CN117836427A - 多核苷酸测序 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多核苷酸测序方法，该方法包括使用包含聚合酶的组合物的洗涤步骤。该组合物还可包含多种核苷酸。该组合物可被配置为防止该聚合酶将该多种核苷酸之一掺入拷贝多核苷酸链中。该组合物可基本上不含Mg2。

Description

多核苷酸测序
技术领域
本公开尤其涉及多核苷酸的测序。
背景技术
模板多核苷酸链的测序可通过多个步骤循环发生，其中每个循环一个可检测核苷酸被掺入与模板链互补的拷贝链中。可检测核苷酸通常被封闭以防止每个循环掺入多于一个可检测核苷酸。在孵育时间后，通常进行洗涤步骤以去除任何未掺入的可检测核苷酸。然后可以进行检测步骤，其中确定掺入拷贝链中的可检测核苷酸的身份。接着，进行去封闭步骤和裂解或掩蔽步骤，其中从拷贝链中最后一个掺入的核苷酸中去除封闭剂，并且从掺入拷贝链中的最后一个核苷酸裂解可检测部分或在该核苷酸上掩蔽可检测部分。在一些情况下，去除封闭部分的步骤也去除可检测部分。然后通过在掺入步骤中引入封闭的、可检测核苷酸来重复该循环。
测序循环的每个步骤都采用不同的组合物。例如，在掺入步骤期间采用包含聚合酶和核苷酸的掺入组合物。扫描组合物尤其可以包括抗氧化剂，该抗氧化剂在检测步骤期间保护多核苷酸免受光诱导的损伤，例如，当核苷酸包含用于检测的荧光团标记时。在去封闭步骤期间采用去封闭组合物，该去闭组合物包含用于从所掺入的核苷酸中裂解封闭部分的试剂。可在去封闭步骤之后使用可包含清除剂化合物的裂解后洗涤组合物，以保护多核苷酸、酶或其他测序试剂免受去封闭步骤中使用或产生的反应性化合物的影响。
通常使用大量的试验以及误差和考虑来开发每个测序步骤中使用的组合物和试剂，以减少测序中的误差，增加测序速率，增加可进行的测序循环的数目，直至先前掺入的核苷酸的身份不再能被可靠地确定等。尽管在开发测序试剂和组合物时小心，但仍存在一些问题。例如，来自先前掺入的核苷酸的大量残留信号在去封闭步骤后仍然存在。残留信号可能增加噪音，这可能干扰准确识别在下一个测序循环中掺入的核苷酸的能力。
发明内容
本公开尤其描述了使用包含聚合酶的洗涤组合物的多核苷酸测序方法。令人惊奇的是，已经发现在洗涤组合物中使用聚合酶减少了去封闭步骤之后的残留信号。甚至更令人惊奇的是，在洗涤组合物中掺入聚合酶可改善其他测序度量，诸如减少定相、预定相、误差率和信号衰减中的一者或多者。在洗涤组合物中使用聚合酶还可允许较短的测序循环时间。例如，在洗涤组合物中使用聚合酶可允许减少掺入步骤的持续时间。
尽管未完全理解关于包含聚合酶的洗涤组合物如何减少残留信号的机制，但洗涤组合物中的聚合酶(“第二”聚合酶)有可能促进测序聚合酶(“第一”聚合酶)从拷贝链或模板链的去除。第一聚合酶可接受或保留裂解的可检测部分。因此，去除结合的第一聚合酶可引起残留信号的减少。如果包含第二聚合酶的洗涤组合物促进结合的第一聚合酶的去除，则在去封闭步骤之前或之后使用洗涤组合物可减少残留信号。
已理解或还未充分理解关于包含聚合酶的洗涤组合物如何可减少定相和预定相以及如何可影响其他测序度量的一种或多种机制。不考虑所涉及的一种或多种机制，使用包含聚合酶的洗涤组合物可令人惊奇地为测序提供益处。
在本文所述的一些实施方案中，多核苷酸测序方法包括：(a)将包含第一聚合酶和多个封闭的、标记的核苷酸的掺入组合物与模板多核苷酸链一起孵育，使得该聚合酶将该多个封闭的、标记的核苷酸之一掺入与该模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中；(b)识别掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸；(c)从掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分；(d)用包含第二聚合酶的第一洗涤组合物将去除的标记和该封闭部分从该拷贝多核苷酸链上洗去；以及(e)重复步骤(a)至(d)直至确定该模板多核苷酸链的至少部分序列为止。
在本文所述的一些实施方案中，多核苷酸测序方法包括：(a)将包含第一聚合酶和多个封闭的、标记的核苷酸的掺入组合物与模板多核苷酸链一起孵育，使得该聚合酶将该多个封闭的、标记的核苷酸之一掺入与该模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中；(b)识别掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸；(c)使掺入了该封闭的、标记的核苷酸的该拷贝多核苷酸链与包含第二聚合酶的第一洗涤组合物接触；(d)从掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分；(e)用第二洗涤组合物将去除的标记和该封闭部分从该拷贝多核苷酸链上洗去；以及(f)重复步骤(a)至(e)直至确定该模板多核苷酸链的至少部分序列为止。
第一聚合酶和第二聚合酶可以是相同的聚合酶或可以是不同的聚合酶。
第一洗涤组合物可包含多种核苷酸。核苷酸可包含封闭部分。核苷酸可包含可检测部分。第一洗涤组合物可被配置为防止第二聚合酶将核苷酸掺入拷贝多核苷酸链中。例如，第一洗涤组合物可基本上不含镁离子(Mg2+)。除了第一洗涤组合物基本上不含Mg2+之外，第一洗涤组合物可与掺入组合物基本上相同。
在本文所述的一些实施方案中，与测序设备一起使用的盒包括：(a)第一室，该第一室含有掺入组合物，该掺入组合物包含用于将封闭的、标记的核苷酸掺入与模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中的第一多种试剂；(b)第二室，该第二室含有用于识别掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸的检测组合物；(c)第三室，该第三室含有裂解组合物，该裂解组合物包含用于从掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分的第二多种试剂；以及(d)第四室，该第四室含有第一洗涤组合物，该第一洗涤组合物包含聚合酶和多种核苷酸，其中该第一洗涤组合物被配置为防止第二聚合酶将该多种核苷酸之一掺入该拷贝多核苷酸链中。
第一聚合酶和第二聚合酶可以是相同的聚合酶或可以是不同的聚合酶。
第一洗涤组合物可包含多种核苷酸。核苷酸可包含封闭部分。核苷酸可包含可检测部分。第一洗涤组合物可被配置为防止第二聚合酶将核苷酸掺入拷贝多核苷酸链中。例如，第一洗涤组合物可基本上不含镁离子(Mg2+)。除了第一洗涤组合物基本上不含Mg2+之外，第一洗涤组合物可与掺入组合物基本上相同。
该盒可包括含有第二洗涤组合物的第五室。第二洗涤组合物可基本上不含聚合酶和核苷酸。
在本文所述的一些实施方案中，与测序设备一起使用的试剂盒包括：(a)第一容器，该第一容器含有掺入组合物，该掺入组合物包含用于将封闭的、标记的核苷酸掺入与模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中的第一多种试剂；(b)第二容器，该第二容器含有用于识别掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸的检测组合物；(c)第三容器，该第三容器含有裂解组合物，该裂解组合物包含用于从掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分的第二多种试剂；以及(d)第四容器，该第四容器含有第一洗涤组合物，该第一洗涤组合物包含聚合酶和多种核苷酸，其中该第一洗涤组合物被配置为防止第二聚合酶将该多种核苷酸之一掺入该拷贝多核苷酸链中。
第一洗涤组合物可包含多种核苷酸。核苷酸可包含封闭部分。核苷酸可包含可检测部分。第一洗涤组合物可被配置为防止第二聚合酶将核苷酸掺入拷贝多核苷酸链中。例如，第一洗涤组合物可基本上不含镁离子(Mg2+)。除了第一洗涤组合物基本上不含Mg2+之外，第一洗涤组合物可与掺入组合物基本上相同。
该试剂盒可包括含有第二洗涤组合物的第五容器。第二洗涤组合物可基本上不含聚合酶和核苷酸。
该试剂盒可包括使用所述试剂盒的说明书。
在以下附图和说明书中阐述了一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求书，其他特征、对象和优点将显而易见。
应当理解，前述一般描述和以下详细描述两者都提出了本公开的主题的实施方案，并且旨在提供用于理解如所要求保护的本公开的主题的性质和特性的综述或框架。包括附图以提供对本公开的主题的进一步理解，并且附图并入本说明书中并构成本说明书的一部分。附图展示了本公开的主题的各个实施方案，并且与说明书一起用于解释本公开的主题的原理和操作。另外，附图和描述意在仅为说明性的并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可最好地理解本公开的具体实施方案的以下详细描述。
图1-图3是测序方法的一些步骤的示意图，展示了在各个步骤中使用的一些组合物。
图4是根据本文公开的各种实施方案的包括用于测序的组合物的盒的示意性俯视图。
图5是根据本文公开的各种实施方案的试剂盒的示意性侧视平面图，该试剂盒包括含有包含用于测序的组合物的容器。
图6是可根据本文呈现的教导采用的流动池的实施方案的示意性平面图。
图7A-图7C是来自掺入步骤(7A)之后、去封闭洗涤步骤(7B)之后以及包括含有聚合酶的第一洗涤组合物的模拟洗涤步骤(7C)之后的测序运行的图像。
图8是测序运行的误差率与循环的图，其中包括空白循环，如下文实施例中更详细地描述的。
图9是测序运行的误差率与循环的图，其中包括模拟掺入混合物步骤，如下文实施例中更详细地描述的。
图10是测序运行的误差率与循环的图，其中包括模拟掺入混合物步骤，如下文实施例中更详细地描述的。
图11是测序运行的定相百分比与循环的图，其中包括模拟掺入混合物步骤，如下文实施例中更详细地描述的。
图12是测序运行的定相百分比与循环的图，其中50个循环包括模拟掺入步骤，如下文实施例中更详细地描述的。
示意图未必按比例绘制。附图中使用的类似标号是指类似的部件、步骤等。然而，应当理解，在给定附图中使用数字来指代部件并非旨在限制在另一附图中用相同数字标记的部件。此外，使用不同的数字来指代部件并非旨在指示不同编号的部件不能与其他编号的部件相同或类似。
具体实施方式
现在将更详细地参考本公开的主题的各种实施方案，本公开的一些实施方案在附图中说明。
