CN117821415A - 一种大分子修饰的Bst DNA聚合酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大分子修饰Bst DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述大分子修饰Bst DNA聚合酶为聚乙二醇修饰的Bst DNA聚合酶，本发明经过大分子聚乙二醇修饰的Bst DNA聚合酶具有比野生型更好的热稳定性，而且对于常见核酸扩增抑制剂的耐受能力更强，同时经过修饰的Bst DNA聚合酶用于环介导等温扩增中，对于粗样本的检测效果更好。
Description
技术领域
本发明属于医药生物工程技术领域，尤其涉及一种大分子修饰的Bst DNA聚合酶及其制备方法和应用。
背景技术
Bst DNA聚合酶来源于Bacillus stearothermophilus，是一种具有链置换活性的DNA聚合酶，最适反应温度为65℃，温度超过70℃即基本失活，主要被用于环介导等温扩增(LAMP)。LAMP反应在60-65℃的恒温下进行，不需要PCR仪等较昂贵的仪器设备，反应快速，灵敏度高，被广泛用作病原微生物快速检测等领域。
然而，Bst DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶类似，在低温下容易发生非特异性扩增。常用抑制非特异性扩增的抗体和小分子化合物热启动策略，解离温度都高于65℃，不适用于Bst DNA聚合酶。另一方面，在使用LAMP快速检测病原微生物时，因为现场条件所限，往往只能使用粗裂解样本，而野生型Bst DNA聚合酶活性容易受到粗样本中裂解液、抗凝剂等抑制因子的抑制。因此，提高Bst DNA聚合酶的热稳定性和抑制剂耐受性，具有重要意义。目前对酶进行改造的主要技术是对蛋白质残基进行突变，或融合其他蛋白，需要从编码基因开始进行改造与筛选，成本高、耗费时间长，且经常达不到期望的效果。
聚乙二醇(PEG)及其衍生物是一类无毒、无免疫原性的合成大分子物质，具有良好的生物相容性。在生物制药领域，PEG被广泛用于蛋白类药物的修饰，通过与蛋白质表面氨基酸残基侧链的巯基、氨基等基团共价结合，改变目标蛋白的理化性质，从而改善药物的半衰期、亲和力、靶向性等性能。但在酶工程领域，利用PEG修饰酶蛋白的应用还较为少见。已有少量研究表明，PEG修饰不同种类的酶会带来不同效果。例如用PEG修饰漆酶，会使酶的活性上升；但用PEG定点修饰M-MLV逆转录酶的RNase H结构域中特定氨基酸，却会使RNase H失去活性。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种大分子修饰Bst DNA聚合酶，经过大分子PEG修饰的Bst DNA聚合酶，热稳定性和抑制剂耐受性均有较大提升，并在检测食品中沙门氏菌粗样本时表现出更高的反应效率。
本发明还提供一种大分子修饰Bst DNA聚合酶的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述大分子修饰的Bst DNA聚合酶为聚乙二醇修饰的Bst DNA聚合酶，由聚乙二醇和Bst DNA聚合酶组成。
进一步地，所述聚乙二醇的分子量为300Da～10,000,000Da，所述Bst DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量为10～40kDa。
进一步地，所述聚乙二醇与Bst DNA聚合酶的摩尔比为3:1～150:1。
进一步地，所述聚乙二醇与Bst DNA聚合酶的摩尔比为48:1～96:1。
本发明所述大分子修饰Bst DNA聚合酶的制备方法，具体步骤包括：将聚乙二醇与Bst DNA聚合酶混合，再加入NaCNBH3，后在缓冲液中孵育。
进一步地，所述缓冲液为乙酸盐缓冲液，pH值范围为4.5～7.0。
作为优选，所述乙酸盐缓冲液的pH值范围为4.5～5.5。
进一步地，孵育条件为在25～30℃下孵育2～24h。
作为优选，所述孵育条件为在25℃下孵育16h。
本发明所述大分子修饰Bst DNA聚合酶在LAMP反应中的应用。
进一步地，所述LAMP反应体系包括：聚合酶、缓冲液、待测样本DNA、引物组预混液、dNTP mix、MgSO4，所述LAMP反应条件为60～70℃温育20～30min。
作为优选，所述LAMP反应条件为65℃温育30min，产物可用琼脂糖凝胶电泳检测，也可在荧光定量PCR仪中实施检测。
目前对酶进行改造的主要技术是对蛋白质残基进行突变，或融合其他蛋白，需要从编码基因开始进行改造与筛选，成本高、耗费时间长，且经常达不到期望的效果。本发明首次将聚乙二醇修饰Bst DNA聚合酶，在特定修饰条件下，本发明使用聚乙二醇修饰BstDNA聚合酶后，发现修饰后的Bst DNA聚合酶具有更好的热稳定性，而且对于常见核酸扩增抑制剂的耐受能力更强，经过修饰的Bst DNA聚合酶用于环介导等温扩增中，对于粗样本的检测效果更好。在对蛋白抑制剂耐受性以及检测细菌粗样本等方面获得了预料不到的技术效果，同时克服了对酶进行改造时成本高、耗时长，效果不佳的技术问题。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
本发明经PEG修饰的Bst DNA聚合酶，在70℃下仍可保有80％以上活性；而未经修饰的Bst DNA聚合酶在70℃下已经失活，具有更好的热稳定性。
本发明经PEG修饰的Bst DNA聚合酶，对尿素、乙醇和Trizol等蛋白抑制剂的耐受性显著高于未经修饰的Bst DNA聚合酶。
本发明经PEG修饰的Bst DNA聚合酶，在检测细菌粗样本时，表现出更高的反应效率。
同时，本发明PEG修饰的Bst DNA聚合酶制备过程简单，使用方便。
附图说明
图1为经mPEG-ALD修饰Bst DNA聚合酶的反应条件筛选；
图2为尺寸排阻色谱层析纯化经mPEG-ALD修饰Bst DNA聚合酶的色谱图；
图3为经mPEG-ALD修饰的Bst DNA聚合酶热稳定性提升效果；
图4为经mPEG-ALD修饰的Bst DNA聚合酶耐抑制剂效果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)：凯正医药，货号M006；
Bst DNA聚合酶蛋白及Bst缓冲液：江苏百时美生物科技有限公司，货号EG23101；
NaCNBH3：Sigma，货号156159；
Evogreen荧光染料：江苏百时美生物科技有限公司，货号CP23101。
实施例1
制备PEG修饰的Bst DNA聚合酶
在0.2M乙酸盐缓冲液(pH 5.0@25℃)中，将特定分子量的PEG分子与Bst DNA聚合酶(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)，按一定摩尔比混合后，在25℃下孵育16h。取反应产物进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用Quantity One凝胶分析软件(Bio-Rad)获得蛋白条带光密度，计算PEG修饰率。修饰率计算公式为(修饰后蛋白条带光密度之和/总蛋白光密度)×100％。
(1)筛选最优修饰条件
筛选Bst DNA聚合酶与单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)比例：在0.2M乙酸盐缓冲液(pH 5.0@25℃)中，将500μg Bst DNA聚合酶蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)与mPEG-ALD(分子量20kDa)，分别按照1:3、1:6、1:12、1:24、1:48和1:96的摩尔比混合，再分别加入终浓度为20mM的NaCNBH3，在25℃下孵育16h，反应结束后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液终止反应。使用SDS-PAGE凝胶电泳检测产物并采用本实施例计算修饰率的方法进行计算。结果如图1(a)所示，当Bst DNA聚合酶蛋白与mPEG-ALD摩尔比达到1:48后，PEG修饰率达到最高，稳定在77％左右。
筛选孵育时间：将500μg Bst DNA聚合酶蛋白与mPEG-ALD按照1:48的摩尔比，在pH为5.5的乙酸盐缓冲液中混合，再加入终浓度为20mM的NaCNBH3，在25℃下分别孵育2、4、8、16、24h，反应结束后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液终止反应。使用SDS-PAGE凝胶电泳检测产物并计算修饰率。结果如图1(b)所示，当孵育时间为16h时，PEG修饰率达到最高，超过80％。
筛选反应pH值：将500μg Bst DNA聚合酶蛋白与mPEG-ALD按照1:48的摩尔比，在pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的乙酸盐缓冲液中混合，再分别加入终浓度为20mM的NaCNBH3，在25℃下孵育16h，反应结束后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液终止反应。使用SDS-PAGE凝胶电泳检测产物并计算修饰率。结果如图1(c)所示，当pH值为5.5时，PEG修饰率达到最高，超过80％。
因此，设置最优修饰条件为pH5.5，Bst DNA聚合酶与mPEG-ALD摩尔比为1:48，25℃反应16h。在最优条件下修饰后的产物，通过Chromdex 200PG尺寸排阻色谱层析柱(上海博格隆生物技术有限公司，货号AG319107)分离纯化，进样量为1.5mL，柱温25℃，流动相为0.2M乙酸盐缓冲溶液，流速为0.5mL/min，收集第一个主峰(图2)，得到mPEG-ALD修饰的BstDNA聚合酶。
实施例2
PEG修饰的Bst DNA聚合酶热稳定性
取经过mPEG-ALD修饰的Bst DNA聚合酶，按照中国专利202011002396.5公开的“一种快速测定DNA聚合酶活性的方法”所载实施例方法测定酶活(U)。然后按照表1所载LAMP反应体系，分别取8U/μL实施例1制备的mPEG-ALD修饰的Bst DNA聚合酶，以pBAD质粒DNA(10ng/μl，淼灵生物，P0079)为模板，设计特定的LAMP-1114引物组(引物组序列如表2所示)，分别在50、55、60、65、68、70℃下反应30min。同时以8U/μL未经修饰的Bst DNA聚合酶作为对照在相同条件下进行反应。产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶分析软件计算产物光密度及比例，将产物光密度最高对应的聚合酶相对活性设为100％。
表1LAMP反应体系
表2热稳定性测试LAMP引物序列
结果如图3所示，经mPEG-ALD修饰的Bst DNA聚合酶在68℃时保有接近85％的活性，在70℃时仍有80％左右活性。而未经修饰的Bst DNA聚合酶在68℃时活性下降到60％以下，70℃时已几乎完全失去活性。表明经过mPEG-ALD修饰后，Bst DNA聚合酶的热稳定性有显著提高。
实施例3
PEG修饰的Bst DNA聚合酶抑制剂耐受性
取8U/μL实施例1制备的经过mPEG-ALD修饰的Bst DNA聚合酶，按照表1所载LAMP反应体系，以10ng pBAD质粒DNA为模板，分别额外加入尿素(终浓度0～1000mM，200mM为一个梯度)、乙醇(终浓度0-8％(v/v)，2％为一个梯度)、Trizol(终浓度0-0.4％(v/v)，0.1％为一个梯度)，然后分别在65℃下反应30min。同时以8U/μL未经修饰的Bst DNA聚合酶作为对照在相同条件下进行反应。产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶分析软件计算产物光密度及比例，将产物光密度最高对应的聚合酶相对活性设为100％。
结果如图4所示，经mPEG-ALD修饰的Bst DNA聚合酶在800mM尿素、6％乙醇和0.3％Trizol的条件下，分别仍保有45％、39％和30％的活性；而未经修饰的Bst DNA聚合酶在对应条件下，活性仅有18％、2％和5％。可见经过mPEG-ALD修饰后，Bst DNA聚合酶的抑制剂耐受性有显著提高。
实施例4
PEG修饰的Bst DNA聚合酶检测沙门氏菌粗样本
将肠炎沙门氏菌(由武汉食品化妆品检验所提供)接种于TSB培养基中，36℃培养16h得到新鲜菌液。将菌液进行10倍系列稀释，从每个稀释浓度分别取1mL涂布TSB平板，37℃培养24h后进行菌落计数。取菌落数在102～107CFU/mL之间的肠炎沙门氏菌培养液各400μL，分别添加到10g鸡胸肉样品中，捣碎后吸取1mL样液，12000r/min离心5min,移去上清液,再加入1mL无菌水12000r/min离心5min,再次移去上清液，加热煮沸15min裂解细胞，冷却后12000r/min离心1min,取上清液作为模板用于LAMP检测，设计特定的肠炎沙门氏菌LAMP引物组(引物序列分别如表3中所示)。按表1所载LAMP反应体系，分别额外再加入终浓度为1×的Evogreen荧光染料，分别使用经mPEG-ALD修饰和未经修饰的Bst DNA聚合酶，在荧光定量PCR仪中，65℃反应30min，记录扩增曲线和Ct值。
表3肠炎沙门氏菌LAMP引物序列
结果如表4所示，在菌体浓度低于104CFU/mL时，经修饰的Bst DNA聚合酶Ct值相对未经修饰的酶显著提前1个循环数以上，表现出更好的扩增效率。尤其当菌体浓度低至102CFU/ml时，经修饰的Bst DNA聚合酶仍能保持较高的扩增效率，而未经修饰的Bst DNA聚合酶Ct值已滞后到28个循环，效率严重下降。
表4LAMP检测肠炎沙门氏菌结果(Ct值)
Claims (10)
1.一种大分子修饰的Bst DNA聚合酶，其特征在于，所述大分子修饰的Bst DNA聚合酶为聚乙二醇修饰的Bst DNA聚合酶，由聚乙二醇和Bst DNA聚合酶组成。
2.根据权利要求1所述的大分子修饰的Bst DNA聚合酶，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为300Da～10,000,000Da，所述Bst DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的大分子修饰的Bst DNA聚合酶，其特征在于，所述聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量为10～40kDa。
4.根据权利要求1所述的大分子修饰的Bst DNA聚合酶，其特征在于，所述聚乙二醇与Bst DNA聚合酶的摩尔比为3:1～150:1。
5.根据权利要求1所述的大分子修饰的Bst DNA聚合酶，其特征在于，所述聚乙二醇与Bst DNA聚合酶的摩尔比为48:1～96:1。
6.一种权利要求1所述大分子修饰Bst DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：将聚乙二醇与Bst DNA聚合酶混合，再加入NaCNBH3，后在缓冲液中孵育。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为乙酸盐缓冲液，pH值范围为4.5～7.0。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，孵育条件为在25～30℃下孵育2～24h。
9.一种权利要求1所述大分子修饰Bst DNA聚合酶在LAMP反应中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述LAMP反应体系包括：聚合酶、缓冲液、待测样本DNA、引物组预混液、dNTP mix、MgSO4，所述LAMP反应条件为60～70℃温育20～30min。
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