CN117836425A - 人因子viii的选择性测量 - Google Patents

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安德里·恩格尔麦尔
克里斯托弗·泽拉宾格尔
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Abstract

本文描述了用于选择性且灵敏地测量人凝血因子VIII(FVIII)的活性的方法和试剂盒。

Description

人因子VIII的选择性测量
技术领域
本发明总体上涉及基于显色的测定领域，并且更具体地涉及用于测量血浆和其他流体中因子VIII(FVIII)促凝血活性的基于显色的测定。
背景技术
选择性地测量血浆或其他流体中治疗性施用的因子VIII(FVIII)的促凝血活性的能力对于检验因子VIII替代治疗方法是必需的。在测试和开发人FVIII药物候选物或评价替代施用途径期间，通常需要在具有正常水平的内源性FVIII的动物模型中测试它们。然而，定量人FVIII并以足够的准确度和精确度将其与动物宿主模型的内源性FVIII区分开是具有挑战性的。内源性非人FVIII的存在不仅可以潜在地使药代动力学研究分析有偏差，某些生产过程相关的添加剂还可能影响测定性能。例如，在病毒灭活过程期间使用的溶剂/去污剂混合物可能干扰测定。
因此，存在对如下测定的未满足的需求，所述测定允许在含有非人FVIII的动物血浆的存在下或在生产相关添加剂的存在下选择性且灵敏地测量人FVIII的活性。
发明内容
本文描述了允许选择性地和灵敏地测量人凝血因子VIII(FVIII)的活性的方法和试剂盒。这些方法利用甚至在来自另一种动物的内源性FVIII和/或其他生产相关添加剂的存在下与人FVIII选择性地结合的FVIII识别捕获剂。
在一方面，本文提供了用于测量样品中人凝血因子VIII(FVIII)的活性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述样品与选择性地结合所述人FVIII的捕获剂在足以允许所述捕获剂与所述人FVIII选择性地结合的条件下和时间内孵育，由此形成反应混合物，其中所述捕获剂附着于固体支持物上；
b)从所述反应混合物中去除未结合的人FVIII级分；和
c)使用显色测定测量所述反应混合物中人FVIII的活性。
在一些实施方案中，所述方法还包括d)通过与FVIII参考制剂比较来确定反应混合物中人FVIII的活性。
在一些实施方案中，显色测定通过以下来进行：
c1)向所述反应混合物中添加活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶，并将所述反应混合物在足以产生活化的FX(FXa)的条件下和时间内孵育；
c2)向所述反应混合物中添加FXa特异性显色底物，并在足以产生可测量信号的条件下和时间内孵育所述反应混合物；
c3)任选地，向所述反应混合物中添加终止剂以终止从所述FXa特异性显色底物产生信号；和
c4)测量由所述反应混合物产生的所述信号。
在一些实施方案中，显色底物是CH3OCO-D-环己基丙氨酸-Gly-Arg-pNA。
在一些实施方案中，终止剂是乙酸。
在一些实施方案中，捕获剂选择性地结合人FVIII的A1、A2、A3、B、C1或C2结构域。在一些实施方案中，捕获剂选择性地结合人FVIII的A2结构域。在一些实施方案中，捕获剂不与人FVIII的B结构域结合。在一些实施方案中，捕获剂是抗体、抗原结合片段、亲和体(affibody)、适体(aptamer)或亲和配体。
在一些实施方案中，捕获抗体是GMA-8024、GMA-8023、或其抗原结合片段或变体。
在一些实施方案中，样品包含来自非人动物的血浆和/或血清。在一些实施方案中，非人动物是实验室动物。在一些实施方案中，非人动物是绵羊、山羊、食蟹猴、兔、大鼠、恒河猴、小鼠、猪、仓鼠、小型猪或豚鼠。在一些实施方案中，样品包含含枸橼酸盐的血浆。
在一些实施方案中，在步骤a)之前稀释样品。可以将样品以1:2至约1:20000之间的系数稀释。在一个实施方案中，将样品以约1:10的系数稀释。
在一些实施方案中，固体支持物是烧瓶、ELISA板、多孔板、膜、管、片、柱或微粒。
在一些实施方案中，将步骤a)中的孵育在室温下进行约1小时。
在一些实施方案中，将步骤c1)中的孵育在室温下进行约15分钟。
在一些实施方案中，将c2)中的孵育在室温下进行约25分钟。
在一些实施方案中，在步骤b)中去除未结合的人FVIII通过用洗涤缓冲液洗涤固体支持物来进行。在一些实施方案中，将步骤b)中去除未结合的人FVIII通过用PBS-Tween缓冲液洗涤固体支持物约三次来进行。
在各种实施方案中，人FVIII是重组FVIII。在一些实施方案中，人FVIII是全长FVIII。在一些实施方案中，人FVIII是B结构域缺失的FVIII。
在一方面，本文提供了用于测量样品中人凝血因子VIII(FVIII)活性的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)选择性地结合所述人FVIII的捕获剂，其中所述捕获剂附着于固体支持物上；
ii)包含活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶中的一种或多种的第一小瓶；
iii)包含FXa特异性显色底物的第二小瓶；和/或
iv)任选地，包含终止剂的第三小瓶。
在上述试剂盒的一些实施方案中，捕获剂选择性地结合人FVIII的A1、A2、A3、B、C1或C2结构域。在上述试剂盒的一些实施方案中，捕获剂选择性地结合人FVIII的A2结构域。在上述试剂盒的一些实施方案中，捕获剂不与人FVIII的B结构域结合。在一些实施方案中，捕获剂是抗体、抗原结合片段、亲和体、适体或亲和配体。在一些实施方案中，捕获抗体是GMA-8024、GMA-8023、或其抗原结合片段或变体。
在上述试剂盒的一些实施方案中，固体支持物是烧瓶、ELISA板、多孔板、膜、管、片、柱或微粒。在一些实施方案中，显色底物是CH3OCO-D-环己基丙氨酸-Gly-Arg-pNA。在一些实施方案中，终止剂是乙酸。
试剂盒的一些实施方案还可以包括反应缓冲液、FVIII稀释缓冲液、洗涤缓冲液和/或FVIII参考制剂中的一种或多种。
附图说明
并入本说明书中并构成其一部分的附图示出了下述几个方面。
图1显示了根据本发明的显色FVIII活性测定的示意图。CHA和pNA分别代表环己基丙氨酸和对硝基苯胺(p-nitrophenylanilide)。
图2显示了对于188mU/mL、94mU/mL和47mU/mL的B结构域缺失的(BDD)rFVIII浓度获得的空白校正的光密度(OD)。根据本发明的显色FVIII活性测定的实施方案测试的不同捕获抗体的FVIII活性以mIU/mL测量。从左到右，所述抗FVIII捕获抗体是：GMA-8024、GMA-8023、GMA-012、ESH-8、ESH-4、RFF-VIIIC/8、RFF-VIIIC/5和N55195M。
图3显示了平均校准曲线和反向拟合测定校准与其标称值的一致性。误差条标记了平均值的单个标准偏差。
图4显示了通过使用BDD rFVIII制剂获得的平均校准曲线和反向拟合测定校准与其标称值的一致性。误差条标记了平均值的单个标准偏差。
图5显示了对于加标至含枸橼酸盐的动物血浆物质中的人FVIII(100mU/mL)确定的单个回收率。柱顶部的数字表示作为加标的100mU/mL的百分比的回收率。
图6显示了对于加标至动物血清样品中的人FVIII(100mU/mL)确定的回收率。柱顶部的数字表示作为加标的100mU/mL的百分比的回收率。
图7显示了对于加标至含枸橼酸盐的山羊、绵羊和食蟹猴血浆中的人FVIII的剂量-响应曲线。插图显示了双对数浓度-响应曲线的相对斜率(以对于缓冲液稀释系列确定的百分比给出)和曲线的对应判定系数。
图8显示了对于加标至含枸橼酸盐的兔和大鼠血浆和小鼠血清中的人FVIII的剂量-响应曲线。插图显示了双对数浓度-响应曲线的相对斜率(以对于缓冲液稀释系列确定的百分比给出)和曲线的对应判定系数。
图9显示了对于加标至含枸橼酸盐的恒河猴血浆和豚鼠血清中的人FVIII的剂量-响应曲线。插图显示了双对数浓度-响应曲线的相对斜率(以对于缓冲液稀释系列确定的百分比给出)和曲线的对应判定系数。
图10显示了对于加标至猪和仓鼠血清中的人FVIII的剂量-响应曲线。插图显示了双对数浓度-响应曲线的相对斜率(以对于缓冲液稀释系列确定的百分比给出)和曲线的对应判定系数。
图11A-11D显示了由三个操作者在六个月的时间段内进行的108次测量的数据，以展示该测定随时间推移的中间精确度和稳健性。图11A和11B分别显示了所有单个值和三个操作者的值(平均值±SD)，而图11C和11D以QQ图(11C)和直方图(11D)的形式呈现数据。
图12显示了对于在溶剂/去污剂(S/D)溶液(即1％ Triton X 100、0.3％聚山梨醇酯80和0.3％溶剂/去污剂(S/D))的存在下含有10IU人FVIII/mL的样品以及在PBS缓冲液中的相同FVIII浓度(＝天然FVIII)获得的浓度-响应曲线。插图显示了稀释-响应曲线的相对斜率，表示为对于天然FVIII确定的斜率的百分比，以及它们的变异系数。
图13显示了使用在溶剂/去污剂(S/D)溶液(即1％ Triton X 100、0.3％聚山梨醇酯80和0.3％溶剂/去污剂(S/D))的存在下1IU/mL的FVIII浓度以及在PBS缓冲液中的相同FVIII浓度(＝天然FVIII)获得的浓度-响应曲线，其需要1/10的样品稀释度并因此在基于抗体的FVIII捕获期间显著增加S/D组分的水平。插图显示了稀释-响应曲线的相对斜率，表示为对于天然FVIII确定的斜率的百分比，以及它们的变异系数。
图14显示了在S/D溶液中和在S/D溶液的单个组分中的三种水平的人FVIII(10IU/mL、1IU/mL和0.1IU/mL)的回收率。
图15显示了在S/D病毒灭活溶液的单个组分的存在下的测定性能。
具体实施方式
本申请尤其提供了用于测量样品中人凝血因子VIII(FVIII)的促凝血活性的方法和试剂盒。如下面实施例部分所证明，本发明人研究了通过组合选择性捕获人FVIII，然后进行FVIII活性的显色测定(该测定不是在溶液中(如常规测定)进行，而是用捕获的并因此纯化的人FVIII进行)，是否可以在含有内源性FVIII的动物血浆基质中选择性地测量人因子VIII(FVIII)的促凝血活性。所述方法也可以用于离体血浆测试，其中施用FVIII产品以及动物中存在的内源性FVIII。此外，所述测定可以用于生产相关基质，其中FVIII测量可能由于测定干扰而不可行。最后，在临床环境中，所述测定能够在FVIII活性模拟剂(如双特异性抗体)的存在下测量人FVIII，而不干扰这些试剂。
在一方面，本文提供了用于测量样品中的人凝血FVIII的活性的方法。所述方法的步骤可以包括以下中的一个或多个：a)将所述样品与选择性地结合人FVIII的捕获剂在足以允许所述捕获剂与所述人FVIII选择性地结合的条件下和时间内孵育，由此形成反应混合物，其中所述捕获剂附着于固体支持物上；b)从所述反应混合物中去除未结合的人FVIII；和c)使用活性测定测量所述反应混合物中人FVIII的活性。
在一些实施方案中，所述方法还可以包括步骤d)通过与FVIII参考制剂比较来确定反应混合物中人FVIII的活性。
本说明书的各方面公开了捕获剂。捕获剂是指能够与人FVIII或存在于人FVIII上或以其他方式与人FVIII相关的靶位点选择性地或基本上选择性地(即具有有限的交叉反应性)结合的任何分子。如本文所用，术语“选择性地”是指仅以一种方式或仅与一种靶标具有独特的作用或影响或反应。如本文所用，在提及捕获剂时术语“选择性地结合”是指捕获剂与人FVIII或在人FVIII上存在的指定靶位点的区别结合，使得所述试剂基本上不与人FVIII或来自其他动物的FVIII上的非靶位点交叉反应。可以与人FVIII、或存在于人FVIII上或以其他方式与人FVIII相关的靶位点选择性地结合的任何捕获剂都可以用于本文公开的方法中。捕获剂通常具有单一特异性，尽管可以使用对两个或更多个靶位点具有多种特异性的捕获剂。捕获剂的非限制性实例包括抗体、抗原结合片段、亲和体、适体(例如，DNA适体)、合成肽、结合分子、核酸和能够特异性地捕获人FVIII并且优选地不干扰活性测定(例如，干扰FVIII作为FIXa介导的FXa产生的辅因子的作用)的其他亲和配体。