除非另有说明，否则本文使用的所有科学和技术术语具有本领域中常用的含义。本文提供的定义是为了便于理解本文经常使用的某些术语，并且并不意图限制本公开的范围。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“模板多核苷酸序列”包括具有两个或更多个此类“模板多核苷酸序列”的示例，除非上下文清楚地另外指出。
如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则术语“或”通常以包括“和/或”的含义被采用。术语“和/或”意指所列要素中的一个或全部，或所列要素中的任何两个或更多个的组合。在一些情况下，使用“和/或”并不暗示在其他情况下使用“或”可能不意味着“和/或”。
如本文所用，“具有(have/has/having)”、“包括/包含(include/includes/including/comprise/comprises/comprising)”等以它们的开放式包含性意义使用，并且通常意指“包括/包含但不限于(include,but not limited to/includes,but notlimited to或including,but not limited to)”。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、情况或组分可以发生或不发生，并且该描述包括其中该事件、情况或组分发生的实例以及其中它不发生的实例。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些益处的本公开的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的叙述并不意味着其他实施方案是无用的，并且不旨在将其他实施方案排除在本发明技术的范围之外。
另外，本文通过端点表述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。当值的范围“大于”、“小于”等特定值时，该值包括在该范围内。
除非另有明确说明，否则不旨在将本文中所阐述的任何方法解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在方法权利要求实际上没有叙述其步骤所遵循的顺序或者在权利要求或说明书中没有另外具体说明步骤被限制为特定顺序的情况下，绝不旨在推断任何特定顺序。然而，应当理解，所给出的顺序是可以执行该方法的顺序的一个实施方案。任一项权利要求中的任何所叙述的单个或多个特征或方面可以与任何其他一项或多项权利要求中的任何其他所叙述的特征或方面组合或置换。
虽然可以使用过渡短语“包括/包含”来公开特定实施方案的各种特征、元件或步骤，但是应当理解，隐含了替代实施方案，包括可以使用过渡短语“由...组成”或“基本上由...组成”来描述的那些实施方案。因此，例如，包括掺入步骤、检测步骤、脱保护步骤和一个或多个洗涤步骤的方法的隐含的替代实施方案包括其中该方法由列举的步骤组成的实施方案和其中该方法基本上由列举的步骤组成的实施方案。短语“基本上由...组成”意指属于制品、试剂盒、系统、方法等的一个或多个项目的列举列表以及不实质上影响制品、试剂盒、系统、方法等的基本和新型特性或性质的其他未列出的项目。
如本文中所用的术语“第一”、“第二”、“第三”等被用作它们之前的名词的标记，并且不隐含任何类型的排序(例如，空间的、时间的、逻辑的、数值的等)，除非这样的排序被另外明确地指示。例如，除非另外指明，否则“第二”特征不要求“第一”特征存在或者不要求“第一”特征在“第二”特征之前实施。
各种组分可被描述为“被配置为”为执行一个或多个任务。在这样的上下文中，“配置为”是对通常意指“具有在操作期间执行一个或多个任务的结构”的广义表述。因此，该组分可被配置为执行该任务，即使当该组分当前不执行该任务时(例如，被配置为防止聚合酶将核苷酸掺入拷贝链中的洗涤组合物可包含防止聚合酶掺入核苷酸的组分或可缺乏聚合酶掺入核苷酸所需的组分)。
如本文所用，在化合物、组合物、试剂盒、制品、系统等的上下文中“提供”意指制备该化合物、组合物、试剂盒、制品、系统等，购买该化合物、组合物、试剂盒、制品、系统等或以其他方式获得该化合物、组合物、试剂盒、制品、系统等。
除非另有说明，否则组合物中分子的浓度在本文中以重量百分比表示。
如本文所用，术语“聚合酶”是使用多核苷酸作为模板链产生多核苷酸的拷贝复制的酶。通常，DNA聚合酶结合到模板链并且然后沿模板链向下移动，将核苷酸依序添加到生长核酸链的3’端处的游离羟基。DNA聚合酶通常自DNA模板合成互补DNA分子并且RNA聚合酶通常自DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可以使用短RNA或DNA链(称为引物)来开始链生长。一些聚合酶可以使它们将碱基添加到链的位点上游的链移位。此类聚合酶称为链置换的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链置换活性的示例性聚合酶包括但不限于Bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))聚合酶、exo-Klenow聚合酶或测序级T7 exo-聚合酶的大片段。一些聚合酶使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换前方链(5’核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有使它们后面的链降解的活性(3’核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或以其他方式修饰以减少或消除3’和/或5’核酸外切酶活性。
如本文所用，术语“引物”和其派生词通常是指可与所关注靶序列杂交的任何多核苷酸。通常，引物用作底物，核苷酸可以通过聚合酶聚合到该底物上；然而，在一些实施方案中，引物可掺入合成的多核苷酸链中并提供另一引物可与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些实施方案中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。该术语仅是指分子的主要结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。如本文所用，“扩增的靶序列”和其派生词通常是指通过使用靶标特异性引物和本文提供的方法扩增靶序列而产生的多核苷酸序列。扩增的靶序列可为与靶序列相同的有义(即，正链)或反义(即，负链)。
用于所提供的方法的合适的核苷酸包括但不限于脱氧核苷酸三磷酸、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)和脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)。任选地，在所提供的方法中使用的核苷酸，无论是标记的还是未标记的，可以包括封闭部分，诸如抑制链延伸的可逆终止子部分。用于标记的核苷酸上的合适的标记包括但不限于半抗原、放射性核苷酸、酶、荧光标记、化学发光标记和显色剂。
多核苷酸通常将含有磷酸二酯键，但在一些情况下核酸类似物可具有交替的主链，包括例如磷酰胺(Beaucage等人，Tetrahedron 49(10):1925(1993)以及其中的参考文献；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970)；Sprinzl等人，Eur.J.Biochem.81:579(1977)；Letsinger等人，Nucl.Acids Res，14:3487(1986)；Sawai等人，Chem.Lett.805(1984),Letsinger等人，J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；以及Pauwels等人，Chemica Scripta26:141 91986))、硫代磷酸酯(Mag等人，Nucleic Acids Res.19:1437(1991)；和美国专利第5,644,048号)、二硫代磷酸酯(Briu等人，J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989))、O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,OxfordUniversity Press)以及肽核酸主链和键(参见Egholm,J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992)；Meier等人，Chem.Int.Ed.)。其他核酸类似物包括具有正主链的核酸类似物(Denpcy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097(1995)；非离子型主链(美国专利第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号和第4,469,863号；Kiedrowshi等人，Angew.Chem.Inti.Ed.English 30:423(1991)；Letsinger等人，J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；Letsinger等人，Nucleoside&Nucleotide 13:1597(1994)；第2章和第3章，ASCSymposium Series 580,“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”，编辑Y.S.Sanghui和P.Dan Cook；Mesmaeker等人，Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395(1994)；Jeffs等人，J.Biomolecular NMR 34:17(1994)；Tetrahedron Lett.37:743(1996))和非核糖主链，包括描述于以下中的非核糖主链：美国专利第5,235,033号和第5,034,506号，以及第6章和第7章，ASC Symposium Series 580,“CarbohydrateModifications in Antisense Research”，编辑Y.S.Sanghui和P.Dan Cook。含有一个或多个碳环糖的多核苷酸也包括在多核苷酸的定义内(参见Jenkins等人，Chem.Soc.Rev.(1995)第169-176页)。若干种多核苷酸类似物描述于Rawls,C&E News 1997年6月2日第35页中。所有这些参考文献在此明确地以引用方式并入。可进行核糖-磷酸主链的这些修饰以促进标记的添加，或增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
多核苷酸通常将含有以下四种核苷酸碱基的特定序列：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。当核酸是RNA时，尿嘧啶(U)也可例如作为胸腺嘧啶的天然替代物存在。尿嘧啶也可用于DNA。多核苷酸也可包括天然的或非天然的碱基。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸多核苷酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基。应当理解，本文所述方法或组合物中使用的脱氧核糖核酸多核苷酸可包括例如尿嘧啶碱基，并且核糖核酸可包括例如胸腺嘧啶碱基。可以包括在核酸中的示例性非天然碱基(无论其具有天然主链还是类似结构)包括但不限于肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基蝶呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤等。任选地，核酸中可包括异胞嘧啶和异鸟嘌呤以减少非特异性杂交，如美国专利第5,681,702号中一般性描述的，该美国专利以引用方式整体并入本文。
用于多核苷酸的非天然碱基可具有通用碱基配对活性，使得其能够与任何其他天然存在的碱基进行碱基配对。具有通用碱基配对活性的示例性碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。可使用的其他碱基包括与天然存在的碱基的子集(诸如肌苷，其与胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶碱基配对)具有碱基配对活性的那些。
将核苷酸掺入多核苷酸链中是指经由与核苷酸的5’磷酸基团形成磷酸二酯键来将核苷酸接合到多核苷酸链的游离的3’羟基基团。待测序的多核苷酸模板可以是DNA或RNA，或者甚至是包括脱氧核苷酸和核糖核苷酸的杂合分子。多核苷酸可以包括天然存在和/或非天然存在的核苷酸以及天然或非天然主链键。
定相和预定相是本领域技术人员已知的术语，并且用于描述在簇的序列拷贝的读出失去同步。定相和预定相导致特定循环的提取强度由来自当前循环的信号以及来自前一个和后一个循环的噪声组成。因此，如本文所用，术语“定相”是指边合成边测序(SBS)中的现象，其是由于聚合酶在给定的测序循环中将核苷酸不完全掺入簇内的多核苷酸链的某些部分而引起的，因此是簇内的单分子彼此松散同步的速率的量度。定相可以在每个循环的簇信号的检测期间被测量，并且可以被报告为来自簇的与该簇中的信号不同步的可检测信号的百分比。作为示例，在循环N期间通过“绿色”荧光团信号来检测簇。在随后的循环(循环N+1)中，在“红色”通道中检测到99.9％的簇信号，并且0.1％的信号保留在先前循环中并在“绿色”通道中检测到。此结果将表明发生了定相，并且可以报告为数值，诸如0.1的定相值，表明簇中0.1％的分子在每个循环中落后。
如本文所用，术语“预定相”是指SBS中在没有有效3’终止子的情况下掺入核苷酸而引起的一种现象，导致掺入事件提前1个循环。随着循环的数量增加，受到定相影响的每个簇的序列分数增加，妨碍对正确碱基的识别。预定相可通过测序仪器检测并报告为数值，诸如0.1的预定相值，表明簇中0.1％的分子在每个循环中向前运行。
定相和预定相的检测可以根据本领域已知的任何合适的方法进行和报告，例如，如在U.S.2012/0020537中描述的，其以引用方式整体并入。
本公开尤其描述了多核苷酸测序方法以及用于该测序方法的组合物、试剂盒、设备和设备部件或附件。这些方法和组合物、试剂盒、设备、部件或附件可允许较长的测序运行，这意味着可进行较多的测序循环直至先前掺入的核苷酸的身份不再能被可靠地确定为止。这些方法和组合物、试剂盒、设备、部件或附件可降低误差率。由其当不正确的核苷酸掺入拷贝链中时，或者当发生定相时，可能出现误差。
如全文所讨论的，提供了用于多核苷酸测序的改进方法。示例性测序方法在以下文献中有所描述，例如Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)；WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281以及US 2008/0108082，上述文献中的每一个均以引用方式并入本文。用于高通量或快速测序的一种有用方法是边合成边测序(SBS)。SBS技术包括但不限于基因组分析仪系统(加利福尼亚州圣地亚哥的因美纳公司(Illumina Inc.,San Diego,CA))和真正单分子测序(tSMS)TM系统(马萨诸塞州剑桥的Helicos生物科学公司(Helicos BioSciencesCorporation,Cambridge,MA))。简言之，许多通过合成反应的测序用于阐明靶序列内靶位置处的多个碱基的身份。所有这些反应都依赖于具有至少两个结构域的靶核酸序列(模板多核苷酸)的使用；测序引物将与其杂交的第一结构域，以及需要其序列信息的相邻的第二结构域。在形成测定络合物后，使用延伸酶(诸如聚合酶)将脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)添加到与第一结构域杂交的测序引物，并且读取dNTP的每次添加以确定所添加的dNTP的身份。这可以进行多次循环。SBS技术诸如基因组分析仪系统(加利福尼亚州圣地亚哥的因美纳公司)和真正单分子测序(tSMS)TM系统(马萨诸塞州剑桥的Helicos生物科学公司)利用标记的核苷酸来确定靶核酸分子的序列。靶核酸分子(模板多核苷酸)可以与引物杂交，并且在存在聚合酶和含有封闭基团的标记的核苷酸的情况下孵育。延伸引物使得核苷酸被掺入。封闭基团的存在仅允许一轮掺入，即，单个核苷酸的掺入。标记的存在允许识别掺入的核苷酸。可以在每个循环期间添加多个同质的单核苷酸碱基，诸如用于真正单分子测序(tSMS)TM系统(马萨诸塞州剑桥的Helicos生物科学公司)，或者可替代地，可以在每个循环期间同时添加所有四种核苷酸碱基，诸如用于基因组分析仪系统(加利福尼亚州圣地亚哥的因美纳公司)，特别是当每个碱基与可区分的标记结合时。在通过其对应的标记识别掺入的核苷酸后，可去除标记和封闭基团，从而允许进行随后的一轮掺入和识别。在一些实施方案中，确定添加的核苷酸碱基的身份包括将新添加的标记的碱基重复暴露于光源，该光源可由于添加特定核苷酸碱基(即，dATP、dCTP、dGTP或dTTP)而诱导可检测的发射。本文公开的方法和组合物特别适用于此类SBS技术。此外，本文所述的方法和组合物可特别用于核酸阵列的测序，其中可从阵列上的多个位置同时读取多个序列，因为每个位置处的每种核苷酸都可以根据其可识别的标记被识别。示例性方法描述于US2009/0088327；US2010/0028885；和US2009/0325172中，这些中的每一个以引用方式并入本文。
本文所述的多核苷酸序列方法包括掺入步骤，其中基于模板链的序列将封闭的标记的核苷酸掺入拷贝多核苷酸链中。在掺入步骤期间，将包含第一聚合酶和多个封闭的、标记的核苷酸的掺入组合物与模板多核苷酸链一起孵育，使得该第一聚合酶将该多个封闭的、标记的核苷酸之一掺入与该模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中。
多核苷酸测序方法还包括识别步骤，其中确定掺入拷贝多核苷酸链中的封闭的、标记的核苷酸的身份。该方法还包括去封闭步骤，其中从掺入拷贝多核苷酸链中的封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分。多核苷酸测序方法包括至少第一洗涤步骤，并且可任选地包括一个或多个另外的洗涤步骤，其中在引入用于下一步骤的包含试剂或组分的组合物之前，将来自先前步骤的试剂或组分从模板链和拷贝链洗去。优选地将模板链、拷贝链或模板链和拷贝链固定在固体载体上，使得模板链和拷贝链在洗涤步骤期间不被洗去。
在第一洗涤步骤中，将拷贝链和因此杂交的模板链与第一洗涤组合物一起孵育。第一洗涤组合物包含第二聚合酶。用于测序方法的洗涤组合物先前没有包含聚合酶，因为相对于洗涤组合物的其他组分，聚合酶通常是昂贵的，并且因为聚合酶不会被认为提供包含在洗涤组合物中的益处。然而，如本文所述，在第一洗涤组合物中包含第二聚合酶可减少去封闭步骤后的残留信号。在第一洗涤组合物中掺入第二聚合酶可改善其他测序度量，诸如减少定相、预定相、误差率和信号衰减中的一者或多者。在第一洗涤组合物中掺入第二聚合酶可允许减少序列循环时间而基本上不影响测序准确性。例如，可以减少掺入步骤的持续时间。
在不受理论束缚的情况下，据信第一(测序)聚合酶保留或接受在去封闭步骤期间裂解的可检测部分，并且包含第二聚合酶的第一洗涤组合物促进第一聚合酶的置换。如果包含第二聚合酶的第一洗涤组合物促进结合的第一聚合酶的去除，则在去封闭步骤之前或之后使用第一洗涤组合物可减少残留信号。
第一聚合酶可被识别步骤诱导的反应性氧物质破坏，该识别步骤使用能够产生这些反应性氧物质的光源。这种损伤可引起第一聚合酶在扫描步骤期间保持结合到模板链和/或拷贝链。受损结合的第一聚合酶可保留或接受在去封闭步骤期间裂解的可检测部分。第一洗涤步骤可促进受损第一结合聚合酶的置换。
在一些实施方案中，在测序循环中的去封闭步骤之后引入第一洗涤组合物。例如，可在去封闭步骤之后和掺入步骤之前引入第一洗涤组合物。
在一些实施方案中，在测序循环中的去封闭步骤之前引入第一洗涤组合物。例如，第一洗涤组合物可在识别步骤之后和去封闭步骤之前引入。第一洗涤组合物可在掺入步骤之后和识别步骤之前以及去封闭步骤之前引入。
第一洗涤组合物可包含任何合适的聚合酶。在一些实施方案中，第一洗涤组合物中的第二聚合酶与掺入步骤中使用的第一聚合酶相同。第二聚合酶可以不同于第一聚合酶。可开发第一聚合酶以在测序条件下基于模板链的序列将封闭的、标记的核苷酸快速且准确地掺入拷贝链中。第二聚合酶可以不需要如此精制。
在一些实施方案中，第一聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方案中，第二聚合酶是DNA聚合酶。
第二聚合酶可以任何合适的浓度存在于第一洗涤组合物中。例如，第二聚合酶可以10微克/毫升至150微克/毫升，诸如20微克/毫升至120微克/毫升、或30微克/毫升至100微克/毫升的浓度存在于第一洗涤组合物中。在一些实施方案中，第二聚合酶以掺入组合物中的第一聚合酶浓度的50％以内的浓度存在于第一洗涤组合物中。例如，第二聚合酶以掺入组合物中的第一聚合酶浓度的40％以内、掺入组合物中的第一聚合酶浓度的30％以内、掺入组合物中的第一聚合酶浓度的20％以内、或掺入组合物中的第一聚合酶浓度的10％以内的浓度存在于第一洗涤组合物中。
第一洗涤组合物可包含多种核苷酸。例如，该多种核苷酸可包括足以允许聚合酶将该多种核苷酸之一掺入拷贝链的核苷酸，而不管模板链的序列如何。例如，该多种核苷酸可包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP或它们的标记的衍生物、它们的封闭的衍生物或它们的标记的和封闭的衍生物。在一些实施方案中，第一洗涤组合物中的该多种核苷酸未被封闭或标记。在一些实施方案中，第一洗涤组合物中的该多种核苷酸被封闭。在一些实施方案中，第一洗涤组合物中的该多种核苷酸被标记。在一些实施方案中，第一洗涤组合物中的该多种核苷酸被封闭和标记。在一些实施方案中，第一洗涤组合物中的该多种核苷酸与掺入组合物中的该多种核苷酸相同。在一些实施方案中，第一洗涤组合物中的该多种核苷酸与掺入组合物中的该多种核苷酸不同。
该多种核苷酸可以任何合适的浓度存在于第一洗涤组合物中。例如，该多种核苷酸中的任何一种核苷酸可以0.5微摩尔至15微摩尔，诸如0.5微摩尔至10微摩尔、或1微摩尔至5微摩尔的浓度存在于第一洗涤组合物中。优选地，该多种核苷酸中的每一种核苷酸以与第一洗涤组合物中多种核苷酸中的另一种核苷酸的每一种基本上相同(例如，在10％以内)的浓度存在于第一洗涤组合物中。
在一些实施方案中，该多种核苷酸中的每一种核苷酸以掺入组合物中的该多种核苷酸中的每一种核苷酸浓度的50％以内的浓度存在于第一洗涤组合物中。例如，第二聚合酶以掺入组合物中的第一聚合酶浓度的40％以内、掺入组合物中的第一聚合酶浓度的30％以内、掺入组合物中的第一聚合酶浓度的20％以内、或掺入组合物中的第一聚合酶浓度的10％以内的浓度存在于第一洗涤组合物中。
优选地，该第一洗涤组合物被配置为防止该第二聚合酶将该多种核苷酸之一掺入拷贝多核苷酸链中。第一洗涤组合物可包含聚合酶抑制剂。可以修饰第二聚合酶，使得抑制或防止第二聚合酶活性将核苷酸掺入拷贝链的能力。第一洗涤组合物可缺乏或基本上缺乏聚合酶活性所需的组分。在一些实施方案中，第一洗涤组合物基本上不含Mg2+。如本文所用，“基本上不含Mg2+”意指第一组合物包含足够低浓度的Mg2+以抑制或防止第二聚合酶将核苷酸掺入拷贝链中。优选地，第一洗涤组合物不含Mg2+。第一洗涤组合物可包含微量的Mg2+。
第一洗涤组合物可包含扫描组合物的组分。因此，第一洗涤组合物可在识别步骤期间用作扫描组合物。第一洗涤组合物可包含抗氧化剂以保护模板链和拷贝链免受可在识别步骤期间由光诱导的损伤，或其他合适的扫描组合物组分。第一洗涤组合物可包含任何合适量的抗氧化剂。例如，第一洗涤组合物可包含一种或多种抗氧化剂，该一种或多种抗氧化剂的组合总抗氧化剂浓度为约2mM至约50mM，如约5mM至约40mM、或约15mM至约25mM、或约20mM。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸盐、香草乙酮和6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸(Trolox)。在一些优选的实施方案中，第一洗涤组合物包含抗坏血酸钠。
第一洗涤组合物可包含去封闭组合物的组分。因此，第一洗涤组合物可在去封闭步骤期间用作去封闭组合物。第一洗涤组合物可包含裂解剂，该裂解剂被配置为从封闭的、标记的核苷酸裂解或去除封闭部分和/或标记的部分。优选地，裂解剂去除封闭部分和标记的部分。可包含在第一洗涤组合物中的去封闭组合物的另外的组分以及关于裂解剂的其他细节在下文关于去封闭组合物进行讨论。
第一洗涤组合物可包含任何其他合适的组分。优选地，第一洗涤组合物包含与测序程序的后续步骤相容的缓冲液；例如，如果在掺入步骤之前使用，则掺入序列中的下一个封闭的、标记的核苷酸。
第一洗涤组合物可包含缓冲液，诸如Tris缓冲液。缓冲液可以任何合适的浓度存在。例如，缓冲液可以约5mM至约2M，诸如约10mm至约1.5M、或约50mM至约1M的浓度存在。在一些优选的实施方案中，第一洗涤组合物包含浓度为约75mM至约250mM，诸如约100mM至约200mM或约150mM的Tris缓冲液。
第一洗涤组合物可包含洗涤剂。第一洗涤组合物中可包含任何合适的洗涤剂。例如，第一洗涤组合物可包含阴离子、阳离子、两性离子或非离子洗涤剂。在一些优选的实施方案中，第一洗涤组合物包含非离子洗涤剂。合适的非离子洗涤剂的示例是Tween 20(可从赛默飞世尔科技公司获得(ThermoFischer Scientific))。洗涤剂可以任何合适的浓度存在于第一洗涤组合物中。例如，洗涤剂可以约0.01重量％至约0.5重量％，诸如约0.02重量％至约0.1重量％、或约0.03重量％至约0.07重量％存在于第一洗涤组合物中。在一些优选的实施方案中，第一洗涤组合物包含浓度为约0.03重量％至约0.07重量％或约0.5重量％的Tween 20。
第一洗涤组合物可包含螯合剂。第一洗涤组合物中可包含任何合适的螯合剂。例如，第一洗涤组合物可包含二羟乙基甘氨酸(HEG)或乙二胺四乙酸(EDTA)。螯合剂可以任何合适的浓度存在。例如，螯合剂可以约0.1mM至约50mM，诸如约0.5mM至约20mM的浓度存在于第一洗涤组合物中。在一些优选的实施方案中，第一洗涤组合物包含浓度为约5mM至约15mM，诸如约10mM的HEG。
第一洗涤组合物可包含盐。例如，第一洗涤组合物可包含氯化钠。盐可以任何合适的浓度存在于第一洗涤组合物中。例如，盐可以约10mM至约250mM，诸如约25mM至约100mM、约30mM至约70mM或约50mM的浓度存在。
现在参考图1-图3，示出了SBS方法中的一些步骤的概览。具体地，示出了在SBS方法的不同阶段使用的组合物。这些组合物包含在掺入步骤中使用的掺入组合物(Inc.)、在识别步骤中使用的扫描组合物(Scan)、在去封闭步骤中使用的去封闭组合物(De-Block)和在第一洗涤步骤中使用的第一洗涤组合物(1st wash)以及任选地在第二洗涤步骤中使用的第二洗涤组合物(2nd wash)。可以进行一个或多个另外的洗涤步骤(未示出)。第二洗涤组合物(2nd wash)和其他另外的洗涤组合物(如果使用的话)优选地不含聚合酶。第二洗涤组合物(2nd wash)和其他另外的洗涤组合物(如果使用的话)优选地不含核苷酸。
如图1和图2中的虚线椭圆所示，第一洗涤(1st wash)组合物可包含去封闭组合物(De-Block)的一种或多种组分。因此，第一洗涤(1st wash)组合物可用于去封闭步骤。
如图3中的虚线椭圆所示，第一洗涤(1st wash)组合物可包含扫描组合物(Scan)的一种或多种组分。因此，第一洗涤(1st wash)组合物可用于识别步骤。
应当理解，可以将洗涤组合物与模板链和拷贝链一起孵育一段时间，而不是使第一洗涤组合物连续流过模板链和拷贝多核苷酸链。当然，洗涤组合物可连续流过模板链和拷贝多核苷酸链。
掺入组合物(Inc.)包含多个封闭的、标记的核苷酸，并且可包含第一聚合酶。在掺入步骤中，将封闭的、标记的核苷酸与模板链和第一聚合酶一起孵育，以基于模板链的序列将合适的核苷酸掺入拷贝链中。
掺入组合物中的封闭的、标记的核苷酸包含封闭部分和标记的部分。在一些实施方案中，封闭部分可以是标记的部分。封闭部分、标记的部分、或封闭部分和标记的部分分子可通过任何合适的接头与核苷酸连接。接头可包括一个或多个可裂解基团，包括但不限于二硫化物基团、二醇基团、重氮基团、酯基团、砜叠氮化物基团、烯丙基和甲硅烷基醚基团、叠氮化物基团和烷氧基基团。在优选的实施方案中，接头包括叠氮化物基团、烷氧基基团和二硫化物基团中的一者或多者作为接头。可以多种方式将二硫键掺入接头中，例如如美国专利第7,771,973号中所述或如Hermanson,Bioconjugate Techniques，第二版，Academic Press(以引用方式整体并入本文)中所述。
更通常地，合适的接头包括但不限于二硫化物接头、酸不稳定接头(包括二烷氧基苄基接头、Sieber接头、吲哚接头和叔丁基Sieber接头)、亲电可裂解接头、亲核可裂解接头、光可裂解接头、还原条件下的裂解、氧化条件下的裂解、通过使用安全捕获接头的裂解以及通过消除机制的裂解。
可以使用任何合适的亲电可裂解接头。亲电可裂解接头通常被质子裂解并且包括对酸敏感的裂解。合适的亲电可裂解接头包括改性的苄基系统，诸如三苯甲基、对烷氧基苄基酯和对烷氧基苄基酰胺。其他合适的亲电可裂解接头包括叔丁氧羰基(Boc)基团和缩醛系统。
也可考虑在硫缩醛或其他含硫保护基团的裂解中使用亲硫金属诸如镍、银或汞来制备合适的亲电可裂解接头分子。
可使用任何合适的亲核裂解接头。亲核裂解是制备接头分子的公认方法。可使用在水中不稳定(即，可在碱性pH下简单地裂解)的基团诸如酯和对非水亲核试剂不稳定的基团。氟离子可用于裂解基团中的硅-氧键，诸如三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)。
可使用任何合适的光可裂解接头。光可裂解接头已广泛用于碳水化合物化学中。优选的是，激活裂解所需的光不影响经修饰的核苷酸的其他组分。例如，如果使用荧光团作为标记，则优选的是如果此荧光团吸收与裂解接头分子所需的波长不同的波长的光。合适的接头包括基于O-硝基苄基化合物和硝基藜芦基化合物的接头。也可使用基于苯偶姻化学的接头(Lee等人，J.Org.Chem.64:3454-3460,1999)。
可使用在还原条件下裂解的任何合适的接头。已知许多接头对还原裂解敏感。例如，使用基于钯的催化剂的催化氢化已经用于裂解苄基和苄氧基羰基基团。进一步举例来说，二硫键还原也是本领域已知的。
可使用在氧化条件下裂解的任何合适的接头。基于氧化的方法是本领域公知的。这些包括对-烷氧基苄基基团的氧化以及硫接头和硒接头的氧化。使用碘水溶液裂解二硫化物和其他基于硫或硒的接头也在本发明的范围内。
可使用任何合适的安全捕获接头。安全捕获接头是在两个步骤中裂解的接头。在优选的系统中，第一步骤是产生反应性亲核中心，随后是涉及引起裂解的分子内环化的第二步骤。例如，可用肼或光化学处理乙酰丙酸酯键以释放活性胺，然后可将该活性胺环化以在分子中的别处裂解酯(Burgess等人，J.Org.Chem.62:5165-5168,1997)。
可使用可通过消除机制裂解的任何合适的接头。例如，可使用诸如Fmoc和氰基乙基等基团的碱催化消除，以及烯丙基系统的钯催化还原消除。
除了裂解位点之外，接头还可包括一个或多个间隔子。间隔子将例如核苷酸碱基与裂解位点或标记或封闭部分隔开。接头的长度通常不重要，只要核苷酸可在封闭部分被裂解后通过链延伸酶掺入拷贝链中即可。
可使用的合适的接头、核苷酸、封闭部分的示例描述于美国专利第7,541,444号；WO 03/048387；US2013/0079232A1；和美国专利第7,414,116号中，这些中的每一个在不与本公开冲突的程度上特此以其相应整体并入本文。特别优选的接头是含有膦可裂解的叠氮化物的接头。标记的部分可包含荧光团。
本领域技术人员将理解如何将合适的封闭基团连接到核苷酸的核糖环以阻断与3’-OH的相互作用。封闭基团可直接连接在3’位置或可连接在2’位置(封闭基团具有足够的大小或电荷以阻断3’位置的相互作用)。可替代地，封闭基团可连接在3’位置和2’位置处，并且可被裂解以暴露3’OH基团。
合适的封闭基团对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以由以下中公开的任何合适的保护基团形成：“Protective Groups in Organic Synthesis”,T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，Wiley Interscience,New York，其在不与本公开冲突的程度上以引用方式整体并入本文。封闭基团优选地是可去除的(或可改性的)以产生3’OH基团。用于获得3’OH基团的方法可以是任何合适的化学或酶促反应。
封闭部分可以如美国专利第7,414,116号中所述，该美国专利在不与本公开冲突的程度上以引用方式整体并入本文。
当测序循环包括含有第一洗涤组合物的洗涤步骤时，可减少掺入步骤的持续时间。相对于基本上类似的测序循环中的掺入步骤的持续时间，该掺入步骤的持续时间可减少10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、或50％或更多，该基本上类似的测序循环不包括含有第一洗涤组合物的洗涤步骤。可以减少掺入步骤的持续时间，同时实现相同或基本上类似的测序准确性。例如，掺入步骤可从没有包括第一洗涤组合物的洗涤步骤的25秒减少到具有包括第一洗涤组合物的洗涤步骤的10秒。在一些实施方案中，掺入步骤可以是20秒或更短时间、15秒或更短时间、10秒或更短时间、或5秒或更短时间。
在掺入步骤之后，可以使用洗涤组合物(未示出)洗去未掺入的封闭的、标记的核苷酸，并且可以确定掺入拷贝链中的核苷酸的身份。在检测掺入的封闭的、标记的核苷酸的身份期间，存在扫描组合物(Scan)。扫描组合物可包含抗氧化剂以保护模板链和拷贝链免受可在检测步骤期间由光诱导的损伤。参见例如美国专利第9,115,353号和第9,217,178号，这些美国专利在不与本公开冲突的程度上特此以引用方式以其相应整体并入本文。通用洗涤组合物(未示出)可用于在引入扫描组合物之前洗去未掺入的封闭的、标记的核苷酸，第一洗涤组合物(1st wash)可用于在引入扫描组合物之前洗去未掺入的封闭的、标记的核苷酸(例如，如图3中所示)，或者引入扫描组合物(Scan)可用于洗去未掺入的封闭的、标记的核苷酸。
在识别步骤之后，可将模板多核苷酸链和拷贝多核苷酸链与第一洗涤组合物一起孵育(1st wash)，如图2中所示。无论第一洗涤步骤是否发生在扫描步骤之后，封闭部分和标记的部分都可以通过引入去封闭组合物(De-Block)而从掺入拷贝链中的核苷酸中去除。去封闭组合物(De-Block)可包含裂解剂。优选地，裂解剂去除封闭部分和标记的部分。例如，标记的部分可用作封闭部分，标记的部分可在封闭部分上，标记的部分可通过与封闭部分相同的接头连接到核苷酸等。
在一些实施方案中，封闭部分被化学去除。出于本公开的目的，封闭部分的“化学”去除涉及裂解剂与封闭的核苷酸之间的化学反应，以引起封闭部分从核苷酸中去除。优选地，当封闭部分和标记的部分是分开的部分时，封闭部分和标记的部分都通过相同的方法裂解。例如，封闭部分和标记的部分可以通过相同或类似的连接基团结合到核苷酸，这些连接基团可以通过相同的试剂或条件裂解或去除。这将使得去封闭和去标记方法更有效，因为将仅需要单一处理来去除标记和封闭两者。封闭部分和标记的部分当然可以在完全不同的化学条件下裂解，并且去封闭组合物可以包含用于去除标记的部分的单独的裂解剂。
去封闭组合物可包含任何合适的裂解剂。裂解剂可取决于存在的裂解基团。例如，二硫键或其他还原性裂解基团的裂解可通过还原剂完成。二硫键的还原导致所连接的分子从核苷酸中释放出来。可用于实践如本文所述的实施方案的还原剂包括但不限于膦化合物、水溶性膦、含氮膦以及其盐和衍生物、二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖醇(DTT)(分别为2,3-二羟基-1,4-二硫醇丁烷的顺式异构体和反式异构体)、2-巯基乙醇或β-巯基乙醇(BME)、2-巯基乙醇或氨基乙硫醇、谷胱甘肽、巯基乙醇酸盐或巯基乙酸、2,3-二巯基丙醇和三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟甲基)膦(THP)以及β-[三(羟甲基)膦]丙酸(THPP)。在一些实施方案中，用于裂解如本文所述的接头中的二硫键的还原剂是DTT。在一些实施方案中，用于裂解二硫键的还原剂(例如DTT)的浓度为至少1mM至1000mM、至少20mM至800mM、至少40mM至500mM以及优选地至少50mM至200mM。
在一些实施方案中，用于裂解接头或包含烯丙基基团或叠氮基基团的可裂解接头中的二硫键的还原剂是膦试剂、水溶性膦试剂、含氮膦试剂以及其盐和衍生物。示例性膦试剂包括但不限于三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟丙基)膦(THP)、三(羟甲基)膦(TMP)和美国专利公开2009/0325172(以引用方式整体并入本文)中公开的那些，诸如三芳基膦、三烷基膦、含磺酸酯和含羧酸酯的膦以及衍生的水溶性膦。可用作裂解剂的其他膦包括美国专利第7,414,116号中所述的膦，该美国专利在不与本公开冲突的程度上以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，所用膦的浓度为约0.5mM至约500mM，诸如约5mM至约50mM，以及优选地约10mM至约40mM。如本文所述的方法和组合物不受任何特定裂解基团限制，并且替代方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的并被认为在本公开的范围内。
在去封闭步骤之后，用洗涤组合物，诸如图1中所示的第一洗涤组合物(1st Wash)或图2-图3中所示的第二洗涤组合物(2nd Wash)洗去所去除的封闭部分和裂解剂，并且可以重复该方法。在去封闭步骤之后使用的至少一种洗涤组合物(例如，第一洗涤组合物或第二洗涤组合物)可包含清除剂，如上文关于第一洗涤组合物所述。
在去封闭步骤之后使用第二洗涤组合物的一些实施方案中，第二洗涤组合物和扫描组合物可以是相同的。例如，如美国专利公开第2020/0190569A1号中所述的“ScavScan”组合物可用作Scan组合物和第二洗涤组合物。这种组合物可包含抗氧化剂以减少扫描步骤期间潜在的光致损伤，和清除剂以与去封闭步骤中或由去封闭步骤产生的反应性化合物相互作用。
可采用通用洗涤组合物、第二洗涤组合物或另一种合适的洗涤组合物的另外的洗涤步骤可在图1-图3所示的任何步骤之间采用。
在一些实施方案中，与测序设备(诸如测序仪器)一起使用的盒可包括室，一种或多种组合物可从该室抽出或排出以用于测序。例如并参考图4，示出了包括多个室110、120、130、140、150、160的盒100。盒100可包括用于将室110、120、130、140、150、160可操作地联接到测序仪器的流体联接端口、阀等。每个室110、120、130、140、150、160可含有单一组合物。室110、120、130、140、150、160中的组合物在室温或测序仪器的环境操作温度下可以是流体组合物。优选地，盒100和测序仪器被配置为使得测序仪器可以从盒100的每个室110、120、130、140、150、160选择性地抽出或排出组合物。
包含用于将封闭的、标记的核苷酸掺入与模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中的试剂的掺入组合物(例如，如图1-图3中所示和上文关于图1-图3讨论的Inc.组合物)可安置在第一室110中。第一室110中的掺入组合物可包含多个封闭的、标记的核苷酸。第一室110中的掺入组合物可包含第一聚合酶。
用于识别掺入拷贝多核苷酸链中的封闭的、标记的核苷酸的步骤中的检测组合物(例如，如图1-图3中所示和上文关于图1-图3讨论的Scan组合物)可安置在第二室120中。安置在第二室120中的检测组合物可包含抗氧化剂。
可将包含一种或多种试剂的裂解组合物安置在第三室130中，该一种或多种试剂用于从掺入拷贝链中的封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分(例如，如图1-图3中所示和上文关于图1-图3讨论的De-Block组合物)。第三室130中的裂解组合物可包含裂解剂。
用于洗涤来自测序循环中先前步骤的试剂或组分的第一洗涤组合物(例如，如图1-图3中所示和上文关于图1-图3讨论的1st Wash组合物)可安置在第四室140中。第四室140中的第一洗涤组合物可包含第二聚合酶。第一洗涤组合物可包含多种核苷酸。核苷酸可以被封闭、标记或封闭和标记。第一洗涤组合物可被配置为防止第二聚合酶将多种核苷酸之一掺入拷贝多核苷酸链中。第一洗涤组合物可基本上不含Mg2+或不含Mg2+。
用于洗涤来自测序循环中先前步骤的试剂或组分的第二洗涤组合物(例如，如图2-图3中所示和上文关于图2-图3讨论的2nd Wash组合物)可安置在第五室150中。第五室140中的第二洗涤组合物优选地不含聚合酶和核苷酸。第二洗涤组合物可包含清除剂。在一些实施方案中，第二洗涤组合物可包含抗氧化剂并且也可用作检测组合物。
通用洗涤组合物可安置在第六室160中。通用洗涤组合物可用于在通过测序仪器进行测序方法中可能需要或期望的任何另外的洗涤步骤。
图4中所示的盒100可包括任何合适数量的室110、120、130、140、150、160，这些室可含有任何合适的组合物。应当理解，盒可以包括比图4中所描绘的更多或更少的室，并且上文关于图4描述的组合物仅仅是可以容纳在盒的室中的组合物的示例。
在一些实施方案中，与测序设备(诸如测序仪器)一起使用的试剂盒可包括容器，一种或多种组合物可从这些容器取出或排出以用于测序。例如并参考图5，示出了包括多个容器191、192、193、194、195、196的试剂盒190。每个容器191、192、193、194、195、196可含有单一组合物。这些组合物在室温或测序设备的环境操作温度下可以是流体组合物。容器191、192、193、194、195、196可被配置为与测序设备流体联接，使得容器191、192、193、194、195、196中的组合物可被测序设备抽出或排出。
容器191可含有如上所述的掺入组合物。容器192可含有如上所述的检测组合物。容器193可含有如上所述的裂解组合物。容器194可含有如上所述的第一洗涤组合物。容器195可含有如上所述的第二洗涤组合物。容器196可含有如上所述的通用洗涤组合物。
该试剂盒可包括使用该试剂盒的说明书。例如，试剂盒可包括用于使用容器中的一个或多个容器的说明书，诸如当在测序反应中使用容器中的组合物时，如何将容器可操作地联接到测序设备，如何用容器的内容物填充盒的室等。
图5中所示的试剂盒190可包括任何合适数量的容器191、192、193、194、195、196，这些容器可含有任何合适的组合物。应当理解，试剂盒可以包括比图5中所描绘的更多或更少的容器，并且上文关于图5描述的组合物仅仅是可以容纳在试剂盒的容器中的组合物的示例。
本文所述的测序方法可使用任何合适的设备以任何合适的方式进行。在一些实施方案中，测序方法使用其上固定有多个模板多核苷酸链的固体载体。如本文所用的术语固定旨在涵盖经由共价键或非共价键直接或间接连接到固体载体。在特定实施方案中，全部所需的是多核苷酸在旨在使用载体的条件下(例如，在需要核酸扩增和/或测序的应用中)保持固定或连接到载体。例如，寡核苷酸或引物可被固定，使得3’端可用于酶促延伸和/或序列的至少一部分能够与互补序列杂交。固定可经由与表面连接的引物杂交而发生，在这种情况下，固定化引物或寡核苷酸可处于3’-5’取向。可替代地，固定可通过非碱基配对杂交(诸如共价连接)发生。
举例来说，多核苷酸可以通过与引物贴片(patch)中的一个或多个引物杂交或退火而连接到表面。杂交可以例如通过将衔接子连接到模板多核苷酸的端部来完成。衔接子的核酸序列可以与引物的核酸序列互补，因此允许衔接子与表面上的引物结合或杂交。任选地，多核苷酸可以是单链或双链的，并且衔接子可以被添加到多核苷酸的5’端和/或3’端。任选地，多核苷酸可以是双链的，并且衔接子可以连接到双链多核苷酸的3’端上。任选地，多核苷酸可以在没有任何衔接子的情况下使用。在一些实施方案中，模板多核苷酸可通过除与互补引物杂交之外的相互作用连接到表面。例如，多核苷酸可使用化学键(诸如由点击化学或受体-配体相互作用诸如链霉亲和素-生物素结合产生的化学键)共价连接到表面。
引物寡核苷酸、寡核苷酸引物和引物自始至终可互换使用，并且是具有能够与待扩增或测序的一个或多个多核苷酸模板特异性退火的序列的多核苷酸。通常，引物寡核苷酸是单链的或部分单链的。引物还可以含有非天然碱基、非核苷酸化学修饰或非天然主链连接的混合物，只要非天然实体不干扰引物的功能。任选地，固体载体的表面上的引物贴片可包含一种或多种不同的多个引物分子。举例来说，贴片可包含第一、第二、第三、第四或多种多个引物分子，每种多个引物分子具有不同序列。应当理解，对于在单个贴片中具有不同的多个引物的实施方案，不同的多个引物可以共享共同的序列，只要不同的多个引物的至少一部分之间存在序列差异。例如，第一多个引物可以与第二多个引物共享序列，只要一种多个引物中的引物具有在其他多个引物中未发现的不同序列。
模板多核苷酸可以在固体载体的表面上扩增。多核苷酸扩增包括通过产生多核苷酸模板和/或其互补物的一个或多个拷贝来扩增或增加存在的该模板和/或其互补物的数目的过程。扩增可通过多种已知方法在包括但不限于热循环扩增或等温扩增的条件下进行。例如，用于进行扩增的方法描述于美国公开第2009/0226975号、WO 98/44151、WO 00/18957、WO 02/46456、WO 06/064199和WO 07/010251中，这些以引用方式整体并入本文。简言之，在所提供的方法中，扩增可发生在多核苷酸分子所连接的表面上。这种类型的扩增可以称为固相扩增，当该扩增用于指代多核苷酸时，指的是在表面(例如，固体载体)上进行或与表面相关的任何多核苷酸扩增反应。通常，扩增产物的全部或一部分通过固定化引物的延伸来合成。固相扩增反应类似于标准溶液相扩增，除了扩增引物中的至少一种扩增引物被固定在表面(例如，固体载体)上。
合适的条件包括提供用于扩增多核苷酸的合适缓冲液/溶液。此类溶液包含，例如具有聚合酶活性的酶、三磷酸核苷酸和任选地添加剂诸如DMSO或甜菜碱。任选地，在存在如美国专利第7,485,428号中所述的重组酶试剂的情况下进行扩增，该美国专利以引用方式整体并入本文，该重组酶试剂允许在没有热解链的情况下扩增。简言之，在存在例如ATP、dATP、ddATP、UTP或ATPγS的情况下，重组酶试剂诸如来自大肠杆菌(E.coli)的RecA蛋白(或来自其他门的RecA亲属)将在单链DNA周围形成核蛋白丝(例如引物)。当此络合物与同源序列接触时，重组酶试剂将催化链侵入反应以及引物与靶DNA同源链的配对。原始配对链通过链侵入而被置换，在该区域中留下单链DNA泡，其用作扩增的模板。
固相扩增可包括多核苷酸扩增反应，该多核苷酸扩增反应仅包含一种固定到表面的寡核苷酸引物。可替代地，该表面可包含多种第一和第二不同的固定化寡核苷酸引物物质。固相核酸扩增反应通常包括两种不同类型的核酸扩增(界面扩增和表面(或桥)扩增)中的至少一种。例如，在界面扩增中，固体载体包含通过与固定化寡核苷酸引物杂交而间接固定到固体载体的模板多核苷酸，固定化引物可以在聚合酶催化的、模板引导的延伸反应(例如引物延伸)过程中延伸，以产生保持连接到固体载体的固定化多核苷酸。在延伸阶段后，多核苷酸(例如，模板和其互补产物)被变性，使得模板多核苷酸释放到溶液中并可用于与另一固定化寡核苷酸引物杂交。模板多核苷酸可以在1、2、3、4、5或更多轮引物延伸中获得，或者可以在1、2、3、4、5或更多轮引物延伸后从反应中洗出。
在表面(或桥)扩增中，固定化多核苷酸与固定化寡核苷酸引物杂交。固定化多核苷酸的3’端为从固定化寡核苷酸引物延伸的聚合酶催化的、模板引导的延伸反应(例如，引物延伸)提供模板。所得双链产物“桥连”两种引物，并且两条链都共价连接到载体。在下一个循环中，在产生固定到固体载体的一对单链(固定化模板和延伸的引物产物)的变性之后，两条固定化链都可以用作新引物延伸的模板。
扩增可用于产生固定化多核苷酸的集落。例如，这些方法可以产生多核苷酸集落的成簇阵列，类似于美国专利第7,115,400号、美国公开第2005/0100900号、WO 00/18957和WO 98/44151(这些以引用方式整体并入本文)中描述的成簇阵列。“簇”和“集落”可互换使用，并且是指连接到表面的具有相同序列和/或其互补物的多核苷酸的多个拷贝。通常，簇包含具有相同序列和/或其互补物的多核苷酸的多个拷贝，该多核苷酸的多个拷贝通过其5’端连接到表面。构成簇的核酸链的拷贝多核苷酸可为单链或双链形式。
因此，该多个模板多核苷酸可以在簇中，每个簇含有具有相同序列的模板多核苷酸。可以对多个簇进行测序，每个簇包含具有相同序列的多核苷酸。任选地，第一簇中的多核苷酸的序列不同于第二簇的核酸分子的序列。任选地，通过使模板多核苷酸退火到固体表面上的引物并在形成包含具有相同序列的多个模板多核苷酸的簇的条件下扩增模板多核苷酸来形成簇。扩增可以是热的或等温的。
每个集落可包含具有相同序列的多核苷酸。在特定实施方案中，一个集落的多核苷酸序列不同于另一个集落的多核苷酸序列。因此，每个集落包含具有不同核酸序列的多核苷酸。集落中所有固定的多核苷酸通常通过扩增相同的多核苷酸产生。在一些实施方案中，固定化多核苷酸的集落可能含有一种或多种没有固定化多核苷酸的引物，当另外施加含有游离或未结合的多核苷酸的溶液时，具有不同序列的另一种多核苷酸可与该一种或多种引物结合。然而，由于集落中缺乏足够数目的游离引物，此第二或侵入多核苷酸可能不扩增到显著数目。第二或侵入多核苷酸通常小于单个菌落中多核苷酸总群体的1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.001％或0.0001％。因此，第二或侵入多核苷酸可以不被光学检测到，或者第二或侵入多核苷酸的检测被认为是背景噪音或不干扰集落中原始的、固定化多核苷酸的检测。在此类实施方案中，根据用于检测集落的方法或设备的分辨率，集落将是明显同质或均一的。
根据所用的条件，簇可具有不同的形状、大小和密度。例如，簇可具有基本上圆形、多边形、圆环形或环形的形状。簇的直径或最大横截面可以为约0.2μm至约6μm、约0.3μm至约4μm、约0.4μm至约3μm、约0.5μm至约2μm、约0.75μm至约1.5μm或任何介于其间的直径。任选地，簇的直径或最大横截面可以为至少约0.5μm、至少约1μm、至少约1.5μm、至少约2μm、至少约2.5μm、至少约3μm、至少约4μm、至少约5μm或至少约6μm。簇的直径可受到多个参数的影响，包括但不限于产生簇时进行的扩增循环数目、多核苷酸模板的长度、多核苷酸模板的GC含量、引物所连接的贴片的形状或连接到其上形成有簇的表面的引物的密度。然而，如上文所讨论的，在所有情况下，簇的直径可以不大于在其上形成有簇的贴片的直径。例如，如果贴片是珠粒，则簇大小将不大于珠粒的表面积。簇的密度可以在至少约0.1/mm2、至少约1/mm2、至少约10/mm2、至少约100/mm2、至少约1,000/mm2、至少约10,000/mm2至至少约100,000/mm2的范围内。任选地，簇具的密度为例如100,000/mm2至1,000,000/mm2或1,000,000/mm2至10,000,000/mm2。本文提供的方法可产生大小大致相等的集落。这不考虑具有不同序列的多核苷酸的扩增效率的差异而发生。
例如，可使用合适的成像装置，诸如共焦成像装置或电荷耦合装置(CCD)或CMOS相机检测簇。示例性成像装置包括但不限于在美国专利第7,329,860号、第5,754,291号和第5,981,956号以及WO 2007/123744中描述的成像装置，这些美国专利中的每一个以引用方式整体并入本文。成像设备可以用于确定表面上的一个或多个簇中的参考位置，诸如一个或多个簇的定位、边界、直径、面积、形状、重叠和/或中心(和/或源自其的可检测信号)。这种参考位置可以被记录、记载、注释、转换成可解释的信号等，以产生有意义的信息。
如本文所用，术语载体是指用于连接多核苷酸的基材。载体是具有刚性或半刚性表面的材料，多核苷酸可以连接到其上或者可以在其上合成和/或修饰核酸。载体可包括任何树脂、凝胶、珠粒、孔、柱、芯片、流动池、膜、基质、板、过滤器、玻璃、可控孔度玻璃(CPG)、聚合物载体、膜、纸、塑料、塑料管或片剂、塑料珠粒、玻璃珠粒、载玻片、陶瓷、硅芯片、多孔板、尼龙膜、光纤和PVDF膜。
载体可以包括任何平坦的晶片样基材和具有孔的平坦基材，诸如微量滴定板，包括96孔板。示例性平坦基材包括芯片、载玻片、蚀刻基材、微量滴定板和流动池反应器，包括具有多个微流体通道的多泳道流动池反应器，诸如在cBot测序工作站(加利福尼亚州圣地亚哥的因美纳公司)中使用的八通道流动池。示例性流动池描述于WO 2007/123744中，其以引用方式整体并入本文。任选地，流动池是图案化的流动池。合适的图案化流动池包括但不限于在WO 2008/157640(以引用方式整体并入本文)中描述的流动池。
载体还可以包括珠粒，包括磁珠、空心珠和实心珠。珠粒可以与平面载体结合使用，此类平面载体任选地还含有孔。珠粒或可替代地微球通常指由刚性或半刚性材料制成的小主体。该主体可具有例如以球形、椭圆形、微球形或其他公认的颗粒形状为特征的形状，无论是具有规则的尺寸还是不规则的尺寸。具体地，珠粒的大小包括但不限于直径约1μm、约2μm、约3μm、约5μm、约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约60μm、约100μm、约150μm或约200μm。可以与本文针对珠粒和微球描述的方式类似的方式使用其他颗粒。
载体的组成可以根据例如形式、化学和/或连接方法和/或核酸合成方法而变化。根据本公开可使用的载体材料包括但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、尼龙、金属和其他合适的材料。示例性组合物包含在多肽、多核苷酸和/或有机部分合成中使用的载体和赋予其的化学官能团。此类组合物包含例如塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交联葡聚糖(诸如SepharoseTM、纤维素、尼龙、交联胶束和TeflonTM)以及可以在例如印第安纳州费希尔斯的Bangs实验室(Bangs Laboratories,Fishers IN)的“Microsphere Detection Guide”(以引用方式并入本文)中找到描述的任何其他材料。载体颗粒可以由交联淀粉、葡聚糖、纤维素、蛋白质、有机聚合物包括苯乙烯聚合物(包括聚苯乙烯和甲基苯乙烯以及其他苯乙烯共聚物)、塑料、玻璃、陶瓷、丙烯酸聚合物、磁响应材料、胶体、钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、尼龙、乳胶或制成。来自印第安纳州费希尔斯的Bangs实验室的“MicrosphereDetection Guide”(特此以引用方式整体并入)是有帮助的指南。在本公开范围内的另外的示例性载体包括，例如在美国申请公开第02/0102578号和美国专利第6,429,027号中描述的载体，这两篇文献以引用方式整体并入本文。
例如并参考图6，示出了固体载体200诸如流动池的实施方案。固体载体200具有表面210，簇300相对于固体载体210的表面210固定到该表面，这些簇含有具有相同核苷酸序列的多个模板多核苷酸链。固体载体200的表面210可以是平面的。
含有试剂、洗涤缓冲液等的流体组合物可以流过固体载体200的表面210以与簇300中的模板多核苷酸相互作用。组合物的流动可以在任何方向上发生，例如图6中箭头所示的方向。
可与流动池300一起使用的测序设备可被配置为使包含试剂或洗液的组合物流过表面210以与簇300中的模板链相互作用。例如，该设备可使聚合酶、测序引物、核苷酸、洗涤组合物、裂解剂等流过固体载体200(诸如流动池)的表面210，在合适的时间与簇300中的模板多核苷酸相互作用，以进行模板链的测序。
每个簇300可以含有与另一个簇300相同的模板多核苷酸或不同的多核苷酸。
待测序的模板多核苷酸可以使用已知的常规方法由任何生物样品获得。合适的生物样品包括但不限于血液样品、活检样本、组织外植体、器官培养物、生物流体或任何其他组织或细胞制剂、或它们的级分或衍生物或从其分离的级分或衍生物。生物样品可以是原代细胞培养物或培养物适应细胞系，包括但不限于可含有染色体整合或附加型重组核酸序列的基因工程化细胞系、永生化或可永生化细胞系、体细胞杂交细胞系、分化或可分化细胞系、转化细胞系、干细胞、生殖细胞(例如精子、卵母细胞)、转化细胞系等。例如，多核苷酸分子可以从原代细胞、细胞系、新鲜分离的细胞或组织、冷冻的细胞或组织、石蜡包埋的细胞或组织、固定的细胞或组织和/或激光解剖的细胞或组织获得。生物样品可以从任何受试者或生物来源获得，包括例如人类或非人类动物，包括哺乳动物和非哺乳动物、脊椎动物和无脊椎动物，并且还可以是任何多细胞生物体或单细胞生物体，诸如真核生物体(包括植物和藻类)或原核生物体、古细菌、微生物(例如细菌、古细菌、真菌、原生生物、病毒)和水生浮游生物。
一旦获得多核苷酸，可使用多种可用且已知的标准技术制备用于所提供方法的具有不同序列的多种多核苷酸分子。多核苷酸分子制备的示例性方法包括但不限于以下中描述的方法：Bentley等人，Nature 456:49-51(2008)；美国专利第7,115,400号；以及美国专利申请公开第2007/0128624号；第2009/0226975号；第2005/0100900号；第2005/0059048号；第2007/0110638号和第2007/0128624号，这些文献中的每一个以引用方式整体并入本文。模板多核苷酸可含有多种序列，包括但不限于通用序列和已知或未知序列。例如，多核苷酸可以包含位于5’端和/或3’端上的已知序列的一个或多个区域(例如，衔接子)。此类模板多核苷酸可以通过将衔接子连接到未知序列的多核苷酸的端而形成。当多核苷酸包含5’端和3’端上的已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。任选地，位于多核苷酸5’端和/或3’端上的已知序列能够与固定在表面上的一种或多种引物杂交。例如，包含5’已知序列的多核苷酸可与第一多个引物杂交，而3’已知序列可与第二多个引物杂交。任选地，多核苷酸包含一个或多个可检测标记。该一个或多个可检测标记可以在5’端处、3’端处和/或在多核苷酸分子内的任何核苷酸位置处连接到多核苷酸模板。用于所提供的方法的多核苷酸可包含待扩增和/或测序的多核苷酸以及任选地5’端和/或3’端处的短核酸序列。
添加到多核苷酸的5’端和/或3’端的短核酸序列可以是通用序列。通用序列是两种或更多种多核苷酸共有的(即，共享的)核苷酸序列区域，其中该两种或更多种多核苷酸也具有序列差异区域。可存在于多种多核苷酸的不同成员中的通用序列可允许使用与通用序列互补的单个通用引物来复制或扩增多个不同序列。类似地，可存在于多核苷酸集合的不同成员中的至少一个、两个(例如一对)或更多个通用序列可允许使用与通用序列互补的至少一个、两个(例如一对)或更多个单个通用引物复制或扩增多个不同序列。因此，通用引物包含可与这种通用序列特异性杂交的序列。可修饰多核苷酸以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)连接到不同靶序列的一端或两端，这些衔接子提供通用引物杂交的位点。此方法具有以下优点：无需为待生成、扩增、测序和/或以其他方式分析的每个多核苷酸设计特定的引物对；单对引物可用于扩增不同的多核苷酸，条件是每个多核苷酸通过在其5’端和3’端添加相同的通用引物结合序列而被修饰。
还可以使用标准的已知方法修饰多核苷酸以包含任何期望的核酸序列。此类另外的序列可以包括例如限制性内切酶位点或索引标签以允许识别给定核酸序列的扩增产物。
如本文所用，当用于提及两种或更多种多核苷酸时，术语不同意指该两种或更多种多核苷酸具有不同的核苷酸序列。例如，两种多核苷酸可以在一个多核苷酸序列中的核苷酸的含量和顺序与另一个多核苷酸相比有所不同。该术语可用于描述多核苷酸，无论它们是指拷贝、扩增子、模板、靶标、引物、寡核苷酸等。
公开了可以用于所公开的方法和组合物，可与所公开的方法和组合物结合使用，可以用于制备所公开的方法和组合物，或者是所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。这些和其他材料在本文中公开，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开每一种不同的单独和集体组合和排列的具体参考，但每一种都在本文中被具体设想和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法并且讨论了可以对这些方法步骤做出的多个修改，则具体考虑了这些方法步骤的每一个组合和排列以及可能的修改，除非具体相反地指示。同样，还具体考虑和公开了这些组合物或方法的任何子集或组合。此概念适用于本公开的所有方面。因此，如果存在可以执行的各种另外的步骤，则应理解，这些另外的步骤中的每个步骤可以用所公开的方法的任何具体方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每个这样的组合或组合子集特别加以考虑并且应该被视为公开的。
在本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容特此以引用方式整体并入本申请中。
实施例
在边合成边测序(SBS)期间，在来自可逆封闭的、标记的核苷酸掺入的先前循环的去封闭步骤之后，大量残留信号保留。残留信号以簇的形式保留在流动池上，直到下一个可逆封闭的、标记的核苷酸掺入为止。用标准洗涤组合物洗涤不能消除残留信号。保留在簇中的染料(标记)影响下一循环中的掺入速率和影响其他测序度量的程度尚不充分了解。
包括含有聚合酶的洗涤步骤在去除残留信号方面是有效的。还观察到测序度量(诸如误差率、定相、预定相和信号衰减)的改善。另外，包括含有聚合酶的洗涤步骤可允许较短的掺入时间。
为了确定包含聚合酶的洗涤步骤是否可以降低背景信号，在因美纳MiSeq型号测序仪上使用用于测序仪的标准混合物(包含蓝绿色染料组)确定已知序列的序列。在掺入步骤之后、在去封闭步骤之后和在模拟洗涤步骤之后拍摄图像。模拟洗涤步骤紧接着标准去封闭后洗涤。模拟洗涤组合物与掺入组合物(包含聚合酶和掺入缓冲液)相同，除了模拟洗涤组合物不含全功能核苷酸(ffN)且不含Mg2+。将五十微升模拟洗涤组合物冲洗通过流动池，在60℃下孵育25秒。所得图像示出在图7A(掺入步骤之后)、图7B(去封闭步骤之后)和图7C(模拟洗涤之后)中。在去封闭洗涤后保留大量的信号。然而，包含聚合酶的模拟洗涤去除了所有或几乎所有剩余的信号。
为了确定去封闭步骤后剩余的残留信号是否随着时间的推移而累积，每10个循环运行一个“空白”循环。空白循环中的掺入混合物与正常循环中的掺入混合物相同，除了空白循环掺入混合物缺乏核苷酸。空白循环和正常循环的掺入混合物包含DNA聚合酶(Pol1901)。在每个掺入步骤(包含空白循环)后和每个去封闭步骤后运行检测扫描。使用用于测序仪的已知靶序列和标准混合物(包含红绿染料组)，测序在因美纳MiSeq型号测序仪上运行。
没有观察到显著的信号累积(数据未示出)。即，在每个测序循环后去除残留信号，并且空白循环引起接近背景的信号水平(数据未示出)。结论是在去封闭后去除残留信号不是必需的，因为在随后的循环中引入新鲜的掺入混合物(包含全功能核苷酸和聚合酶)去除了残留信号。注意，这些初始测试使用红绿染料组进行。预期当使用蓝绿色染料组时，信号累积可能是个问题。
发现空白循环增加定相和预定相(大约0.6％)。据信定相和预定相的增加导致了碱基调用问题，这被认为导致了误差率的增加。当采用空白循环时，在图8中示出了每个循环的误差率的曲线图。令人惊讶地，空白循环导致定相、预定相和误差率的增加，该空白循环实际上相当于使用不含核苷酸(但包含聚合酶)的掺入混合物的洗涤步骤。
接下来，测试包含聚合酶、全功能核苷酸(ffN)但不含Mg2+的“模拟”掺入组合物的作用。模拟掺入混合物与正常掺入循环中使用的掺入混合物相同，除了模拟掺入混合物缺乏Mg2+。空白循环和正常循环的掺入混合物包含DNA聚合酶(Pol 1901)和ffN。在每个掺入步骤(包含模拟循环)后和每个去封闭步骤后运行检测扫描。在去封闭步骤之后和紧接着下一轮掺入之前，将模拟掺入混合物用作洗涤组合物。使用用于测序仪的已知靶序列和标准混合物，测序在因美纳MiSeq型号测序仪上运行，除了使用蓝绿染料组。
当采用具有模拟掺入混合物的洗涤步骤时，每个循环的误差率的图示出于图9中。
接下来，评估包括模拟掺入组合物(如上所述)的洗涤步骤的掺入作用。在去封闭步骤与裂解后洗涤步骤之间的每个循环包括含有模拟掺入组合物的洗涤步骤，并且与不包括模拟洗涤步骤的正常测序运行进行比较。使用用于测序仪的已知靶序列和标准混合物，测序在因美纳MiSeq型号测序仪上运行。确定误差率和定相。
误差率示出于图10中，并且定相示出于图11中。如图10和图11所示，模拟掺入组合物洗涤步骤的掺入引起较低的误差率和较低的定相百分比。
确定“模拟”洗涤步骤对测序度量的作用。该模拟洗涤组合物与掺入混合物相同，除了该组合物缺乏ffN和缺乏Mg2+。在去封闭洗涤步骤后立即进行模拟洗涤步骤。对于模拟洗涤步骤，将50微升模拟洗涤组合物冲洗通过流动池，在60℃下孵育25秒。在模拟洗涤步骤之后立即掺入标准物。在因美纳MiSeq型号测序仪上使用包含蓝绿色染料组的标准混合物(除了模拟洗涤步骤之外)对已知序列进行测序。掺入时间从2×25秒减少到2×10秒。掺入步骤持续时间减少的标准测序运行50个循环，随后是包括模拟洗涤步骤的50个循环，随后是50个标准循环。如图12中所示，在包括模拟洗涤步骤的50个循环中，定相百分比降低(0.074)(与前50个循环中的0.105相比)，并且当不再执行模拟洗涤步骤时，定相百分比升高(最后50个循环为0.116)。
确定“模拟”洗涤步骤对另外的测序度量的作用。该模拟洗涤组合物与掺入混合物相同，除了该组合物缺乏ffN和缺乏Mg2+。在去封闭洗涤步骤后立即进行模拟洗涤步骤。对于模拟洗涤步骤，将50微升模拟洗涤组合物冲洗通过流动池，在60℃下孵育25秒。在模拟洗涤步骤之后立即掺入标准物。在因美纳MiSeq型号测序仪上使用包含蓝绿色染料组的标准混合物(除了模拟洗涤步骤之外)对已知序列进行测序。掺入时间从2×25秒减少到2×10秒。掺入步骤持续时间减少的标准测序运行150个循环。具有模拟洗涤步骤的测序也运行150个循环。为了对系统施加压力并评估信号衰减对光剂量增加的影响，检测步骤包括标准(1X)光剂量(蓝色和绿色的标准曝光)、5X光剂量(4X光剂量，随后是1X成像曝光)和10X光剂量(9X光剂量，随后是1X成像)。评估定相百分比、预定相百分比、误差率％和信号衰减。模拟洗涤没有引起信号衰减的显著变化(数据未示出)。定相、预定相和误差率的结果示于下表1中。
表1.标准测序与模拟洗涤测序之间度量的比较
如表1中所示，该模拟引起定相的降低和误差率的降低。定相的减少可能是由于模拟洗涤步骤中聚合酶的预结合，加速了随后的掺入。表1中的结果表明，如果包括模拟洗涤步骤，则较短的掺入时间可带来准确的测序。
已经描述了多个实施方案。然而，应当理解，可进行各种修改。因此，其他实施方案也在以下权利要求书的范围内。

Claims (20)

1.一种多核苷酸测序方法，所述多核苷酸测序方法包括：
(a)将包含第一聚合酶和多个封闭的、标记的核苷酸的掺入组合物与模板多核苷酸链一起孵育，使得所述第一聚合酶将所述多个封闭的、标记的核苷酸之一掺入与所述模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中；
(b)识别掺入所述拷贝多核苷酸链中的所述封闭的、标记的核苷酸；
(c)从掺入所述拷贝多核苷酸链中的所述封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分；
(d)用包含第二聚合酶的第一洗涤组合物将去除的标记和所述封闭部分从所述拷贝多核苷酸链上洗去；以及
(e)重复步骤(a)至(d)直至确定所述模板多核苷酸链的至少部分序列为止。
2.一种多核苷酸测序方法，所述多核苷酸测序方法包括：
(a)将包含第一聚合酶和多个封闭的、标记的核苷酸的掺入组合物与模板多核苷酸链一起孵育，使得所述第一聚合酶将所述多个封闭的、标记的核苷酸之一掺入与所述模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中；
(b)识别掺入所述拷贝多核苷酸链中的所述封闭的、标记的核苷酸；
(c)使掺入了所述封闭的、标记的核苷酸的所述拷贝多核苷酸链与包含第二聚合酶的第一洗涤组合物接触；
(d)从掺入所述拷贝多核苷酸链中的所述封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分；
(e)用第二洗涤组合物将去除的标记和所述封闭部分从所述拷贝多核苷酸链上洗去；以及
(f)重复步骤(a)至(e)直至确定所述模板多核苷酸链的至少部分序列为止。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一洗涤组合物包含多种核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多种核苷酸包括封闭的核苷酸。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述多种核苷酸包括用可检测部分标记的核苷酸。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤组合物被配置为防止所述第二聚合酶将所述多种核苷酸之一掺入所述拷贝多核苷酸链中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中洗涤溶液基本上不含Mg2+。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述模板多核苷酸链固定在固体载体上。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述模板多核苷酸固定在流动池的表面上。
10.一种与测序设备一起使用的盒，所述盒包括：
(a)第一室，所述第一室含有掺入组合物，所述掺入组合物包含用于将封闭的、标记的核苷酸掺入与模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中的第一多种试剂；
(b)第二室，所述第二室含有用于识别掺入所述拷贝多核苷酸链中的所述封闭的、标记的核苷酸的检测组合物；
(c)第三室，所述第三室含有裂解组合物，所述裂解组合物包含用于从掺入所述拷贝多核苷酸链中的所述封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分的第二多种试剂；以及
(d)第四室，所述第四室含有第一洗涤组合物，所述第一洗涤组合物包含聚合酶和多种核苷酸，其中所述第一洗涤组合物被配置为防止所述第二聚合酶将所述多种核苷酸之一掺入所述拷贝多核苷酸链中。
11.根据权利要求10所述的盒，其中所述第一洗涤组合物包含多种封闭的核苷酸。
12.根据权利要求10或11所述的盒，其中所述第一洗涤组合物包含用可检测部分标记的多种核苷酸。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的盒，其中所述第一洗涤组合物基本上不含Mg2 +。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的盒，所述盒还包括含有第二洗涤组合物的第五室，其中所述第二洗涤组合物基本上不含聚合酶和核苷酸。
15.一种与测序设备一起使用的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，所述第一容器含有掺入组合物，所述掺入组合物包含用于将封闭的、标记的核苷酸掺入与模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中的第一多种试剂；
(b)第二容器，所述第二容器含有用于识别掺入所述拷贝多核苷酸链中的所述封闭的、标记的核苷酸的检测组合物；
(c)第三容器，所述第三容器含有裂解组合物，所述裂解组合物包含用于从掺入所述拷贝多核苷酸链中的所述封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分的第二多种试剂；以及
(d)第四容器，所述第四容器含有第一洗涤组合物，所述第一洗涤组合物包含聚合酶和多种核苷酸，其中所述第一洗涤组合物被配置为防止所述第二聚合酶将所述多种核苷酸之一掺入所述拷贝多核苷酸链中。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一洗涤组合物包含多种封闭的核苷酸。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其中所述第一洗涤组合物包含用可检测部分标记的多种核苷酸。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的试剂盒，其中所述第一洗涤组合物基本上不含Mg2+。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括含有第二洗涤组合物的第五容器，其中所述第二洗涤组合物基本上不含聚合酶和核苷酸。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于使用所述试剂盒的说明书。
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