CN117838835A - 成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用 - Google Patents
成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明首次发现不同浓度的FGF17可以恢复Aβ对神经元造成包括细胞活力、胞体状态、突触生长等方面的损伤，在治疗阿尔兹海默病的过程中具有重要的作用，因此具有成为有别于已存在的蛋白或抗体类药物的新型蛋白药物的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)又叫老年痴呆，是一种最常见的神经退行性疾病，占痴呆症病例的近四分之三。其典型临床特征表现为情绪波动、记忆力减退、认知功能障碍、语言功能障碍、视觉空间功能障碍，严重影响患者的社交、职业与生活。当阿尔茨海默病进展到晚期时，可引起严重症状，如营养不良、神经元坏死引起的多器官衰竭，甚至脑死亡。
据报道，全球有超过4.7千万人患有阿尔茨海默病，其发病率每年都在急剧上升。在美国，阿尔茨海默病被正式列为第六大死因。尽管对阿尔茨海默病的发病机制进行了许多基础研究，但将有希望的发现转化为临床治疗的潜力仍然有限。在过去的十年里，针对阿尔茨海默病的临床试验相对较少，且失败率高达99.6％。目前批准的药物主要分为两类，即胆碱酯酶抑制剂，包括他克林、多奈哌齐、利瓦斯汀和加兰他明，以及NMDA受体竞争性抑制剂，即美金刚通过防止神经元丢失以及通过帮助恢复受损神经元功能改善症状来起到神经保护作用。这些药物只能改变疾病的进程，而不是针对症状发挥作用，不能从根本上逆转疾病的进展，因此发展新型AD治疗药物显得尤为必要和紧迫。
成纤维细胞生长因子17(FGF17)属于成纤维细胞生长因子家族的FGF8亚家族，属于自分泌/旁分泌的成纤维细胞生长因子。在结构上，FGF17具有肝素或肝素硫酸盐(HS)亲和特性，可以与从跨膜核心蛋白延伸的糖基化HS链结合。在功能上，FGF17和FGF8作为中脑-后脑交界组织者和峡部组织者等，在胚胎发育、脑的发育和形成、腹壁闭合中发挥作用。目前关于将FGF17应用于阿尔茨海默病的治疗未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用。
本发明还提供成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗β-淀粉样蛋白导致的神经元损伤的药物中的应用。
本发明还提供一种药物组合物，包括成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂。
本发明还提供一种药物制剂，包括所述药物组合物和可药用载体。
优选的是，所述药用载体适用于固体剂型、液体剂型、膏型剂型或乳状剂型。
本发明还提供成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备增强神经元细胞活力的药物中的应用。
本发明还提供成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备提高突触相关蛋白水平的药物中的应用。
本发明还提供成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备增加神经元突起长度的药物中的应用。
基于上述技术方案，本发明具有以下技术效果：
本发明首次发现不同浓度的成纤维细胞生长因子17蛋白可以恢复β-淀粉样蛋白对神经元造成包括细胞活力、胞体状态、突触生长等方面的损伤，在治疗阿尔兹海默病的过程中具有重要的作用，因此具有成为有别于已存在的蛋白或抗体类药物的新型蛋白药物的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同浓度的FGF17恢复Aβ对大鼠原代神经元细胞活力的损伤作用的实验结果图；
图2为高浓度和低浓度的FGF17恢复Aβ对大鼠原代神经元细胞突触相关蛋白的抑制作用的实验结果图；
图3为高浓度和低浓度的FGF17恢复Aβ对大鼠原代神经元细胞突起生长的损伤作用的实验结果图；
图4为高浓度和低浓度的FGF17恢复Aβ对大鼠原代神经元细胞突起数量、长度的损伤作用的实验结果图，其中，A为神经元的平均突起长度，B为每个神经元的突起数量，C为最长突起长度超100μm的神经元比例；
图5为高浓度和低浓度的FGF17恢复了Aβ对大鼠原代神经元细胞的胞体和突起的损伤作用的实验结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1
1.原代神经元提取
1.1在实验前一天，用浓度为0.0125mg/mL的多聚赖氨酸包被培养板，随后放置在超培养箱过夜。次日，在超净台中回收多聚赖氨酸，并用无菌水冲洗包被的培养板洗2次后风干备用。
1.2将使用75％乙醇消毒后的冰盒被置于超净台中间，将盛有D-hank's缓冲液的培养皿放在冰盒上，将灭菌的手术器械顺序依次摆放好，将装有75％乙醇的小烧杯放在超净台一侧。
