO.19)和CH区(SEQ ID NO.20)。获得的双价单域抗体(1-C11+1-H9)的氨基酸序列为SEQ ID NO.21,对应的核酸序列为SEQ ID NO.22。
SEQ ID NO.1:ESLLRLYA;
SEQ ID NO.2:HTTSDTT;
SEQ ID NO.3:HVTSMRDSQNY;
SEQ ID NO.4:GFDLDLYT;
SEQ ID NO.5:IDLTSGAT;
SEQ ID NO.6:NPVAVGGHLY;
SEQ ID NO.7:DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS;
SEQ ID NO.8:MGWYRQLPGQEREWVAI;
SEQ ID NO.9:NYRDSVKGRFTLSRDVATNTIYLQMTSLKPEDTAVYYC;
SEQ ID NO.10:WGQGTQVTVSS;
SEQ ID NO.11:AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS;
SEQ ID NO.12:IAWFRQAPGKEREFVSL;
SEQ ID NO.13:SDAGSMKGRVAISRDKDSNTVSLQLNSLKPEDTAVYYC;
SEQ ID NO.14:WGQGTQVTVSS;
SEQ ID NO.15:
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASESLLRLYAMGWYRQLPGQEREWVAIHTTSDTTNYRDSVKGRFTLSRDVATNTIYLQMTSLKPEDTAVYYCHVTSMRDSQNYWGQGTQVTVSS;
SEQ ID NO.16:
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDLDLYTIAWFRQAPGKEREFVSLIDLTSGATSDAGSMKGRVAISRDKDSNTVSLQLNSLKPEDTAVYYCNPVAVGGHLYWGQGTQVTVSS;
SEQ ID NO.17:
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASESLLRLYAMGWYRQLPGQEREWVAIHTTSDTTNYRDSVKGRFTLSRDVATNTIYLQMTSLKPEDTAVYYCHVTSMRDSQNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDLDLYTIAWFRQAPGKEREFVSLIDLTSGATSDAGSMKGRVAISRDKDSNTVSLQLNSLKPEDTAVYYCNPVAVGGHLYWGQGTQVTVSS;
SEQ ID NO.18:
gatgtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctgaaagcctcctcaggttgtatgccatgggctggtaccgccaacttccagggcaggagcgcgagtgggtcgcaatacacactactagtgacaccactaattatagagactccgtgaagggccgattcacgctctccagagacgtcgccacgaacacgatttatctccaaatgaccagcctcaaacctgaagacacggccgtctattattgtcatgttacttccatgagagattcacaaaactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcgggaggcggaggatctggcggaggtggaagtggcggaggcggttctgcggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggattcgatttggatttgtataccatagcctggttccgccaggctccggggaaggagcgcgagtttgtgtcactcatagatttgactagtggtgccacatccgacgcgggctccatgaagggccgagtcgccatctccagagacaaagacagcaacacggtgtcgctgcaattgaatagcctgaaacctgaagatacggccgtctactactgtaatccagtcgcggtgggaggacacttgtactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca;
SEQ ID NO.19:DKTHTCP;
SEQ ID NO.20:
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
SEQ ID NO.21:
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASESLLRLYAMGWYRQLPGQEREWVAIHTTSDTTNYRDSVKGRFTLSRDVATNTIYLQMTSLKPEDTAVYYCHVTSMRDSQNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDLDLYTIAWFRQAPGKEREFVSLIDLTSGATSDAGSMKGRVAISRDKDSNTVSLQLNSLKPEDTAVYYCNPVAVGGHLYWGQGTQVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
SEQ ID NO.22:
gatgtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctgaaagcctcctcaggttgtatgccatgggctggtaccgccaacttccagggcaggagcgcgagtgggtcgcaatacacactactagtgacaccactaattatagagactccgtgaagggccgattcacgctctccagagacgtcgccacgaacacgatttatctccaaatgaccagcctcaaacctgaagacacggccgtctattattgtcatgttacttccatgagagattcacaaaactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcgggaggcggaggatctggcggaggtggaagtggcggaggcggttctgcggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggattcgatttggatttgtataccatagcctggttccgccaggctccggggaaggagcgcgagtttgtgtcactcatagatttgactagtggtgccacatccgacgcgggctccatgaagggccgagtcgccatctccagagacaaagacagcaacacggtgtcgctgcaattgaatagcctgaaacctgaagatacggccgtctactactgtaatccagtcgcggtgggaggacacttgtactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacg tgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataa。
双价单域抗体(1-C11+1-H9)的制备和纯化:
(Ⅰ)将上述的双价单域抗体序列进行基因合成,与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc(IgG1恒定区氨基酸序列SEQ ID NO.26)中。载体经测序验证无误后,使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。
(Ⅱ)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体,室温解冻后,用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液,温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔,分别加入130μg抗体表达载体,移液枪上下吹打充分混匀后,加入400μL LVTransm,立即用移液器上下吹打混匀,室温下静置10分钟。
(Ⅲ)将上述DNA/LVTransm复合物加入到30mL 293F细胞中,轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5% CO2培养箱,130rpm培养6-8小时后,加入50mL新鲜的293细胞培养基,将细胞重新放回培养箱中继续培养。
(Ⅳ)连续培养7天后,离心收集培养基上清,用0.45μm的滤膜过滤,滤液转至无菌离心管中,使用Protein A纯化抗体。
抗体的纯度>90%,SDS-PAGE结果如图2所示。
SEQ ID NO.26:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
实施例2亲和力检测实验
2.1Human IL-17A重组蛋白与对照抗体ELISA结合活性检测
(1)使用无菌CBS稀释IL-17A重组蛋白至终浓度为2μg/mL。取一块新的96孔板,加入100μL/孔4℃包被过夜。
(2)去掉抗原包被液,使用PBST(含0.5%的吐温)洗涤3次。
(3)加入200μL/孔的3%MPBS 37℃封闭2小时;
(4)去掉封闭缓冲液后,使用PBST洗涤孔板3次;
(5)阳性对照抗体Ixekizumab使用PBS稀释至10μg/ml,5倍稀释7个点,按100μL/孔加入酶标板中,室温孵育1小时,对照孔为PBS;
(6)去掉孔内的液体,并使用PBST洗涤3次;
(7)加入二抗HRP-ProteinA(Boster,BA1080)1:10000稀释,按100μL/孔加入酶标板中,室温孵育1小时;
(8)去掉孔内的液体后,使用PBST洗涤孔板3次;
(9)加入100μL/孔TMB显色液;
(10)室温避光孵育15分钟;
(11)加入50μL/孔终止液(2M HCL);
(12)使用酶标仪读取孔内的OD450值。
结果如表1所示:阳性抗体与IL-17A抗原蛋白结合良好,可以用于免疫。
表1.Human IL17A与阳性抗体结合活性检测
2.2亲和力检测方法及结果
2.2.1HRP-Streptavdin进行ELISA检测
将纯化后的单域抗体2ug/mL包被96孔酶标板,加入Biotin-IL-17A-His,起始浓度为10ug/mL,5倍梯度稀释7个点,采用HRP-Streptavdin进行ELISA检测。检测结果为双价单域抗体(1-C11+1-H9)的EC50=1.465ug/mL,阳性抗体(Ixekizumab)的EC50=10.06ug/mL,说明了双价单域抗体(1-C11+1-H9)可与目标蛋白结合,且结合能力高于阳性抗体(Ixekizumab),结果见图3。
2.2.2ForteBio OCTET R2仪器测定抗体亲和力
(1)使用ForteBio OCTET R2仪器测定抗体亲和力,HIS1K传感器( ProABiosensors)固化IL7A-His,固化浓度为5ug/mL。
(2)缓冲液为PBST(PBS+0.02%tween20),候选抗体样品稀释至50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.13nM,0nM。
(3)亲和力检测:平衡60s,结合180s,解离180s,检测温度25℃。
(4)使用ForteBio OCTET R2系统进行动力学表征分析。
由结果可知,双价单域抗体(1-C11+1-H9)的KD=1.273×10-8M,阳性抗体(Ixekizumab)的KD=3.910×10-10M(图4)。
实施例3阻断功能实验
