CN117820444A - 改造的病毒载体、慢病毒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了改造的病毒载体、慢病毒及应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供了一种包膜蛋白，所述的包膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供了使用上述的包膜蛋白制备慢病毒，所述的慢病毒的制备过程中还包括使用穿梭质粒、包装质粒pMDLg‑pRRE‑K和包装质粒pRsv‑rev‑kana‑V2进行制备。使用上述的慢病毒载体可以包装高滴度慢病毒，高效感染NK，获得外源基因的高效整合和表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及改造的病毒载体、慢病毒及应用。
背景技术
慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒科慢病毒亚科。目前已上市的CAR-T，如Kymriah、Breyanzi、Abecma、Carvykti均使用慢病毒携带CAR基因转导T细胞。常用的慢病毒载体衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV-1)，去除非必需基因和毒力基因，在安全性方面进行了一系列设计和改造，通常使用三代载体、四质粒系统包装慢病毒。原HIV-1的包膜蛋白Env只能结合CD4分子，感染CD4阳性T细胞，作为基因传递工具的慢病毒，使用异源病毒包膜蛋白VSV-G替换Env，可以进行假型的病毒包装。VSV-G通过结合LDLR受体，介导病毒内吞，具有广泛的亲嗜性，能够介导慢病毒内吞进入多种细胞类型。
慢病毒进行CAR基因改造T细胞，从工艺和质控方面已经非常成熟，然而，使用VSV-G包膜蛋白假型的慢病毒转导NK细胞，制备CAR-NK时，慢病毒的转导效率极低。T细胞活化后，VSV-G包膜蛋白假型的携带GFP的慢病毒可以使73％的T细胞转导成功，而NK细胞活化后，仅有2％的NK细胞可以被携带GFP的VSV-G包膜蛋白假型的慢病毒转导。慢病毒转导NK细胞的低效率阻碍了CAR-NK药物的研发和规模化生产。
文献报道，使用包膜蛋白RD114包装的逆转录病毒可以高效感染脐带血NK细胞，制备CAR-NK，经该工艺制备的脐带血靶向CD19的CAR-NK已经临床应用于11名B细胞肿瘤患者，具有73％(8/11)的反应率，其中7名患者完全缓解(Liu E,Marin D,Banerjee P,Macapinlac HA,Thompson P,Basar R,et al.Useof CAR-NKransduced Natural KillerCells in CD19-Positive Lymphoid Tumors.TheNew England journal of medicine2020；382:545-53)。包膜蛋白RD114来源于猫逆转录病毒(Feline retrovirus)，为其膜糖蛋白，通过结合细胞表面ASCT-2受体介导病毒进入胞内，和猫逆转录病毒同属于β逆转录病毒的狒狒内源性逆转录病毒(Baboon endogenous retrovirus,BaEV)的包膜蛋白(BaEVglycoprotein,BaEV-gp)也可通过ASCT2受体介导病毒进入胞内，且可通过另一受体ASCT1介导病毒进入胞内(RD114包膜蛋白不能结合ASCT1)，BaEV-gp相比RD114具有更广泛的亲嗜性。因此，使用BaEV-gp作为慢病毒的假型包膜蛋白，类似RD114包装的逆转录病毒，能够使慢病毒高效感染NK细胞，从而进行基因改造，制备CAR-NK。
目前，亟需一种能够包装出高滴度的慢病毒，且能够高效感染NK细胞的病毒载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效包装出高滴度慢病毒、高效感染NK细胞的病毒载体。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种包膜蛋白，所述的包膜蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
具体地，所述的包膜蛋白是基于BaEV的野生型氨基酸序列突变得到的。
进一步具体地，所述的BaEV的野生型氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