1.3从SD新生鼠剥离获得双侧皮质，接着将皮质转移到另一盛有D-hank's的培养皿中，去除脑膜及海马。
1.4将分离好的皮质转入含有2mL D-hank's缓冲液的西林瓶内，用弯剪将组织剪碎至约1mm3大小。
1.5向每个西林瓶中加入1mL 25％的胰酶，使用移液枪吹打混匀，放入37℃培养箱消化5min，接着取出西林瓶，用玻璃吹管吹打数次，继续放入37℃培养箱消化5min。
1.6消化结束后，向每个西林瓶中加入5mL的DMEM+10％FBS培养基终止消化，用吹管轻轻地吹打组织数次，使细胞从组织中游离出来。
1.7使用移液器将悬液转移至200目筛网，收集通过筛网的滤液，再将滤液转移到15mL的离心管，以1500rpm的速度离心5min。
1.8离心后弃去上清，加入2mL的DMEM+10％FBS培养基轻轻吹打细胞团，使之充分重悬。
1.9取20μL的细胞悬液于20μL台盼蓝溶液中，吹打混匀，吸取混合液加入Countstar细胞计数板中，使用细胞计数仪检测细胞浓度。
1.10将得到的细胞重悬液按照96孔板每孔8万孔，24孔板每孔40万孔，6孔板每孔100万接种到细胞培养板中。
1.11接种6h后，弃掉DMEM+10％FBS培养基，换为Neurobasal+2％ B27培养基。
1.12于第3天更换一次培养基，期间观察细胞生长的状态，第5天用于各种实验。
2.CCK8实验
2.1将原代神经元每孔8万细胞铺到96孔板中，5h后更换培养基，37℃培养箱培养至第3天再次更换培养基，继续培养2天。
2.2使用Neurobasal+2％ B27培养基稀释Aβ1-42和FGF17，使稀释后Aβ1-42浓度为3μM，FGF17分别为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL，小心去除96孔板培养基并加入含有Aβ1-42和FGF17的培养基，继续在37℃培养箱中培养24h。
2.3 24h后去除培养液，每孔加入100μL的CCK8反应液，放入37℃培养箱继续避光培养2h-4h。
2.4使用酶标仪读取450nm波长下的吸光度值，并计算细胞活力。
实验结果说明：不同浓度的FGF17均可以恢复Aβ导致的神经元细胞活力降低(图1)。
3.Western Blot实验
3.1细胞裂解
3.1.1PIPA裂解液与蛋白酶抑制剂cocktail、PMSF按照100:1混合均匀，现配现用，置于冰上预冷。
3.1.2弃去培养皿中的培养基，加1mL PBS清洗2次。
3.1.3根据细胞量，加入适量的裂解液，轻轻摇匀使裂解液充分浸润皿底，于冰上静置30min以充分裂解细胞。
3.1.4用刮刀刮下培养皿上的细胞，将混有细胞的裂解液转移到1.5mL EP管。
3.1.5于预冷至4℃的离心机，12000×g离心30min，将上清转移在新的1.5mL EP管即为裂解得到的总蛋白溶液，于-80℃保存。
3.2蛋白浓度测定与制样
3.2.1使用超纯水稀释配置浓度梯度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的蛋白标准品溶液。
3.2.2按照A液：B液＝50：1的比例配置BCA溶液，混匀备用。
3.2.3在96孔板中逐一加入每孔20μL梯度稀释的蛋白标准溶液，样品孔则加入18μL的超纯水和2μL蛋白样品溶液，最后，在每个含有蛋白标准溶液或样品的96孔里面加入200μL的BCA溶液。
3.2.4把96孔板放在37℃培养箱里，孵育30min。使用酶标仪，波长为570nm测量吸光值，用excel绘制标准曲线，趋势线R2值≥0.995方为可用的标准曲线，将每个样品数值带入公式，计算得出每个样品的浓度。
3.2.5利用测得的蛋白浓度计算得出制备等质量样品所需的蛋白样品溶液体积，将等质量的蛋白样品溶液、5×SDS loading buffer和超纯水混合均匀，制成等体积的蛋白样品后，于100℃水浴10min使蛋白变性。
3.3Western blot
3.3.1根据目的蛋白的分子量大小配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶，待胶彻底凝固后将样品和双色预染蛋白marker分别加至凝胶的孔中。
3.3.2在组装好电泳槽中加入电泳缓冲液即可进行电泳，先将电压调至恒压60V电泳，待样品从上层的浓缩胶电泳至分离胶后，调整电压至100V分离蛋白。
3.3.3根据凝胶的长宽，剪下相应面积的PVDF膜用甲醇浸泡2min使PVDF膜上的电荷活化。
3.3.4将电泳完成的SDS-聚丙烯酰胺凝胶取出，将转印夹各部分按照顺序组装好，排出PDVF膜和凝胶之间的所有气泡，并将其放置于转印夹盒中。
3.3.5将组装好的夹盒放入转膜槽中，加入预冷的转膜缓冲液，将装置放置于冰上，恒流235mA转膜，根据目的蛋白分子量大小和SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度设置转膜时间。