在96孔板中加入梯度稀释的检测抗体(阳性抗体:Ixekizumab;待检测抗体:双价单域抗体(1-C11+1-H9)),按照10倍梯度稀释抗体,连续稀释10个梯度,终浓度依次为100μg/mL,10μg/mL,1μg/mL,0.1μg/mL,0.01μg/mL,0.001μg/mL,0.0001μg/mL,0.00001μg/mL,0.000001μg/mL,0.0000001μg/mL,0μg/mL,将稀释好的梯度浓度抗体取50μL加入96孔板中,每个梯度2个复孔。然后再向对应孔中,每孔加入50μL 0.4μg/mL的IL-17A蛋白(终浓度为0.1μg/mL)。混匀后,放置37℃培养箱中,孵育1小时。吸取培养至对数生长期的293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞于96孔板中,每孔接种2×104个细胞。共培养18h后,每孔加入20μL Bright-GloTM检测试剂,使用Tecan M1000pro酶标仪检测孔内的荧光素酶活性数值。
3.2结果
结果可知,阳性对照Ixekizumab的IC50为1.356μg/mL,双价单域抗体(1-C11+1-H9)的IC50为1.225μg/mL,两者均可以阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc,并且双价单域抗体的阻断效果明显优于阳性对照(图5)。
实施例4稳定性实验
通过微量差示扫描荧光技术(nanoDSF)技术检测荧光变化,可在天然条件下检测蛋白热变性和化学变性,精确地确定蛋白50%处于去折叠状态时的温度(Tm)以及开始出现聚集时的温度(Tagg);热变性Tm、Tonset值和Tagg越高说明抗体蛋白越稳定。
4.1实验步骤
取100μL前期项目制备的候选抗体以及Ixekizumab(样本浓度大于200μg/mL),4℃,12000×g,离心10min后,用毛细管吸取样品,每个样品准备两根毛细管,作为平行对照,按顺序放入对应的卡槽中,确保毛细管吸满样品,无气泡,进行检测分析。
4.2结果
双价单域抗体(1-C11+1-H9)和阳性对照Ixekizumab的稳定性结果见图6-图7,结果显示,双价单域抗体(1-C11+1-H9)的Tm1为62.28℃,Tm2为81.94℃,Tonset为51.36℃,Tagg为73.59℃;阳性对照Ixekizumab的Tm1为56.10℃,Tm2为79.84℃,Tonset为47.50℃,Tagg为61.86℃。结果表明双价单域抗体(1-C11+1-H9)稳定性明显强于阳性对照Ixekizumab。
应用实施例1ELISA试剂盒的制备
ELISA试剂盒包含以下各组分:
(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);
(2)酶标记的抗原或抗体(结合物);
(3)酶的底物;
(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中),参考标准品和控制血清(定量测定中);
(5)结合物及标本的稀释液;
(6)洗涤液,在板式ELISA中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水;
(7)酶反应终止液,常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
在一些实施方式中,所述的包被浓度为0.3-5μg/mL;优选地,所述的包被浓度为2-3μg/mL。
在一些实施方式中,所述的酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶中的一种;优选为辣根过氧化物酶;所述的底物选自邻苯二胺、四甲基联苯胺或氨基水杨酸中的一种;优选为四甲基联苯胺。
应用实施例2:一种双价单域抗体(1-C11+1-H9)的药物偶联物
本发明提供了一种含双价单域抗体(1-C11+1-H9)的药物偶联物的制备方法,包括:
(1)双价单域抗体(1-C11+1-H9)或其抗原结合片段与还原剂在缓冲液中反应;
(2)将接头-有效载荷与步骤(1)中得到的具有巯基的抗体或其抗原结合片段反应;
在一些实施方式中,还原剂与抗体或其抗原结合片段的物质的量比为1:1-5:1;优选为1:1-4:1;进一步优选为1:1-3:1;更进一步优选为2:1-3:1。
在一些实施方式中,所述的还原剂选自三(2-羧基乙基)膦(TCEP)或其盐、二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。在一些实施方案中所述还原剂为三(2-羧基乙基)膦或其盐,优选为三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)。
在一些实施方式中,所述的缓冲液选自HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液;优选为为组氨酸缓冲液;进一步优选为组氨酸-盐酸缓冲液;所述缓冲液的浓度为1mM-30mM,如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM,优选为20mM。
在一些实施方式中,所述的接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的物质的量之比为2:1-10:1;优选地,所述的接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的物质的量之比为3:1-9:1;进一步优选地,所述的接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的物质的量之比为4:1-7:1;更一步优选地,所述的接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的物质的量之比为5:1-7:1。
在一些实施方式中,还包括用于溶解接头-有效载荷的溶剂;所述的溶剂包括有机溶剂;所述的有机溶剂可以选自丙酮水溶液(例如50%丙酮水溶液)、乙醇水溶液(例如80%乙醇水溶液)、甲醇水溶液(例如80%甲醇水溶液)、异丙醇水溶液(例如80%异丙醇水溶液)、二甲亚砜水溶液(例如80%二甲亚砜水溶液)、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP);优选为丙酮水溶液或DMSO水溶液,优选为50%丙酮水溶液。
应用实施例3:一种双价单域抗体(1-C11+1-H9)药物组合物
一种药物组合物,包含:(1)缓冲液;和(2)双价单域抗体(1-C11+1-H9)或其抗原结合片段。
在一些实施方式中,所述的双价单域抗体(1-C11+1-H9)或其抗原结合片段的浓度为1-300mg/L;优选为5-100mg/L;更优选为5-50mg/L。
在一些实施方式中,所述的缓冲液选自醋酸缓冲液、组氨酸缓冲液磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸缓冲液或Tris中的至少一种;优选地,所述缓冲液为组氨酸缓冲液;更优选地,所述组氨酸缓冲液为组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液。
在一些实施方式中,所述的缓冲液的浓度为3-60mM;优选为5-20mM;所述的缓冲液的pH为4.0-7.0,优选为5.0-6.0。
在一些实施方式中,所述的药物组合物中,还包括稳定剂,所述稳定剂选自精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、甘氨酸和海藻糖中的至少一种;优选地,所述药物组合物中,所述稳定剂的浓度为50-400mM,优选为100-200mM,更优选为100-150mM。
在一些实施方式中,所述稳定剂为蔗糖,蔗糖的浓度100-300mM,优选为150-200mM;或所述稳定剂为蔗糖和精氨酸盐酸盐的组合,其中,蔗糖的浓度为50-200mM,精氨酸盐酸盐的浓度为10-100mM,优选为,蔗糖的浓度为100-150mM,精氨酸盐酸盐的浓度为30-50mM。
在一些实施方式中,所述的药物组合物还包括表面活性剂,所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的至少一种。
在一些实施方式中,所述的药物组合物还包括其他的治疗免疫疾病或抗肿瘤的药物。
Claims (27)
1.一种抗体,其特征在于,所述的抗体包含下述(1)和(2):
(1)第一单域抗体,所述的第一单域抗体的氨基酸序列包含序列如SEQ ID NO.1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3;和/或与SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列;
(2)第二单域抗体,所述的第二单域抗体的氨基酸序列包含序列如SEQ ID NO.4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6;和/或与SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述的抗体的氨基酸序列包含通过在SEQID NO.1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰或取代中的至少一种方式获得的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗体,其特征在于,所述的抗体的氨基酸序列包含与SEQ IDNO.1-6所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸差异的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗体,其特征在于,所述的第一单域抗体或第二单域抗体还包括用于连接重链可变区的至少4个重链框架区。
5.根据权利要求4所述的抗体,其特征在于,所述重链框架区包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体;
优选地,包含部分或全部选自骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体;
更优选地,包含部分或全部选自羊驼源的抗体重链框架区或其变体。
6.一种抗体,其特征在于,所述的抗体包含下述(1)和(2):
(1)第一单域抗体,所述的第一单域抗体的结构为:
FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4;
(2)第二单域抗体,所述的第二单域抗体的结构为:
FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8;
所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.1-3相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸差异的氨基酸序列;
所述的HCDR4、HCDR5和HCDR6选自如SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.4-6相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列;
所述的FR1、FR2、FR3和FR4选自如SEQ ID NO.7-10所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.7-10相比具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列;
所述的FR5、FR6、FR7和FR8选自如SEQ ID NO.11-14所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.11-14相比具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列;
所述的氨基酸差异通过在SEQ ID NO.1-3和SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和或取代中的至少一种方式实现。