在一些实施方案中，捕获剂选择性地结合人FVIII的A1、A2、A3、B、C1或C2结构域。在一些实施方案中，捕获剂选择性地结合人FVIII的A2结构域。在一些实施方案中，捕获剂不与人FVIII的B结构域结合。
捕获剂的选择性结合可以包括结合特性，例如结合亲和力、结合特异性和结合亲合力。结合亲和力是指捕获剂位于其结合位点或部分的时间长度，并且可以被视为捕获剂结合其结合位点或部分的强度。结合亲和力可以描述为捕获剂的平衡解离常数(KD)，其定义为平衡时的比率Kd/Ka，其中Ka是捕获剂的缔合速率常数，并且Kd是捕获剂的解离速率常数。结合亲和力由缔合和解离两者确定，并且单独的高缔合和低解离都不能确保高亲和力。缔合速率常数(Ka)或结合速率常数(Kon)度量每单位时间结合事件的数目、或捕获剂与其结合位点或部分可逆地缔合成其试剂-部分复合物的倾向。缔合速率常数以M-1s-1表示，并且用符号表示如下：[CA]×[BS]×Kon。缔合速率常数越大，捕获剂与其结合位点或部分结合越快，或捕获剂与其结合位点或部分之间的结合亲和力越高。解离速率常数(dissociation rate constant，Kd)或解离速率常数(off-rate constant，Koff)度量每单位时间的解离事件的数目、试剂-部分复合物可逆地分离(解离)为其组分分子(即捕获剂及其结合位点或部分)的倾向。解离速率常数以s-1表示，并且用符号表示如下：[CA+BS]×Koff。解离速率常数越小，捕获剂与其结合位点或部分结合越紧，或捕获剂与其结合位点或部分之间的结合亲和力越高。平衡解离常数(KD)度量在平衡时新试剂-部分复合物形成的速率等于试剂-部分复合物解离的速率。平衡解离常数以M表示，并且定义为Koff/Kon＝[CA]×[BS]/[CA+BS]，其中[CA]是捕获剂的摩尔浓度，[BS]是结合位点或部分的摩尔浓度，并且[CA+BS]是试剂-部分复合物的摩尔浓度，其中当系统处于平衡时，所有浓度都是此类组分的浓度。平衡解离常数越小，捕获剂与其结合位点或部分结合越紧，或捕获剂与其结合位点或部分之间的结合亲和力越高。
在一个实施方案中，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如小于1×105M- 1s-1、小于1×106M-1s-1、小于1×107M-1s-1、或小于1×108M-1s-1的缔合速率常数。在另一个实施方案中，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如大于1×105M-1s-1、大于1×106M- 1s-1、大于1×107M-1s-1、或大于1×108M-1s-1的缔合速率常数。在其他方面，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有在1×105M-1s-1至1×108M-1s-1之间、在1×106M-1s-1至1×108M-1s-1之间、在1×105M-1s-1至1×107M-1s-1之间、或在1×106M-1s-1至1×107M-1s-1之间的缔合速率常数。
在另一个实施方案中，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有小于1×10-3s-1、小于1×10-4s-1、或小于1×10-5s-1的解离速率常数。在该实施方案的其他方面，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如小于1.0×10-4s-1、小于2.0×10-4s-1、小于3.0×104s-1、小于4.0×10-4s-1、小于5.0×10-4s-1、小于6.0×10-4s-1、小于7.0×10-4s-1、小于8.0×10-4s-1、或小于9.0×10-4s-1的解离速率常数。在另一个实施方案中，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如大于1×10-3s-1、大于1×10-4s-1、或大于1×10-5s-1的解离速率常数。在该实施方案的其他方面，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如大于1.0×10-4s-1、大于2.0×10-4s-1、大于3.0×10-4s-1、大于4.0×10-4s-1、大于5.0×10-4s-1、大于6.0×10-4s-1、大于7.0×10-4s-1、大于8.0×10-4s-1、或大于9.0×10-4s-1的解离速率常数。
在另一个实施方案中，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有小于或约50nM的平衡解离常数。在该实施方案的各方面，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如小于或约50nM、小于或约20nM、小于或约10nM、小于或约5nM、小于或约2nM、小于或约1nM、小于或约0.5nM、小于或约0.45nM、小于或约0.4nM、小于或约0.35nM、小于或约0.3nM、小于或约0.25nM、小于或约0.2nM、小于或约0.15nM、小于或约0.1nM、或小于或约0.05nM的平衡解离常数。在另一个实施方案中，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有大于0.5nM的平衡解离常数。在该实施方案的各方面，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如大于0.5nM、大于0.45nM、大于0.4nM、大于0.35nM、大于0.3nM、大于0.25nM、大于0.2nM、大于0.15nM、大于0.1nM、或大于0.05nM的平衡解离常数。
在又一个实施方案中，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如小于1×100M-1s-1、小于1×101M-1s-1、小于1×102M-1s-1、小于1×103M-1s-1、或小于1×104M-1s-1的对来自除人以外的动物的FVIII的缔合速率常数。在另一个实施方案中，本文公开的捕获剂的结合亲和力可以具有例如至多1×100M-1s-1、至多1×101M-1s-1、至多1×102M-1s-1、至多1×103M-1s-1、或至多1×104M-1s-1的对来自除人以外的动物的FVIII的缔合速率常数。
结合特异性是捕获剂区分开含有其结合位点或部分的分子与不含有该结合位点或部分的分子的能力。测量结合特异性的一种方式是相对于捕获剂对不含有该结合位点或部分的分子的Kon缔合速率比较捕获剂对含有其结合位点或部分的分子的Kon缔合速率。例如，相对于来自其他动物的FVIII比较捕获剂对人FVIII的缔合速率常数(Ka)。在该实施方案的各方面，与人FVIII选择性地结合的捕获剂具有例如相对于对来自其他动物的FVIII的缔合速率常数(Ka)高至少2倍、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍或高至少9倍的对人FVIII的缔合速率常数(Ka)。在该实施方案的另外方面，与人FVIII选择性地结合的捕获剂具有例如相对于对来自其他动物的FVIII的缔合速率常数(Ka)高至少10倍、高至少100倍、高至少1,000倍或高至少10,000倍的对人FVIII的缔合速率常数(Ka)。在该实施方案的又其他方面，与人FVIII选择性地结合的捕获剂具有例如相对于对来自其他动物的FVIII的缔合速率常数(Ka)高至多1倍、高至多2倍、高至多3倍、高至多4倍、高至多5倍、高至多6倍、高至多7倍、高至多8倍或高至多9倍的对人FVIII的缔合速率常数(Ka)。在该实施方案的又其他方面，与人FVIII选择性地结合的捕获剂具有例如相对于对来自其他动物的FVIII的缔合速率常数(Ka)高至多10倍、高至多100倍、高至多1.000倍或高至多10.000倍的对人FVIII的缔合速率常数(Ka)。
捕获剂的结合特异性也可以表征为人FVIII相对于来自其他动物的FVIII的结合特异性比率。在该实施方案的各方面，捕获剂对人FVIII相对于来自其他动物的FVIII的结合特异性比率为例如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少64:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1或至少40:1。在该实施方案的又其他方面，捕获剂对人FVIII相对于来自其他动物的FVIII的结合特异性比率为例如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1或至少40:1。在该实施方案的仍其他方面，捕获剂对人FVIII相对于来自其他动物的FVIII的结合特异性比率为例如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少64:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1或至少40:1。
结合亲合力(也称为功能亲和力)是指在多价捕获剂与其结合位点或部分之间的功能结合强度的总和。捕获剂可以在人FVIII上具有超过一个结合位点。虽然捕获剂的结合亲合力取决于单个捕获剂结合位点的结合亲和力，但结合亲合力大于结合亲和力，因为对于捕获剂完全解离，必须同时破坏所有试剂-结合位点相互作用。设想了捕获剂可以选择性地结合该捕获剂的任何和所有结合位点或部分。
典型地，捕获剂可以区分人FVIII与来自其他动物的FVIII。来自其他动物的FVIII可以存在于样品中，但将不会选择性地结合本文公开的捕获剂，因为来自其他动物的FVIII缺乏捕获所必需的结合位点，或相对于人FVIII对捕获剂的结合亲和力弱得多。来自其他动物的FVIII的一个非限制性实例是从动物(样品直接取自或来源于所述动物)的基因组中表达的天然存在的或内源性FVIII。来自其他动物的FVIII的又另一个非限制性实例是由用于表达人FVIII的细胞培养系的细胞表达的FVIII。
在一些实施方案中，捕获剂是抗体或抗体片段。抗体是指由免疫系统产生的分子，其响应于与该抗原特异性地结合的特定抗原而产生，并且包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体、单特异性抗体、双特异性抗体，例如二硫化物稳定的Fv片段、scFv串联体[(scFv)2片段]、多特异性抗体、多价抗体、人源化抗体、骆驼源化抗体、嵌合抗体、双功能抗体、细胞相关抗体如Ig受体、线性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、或它们的衍生物或类似物，只要所述片段表现出期望的生物活性即可，以及它们的单链衍生物。抗体可以是包含VH和VL结构域以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的全长免疫球蛋白分子，或全长免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如Fab片段、F(ab′)2片段、Fc片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)。抗体可以来源于任何脊椎动物物种(例如，人、山羊、马、驴、鼠类、大鼠、兔或鸡)，并且可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
可用于实施本文公开的方法的抗体是可商购获得的或可以根据本领域熟知的方法产生。例如，可以通过杂交瘤方法产生单克隆抗体。抗体片段可以通过完整抗体的蛋白水解消化产生，或者可以直接由重组宿主细胞产生。例如，Fab′片段可以直接从大肠埃希氏菌(E.coli)回收并经化学偶联以形成F(ab′)2片段。在另一个实施方案中，F(ab′)2可以使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab′)2分子的组装而形成。根据另一种方法，Fv、Fab或F(ab′)2片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。用于产生抗体片段的其他技术对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
在一个实施方案中，捕获抗体是GMA-8024或其抗原结合片段或变体。
在一个实施方案中，捕获抗体是GMA-8023或其抗原结合片段或变体。
在一个实施方案中，捕获抗体是GMA-012或其抗原结合片段或变体。
捕获剂可以采取其他形式(例如，亲和体、适体、合成肽)，只要捕获剂能够特异性地捕获人FVIII，并且优选地不干扰活性测定，例如干扰FVIII作为FIXa介导的FXa产生的辅因子的作用。在一些实施方案中，捕获剂是亲和体。亲和体分子是对靶蛋白质具有特异性亲和力的小的高度稳健的蛋白质。它们通常是基于三螺旋束结构域框架设计的。在一些实施方案中，捕获剂是适体。适体是能够以高亲和力和特异性结合其靶标的结构化核酸分子。适体由于其形成螺旋和单链环的倾向而可以采取多种形状。
本文公开的捕获剂可以附着于作为捕获剂的支持物的固相上。如本文所用，术语“固相支持物”与“固体支持物”或“固相”同义，并且是指可以用于固定本文公开的捕获剂的任何基质。可以使用具有足够表面亲和力以结合捕获剂的任何合适的材料构建固相。所选择的固相支持物可以具有使其易于与可溶性或未结合材料分离并且通常允许未结合材料(例如，过量试剂、反应副产物或溶剂)从固相支持物结合的测定组分中分离或以其他方式去除(例如，通过洗涤、过滤、离心等)的物理特性。如何制备和使用固相支持物的非限制性实例描述于例如Molecular Cloning,A Laboratory Manual,同上,(2001)；以及CurrentProtocols in Molecular Biology,同上,(2004)，其各自据此以引用的方式整体并入。
有用的固体支持物包括：天然聚合碳水化合物及其合成改性的、交联的或取代的衍生物，诸如琼脂、琼脂糖、交联的藻酸、取代的和交联的瓜尔胶、葡聚糖、重氮纤维素、碳水化合物、淀粉、纤维素酯(尤其是与硝酸和羧酸的纤维素酯)、混合纤维素酯和纤维素醚；含有氮的天然聚合物，诸如蛋白质和衍生物，包括交联的或改性的明胶；天然碳氢化合物聚合物，诸如胶乳和橡胶；合成聚合物，诸如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯乙酸酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，诸如聚酯、聚酰胺、以及其他聚合物(诸如聚氨酯或聚环氧化物)；无机材料，诸如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙，碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐，以及铝或硅的氧化物或水合物，诸如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可以与上述聚合物材料一起用作过滤器)；以及上述类别的混合物或共聚物，诸如通过在预先存在的天然聚合物上引发合成聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。也可以使用硝化纤维素和尼龙。所有这些材料可以以合适的形状使用，诸如膜、片、管、柱；针或“浸渍片”；磁性颗粒、颗粒、微粒、珠或板，或者它们可以涂覆到、粘合到或层压到适当的惰性载体上，诸如纸、玻璃、塑料膜、织物等。
可替代地，固体支持物可以构成微粒。适当的微粒包括由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、胶乳、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯或类似材料构成的微粒。此外，微粒可以是磁性或顺磁性微粒，以便于在磁场中操纵微粒。微粒可以悬浮在可溶性试剂和生物样品的混合物中，或者可以被支持物材料保留和固定。在后一种情况下，在支持物材料上或支持物材料中的微粒不能充分移动到支持物材料内的其他位置。可替代地，可以通过沉降或离心将微粒从在可溶性试剂和生物样品的混合物中的悬浮液中分离出来。当微粒是磁性的或顺磁性的时，可以通过磁场将微粒与在可溶性试剂和生物样品的混合物中的悬浮液分离。
捕获剂可以通过吸附附着于固体支持物上，其中捕获剂通过疏水力保持。可替代地，固体支持物的表面可以通过引起捕获剂与支持物共价连接的化学方法活化。捕获剂可以通过离子捕获附着于固相上，其中捕获剂通过带电聚合物保持。
在本文公开的孵育步骤之后，可以进行洗涤步骤以便从混合物中去除任何未结合的组分，包括未结合的人FVIII、非人FVIII和/或可能干扰亚序列活性测定的其他试剂。洗涤可以通过用洗涤缓冲液洗涤含有捕获剂和捕获的人FVIII的固体支持物来进行。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tween(称为PBST缓冲液)。在一个实施方案中，洗涤缓冲液包含PBS和0.05％ Tween 20。在另一个实施方案中，洗涤缓冲液包含PBS和约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％Tween 20。洗涤可以进行一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次。在一个实施方案中，将洗涤进行三次。
本文公开的人FVIII活性的存在的检测或测量可以通过任何测定来完成，所述测定可以定性地或定量地测量指示与被监测的人FVIII相关的存在或活性的特征，包括但不限于体外测定、基于细胞的测定或体内测定。所述测定可以是非特异性多肽测定，例如UV吸收测定或基于化学的测定如Bradford测定或缩二脲测定、或特异性多肽测定，例如显色测定、比色测定、计时测定(chronometric assay)、化学发光测定、电致化学发光测定、生物发光测定、荧光测定、共振能量转移测定、平面偏振测定、流式细胞术测定、基于免疫的测定或活性测定(如酶活性，抑制活性，凝血活性或聚合活性)。用于检测人FVIII的特征或测量人FVIII活性的实际测定可以由本领域普通技术人员通过考虑各因素来确定，所述因素包括但不限于存在的人FVIII的量、被测定的特征和本领域普通技术人员的偏好。检测本文公开的人FVIII的存在或活性可以以单重或多重的方式实施。
本文公开的方法的一些实施方案采用显色测定。显色测定通常使用由特定寡肽或多肽部分和发色团(染料载体)构成的肽底物，并且通常用于确定拥有蛋白酶活性的因子，例如用于确定血液和血浆样品中的凝血因子(例如，FVIII)。根据样品中存在的人FVIII的量和/或活性，最初无色的显色肽底物被裂解，从而释放发色团。裂解改变了产物的光学特性，其不同于未裂解底物的光学特性，并且其可以通过分光光度法测量。可以与肽底物偶联的显色基团的非限制性实例包括对硝基苯胺(pNA)、5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)、7-氨基-4-甲氧基香豆素(ANC)、醌酰胺(QUA)、5-氨基间苯二甲酸二甲酯(DPA)及其衍生物。荧光底物包括但不限于Z-Gly-Pro-Arg-AMC[Z＝苄氧基羰基；AMC＝7-氨基-4-甲基香豆素]、高香草酸、4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原的吩噁嗪、还原的苯并噻嗪、试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡糖苷酸及其结构变体(美国专利号5,208,148；5,242,805；5,362,628；5,576,424和5,773,236，以引用的方式整体并入本文)、4-甲基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷和氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷(美国专利号5,830,912，以引用的方式整体并入本文)。
非限制性活性测定是用于基于凝血级联测量FVIII活性的显色测定。在该测定中，凝血酶活化的因子VIII与因子IXa形成复合物，并且该复合物随后活化因子X。活化的因子X活性可以通过释放显色基团如对硝基苯胺(pNA)的显色底物水解获得。如通过在405nm下以dOD测量的每分钟吸光度的变化所确定的pNA释放初始速率与因子Xa活性成比例，随后与样品中的FVIII活性成比例。通过使用过量的因子IXa和因子X，因子X的活化速率仅与样品中存在的凝血酶裂解的因子VIII的量成比例。
在一些实施方案中，显色测定可以包括以下中的一个或多个步骤：向反应混合物中添加活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶，并且将反应混合物在足以产生活化的FX(FXa)的条件下和时间内孵育；向反应混合物中添加FXa特异性显色底物，并且将反应混合物在足以产生可测量信号的条件下和时间内孵育；任选地，向反应混合物中添加终止剂以终止从FXa特异性显色底物产生信号；和测量由反应混合物产生的信号。
显色测定的试剂(包括活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶)可以以任何顺序添加。在一些实施方案中，逐步添加显色测定的试剂，包括活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶。例如，可以首先添加凝血酶以允许FVIII被活化以形成活化的FVIII(FVIIIa)。活化的因子IX(FIXa)和因子X(FX)可以随后并以过量添加，以允许FVIIIa与FX和FIXa形成十酶(tenase)复合物，导致产生活化的因子X(FXa)。在替代性的实施方案中，同时添加显色测定的试剂，包括活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶。在一些实施方案中，凝血酶可以作为凝血酶原提供。试剂可以是任何来源，例如人或动物(主要是牛来源)。
FXa特异性显色底物可以是对FXa具有选择性并且具有显色基团(诸如本文所述的那些)的任何底物。在一个实施方案中，显色底物是CH3OCO-D-环己基丙氨酸-Gly-Arg-pNA。显色底物溶液还可以含有合成的凝血酶抑制剂。
在添加FXa特异性显色底物之后，反应后可以连续读取显色(吸光度增加)进行动力学测量或在预定时间后终止显色进行终点测量。对于后者，可以使用终止剂。
在一些实施方案中，终止剂是乙酸。在一个实施方案中，终止剂是约20％乙酸。在其他实施方案中，终止剂为约5％、约10％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约35％、约40％乙酸。
在具体的实施方案中，选择性显色FVIII活性测定基于固定在微板孔上的抗人FVIII抗体特异性地捕获人FVIII(图1)。孵育之后，随后的洗涤步骤去除任何未结合的组分，包括动物FVIII。然后，添加FVIII显色测定的试剂，其包括活化的FIXa(FIXa)、因子X(FX)、钙、磷脂和凝血酶，允许活化的因子FVIII(FVIIIa)充当FIXa介导的FXa产生的辅因子。最后，在测定期间产生的活化的FX(FXa)通过FXa的特异性底物来检测。通过与FVIII参考制剂比较来确定FVIII显色活性。
本公开的各方面部分地包括包含本文公开的人FVIII的样品。样品可以是测试本文公开的人FVIII的存在或活性的任何材料。可以根据本文公开的方法测定多种样品，包括但不限于纯化的、部分纯化的或未纯化的人FVIII；配制的人FVIII产品；来自例如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物来源的粗制的、分级的或部分纯化的、或纯化的细胞裂解物；以及细胞、组织或器官样品。样品可以来自任何受试者个体，包括但不限于昆虫或哺乳动物，例如人、鸟、猪、马、牛、鼠类、猫、大鼠、狗或绵羊。在一些实施方案中，样品从非人动物获得。在一些实施方案中，样品从实验室动物获得，所述实验室动物包括但不限于绵羊、山羊、食蟹猴、兔、大鼠、恒河猴、小鼠、猪、仓鼠、小型猪和豚鼠。
在该实施方案的一个方面，样品可以是含有或潜在地含有人FVIII的生物样品。生物样品可以包括直接取自个体的任何细胞、组织或器官样品。生物样品还可以是直接取自个体的任何体液的样品，包括但不限于血液、尿液、痰、精液、粪便、唾液、胆汁、脑液、鼻拭子、泌尿生殖拭子、鼻抽吸物、脊髓液等。生物样品还可以包括从直接取自个体的样品衍生的任何制剂，包括但不限于血液样品的血浆级分、血液样品的血清级分或来自纯化过程的洗脱液。血液样品是指取自或衍生自血液的任何样品，诸如全血样品、血浆样品或血清样品。在一些实施方案中，样品是含枸橼酸盐的血浆样品。在一些实施方案中，样品可以含有添加剂，诸如用于生产重组人FVIII的那些。此类添加剂的非限制性实例是溶剂/去污剂(S/D)溶液，通常用作有效的病毒灭活溶液，含有1％ Triton X-100、0.3％聚山梨醇酯80和0.3％磷酸三正丁酯(tnBP)。在一些实施方案中，样品可以含有一种或多种FVIII活性模拟剂。已知FVIII活性模拟剂使常规方法的FVIII测量有偏差。FVIII活性模拟剂包括但不限于抗体(例如，双特异性抗体)、抗原结合片段、肽、核酸或小分子。在一个实施方案中，FVIII活性模拟剂是双特异性抗体，诸如艾美赛珠单抗(Emicizumab)。
设想了本文所述的方法使得有可能选择性地确定施用于动物或除动物内源性FVIII以外添加到动物血浆中的人FVIII的活性。本文所述的方法可以在非临床模型中，甚至在正常水平的内源性动物FVIII的存在下，特异性地测量研究性人FVIII产品的促凝血活性。目前可用的测量FVIII活性的方法可能不能区分人FVIII(无论是直接添加还是通过基因转移产生)与内源性动物FVIII，而是测量人凝血因子和动物凝血因子两者的活性。不幸的是，这种测量可能引入偏差，在施用/产生的人FVIII的循环半衰期结束时变得甚至更高，其中施用/产生的人FVIII与内源性FVIII之间的差异达到零。
此外，本文所述的方法还可以允许测量目前不可用于分析的样品基质中的FVIII活性，例如由于干扰。这种干扰样品基质的非限制性实例是在血浆衍生和重组FVIII的生产过程中包括的用于病毒灭活得溶剂-去污剂(S/D)溶液。然而，感兴趣的是确定和监测尽可能多的中间体和样品类型中的FVIII活性。本文所述的方法还可以允许在溶剂-去污剂溶液和单个化合物的存在下进行测量。
可以以改善样品内的人FVIII或其活性的可检测性的方式处理样品。此类处理可以例如降低样品的粘度或纯化样品的组分级分。处理方法可以涉及裂解、稀释、纯化、提取、过滤、蒸馏、分离、浓缩、干扰组分的灭活和试剂的添加。另外，怀疑含有人FVIII的固体材料一旦被修饰以形成液体介质或释放人FVIII就可以用作测试样品。测试前生物样品的选择和预处理是本领域熟知的。
在一些实施方案中，在孵育步骤之前稀释样品，使得可以以可接受的准确度和精确度水平测量FVIII活性。在一些实施方案中，将样品以1:1至约1:100,000之间的系数稀释。在一些实施方案中，将样品以1:2至约1:20000之间的系数稀释。在一些实施方案中，将样品以约1:5、约1:10、约1:20、约1:40、约1:80、约1:100、约1:160、约1:200、约1:320、约1:400、约1:500、约1:640、约1:800、约1:1000、约1:1280、约1:1200、约1:1500、约1:1600、约1:1800、约1:2000、约1:2400、约1:2500、约1:4000、约1:5000、约1:8000、约1:10000、约1:12000、约1:14000、约1:15000、约1:16000、约1:18000、或约1:20000的系数稀释。
在一些实施方案中，可以用与保留FVIII活性相容的稀释缓冲液稀释样品。本文所用的示例性稀释缓冲液包含咪唑和NaCl。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含约1-10g/L咪唑和约1-10g/L NaCl，并且具有7-8之间的pH。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含约1、约1.5、约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约1-3、约2-4、约3-5、约2.5-4.5、约3-6、约4-8或约5-10g/L咪唑。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.75、约5.8、约5.85、约5.9、约5.95、约6、约6.1、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约1-3、约2-4、约3-5、约2.5-4.5、约3-6、约4-8或约5-10g/L NaCl。在一些实施方案中，稀释缓冲液具有约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9或约8.0的pH。在一个实施方案中，稀释缓冲液包含约3.4g/L咪唑、约5.85g/L NaCl，并且具有约7.4的pH。
在一些实施方案中，样品与捕获剂的孵育在允许捕获剂与人FVIII选择性结合的条件下进行。在一些实施方案中，样品与捕获剂的孵育在室温下进行约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约2小时或约3小时。在一些实施方案中，样品与捕获剂的孵育在37℃下进行约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约2小时或约3小时。在一些实施方案中，样品与捕获剂的孵育在20℃下进行约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约2小时或约3小时。
在一些实施方案中，样品与捕获剂的孵育在允许捕获剂与人FVIII选择性结合的条件下进行。在一些实施方案中，样品与捕获剂的孵育在室温下进行约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约2小时、约3小时、约20-30分钟、约30-60分钟、约40-80分钟、约60-90分钟或约1-2小时。在一些实施方案中，样品与捕获剂的孵育在约37℃下进行约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约2小时、约3小时、约20-30分钟、约30-60分钟、约40-80分钟、约60-90分钟或约1-2小时。在一些实施方案中，样品与捕获剂的孵育在约20℃下进行约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约2小时、约3小时、约20-30分钟、约30-60分钟、约40-80分钟、约60-90分钟或约1-2小时。
在一些实施方案中，在添加显色测定的试剂(例如，活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶)之后，在足以产生活化的FX(FXa)的条件下和时间内进行反应混合物的孵育。在一些实施方案中，在添加显色测定的试剂(例如，活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶)之后，将反应混合物的孵育在室温下进行约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约1-10分钟、约5-12分钟、约8-15分钟、约10-20分钟、约15-30分钟或约20-40分钟。在一些实施方案中，在添加显色测定的试剂(例如，活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶)之后，将反应混合物的孵育在约37℃下进行约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约1-10分钟、约5-12分钟、约8-15分钟、约10-20分钟、约15-30分钟或约20-40分钟。在一些实施方案中，在添加显色测定的试剂(例如，活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶)之后，将反应混合物的孵育在约20℃下进行1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约1-10分钟、约5-12分钟、约8-15分钟、约10-20分钟、约15-30分钟或约20-40分钟。
在一些实施方案中，提供反应缓冲液用于显色测定。本文所用的示例性反应缓冲液包含约1-10g/L Tris、约0.1-10g/L Na2EDTA、约10-50g/L NaCl，并且具有pH 7.5-9。在一些实施方案中，反应缓冲液包含约1、约2、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.85、约5.9、约5.95、约6、约6.06、约6.1、约6.15、约6.2、约6.25、约6.3、约6.35、约6.4、约6.45、约6.5、约6.55、约6.6、约6.65、约6.7、约6.75、约6.8、约6.85、约6.9、约7、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8、约9、约10、或约2-4、约3-8、约4-7、约6-7、约5-8、或约6-9g/L Tris。在一些实施方案中，反应缓冲液包含约0.1、约0.5、约1、约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.75、约2.8、约2.85、约2.9、约2.95、约3、约3.03、约3.05、约3.1、约3.15、约3.2、约3.25、约3.3、约3.35、约3.4、约3.45、约3.5、约3.55、约3.6、约3.65、约3.7、约3.75、约3.8、约3.85、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约0.1-4、约1-5、约2-4、约3-4、约3-5、约4-6、或约5-8g/L Na2EDTA。在一些实施方案中，反应缓冲液包含约10、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约37、约40、约45、约50、约10-20、约15-25、约20-40、约20-30、或约30-50g/L NaCl。在一些实施方案中，稀释缓冲液具有约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、或约9.0的pH。在一个实施方案中，反应缓冲液包含约6.06g/L Tris、约3.03g/L Na2EDTA、约25g/L NaCl并且具有约8.3的pH。