再进一步具体地，所述的突变为将SEQ ID NO:1序列中编码R区的序列(vltqqyqvlrtdeeaqd)剔除。
又一方面，本发明提供了一种核酸，所述的核酸编码权利要求1所述的包膜蛋白。
优选地，所述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
具体地，在SEQ ID NO:3所示的序列上添加终止密码“TAG”，克隆入编码VSV-G包膜蛋白的质粒(pMD2.G-K)，完全替换VSV-G的开放读框(从起始密码到终止密码)，得到编码BaEVRdel的质粒(ZL003-BaEVRdel)。
又一方面，本发明提供了上述的包膜蛋白或上述的核酸在制备慢病毒中的应用。
又一方面，本发明提供了一种慢病毒的制备方法，所述的制备方法包含使用上述的包膜蛋白进行制备。
优选地，所述的制备方法还包括使用穿梭质粒、包装质粒pMDLg-pRRE-K和包装质粒pRsv-rev-kana-V2进行制备。
进一步优选地，所述的穿梭质粒的序列如SEQ ID NO:6-7所示或如SEQ ID NO:10-11所示，所述的包装质粒pMDLg-pRRE-K的序列如SEQ ID NO:8所示，所述的包装质粒pRsv-rev-kana-V2的序列如SEQ ID NO:9所示。
再进一步优选地，所述的穿梭质粒、包膜蛋白、包装质粒pMDLg-pRRE-K和包装质粒pRsv-rev-kana-V2的比例为9:7:7:7。
具体地，所述的制备方法，包括以下步骤：
S1、将宿主细胞接种至培养基中培养，培养至活细胞密度为(4-6)×106cells/ml时进行慢病毒转染；
S2、将穿梭质粒、包膜蛋白、包装质粒pMDLg-pRRE-K和包装质粒pRsv-rev-kana-V2共同瞬时转染至宿主细胞，其中所述的穿梭质粒、包膜蛋白、包装质粒pMDLg-pRRE-K和包装质粒pRsv-rev-kana-V2的比例为9:7:7:7；
S3、37℃培养48-72小时，收集慢病毒。
具体地，步骤S1中细胞活率大于90％。
具体地，步骤S1中培养至活细胞密度为5×106cells/ml时进行慢病毒转染。
优选地，步骤S1和步骤S2中所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
进一步优选地，步骤S1和步骤S2中所述的宿主细胞选自人胚胎肾细胞(HEK293)或293T细胞。
再进一步优选地，步骤S1和步骤S2中所述的宿主细胞为293TS细胞。
优选地，步骤S1中所述的培养基选自CHO培养基、LB培养基、TB培养基、SOB培养基中的一种或多种。
进一步优选地，步骤S1中所述的培养基为CHO培养基。
再进一步优选地，步骤S1中所述的培养基为OPM-CHO PFF06培养基。
具体地，步骤S3中转染的时间为48h。
又一方面，本发明提供了上述的包膜蛋白或上述的核酸或上述的制备方法制备得到的慢病毒在感染NK细胞中的应用。
具体地，使用上述的慢病毒载体感染NK细胞的时间为48h。
又一方面，本发明提供了上述的包膜蛋白或上述的核酸或上述的制备方法制备得到的慢病毒在制备药物或疫苗中的应用。
优选地，所述的药物是工程化免疫细胞。
进一步优选地，所述的工程化免疫细胞是CAR-NK细胞。
本发明的有益效果为：
(1)建立了使用BaEVRdel包膜蛋白假型慢病毒高效感染NK细胞的四质粒系统，可以包装高滴度慢病毒，高效感染NK，获得外源基因的高效整合和表达，显著优于使用VSV-G包膜蛋白假型的慢病毒。
(2)该慢病毒系统符合药物监管机构对于基因改造用病毒系统的要求，如四质粒系统、使用卡那抗性等，可以用于细胞和基因药物的制备。
(3)使用携带BCMA CAR基因的BaEVRdel假型的慢病毒系统高效感染细胞因子活化的NK细胞，表达BCMA-CAR分子。
(4)使用携带BCMA CAR基因的BaEVRdel假型的慢病毒系统高效感染K562-mb IL-21饲养细胞刺激活化的NK细胞，表达BCMA-CAR分子。
附图说明
图1为BaEV、BaEVRdel、MLV-A、BaEVC包膜蛋白的结构示意图。
图2为质粒ZL003-BaEVRdel的图谱。
图3为质粒ZL003-BaEVC的图谱。
图4为不同的BaEV包膜蛋白突变体质粒在慢病毒包装时对转导滴度的影响结果图。
图5为NK细胞ASCT1受体分子的表达(n＝3；**p<0.01；n.s.,nosignificance)。
图6为NK细胞ASCT2受体分子的表达(n＝3；****p<0.0001；*p<0.05)。
图7为三代载体、四质粒系统包装慢病毒的示意图。
图8为细胞因子活化的BCMA CAR-NK细胞CAR阳性率检测结果图。
图9为细胞因子活化的BCMA CAR-NK与未转导NK细胞对MM.1S的细胞毒作用，(n＝3；****p<0.0001)。
图10为BaEVRdel-LV和VSVG-LV感染后的NK细胞在D7和D14的转导效率(测定的CAR阳性率)。
图11为K562-mb IL-21饲养细胞刺激活化的BCMA CAR-NK与未转导NK细胞对MM.1S的细胞毒作用，(n＝3；****p<0.0001)。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实施例1表达包膜蛋白质粒构建
不同包膜蛋白的结构如图1所示。BaEV代表野生型包膜蛋白结构；BaEVRdel代表BaEV剔除R序列后的包膜蛋白结构；MLV-A代表小鼠白血病病毒的包膜蛋白结构；BaEVC表示将BaEV胞质尾和R区序列替换为小鼠白血病病毒MLV-A胞质尾和R区序列的包膜蛋白结构。
包膜蛋白BaEVRdel质粒与BaEVC质粒构建具体步骤如下：
1.获得BaEV野生型氨基酸序列。通过搜索NCBI数据库，获得编码BaEV-gp的氨基酸序列(polyprotein[Baboon endogenous virus strain M7]，NCBI ReferenceSequence:YP_009109691.1)，具体序列如SEQ ID NO:1所示。
2.表达包膜蛋白BaEVRdel的质粒构建
SEQ ID NO:1所示的序列中“vltqqyqvlrtdeeaqd”为R区的序列，对于假型病毒没有功能，剔除该序列后，将编码BaEV的包膜蛋白命名为BaEVRdel，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
在进行人源细胞表达的密码子优化后，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
将该序列添加终止密码“TAG”，克隆入编码VSV-G包膜蛋白的质粒(pMD2.G-K)，完全替换VSV-G的开放读框(从起始密码到终止密码)，得到编码BaEVRdel的质粒(ZL003-BaEVRdel)，质粒图谱如图2。
3.表达包膜蛋白BaEVC的质粒构建
“nrltafindklniihamvltqqyqvlrtdeeaqd”为编码胞质尾与R区的序列，该序列被替换为小鼠白血病病毒MLV-A胞质尾与R区的序列(nrlvqfvkdrisvvqalvltqqyhqlkpleyep)，因此，替换该序列后，编码BaEV的包膜蛋白命名为BaEVC，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在进行人源细胞表达的密码子优化后，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
将该序列添加终止密码“TAG”，克隆入编码VSV-G包膜蛋白的质粒(pMD2.G-K)，完全替换VSV-G的开放读框(从起始密码到终止密码)，得到编码BaEVC的质粒(ZL003-BaEVC)，质粒图谱如图3所示。
实施例2BaEV包膜蛋白突变体BaEVRdel与BaEVC慢病毒包装
采用三代载体、四质粒系统进行包装。将Pre-Lenti-EF1-CD5-CAR V2 WPmutCAR穿梭质粒与包装质粒pMDLg-pRRE-K(SEQ ID NO:8)：包膜质粒：pRsv-rev-kana-V2(SEQ IDNO:9)按9:7:7:7的比例混匀，将以上四种质粒的混合物加入含293TS基础培养基的管中。按照质粒：PEIpro＝1:2比例向另一管中加入PEIpro。两管各在室温孵育5min后，将含PEIpro的混合液缓慢加入到含DNA的混合液中，轻轻晃动离心管混合均匀，室温孵育15min左右。将DNA-PEIpro混合液加入待转染细胞中，混匀，37℃、5％CO2震荡培养。6h后补料。48h后，收集含有慢病毒的培养基上清。含病毒培养上清转入50ml离心管内，离心去除293TS细胞，将含病毒上清过滤，浓缩，分装，-80℃保存备用。
Pre-Lenti-EF1-CD5-CAR V2 WPmut的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
Pre-Lenti-EF1-CD5-CAR V2 WPmut的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
通过测定转导滴度(TU)来评估病毒的包装效率。
转导滴度的检测包括以下步骤：
慢病毒粗毒液梯度稀释(16、64、256、512倍)后感染Jurkat细胞，即在24孔板中加入400μl Jurkat细胞悬液(细胞密度为2.5×105cells/ml)和100μl慢病毒稀释液，每组设置2个平行。将24孔板培养20-24h后加入500μl新鲜培养基继续培养。感染70h左右将平板中的细胞用PBS洗涤，孵育相应抗体，使用流式细胞仪检测样品CAR阳性率，选择阳性率与稀释倍数呈梯度关系的组别进行转导滴度计算，转导滴度(TU/ml)＝稀释倍数*样品阳性率*细胞量/病毒加样量(ml)。检测结果如图4所示，使用BaEVRdel包膜蛋白质粒和BaEVC包膜蛋白质粒时的转导滴度分别为8.56×107TU/ml和2.86×107TU/ml。根据结果可知，相比使用BaEVC包膜蛋白质粒包装，使用BaEVRdel包膜蛋白质粒进行病毒包装效率显著提高。因此，后续的BCMA CAR-NK的研究采用BaEVRdel包膜蛋白质粒进行慢病毒包装，慢病毒感染NK细胞，并通过CAR-NK细胞中CAR的阳性率检测和杀伤结果等进一步验证该慢病毒载体。
实施例3NK细胞ASCT1/2受体分子的表达
为了研究NK细胞表面BaEV包膜蛋白受体ASCT1/2的表达，采集健康志愿者的外周血，并通过CD3磁珠进行阴性选择以去除T细胞，然后使用CD56磁珠进行阳性选择以富集CD3-CD56+的NK细胞，并给与IL-2(500IU/ml)和IL-15(140IU/ml)的活化刺激，分别在0h，48h和96h时间点收获细胞，用QIAGEN试剂盒提取裂解后淋巴细胞中的RNA并使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa，6210A)将RNA反转为cDNA和Q-PCR检测(按照UltraSYBR Mixture CW0957说明书操作)，结果见图5-图6，在刺激前的时间点0h，NK细胞ASCT1和ASCT2的表达水平较低。经过IL-2和IL-15的活化刺激后，ASCT1和ASCT2的表达在48h和96h均显著上升。48h与96h之间在ASCT1的表达水平上无明显差异，但在48h时间点，ASCT2的表达水平显著高于96h时间点(P<0.05)。因此，确定病毒感染的时间点为48h。
实施例4BaEVRdel假型的慢病毒系统高效感染NK细胞，表达CAR分子
1.三代载体、四质粒系统包装慢病毒的示意图如图7所示，穿梭质粒携带Pre-Lenti-EF1-BCMA-CAR V 2WPmut CAR基因，3'-LTR的U3区剔除，避免活化下游基因(self-inactivation,SIN)的设计；WPRE元件为改构后的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，剔除野生型WPRE内源截短X蛋白的启动子，突变X蛋白的起始密码ATG，使无法转录和翻译。包装质粒pMDLg-pRRE-K(SEQ ID NO:8)表达gag和pol基因；包装质粒pRsv-rev-kana-V2(SEQ IDNO:9)表达Rev蛋白，提高慢病毒滴度；包膜质粒BaEVRdel表达改构的BaEV包膜蛋白BaEVRdel。四种质粒按照质量比9:7:7:7的比例混合均匀。通过转染试剂PEIpro将混合物转染到处于对数生长期的293TS细胞中。在48h时收获BaEVRdel包膜蛋白包装的慢病毒粗毒液，离心去除293TS细胞，将含病毒上清过滤，浓缩，分装，-80℃保存备用。
Pre-Lenti-EF1-BCMA-CAR V 2WPmut的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
Pre-Lenti-EF1-BCMA-CAR V 2WPmut的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2.BaEVRdel假型的慢病毒系统高效感染细胞因子活化的NK细胞，表达CAR分子
采集健康志愿者外周血，纯化NK细胞(通过CD3磁珠进行阴性选择去除T细胞，然后使用CD56磁珠进行阳性选择以富集CD3-CD56+的NK细胞)，将分离出的NK细胞接种到24孔板中，接种密度为1.0×106cells/ml，使用IL-2(500IU/ml)和IL-15(140IU/ml)活化NK细胞，培养48h后使用携带BCMA CAR基因的BaEVRdel假型的慢病毒与-1等体积混合，室温孵育10min，感染NK细胞。使用靶点蛋白结合流式细胞术检测BCMA CAR-NK细胞的CAR阳性率。
通过流式细胞术检测转导效率，结果显示见图8，CAR阳性率为62.1％，表明在NK细胞活化后48h，进行慢病毒转导，可以获得高效的慢病毒转导和目的基因整合。
扩大培养后，我们验证了BCMA CAR-NK细胞对靶细胞多发性骨髓瘤MM.1S细胞的毒性，结果见图9，与非转导的NK细胞相比，BCMA CAR-NK细胞剂量依赖地高效杀伤MM.1S细胞。这些结果表明，使用携带BCMA CAR基因的BaEVRdel假型的慢病毒系统高效感染细胞因子活化的NK细胞，表达BCMA-CAR分子，并发挥对靶细胞多发性骨髓瘤MM.1S细胞的杀伤能力。
实施例5
K562-mb IL-21饲养细胞刺激活化的NK细胞，也可使用BaEVRdel假型的慢病毒高效感染NK细胞，并且使其能够杀伤肿瘤细胞。
采集健康志愿者的外周血，并通过CD3磁珠进行阴性选择以去除T细胞，然后使用CD56磁珠进行阳性选择以富集CD3-CD56+的NK细胞。将NK细胞与符合放行标准的经过辐照的饲养细胞K562-mb IL-21按照1:2的比例混合，培养4天后使用携带BCMA CAR基因的BaEVRdel或VSV-G包膜蛋白分别假型获得的慢病毒(BaEVRdel-LV或VSVG-LV)，感染NK细胞。在第7天(D7)和第14天(D14)使用流式细胞术检测转导效率，结果见图10，BaEVRdel-LV的转导效率明显优于VSVG-LV，并且其表达稳定，D7与D14之间没有明显差异。培养D14天后，验证了BCMA CAR-NK细胞对靶细胞多发性骨髓瘤MM.1S细胞的毒性，结果见图11，与非转导的NK细胞相比，BCMA CAR-NK细胞剂量依赖地高效杀伤MM.1S细胞。结果表明，使用携带BCMA CAR基因的BaEVRdel假型的慢病毒系统高效感染饲养细胞K562-mb IL-21刺激活化的NK细胞，表达BCMA-CAR分子，并发挥对靶细胞多发性骨髓瘤MM.1S细胞的杀伤能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种包膜蛋白，其特征在于，所述的包膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的包膜蛋白。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.权利要求1所述的包膜蛋白或权利要求2-3任一项所述的核酸在制备慢病毒中的应用。
5.一种慢病毒的制备方法，其特征在于，所述的慢病毒通过权利要求1所述的包膜蛋白进行制备。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括使用穿梭质粒、包装质粒pMDLg-pRRE-K和包装质粒pRsv-rev-kana-V2制备慢病毒；所述的穿梭质粒的序列如SEQ IDNO:6-7所示或如SEQ ID NO:10-11所示，所述的包装质粒pMDLg-pRRE-K的序列如SEQ IDNO:8所示，所述的包装质粒pRsv-rev-kana-V2的序列如SEQ ID NO:9所示。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的穿梭质粒、包膜蛋白、包装质粒pMDLg-pRRE-K和包装质粒pRsv-rev-kana-V2的比例为9:7:7:7。
8.权利要求1所述的包膜蛋白或权利要求2-3任一项所述的核酸或权利要求5-7任一项所述的制备方法制备得到的慢病毒在感染NK细胞中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用慢病毒载体感染NK细胞的时间为48h。
10.权利要求1所述的包膜蛋白或权利要求2-3任一项所述的核酸或权利要求5-7任一项所述的制备方法制备得到的慢病毒在制备药物或疫苗中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的药物是工程化免疫细胞。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的工程化免疫细胞是CAR-NK细胞。
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