7.根据权利要求6所述的抗体,其特征在于,所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示;所述的HCDR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述的HCDR5的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示;所述的HCDR6的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的抗体,其特征在于,所述的第一单域抗体和第二单域抗体的氨基酸序列直接连接或通过连接子间接连接。
9.根据权利要求8所述的抗体,其特征在于,所述的连接子为(GGGGS)n,其中n选自1、2、3、4、5或6;较佳地,所述的连接子为(GGGGS)3。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的抗体,其特征在于,所述的抗体的连接顺序选自下述(1)-(3)中的一种:
(1)所述的第一单域抗体和第二单域抗体以任选的顺序连接;
(3)第一单域抗体和第二单域抗体按照从N端到C端的顺序连接;
(3)第一单域抗体和第二单域抗体按照从C端到N端的顺序连接。
11.根据权利要求1-10任意一项所述的抗体,其特征在于,所述的抗体为抗IL-17A抗体。
12.一种重组蛋白,其特征在于,所述的重组蛋白包含权利要求1-11中任意一项所述的抗体。
13.根据权利要求12所述的重组蛋白,其特征在于,所述的重组蛋白还包含协助其表达和/或分泌,或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。
14.根据权利要求13所述的重组蛋白,其特征在于,所述的生物活性多肽或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的重组蛋白,其特征在于,所述的Fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体;
较佳地,所述免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG抗体,例如IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc或IgG4 Fc,优选IgG1 Fc。
16.一种抗体制剂,其特征在于,所述的抗体制剂包括下述(1)和(2):
(1)权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白;
(2)药学上可接受的载剂。
17.一种试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白或权利要求16所述的抗体制剂;
任选地,所述试剂盒还包括装载所述抗体制剂的容器。
18.一种药物偶联物,其特征在于,所述的药物偶联物包括下述(1)和(2):
(1)权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白;
(2)与(1)偶联的偶联部分。
19.一种分离的核酸分子,其特征在于,所述的核酸分子编码权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白。
20.一种表达载体,其特征在于,所述的表达载体包含权利要求19所述的核酸分子。
21.一种药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物包含权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白或权利要求16所述的抗体制剂或权利要求18所述的药物偶联物或权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的表达载体;
任选地,所述药物组合物还包括至少一种药学上可接受的辅料。
22.权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白或权利要求16所述的抗体制剂或权利要求18所述的药物偶联物或权利要求21所述的药物组合物在下述(1)-(3)用途中的至少一种:
(1)制备检测试剂或试剂盒;
(2)制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物;
(3)制备预防和/或治疗癌症的药物。
23.根据权利要求22所述的用途,其特征在于,所述的自身免疫性疾病包括白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎;
优选地,所述自身免疫性疾病为斑块状银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎或狼疮性肾炎。
24.根据权利要求22或23所述的用途,其特征在于,所述的癌症包括基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。
25.一种用于非诊断目的的体外检测样品中的IL-17A的方法,其特征在于,所述的方法包括以下步骤:
S1、权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白或权利要求16所述的抗体制剂或权利要求18所述的药物偶联物与待测样品相接触;
S2、检测抗原-抗体复合物;
S3、判读结果。
26.一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法,其特征在于,所述的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白或权利要求16所述的抗体制剂或权利要求18所述的药物偶联物。
27.一种预防和/或治疗癌症的方法,其特征在于,所述的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白或权利要求16所述的抗体制剂或权利要求18所述的药物偶联物。
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