在一些实施方案中，在添加FXa特异性显色底物(例如，CH3OCO-D-环己基丙氨酸-Gly-Arg-pNA)之后，在足以产生活化的FX(FXa)的条件下和时间内进行反应混合物的孵育。在一些实施方案中，在添加FXa特异性显色底物之后，将反应混合物的孵育在室温下进行约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约1-10分钟、约5-15分钟、约10-20分钟、约15-30分钟、约20-40分钟、或约25-50分钟。在一些实施方案中，在添加FXa特异性显色底物之后，将反应混合物的孵育在约37℃下进行5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约1-10分钟、约5-15分钟、约10-20分钟、约15-30分钟、约20-40分钟、或约25-50分钟。在一些实施方案中，在添加FXa特异性显色底物之后，将反应混合物的孵育在约20℃下进行5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约1-10分钟、约5-15分钟、约10-20分钟、约15-30分钟、约20-40分钟、或约25-50分钟。可以添加终止剂(例如，乙酸)以终止从显色底物产生信号。
在各种实施方案中，被检测的人FVIII是重组FVIII。在一些实施方案中，人FVIII是全长FVIII。在一些实施方案中，人FVIII是B结构域缺失的FVIII。在一些实施方案中，人FVIII是与野生型人FVIII相比包含一个或多个突变的经修饰的FVIII。在一些实施方案中，人FVIII是与野生型人FVIII相比除了B结构域缺失之外还包含一个或多个突变的经修饰的B结构域缺失的FVIII。在一些实施方案中，人FVIII是重组FVIII融合蛋白。
本文公开的方法可以通过若干参数来评价，所述参数包括例如准确度、精确度、检测限(LOD)、定量限(LOQ)、范围、特异性、选择性、线性、重现性和系统适用性。方法的准确度是分析方法的正确性的量度，或测量值与作为常规真实值或接受的参考值接受的值之间的一致性的接近度。方法的精确度是当程序重复应用于均质样品的多次取样时，单个测试结果之间的一致性程度。因此，精确度评价1)测定内变异性；2)日内变异性(重复性)；和3)日间变异性(中间精确度)；和4)实验室间变异性(再现性)。变异系数(CV％)是相对于观察到的或理论的平均值表示的精确度的定量量度。
本文公开的方法应该能够在背景上检测人FVIII的存在或活性。方法的检测限(LOD)是指人FVIII的浓度，其产生与阴性对照或空白显著不同的信号并代表可以与背景区分的人FVIII的最低浓度。
因此，在一个实施方案中，本文公开的方法可以以显著不同于阴性对照或空白的量检测人FVIII的LOD。在该实施方案的各方面，本文公开的方法具有例如10ng或更小、9ng或更小、8ng或更小、7ng或更小、6ng或更小、5ng或更小、4ng或更小、3ng或更小、2ng或更小、1ng或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的仍其他方面，本文公开的方法具有例如900pg或更小、800pg或更小、700pg或更小、600pg或更小、500pg或更小、400pg或更小、300pg或更小、200pg或更小、100pg或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的另外方面，本文公开的方法具有例如90pg或更小、80pg或更小、70pg或更小、60pg或更小、50pg或更小、40pg或更小、30pg或更小、20pg或更小、10pg或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法具有例如9pg或更小、8pg或更小、7pg或更小、6pg或更小、5pg或更小、4pg或更小、3pg或更小、2pg或更小、1pg或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的又其他方面，本文公开的方法具有例如0.9pg或更小、0.8pg或更小、0.7pg或更小、0.6pg或更小、0.5pg或更小、0.4pg或更小、0.3pg或更小、0.2pg或更小、0.1pg或更小的人FVIII的LOD。
在该实施方案的另一个方面，本文公开的方法具有例如10nM或更小、9nM或更小、8nM或更小、7nM或更小、6nM或更小、5nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法具有例如900pM或更小、800pM或更小、700pM或更小、600pM或更小、500pM或更小、400pM或更小、300pM或更小、200pM或更小、或100pM或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法具有例如100pM或更小、90pM或更小、80pM或更小、70pM或更小、60pM或更小、50pM或更小、40pM或更小、30pM或更小、20pM或更小、或10pM或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的又其他方面，本文公开的方法具有例如10pM或更小的人FVIII、9pM或更小、8pM或更小、7pM或更小、6pM或更小、5pM或更小、4pM或更小、3pM或更小、2pM或更小、或1pM或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的仍其他方面，本文公开的方法具有例如1000fM或更小、900fM或更小、800fM或更小、700fM或更小、600fM或更小、500fM或更小、400fM或更小、300fM或更小、200fM或更小、或100fM或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的仍其他方面，本文公开的方法具有例如100fM或更小、90fM或更小、80fM或更小、70fM或更小、60fM或更小、50fM或更小、40fM或更小、30fM或更小、20fM或更小、或10fM或更小的人FVIII的LOD。在该实施方案的仍其他方面，本文公开的方法具有例如10fM或更小、9fM或更小、8fM或更小、7fM或更小、6fM或更小、5fM或更小、4fM或更小、3fM或更小、2fM或更小、或1fM或更小的人FVIII的LOD。
定量限(LOQ)是可以以可接受的准确度和精确度水平测量的在样品或样本中的人FVIII的最低和最高浓度。定量下限是指检测方法可以从背景中一致地测量的最低剂量。定量上限是检测方法在信号饱和发生之前可以一致地测量的最高剂量。所述方法的线性范围是在定量下限与定量上限之间的区域。通过从定量上限减去定量下限计算线性范围。如本文所用，术语“下渐近线的信噪比”是指在所述方法中在检测下限检测到的信号除以背景信号。如本文所用，术语“上渐近线的信噪比”是指在所述方法中在检测上限检测到的信号除以背景信号。
因此，在一个实施方案中，本文公开的方法可以以显著不同于阴性对照或空白的量检测人FVIII的LOQ。在该实施方案的各方面，本文公开的方法具有例如10ng或更小、9ng或更小、8ng或更小、7ng或更小、6ng或更小、5ng或更小、4ng或更小、3ng或更小、2ng或更小、1ng或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的仍其他方面，本文公开的方法具有例如900pg或更小、800pg或更小、700pg或更小、600pg或更小、500pg或更小、400pg或更小、300pg或更小、200pg或更小、100pg或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的另外方面，本文公开的方法具有例如90pg或更小、80pg或更小、70pg或更小、60pg或更小、50pg或更小、40pg或更小、30pg或更小、20pg或更小、10pg或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法具有例如9pg或更小、8pg或更小、7pg或更小、6pg或更小、5pg或更小、4pg或更小、3pg或更小、2pg或更小、1pg或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的又其他方面，本文公开的方法具有例如0.9pg或更小、0.8pg或更小、0.7pg或更小、0.6pg或更小、0.5pg或更小、0.4pg或更小、0.3pg或更小、0.2pg或更小、0.1pg或更小的人FVIII的LOQ。
在该实施方案的另一个方面，本文公开的方法具有例如10nM或更小、9nM或更小、8nM或更小、7nM或更小、6nM或更小、5nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法具有例如900pM或更小、800pM或更小、700pM或更小、600pM或更小、500pM或更小、400pM或更小、300pM或更小、200pM或更小、或100pM或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法具有例如100pM或更小、90pM或更小、80pM或更小、70pM或更小、60pM或更小、50pM或更小、40pM或更小、30pM或更小、20pM或更小、或10pM或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的又其他方面，本文公开的方法具有例如10pM或更小的人FVIII、9pM或更小、8pM或更小、7pM或更小、6pM或更小、5pM或更小、4pM或更小、3pM或更小、2pM或更小、或1pM或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的仍其他方面，本文公开的方法具有例如1000fM或更小、900fM或更小、800fM或更小、700fM或更小、600fM或更小、500fM或更小、400fM或更小、300fM或更小、200fM或更小、或100fM或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的仍其他方面，本文公开的方法具有例如100fM或更小、90fM或更小、80fM或更小、70fM或更小、60fM或更小、50fM或更小、40fM或更小、30fM或更小、20fM或更小、或10fM或更小的人FVIII的LOQ。在该实施方案的仍其他方面，本文公开的方法具有例如10fM或更小、9fM或更小、8fM或更小、7fM或更小、6fM或更小、5fM或更小、4fM或更小、3fM或更小、2fM或更小、或1fM或更小的人FVIII的LOQ。
本文公开的方法可以具有不超过50％的精确度。在该实施方案的各方面，本文公开的方法可以具有不超过50％、不超过40％、不超过30％或不超过20％的精确度。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法具有不超过15％、不超过10％或不超过5％的精确度。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法可以具有不超过4％、不超过3％、不超过2％或不超过1％的精确度。
本文公开的方法可以具有至少50％的准确度。在该实施方案的各方面，本文公开的方法可以具有至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的准确度。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法可以具有至少85％、至少90％或至少95％的准确度。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法可以具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的准确度。
本文公开的方法可以具有统计学上显著的下渐近线的信噪比和统计学上显著的上渐近线的信噪比。在该实施方案的各方面，本文公开的方法可以具有例如至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1或至少20:1的下渐近线的信噪比。在该实施方案的其他方面，本文公开的方法可以具有例如至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1、至少40:1、至少45:1、至少50:1、至少60:1、至少70:1、至少80:1、至少90:1、或至少100:1、至少150:1、至少200:1、至少250:1、至少300:1、至少350:1、至少400:1、至少450:1、至少500:1、至少550:1或至少600:1的上渐近线的信噪比。
本文公开的方法的特异性定义了所述方法排除其他相关组分(例如，来自其他动物的FVIII)测量人FVIII的能力。本文公开的方法的选择性描述了所述方法区分样品中的各种物质的能力。本文公开的方法的线性描述了所述方法引出直接地或通过明确的数学变换与样品中的人FVIII的浓度成比例的结果的能力。因此，在一个实施方案中，本文公开的方法可以区分人FVIII与来自其他动物的FVIII，人FVIII的活性为来自其他动物的FVIII的活性的70％或更小、60％或更小、50％或更小、40％或更小、30％或更小、20％或更小或10％或更小。
本文公开的方法的重现性描述了在所述方法的正常(但可变)条件下对于相同样品获得的结果的再现性。本文公开的方法的稳健性描述了所述方法测量其能够保持不受方法参数中的小但有意的变化影响的能力，并且提供了其在正常使用中的可靠性的指示。因此，虽然重现性评价不可避免的变化，但稳健性评价有意的变化。通过重现性和稳健性评价的典型参数包括冷冻/解冻、孵育时间、孵育温度、试剂寿命、样品制备、样品储存、细胞传代次数、许多毒素、纯化之间的变异性和切口反应之间的变异性的影响。本文公开的方法的稳健性参数包括细胞库(冷冻的开始、中间和结束)、细胞传代水平、细胞接种密度、细胞原液密度(培养多少天)、烧瓶中的细胞年龄(接种的等待时间)、孵育时间、不同板、过量的血清和试剂来源。本文公开的方法的系统适用性描述了所述方法通过分析参考标准确定随时间推移的方法性能(包括试剂和仪器的性能)的能力。系统适用性是指设备、电子器件、测定性能和待分析的样品构成集成系统的事实。系统适用性可以通过平行性测试进行评价，平行性是当将对数剂量对响应作图时，参考品的系列稀释液和样品的系列稀释液应产生平行曲线。
本说明书的各方面公开了试剂盒，所述试剂盒包含可用于实施本文公开的方法的一种或多种组分。试剂盒的一种或多种组分可以包含本文公开的一种或多种捕获剂、一种或多种固相支持物和/或检测人FVIII的存在和/或测量人FVIII的活性所必需的一种或多种试剂。本文公开的试剂盒可以包括固相和附着于固相的捕获剂。本文公开的试剂盒可以包括在一个小瓶中或在单独的小瓶中的用于显色测定的一种或多种试剂，包括活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶。在一些实施方案中，凝血酶可以作为凝血酶原提供。在一些实施方案中，FIXa和FX可以组合在一个小瓶中，其中磷脂在单独小瓶中并且钙离子在另一个单独的小瓶中。在一些实施方案中，FIXa、磷脂和Ca组合在一个小瓶中，并且FX在单独的小瓶中。本文公开的试剂盒还可以包括FXa特异性显色底物(例如，CH3OCO-D-环己基丙氨酸-Gly-Arg-pNA)和任选地终止剂(例如，乙酸)。显色底物小瓶也可以含有合成凝血酶抑制剂。试剂可以是任何来源，例如人或动物(主要是牛来源)。
本文公开的试剂盒还可以包括用作捕获剂和/或测定步骤的阳性对照的FVIII参考制剂。如果需要，该组分可以以多种浓度包括在测试试剂盒中，以便于产生标准曲线，在测试样品中检测到的信号可以与所述标准曲线进行比较。
本文公开的试剂盒还可以包括以下中的一种或多种：结合缓冲液、反应缓冲液、FVIII稀释缓冲液和洗涤缓冲液，诸如本文所述的那些。
试剂盒通常包括具有容纳组分(作为一种或多种单独的组合物或任选地作为其中试剂的相容性将允许的混合物)的一个或多个容器的包装。试剂盒还可以包括从使用者的观点来看可能是期望的其他材料，诸如缓冲剂、稀释剂、标准品和/或可用于样品处理、洗涤或进行测定的任何其他步骤的任何其他材料。本文公开的试剂盒还可以包括用于实施本文公开的一种或多种方法的说明书。包括在本文公开的试剂盒中的说明书可以附加到包装材料上或可以作为包装插页包括。虽然说明书通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本文公开的实施方案涵盖能够存储此类说明书并将其传送到最终使用者的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所用，术语“说明书”可以包括提供说明书的互联网站点的地址。
实施例
本发明还通过以下实施例来描述和展示。然而，本说明书中任何地方使用这些和其他实施例仅仅是说明性的，决不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于本文所述的任何特定的优选实施方案。实际上，在阅读本说明书后，本发明的许多修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下进行此类变化。因此，本发明仅由所附权利要求的术语以及那些权利要求所授权的等同物的全部范围来限定。
实施例1：基于单克隆抗体的显色FVIII活性测定的描述
ELISA读数器ELx808(BioTek；Szabo,Vienna,Austria)、板洗涤器(ELx405，BioTek)、移液机器人系统(Precision 2000；BioTek)和板振荡器(PHMP-4；GrantBio.Szabo,Vienna,Austria)用于开发该方法。此外，96孔Nunc MaxiSorp F96平底板从ThermoFisher Scientific(Vienna，Austria)获得。缓冲剂化学品购自VWR(Vienna，Austria)，Tween 20(EIA级)获得自Bio-Rad(Vienna，Austria)，并且盐酸苄脒一水合物获自Sigma(Vienna，Austria)。单克隆抗因子VIII(FVIII)抗体购自Green MountainAntibodies(A2-HC；GMA-8024；Green Mountain Antibodies，Szabo,Vienna,Austria)。用于显色FVIII活性测试的试剂(试剂A：磷脂、人血清白蛋白；批号#7M..；试剂B：FIX、FX、Ca2+人血清白蛋白，批号#7L..；底物FXa-1：10μmol+0.012μmol a-NAPAP/小瓶，批号#8M..；FVIII反应缓冲液：6.06g/L Tris，3.03g/L Na2EDTA，25g/L NaCl，pH 8.3，批号#9T..；以及FVIII稀释缓冲液：3.4g/L咪唑，5.85g/L NaCl，pH 7.4，批号#9Y..)来自Baxter(Vienna，Austria)。制备以下缓冲液/溶液：包被缓冲液(0.1M NaHCO3,0.1M Na2CO3,pH 9.5)、磷酸盐缓冲盐水(PBS；0.8％ NaCl,0.02％ KCl,0.02％ KH2PO4,0.126％ Na2HPO4×2H2O,pH 7.2)、洗涤缓冲液(PBST；含有0.05％ Tween 20的PBS)、封闭/稀释缓冲液(含有0.1％脱脂乳粉、2mM苄脒、650mM NaCl的PBST)、终止溶液(20％乙酸)和抗体捕获溶液(抗FVIII单克隆抗体，在包被缓冲液中以1:100稀释)。
将100μL/孔的抗体捕获溶液在+2℃至+10℃下包被过夜。在用PBST进行三次洗涤步骤之后，将板在室温(RT)下用200μL/孔封闭缓冲液封闭1h，然后洗涤。将孔用100μL/孔稀释缓冲液填充。直接在板上一式两份制备六份系列1+1稀释液，用于标准品、样品和测定对照。将位置B11和B12用作测定空白。将FVIII浓度为0.97IU/mL的人血浆标准品ORKL17(Siemens)用作参考标准品。六点校准曲线覆盖了3.03至97mIU/mL的FVIII活性范围。将样品根据其估计的FVIII水平稀释以获得校准曲线范围内的FVIII浓度，而在板上制备系列1+1稀释液之前，将测定对照(正常参考血浆CRYOcheck，Precision BioLogic CCNRP-05)稀释1/5。将稀释液在室温下孵育1h。然后将洗涤的板与FVIII稀释缓冲液(200μL/孔)在室温下孵育10分钟并排空，之后使用Precision 2000系统进行显色FVIII活性测定。将FVIII稀释缓冲液与试剂A1+1混合并加载(40μL/孔)；添加试剂B(20μL/孔)，并且将板在板振荡器上在室温下孵育15分钟。添加底物(100μL/孔)，并且在室温下孵育25分钟之后，添加终止溶液(40μL/孔)。在405nm(参考波长620nm)下测量该板；定量评价基于在空白校正的光密度(OD)与六个非零测定校准品的FVIII浓度之间的双对数校准曲线。
测定(图1)包括人FVIII的特异性捕获步骤，随后是显色活性测定，其用在孔表面上捕获并固定的人FVIII进行。在该测定中，FVIII首先被人凝血酶活化以形成活化的FVIII(FVIIIa)。然后FVIIIa与过量试剂提供的因子X(FX)和经活化的因子FIX(FIXa)形成十酶复合物，导致产生经活化的因子X(FXa)。在严格依赖于FVIII浓度的限定范围内的所得FXa浓度然后通过水解底物CH3OCO-D-环己基丙氨酸-Gly-Arg-pNA以形成显色pNA来确定。
实施例2：选择适当的捕获抗体
适用于本发明方法的抗FVIII抗体应具有至少以下特征：(1)对人FVIII的绝对选择性和(2)抗体与FVIII的结合不应干扰显色FVIII活性测试。针对表1中总结的抗FVIII抗体研究后一个要求。
表1.抗FVIII抗体的适用性研究
名称 来源 表位
GMA-8024 Green Mountain Antibodies 重链，A2结构域
GMA-8023 Green Mountain Antibodies 重链，A2结构域
ESH-4 American Diagnostica N/A
RFF-VIIIC/5[1] BioRad 轻链
RFF-VIIIC/8[2] BioRad 重链
ESH-8 American Diagnostica N/A
GMA-012 Green Mountain Antibodies 重链，A2结构域
N55195M American Diagnostica 轻链
NB：关于表位特异性的数据由抗体制造商提供。
将抗体以通过在PBS中稀释获得的10μg/mL的浓度包被在F96微板的孔(100μL/孔)上。在用PBST的洗涤步骤之后，将在含有650mM NaCl、1mg/mL脱脂乳粉和2mM苄脒的PBST中制备的B结构域缺失(BDD)rFVIII的系列1+1稀释系列加载到孔中(100μL/孔)并在室温下孵育60分钟。然后将板洗涤并如上面实施例1中所述进行进一步处理。图2显示了对于表1中所列出的抗FVIII抗体，对于188、94和47mU/mL的BDD rFVIII浓度获得的空白校正的OD。在图2中从左到右，抗FVIII捕获抗体是：GMA-8024、GMA-8023、GMA-012、ESH-8、ESH-4、RFF-VIIIC/8、RFF-VIIIC/5和N55195M。
根据用于捕获BDD rFVIII的抗体，在显色FVIII测定中的响应显著不同。然而，对于所有那些抗体都观察到剂量依赖性响应，其提供清楚的信号。针对FVIII的重链A2结构域的抗体GMA-8024提供了所评价的所有三种FVIII浓度的最高信号，并因此用于以下实施例中。
实施例3：用人参考血浆制剂获得的测定校准曲线
将标记的FVIII活性为0.97IU/mL的人参考血浆制剂ORKL17(Siemens)(批号503267)用于测定校准曲线。该曲线包括六个系列稀释液(1/10、1/20、1/40、1/80、1/160和1/320)，并且范围为3.03至97.0mIU/mL。表2显示了六个测定校准品D1至D6和空白的平均空白校正光密度(OD)。表2还显示了在空白校正的OD的对数与测定标准品D1至D6的FVIII浓度之间计算的log-log回归曲线的属性。具体地，显示了斜率、y-截距(y-int)、相关系数r和相对总误差(RTE)。根据以下公式计算RTE：RTE＝|xn-xc|+2SD xc×100，其中xn和xc分别表示测定标准品的标称浓度和计算浓度。通过将校正曲线标准品的空白校正OD插入到校准曲线方程式中，获得测定标准品的计算浓度xc。将所得的浓度与各自的稀释因子相乘，并最后将六个结果平均，也计算该平均值的标准偏差(SD xc)。对于这些校准曲线属性，显示了108条曲线的最小值和最大值以及平均值和对应的相对标准偏差。
表2.用人参考血浆制剂获得的校准曲线
缩写RSD和N/A分别代表相对标准偏差和不适用。
在3.03至97.0mIU FVIII/mL范围内的108条log-log校准曲线展示出相似的形状、良好的准确度和足够的精确度。因此，确定标准品D1至D6的平均空白校正OD的RSD具有不超过15.2％的RSD，较低浓度显示出较高的RSD。log-log校准曲线的平均斜率和平均y-截距的RSD分别为4.3％和-5.3％，证明了校准曲线的形状相似。0.9996的平均相关系数(单个值在0.9977至1.0000范围内)和6.5％的低平均RTE(单个值在1.6％至18.3％范围内)均证实了所应用的曲线拟合模型的准确度。值得注意的是，RTE不应超过25％以指示给定校准曲线的适当拟合。图3显示了平均校准曲线和反向拟合测定校准与其标称值的一致性。
校准品反向拟合的结果确证了校准曲线的良好准确度，因为所有反向拟合值与其各自标称值的偏差小于±14％。这明显在例如由用于验证生物分析方法的EMA指南[2]所限定的±20％范围以内。允许准确和精确确定3.03mIU FVIII/mL D6的测定灵敏度与常规显色测定的灵敏度相似，并且似乎没有明显减少，尽管在运行显色测试之前FVIII必须被抗体捕获。
实施例4：用人B结构域缺失的(BDD)重组FVIII获得的测定校准曲线
使用具有750IU/mL的活性的人重组BDD FVIII制剂，使用实施例1中所述的方法构建校准曲线。校准曲线的范围为2.9至93.8mIU/mL。表3显示了测定校准品D1至D6、空白、以及斜率、y-截距、相关系数r和RTE的平均空白校正OD，其针对四条log-log校准曲线进行计算。
表3.用重组BDD-FVIII制剂获得的校准曲线。
缩写RSD和N/A分别代表相对标准偏差和不适用。
考虑到捕获抗体GMA-8024的表位的位置(其位于重链的A2结构域中)，用BDDFVIII制剂获得的信号在高度上类似于全长血浆FVIII的信号。四(4)个log-log校准曲线展示出相似的形状、良好的准确度和足够的精确度。因此，所确定的平均空白校正OD的RSD不超过7.1％，而斜率和y-截距的RSD分别低至2.0％和1.8％。0.9989的平均相关系数和12.0％的平均RTE证实了所应用的曲线拟合模型的准确度。校准品反向拟合的结果确证了校准曲线拟合的足够准确度，其中所有反向拟合值与其各自标称值的偏差小于±13％。尽管在运行显色测试之前有通过单克隆抗体捕获FVIII的附加步骤，但所述测定的灵敏度与常规显色测定的灵敏度相似，允许准确和精确地确定测定标准品D6中所含的2.9mU FVIII/mL。此外，获得血浆来源的全长FVIII和BDD rFVIII的相同数量级的斜率，证明了捕获步骤对两种FVIII分子都有效地起作用。图4显示了通过使用BDD rFVIII制剂获得的平均校准曲线和反向拟合测定校准与其标称值的一致性。
实施例5：实验室动物含枸橼酸盐的血浆样品的选择性研究
通过在1/10的最小稀释度下测量不同含枸橼酸盐的实验室动物血浆样品证实了基于抗体的显色FVIII活性测定的选择性。表4显示了所获得的结果，提供了具有2.9mU/mL的最低FVIII浓度的测定标准品D6的平均OD，空白的平均OD和对1/10稀释的动物血浆样品测量的那些。此外，列“Δ空白％”和“ΔD6％”涉及对于1/10稀释血浆样品确定的信号与空白和测定标准品D6的信号，分别显示了计算为(OD血浆-OD空白)/OD空白6×100和(OD血浆-ODD6)/ODD6×100的相对差异。
表4.含枸橼酸盐的动物血浆物质的选择性研究
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在六(6)个含枸橼酸盐的动物血浆样品中，只有绵羊血浆样品显示的信号略高于测定空白的信号，而所有其他样品提供的信号略低于空白。然而，这些微小的差异并不表明对测定的实质性干扰，而是反映了测量的变异性。以含有2.9mU FVIII/mL的最低测定标准品的百分比表示，由1/10稀释的动物血浆样品引起的信号低至少20.4％。这些数据证实了基于抗体的显色FVIII测定对人FVIII的选择性，因为没有证据表明内源性动物FVIII干扰所述测定。
实施例6：实验室动物血清样品的选择性研究
通过在1/10的最小样品稀释度下测量不同动物血清样品证实了基于抗体的显色FVIII活性测定的选择性。表5显示了所获得的结果，提供了具有2.9mU/mL的最低FVIII浓度的测定标准品D6的平均OD，空白的平均OD和对1/10稀释的动物血清样品测量的那些。此外，列“Δ空白％”和“ΔD6％”涉及对于血清样品确定的信号与空白和测定标准品D6的信号，分别显示了根据(OD血浆-OD空白)/OD空白×100和(OD血浆-ODD6)/ODD6×100计算的相对差异。
表5.含枸橼酸盐的动物血清物质的选择性研究
所有血清样品提供的信号略低于空白的信号，与空白的差值不超过2.5％。以含有2.9mU FVIII/mL的最低测定标准品的百分比表示，由1/10稀释的血清样品引起的信号低至少23.3％。这些数据证实了基于抗体的显色FVIII测定对人FVIII的选择性，因为没有证据表明内源性动物蛋白质干扰所述测定。
实施例7：含枸橼酸盐的实验室动物血浆样品中的人FVIII回收率
含枸橼酸盐的动物血浆样品中加标了100mU人FVIII，并以1/10的最终稀释度进行测量。所获得的FVIII回收率是可接受的，即在通常接受的80％-120％范围内[2]，并且从83.3％变化至116.9％，尽管100mU/mL的低FVIII浓度用于加标回收率实验。这些数据证实了由抗体驱动的捕获步骤引入的选择性，因为没有来自内源性动物因子VIII的信号，这将明显地增加回收率。当运行对人FVIII不具有特异性的常规显色因子VIII测定时，将观察到这种提高的回收率。图5显示了对于加标至含枸橼酸盐的动物血浆物质中的人FVIII确定的单个回收率。
实施例8：实验室动物血清样品中的人FVIII回收分析
动物血清样品中加标了100mU人FVIII，并以1/10的最终稀释度进行测量。图6显示了对于加标至动物血清样品中的人FVIII确定的回收率。
回收率良好，即在通常接受的80％-120％范围内[2]，并且从86.7％变化至115.8％，尽管100mU/mL的低FVIII浓度用于加标回收率实验。数据证实了测定的选择性，因为对于包括动物白蛋白和免疫球蛋白的主要血清蛋白，不存在由以相对高的浓度引入测定中的动物血清蛋白的存在引起的干扰。
实施例9：动物血浆和血清样品中加标的人FVIII的平行性研究
当用在缓冲液中稀释的标准品构建测定校准曲线时，样品的浓度-响应曲线与测定标准品的浓度-响应曲线足够平行是先决条件。然而，基于缓冲液的校准曲线的使用旨在不仅增加测定的稳健性，而且通过减少生物试剂的数量和通过不需要针对不同动物基质构建单个校准曲线来降低其复杂性。缓冲液中的分析物的稀释系列与动物基质之间的足够平行性证明没有血浆/血清基质的影响可以实现这种简化。因此，使用对于加标了100mU/mL人FVIII的血浆/血清样品获得的结果检查平行性。图7显示了对于加标至含枸橼酸盐的山羊、绵羊和食蟹猴血浆中的人FVIII的剂量-响应曲线。
尽管存在高浓度的动物蛋白质，但是从稀释度1/10开始，含枸橼酸盐的山羊、绵羊和食蟹猴血浆的浓度-响应曲线的斜率具有类似于测定标准品的斜率。因此，动物样品的斜率与测定标准品的斜率相差小于8％。它们的线性几乎相同，其中所有判定系数为至少0.995。这些数据证明，动物蛋白质基质最有可能对测定没有实质性影响，因此支持使用基于缓冲液的校准曲线的重要测定简化。图8显示了对于加标至含枸橼酸盐的兔和大鼠血浆和小鼠血清中的人FVIII的剂量-响应曲线。
从稀释度1/10开始，含枸橼酸盐的大鼠和兔血浆以及小鼠血清的浓度-响应曲线的斜率具有与测定标准品的浓度-响应曲线相似的斜率，其中与测定标准品的差值小于7％。它们的线性几乎相同，其判定系数为至少0.992。这些数据证明，动物蛋白质基质最有可能对测定没有实质性影响，因此支持使用基于缓冲液的校准曲线的重要测定简化。图9显示了对于加标至含枸橼酸盐的恒河猴血浆和豚鼠血清中的人FVIII的剂量-响应曲线。
恒河猴血浆和豚鼠血清的浓度-响应曲线的斜率具有与测定标准品的浓度-响应曲线相似的斜率，其中动物样品的剂量-响应曲线的斜率与测定标准品的剂量-响应曲线的斜率相差小于6％。它们的线性是相同的(R2＝0.999)。这些数据证明，动物蛋白质基质最有可能对测定没有实质性影响，因此支持使用基于缓冲液的校准曲线的重要测定简化。图10显示了对于加标至猪和仓鼠血清中的人FVIII的剂量-响应曲线。
猪和仓鼠血清的浓度-响应曲线的斜率具有与测定标准品的浓度-响应曲线相似的斜率，其中动物样品的斜率与测定标准品的斜率相差小于5％。它们的线性几乎相同，其中相关系数为至少0.999。这些数据证明，动物蛋白质基质最有可能对测定没有实质性影响，因此支持使用基于缓冲液的校准曲线的重要测定简化。
实施例10：食蟹猴血浆中的选定测定性能特征
对于该研究，代替Siemens参考血浆，使用指定FVIII浓度为0.88IU/mL的参考血浆SSC/ISTH#04用于测定校准，如实施例1所述进行测定。这导致灵敏度稍微增加，校准范围从2.8至88mIU/mL，但对校准曲线的质量属性没有影响。在食蟹猴血浆中的性能特征中，人FVIII测量的选择性通过测量天然的和加标了人FVIII之后的含枸橼酸盐的食蟹猴血浆来证实。用重组人全长FVIII和人重组BDD FVIII进行该加标。加标的样品用于计算FVIII回收率作为测定准确度的量度，而它们的重复分析提供关于测定重复性的数据。最后，对于加标的样品的稀释系列获得的浓度-响应曲线允许评价标准品和样品之间的平行性。表6显示了对于含枸橼酸盐的食蟹猴血浆池的六个1/10稀释液和对应测定标准品D6(代表2.8mIU/mL的FVIII浓度)确定的空白校正OD。
表6.含枸橼酸盐的食蟹猴样品的选择性研究
测定标准品D6代表2.8mIU/mL的FVIII浓度。
六个1/10稀释的含枸橼酸盐的食蟹猴血浆样品具有接近零的空白校正OD，其平均值为0.001和-0.003，而含有最低FVIII浓度(2.8mIU/mL)的对应测定标准品分别显示出的空白校正OD为0.107和0.100。因此，对于含枸橼酸盐的食蟹猴血浆发现的FVIII浓度<0.03IU/mL，代表测定的定量下限。
对于食蟹猴血浆中的加标回收率研究，将七份稀释缓冲液与两份含枸橼酸盐的食蟹猴血浆和一份稀释的全长重组FVIII或重组BDD FVIII混合，分别代表1.63IU/mL和1.76IU/mL的FVIII浓度。然后将这些样品直接在板上以1+1连续稀释，导致食蟹猴血浆的最终稀释度为1/10，对于加标了全长和BDD rFVIII的样品，分别导致81.5mIU/mL和88.1mIU/mL的标称FVIII浓度。表7显示了对于加标至含枸橼酸盐的食蟹猴血浆样品中的全长和BDDrFVIII确定的回收率。
表7.食蟹猴血浆样品的准确度和精确度研究
所确定的所有回收率均在普遍接受的100±20％范围内[2]，对于加标的全长rFVIII制剂确定的回收率略好。特别地，全长和BDD rFVIII制剂的平均回收率分别为102.7％和92.4％。对于一式三份加标的平均值确定的RSD不超过2.8％。这些数据证实，通过本发明的测定可以实现人FVIII的准确和精确测量，而不受内源性猴FVIII的干扰。表8显示了剂量-响应曲线的斜率、相对斜率(列“斜率％”)和相关系数。
表8.食蟹猴血浆样品的平行性研究
行“斜率％”显示了相对斜率，其表示为对应测定标准品的剂量-响应曲线的斜率的百分比。
对于加标的猴血浆样品的剂量-响应曲线确定的斜率与测定标准品的斜率相差不超过6％。对于加标了全长和BDD rFVIII的血浆样品，剂量-响应曲线的平均相对斜率分别为104.9％和100.5％。
实施例11：缓冲液中的选定测定性能特征
将冻干人参考血浆制剂CRYOcheck(Precision BioLogic)用作测定对照。图11A-11D显示了由三个操作者在六个月的时间段内进行的108次测量的数据，以展示该时间段内的精确度和准确度。
通过由三个操作者在六个月时间段内进行的108次测量获得的平均值为0.57±0.06IU/mL(RSD 10.4％)。如用D’Agostino&Pearson检验(p＝0.1174；GraphPad Prism8.3)所检查，数据呈正态分布。用GraphPad Prism 8.3计算的ANOVA表明，由三个操作者获得的结果之间没有统计学上显著的差异(p＝0.3407)。这些数据证实了测定在六个月的延长时间内具有足够的中间精确度和稳健性。表9显示了用全长和BDD rFVIII制剂进行的重复性研究的结果。
表9.rFVIII制剂的重复性分析
两种rFVIII制剂都具有高于30IU/mL的FVIII活性，并因此分别从1/400和1/20000稀释度开始制备连续稀释系列用于测量全长和BDD rFVIII制剂。在一次运行中对于六倍测量获得的RSD很低：对于全长和BDD rFVIII确定的RSD分别为3.0％和1.8％。因此，这些结果符合生物分析方法的一般精确度要求[2]。
实施例12：溶剂-去污剂病毒灭活溶液对基于抗体的显色FVIII测定的影响
基于抗体捕获FVIII，随后进行显色活性测量提供了另外的选择来测量样品基质中的FVIII活性，由于对测定的相当大的干扰，因此迄今为止不适用于所述测量。本发明测定的优点在于只要对捕获步骤没有影响，就可以通过洗涤捕获的FVIII去除干扰显色测定的物质。
通常用作有效病毒灭活溶液并含有1％ Triton X-100、0.3％聚山梨醇酯80和0.3％磷酸三正丁酯(tnBP)的溶剂/去污剂(S/D)溶液是与显色活性测定不相容的特定基质的实例。然而，预计S/D溶液组分的存在不会干扰板结合的抗体对FVIII的捕获。图12显示了对于在S/D溶液(即1％Triton X 100、0.3％聚山梨醇酯80和0.3％tnBP)的存在下含有10IU人FVIII/mL的样品以及在PBS缓冲液中的相同FVIII浓度(＝天然FVIII)获得的浓度-响应曲线。
对于在S/D溶液和缓冲液中的FVIII获得的几乎相同的稀释-响应曲线证明S/D混合物对测定性能没有影响。斜率和平方相关系数证明了两个样品之间的相似性。图13显示了类似实验的结果，但是仅使用1IU/mL的FVIII浓度，需要1/10的样品稀释度并且因此在基于抗体的FVIII捕获期间显著提高S/D组分的水平。
在使用较低浓度FVIII的条件下，在初始捕获步骤期间存在高得多的S/D组分浓度，并且两条稀释-响应曲线在斜率和线性方面高度相似。因此，S/D溶液的存在对测定性能具有最小的影响或没有影响。图14显示了在S/D溶液中和在S/D溶液的单个组分中的三种水平的人FVIII(10IU/mL、1IU/mL和0.1IU/mL)的回收率。图15显示了在S/D病毒灭活溶液的单个组分的存在下的测定性能。
参考文献
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[2]EMEA/CHMP/EWP/192217/2009.Bioanalytical assay validation(2011).
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本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员将根据前面的描述而变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料据此以引用的方式整体并入，如同在本说明书中物理地存在一样。

Claims (41)

1.一种用于测量样品中人凝血因子VIII(FVIII)的活性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述样品与选择性地结合所述人FVIII的捕获剂在足以允许所述捕获剂与所述人FVIII选择性地结合的条件下和时间内孵育，由此形成反应混合物，其中所述捕获剂附着于固体支持物；
b)从所述反应混合物中去除未结合的人FVIII级分；和
c)使用显色测定测量所述反应混合物中人FVIII的活性。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括d)通过与FVIII参考制剂比较来确定所述反应混合物中人FVIII的活性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述显色测定通过以下方式来进行：
c1)向所述反应混合物中添加活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶，并将所述反应混合物在足以产生活化的FX(FXa)的条件下和时间内孵育；
c2)向所述反应混合物中添加FXa特异性显色底物，并在足以产生可测量信号的条件下和时间内孵育所述反应混合物；
c3)任选地，向所述反应混合物中添加终止剂以终止从所述FXa特异性显色底物产生信号；和
c4)测量由所述反应混合物产生的所述信号。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述显色底物是CH3OCO-D-环己基丙氨酸-Gly-Arg-pNA。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述终止剂是乙酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，所述捕获剂选择性地结合至人FVIII的A1、A2、A3、B、C1或C2结构域。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述捕获剂选择性地结合至人FVIII的A2结构域。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述捕获剂不结合所述人FVIII的B结构域。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述捕获剂是抗体、抗原结合片段、亲和体、适体或亲和配体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述捕获抗体是GMA-8024、GMA-8023或其抗原结合片段或变体。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述样品包括来自非人动物的血浆和/或血清。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述非人动物是实验室动物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述非人动物是绵羊、山羊、食蟹猴、兔、大鼠、恒河猴、小鼠、猪、仓鼠、小型猪或豚鼠。
14.如权利要求9-13中任一项所述的方法，其中所述样品包含含枸橼酸盐的血浆。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述样品包含一种或多种FVIII活性模拟剂。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述FVIII活性模拟剂是抗体、抗原结合片段、肽、核酸或小分子。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述FVIII活性模拟剂是双特异性抗体。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述双特异性抗体是艾美赛珠单抗。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中将所述样品在步骤a)之前稀释。
20.如权利要求19所述的方法，其中将所述样品以1:1至约1:100,000的系数稀释。
21.如权利要求20所述的方法，其中将所述样品以1:2至约1:20,000的系数稀释。
22.如权利要求21所述的方法，其中将所述样品以约1:10的系数稀释。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是烧瓶、ELISA板、多孔板、膜、管、片、柱或微粒。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中将步骤a)中的所述孵育在室温下进行约1小时。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中将步骤c1)中的所述孵育在室温下进行约15分钟。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中将步骤c2)中的所述孵育在室温下进行约25分钟。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中在步骤b)中去除未结合的人FVIII级分通过用洗涤缓冲液洗涤所述固体支持物来进行。
28.如权利要求27所述的方法，其中在步骤b)中去除未结合的人FVIII级分通过用PBS-Tween缓冲液洗涤所述固体支持物约三次来进行。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述人FVIII是重组FVIII。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述人FVIII是全长FVIII。
31.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述人FVIII是B结构域缺失的FVIII。
32.一种用于测量样品中人凝血因子VIII(FVIII)活性的试剂盒，其包括：
i.选择性地结合所述人FVIII的捕获剂，其中所述捕获剂附着于固体支持物上；
ii.包含活化的因子IX(FIXa)、因子X(FX)、钙离子、磷脂和凝血酶中的一种或多种的第一小瓶；
iii.包含FXa特异性显色底物的第二小瓶；和/或
iv.任选地，包含终止剂的第三小瓶。
33.如权利要求32所述的试剂盒，所述捕获剂选择性地结合至人FVIII的A1、A2、A3、B、C1或C2结构域。
34.如权利要求32或33所述的试剂盒，其中所述捕获剂选择性地结合至所述人FVIII的A2结构域。
35.如权利要求32或33所述的试剂盒，其中所述捕获剂不结合所述人FVIII的B结构域。
36.如权利要求32-35中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获剂是抗体、抗原结合片段、亲和体、适体或亲和配体。
37.如权利要求36所述的试剂盒，其中所述捕获抗体是GMA-8024、GMA-8023或其抗原结合片段或变体。
38.如权利要求32-37中任一项所述的试剂盒，其中所述固体支持物是烧瓶、ELISA板、多孔板、膜、管、片、柱或微粒。
39.如权利要求32-38中任一项所述的试剂盒，其中所述显色底物是CH3OCO-D-环己基丙氨酸-Gly-Arg-pNA。
40.如权利要求32-39中任一项所述的试剂盒，其中所述终止剂是乙酸。
41.如权利要求32-40中任一项所述的试剂盒，其还包括反应缓冲液、FVIII稀释缓冲液、洗涤缓冲液和/或FVIII参考制剂中的一种或多种。
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