3.3.6转膜完成后取出PDVF膜浸泡在5％的脱脂奶粉的TBST溶液中，于20rpm的摇床上，室温封闭1.5h。
3.3.7依据蛋白marker的位置，根据目标蛋白的大小，将其PDVF膜裁剪成不同蛋白大小的部分，放到做好标记的盒子中。
3.3.8把稀释后的一抗分别加入抗体盒里中，使膜完全浸泡在相应的抗体稀释液里，摇床20rpm，4℃孵育12～16h。
3.3.9孵育完成后除去一抗稀释液，加入TBST于摇床80rpm清洗3次，每次10min。
3.3.10根据一抗属性，加入适量二抗于摇床20rpm孵育2h。
3.3.11除去二抗稀释液，加入TBST于摇床80rpm清洗3次，每次10min。
3.3.12在膜上均匀滴加ECL发光液，于荧光成像仪显影。
实验结果说明：不同浓度的FGF17可以恢复Aβ导致的突触相关蛋白水平下调(图2)。
4.免疫荧光
4.1将接种了细胞的爬片的培养取出，弃培养基，加入1mL PBS洗2次。
4.2加入每孔500μL常温4％多聚甲醛，静置30min以固定细胞。
4.3弃多聚甲醛，加入每孔1mL含有2mg/mL甘氨酸的PBS，浸洗3次，每次5min。
4.4加入每孔500μL 0.2％ Tritonx-100的透化液，静置孵育10min，弃透化液，用每孔1mL PBS浸洗细胞3次，每次5min。
4.5加入500μL免疫染色封闭液静置封闭1h。
4.6弃封闭液，按照1:200的比例使用一抗稀释液稀释一抗，每孔加入250uL一抗稀释液，4℃孵育过夜。
4.7去除一抗稀释液，每孔使用1mL 0.05％ Tween20和1％ BSA的PBS清洗液，浸洗5次，每次5min。
4.8根据一抗相应属性按照二抗1:200的比例配置二抗溶液，每孔加入250μL二抗溶液避光孵育1h。
4.9去除二抗，使用每孔1mL 0.05％ Tween20和1％ BSA的PBS清洗液浸洗5次，每次5min。
4.10每孔加入250μLDAPI染液，孵育10min后，每孔加入1mL PBS，浸洗5次，每次5min。
4.11在载玻片上标记好细胞名称、处理方式、日期和名字，取5μL抗荧光淬灭封片液于载玻片上，夹起爬片将细胞面朝下放在有封片液的载玻片上，往爬片与载玻片的连接处滴加指甲油以固定爬片。
4.12使用LSM 900激光共聚焦显微镜观察并拍照。
实验结果说明：加入Aβ处理后，神经元平均突起长度显著缩短，最长突起长度超过100μm的细胞比例显著性降低，神经元突起数量也变少，而不同浓度的FGF17均能有效地缓解了Aβ对神经元的损伤(图3、4)。
5.扫描电镜
5.1弃去培养皿中的培养基，用PBS清洗爬片2次，加入2.5％的戊二醛，常温固定2-3h或4℃过夜。
5.2去除固定液，PBS浸洗2次，每次10min。
5.3使用30％、50％、70％、80％、90％、100％的乙醇梯度脱水，每次5-8皿，100％的乙醇重复脱水2-3次。
5.4将样品转移至临界点干燥仪进行临界点干燥，将干燥后的样品粘在铜台上喷金。
5.5使用扫描电子显微镜进行观察拍摄。
实验结果说明：加入Aβ处理后，神经元胞体粗糙，突起长度显著缩短，加入不同浓度的FGF17后的神经元胞体均恢复平滑、突起长度显著增加(图3、4)。
FGF17是一种内源性分泌蛋白，分子量小，易在体外生产和纯化，且该蛋白在哺乳动物的脑中表达丰度高，不易被宿主的免疫系统识别和排斥。
综上，本发明发现FGF17能够恢复Aβ导致的神经元细胞活力降低，恢复Aβ导致的突触相关蛋白水平下调，缓解Aβ对神经元的损伤，使神经元胞体恢复平滑、突起长度显著增加，可以用于制备治疗阿尔兹海默病的药物。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术用户来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用。
2.成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备治疗β-淀粉样蛋白导致的神经元损伤的药物中的应用。
3.一种药物组合物，其特征在于，包括成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂。
4.一种药物制剂，其特征在于，包括权利要求3所述药物组合物和可药用载体。
5.根据权利要求4所述药物制剂，其特征在于，所述药用载体适用于固体剂型、液体剂型、膏型剂型或乳状剂型。
6.成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备增强神经元细胞活力的药物中的应用。
7.成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备提高突触相关蛋白水平的药物中的应用。
8.成纤维细胞生长因子17蛋白和/或其激活剂在制备增加神经元突起长度的药物中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |