CN117813400A - 引物组和掺入这些引物组的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了示例性引物组，该示例性引物组包括第一核酸酶抗性引物和第二核酸酶抗性引物。该第一核酸酶抗性引物包括：第一序列；第一切割位点，该第一切割位点连接在该第一序列的3'端处；和第一核酸酶抗性修饰，该第一核酸酶抗性修饰掺入该第一序列与该第一切割位点之间。该第二核酸酶抗性引物包括：不同于该第一序列的第二序列；第二核酸酶抗性修饰，该第二核酸酶抗性修饰掺入该第二序列的3'端处；和第二切割位点，该第二切割位点连接在该第二序列与该第二核酸酶抗性修饰之间。该第二切割位点不同于该第一切割位点。
Description
相关申请的交叉引用
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序列表的参考
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背景技术
特定核酸的检测可以用于诊断医学和分子生物学研究。在如基因测序、基因分型等多种核酸检测方法和应用中，使用流通池。流通池表面可使用如引物组、聚合酶等特定的表面化学物功能化，具体取决于将要发生的反应。在许多情况下，表面化学物适于一次性使用的检测方法。
发明内容
本文公开了若干引物组。包括各引物组的流通池的示例是可重复使用的。这些引物组中的一些引物组使得这些流通池能够使用两次，其中在这些使用中的每次使用期间分析不同样品。这些引物组中的一些其它引物组使得这些流通池能够重复使用任何期望的次数，其中在相应的使用期间分析任何期望数量的不同样品。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1A是流通池的示例的顶视图；
图1B是流通池的一个示例的流动通道内的架构的一个示例的放大局部剖面图；
图1C是流通池的另一个示例的流动通道内的架构的另一个示例的放大局部剖面图；
图2是引物组的一个示例的示意图；
图3A至图3E是一起描绘涉及图2的引物组的方法的示意图，其中图3A描绘了与引物连接的第一样品文库片段扩增子，图3B描绘了第一多个第一样品文库片段扩增子的去除和第二多个第一样品文库片段扩增子的测序，图3C描绘了第二多个第一样品文库片段扩增子的切割和由测序产生的新生链，图3D描绘了第二样品文库片段扩增子的产生，并且图3E描绘了第二多个第二样品文库片段扩增子的去除和第一多个第二样品文库片段扩增子的测序；
图4是引物组的另一个示例的示意图；
图5A至图5D是一起描绘涉及图4的引物组的方法的示意图，其中图5A描绘了与引物连接的第一样品文库片段扩增子，图5B描绘了第一多个第一样品文库片段扩增子的去除和第二多个第一样品文库片段扩增子的测序，图5C描绘了第二多个第一样品文库片段扩增子的切割和由测序产生的新生链，并且图5D描绘了再生寡核苷酸的引入；
图6是引物组的另一个示例的示意图；
图7A至图7F是一起描绘涉及图6的引物组的方法的示意图，其中图7A描绘了与引物连接的第一样品文库片段扩增子，图7B描绘了第一多个第一样品文库片段扩增子的去除和第二多个第一样品文库片段扩增子的测序，图7C描绘了由测序产生的新生链以及引物的切割，图7D描绘了切割之后引物的剩余部分，并且图7E和图7F描绘了引物中的每个引物的切割部分的依序再生；
图7A至图7D和图8是一起描绘涉及图6的引物组的另一种方法的示意图，其中图7A描绘了与引物连接的第一样品文库片段扩增子，图7B描绘了第一多个第一样品文库片段扩增子的去除和第二多个第一样品文库片段扩增子的测序，图7C描绘了由测序产生的新生链以及引物的切割，图7D描绘了切割之后引物的剩余部分，并且图8描绘了引物中的每个引物的切割部分的同时再生；
图9是示出使用两种不同类型的引物和具有本文所公开的核酸酶抗性锚寡核苷酸的一个示例流通池表面的示例性方法的示意性流程图；
图10是示出使用图9中所示的夹板引物和流通池表面的示例性方法的示意性流程图；并且
图11是示出使用另一种类型的引物和具有本文所公开的核酸酶抗性锚寡核苷酸的另一个示例的流通池表面的示例性方法的示意性流程图。
具体实施方式
本文公开了寡核苷酸引物组的若干示例。这些引物组中的每个引物组可用作用于核酸分析的流通池内的表面化学物的一部分。这些引物组中的每个引物组使流通池可重复使用一次或多次。在一些情况下，流通池由于可重复使用，所以能够成为测序仪器的一部分，而不是耗材套件的一部分。
定义
应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
术语包含、包括、容纳和这些术语的各种形式彼此同义，并且意在是同样宽泛的。
术语顶部、底部、下部、上部、上等在本文中用于描述流通池和/或流通池的各个部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。
术语第一、第二等也并非意在暗示特定的取向或顺序，而是用于将一个部件与另一个部件区分开来。
应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同此类值或子范围被明确列举一样。例如，约400nm至约1μm(1000nm)的范围应被解释为不仅包括明确列举的约400nm至约1μm的限值，而且包括单个值，诸如约708nm、约945.5nm等，以及子范围，诸如约425nm至约825nm、约550nm至约940nm等。
此外，当使用“约”和/或“基本上”来描述值时，它们意在涵盖与所述值的微小变化(至多+/-10％)。
“丙烯酰胺单体”是具有结构的单体或包含丙烯酰胺基团的单体。包含丙烯酰胺基团的单体的示例包括叠氮基乙酰氨基戊基丙烯酰胺：/>和N-异丙基丙烯酰胺：/>可使用其它丙烯酰胺单体。
如本文所用，术语“活化”是指在基部支持物的表面或多层结构的最外层生成反应性基团的过程。活化可以使用硅烷化或等离子体灰化来完成。虽然附图没有描绘等离子体灰化产生的单独的硅烷化层或-OH基团，但是应当理解活化在活化的支持物或层的表面处产生硅烷化层或-OH基团以将官能化层与下面的支持物或层共价连接。
如本文所用，“醛”是包含具有结构-CHO的官能团的有机化合物，其包括羰基中心(即，碳以双键键合到氧)，其中碳原子也键合到氢和R基团，诸如烷基或其他侧链。醛的通式结构是：
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子。示例性烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为示例，名称“C1-4烷基”指示烷基链中存在一至四个碳原子，即烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
如本文所用，“炔烃”或“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子。
“胺”或“氨基”官能团是指-NRaRb基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢(例如，)、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所定义。
“锚寡核苷酸”或“核酸酶抗性锚核苷酸”是与聚合物水凝胶连接的单链DNA链，其包括核酸酶抗性修饰，并且能够连接引物组中的引物。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、基和蒽基。
短语“在3'端处掺入”或“在5'端处掺入”意指核苷酸或核苷酸类似物连接在相应末端处或连接在相应末端处附近。“附近”意指核苷酸或核苷酸类似物在距末端10个核苷酸以内。作为示例，切割位点或核酸酶抗性修饰可连接在3'端处，或者切割位点可连接在从3'端起的第3个、第5个或第7个核苷酸位置处，或者核酸酶抗性修饰可掺入3'端处的最后三个核苷酸之间。
如本文所用，术语“连接”是指两个事物直接或间接地彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键与聚合物水凝胶连接。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的物理键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N3。
如本文所用，“粘结区域”是指图案化结构的要粘结到另一种材料的区域，该另一种材料可以例如为间隔层、盖、另一个图案化结构等，或者它们的组合(例如，间隔层和盖，或者间隔层和另一个图案化结构)。形成于粘结区域处的粘结可为化学粘结(如本文所述)或机械粘结(例如，使用紧固件等)。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系主链中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基团可具有3至20个碳原子。碳环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。
如本文所用，术语“羧酸”或“羧基”是指-COOH。
如本文所用，“亚环烷基”是指完全饱和的碳环或环系，其通过两个连接点连接到分子的其余部分。
如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。示例包括环己烯基或环己烯以及降冰片烯基或降冰片烯。同样如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。一个示例为环辛炔。另一个示例为双环壬炔。同样如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，术语“沉积”是指任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、流动通过涂覆(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。
如本文所用，术语“凹入部”是指具有表面开口的基部支持物或多层堆叠的层中的离散凹面特征部，该表面开口至少部分地被基部支持物或多层堆叠的层的间隙区域围绕。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，凹入部可以是一个孔或两个互连的孔。凹入部还可具有更复杂的架构，如脊、阶梯特征等。具有阶梯特征的凹入部的示例在本文中被称为多深度凹入部，其中该阶梯特征限定浅部分。
当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“环氧”(也称为缩水甘油基或环氧乙烷基团)是指
如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可进行反应的流动通道、用于将试剂递送到流动通道的入口以及用于从流动通道中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，流通池适于检测在该流通池中发生的反应。例如，流通池可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。
如本文所用，“流动通道”或“通道”可为限定在两个粘结部件之间的区域，该区域可选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可以限定在两个图案化结构之间，因此可以与这些图案化结构的表面化学物流体连通。在一些示例中，流动通道可以限定在一个图案化结构与盖之间，因此可以与一个图案化结构的表面化学物流体连通。
如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可具有5-18个环成员。
如本文所用，“杂环”意指在环主链中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。在环系中，杂原子可存在于非芳族环或芳族环中。杂环基团可具有3至20个环成员(即，构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)。在一些示例中，杂原子是O、N或S。
如本文所用，术语“肼”或“肼基”是指-NHNH2基团。
如本文所用，术语“腙”或“肼基”是指基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环，如本文所定义。
如本文所用，“羟基”是指-OH基团。
如本文所用，术语“间隙区域”是指例如基部支持物或多层叠堆的层中将凹入部(凹形区域)隔开的区域。例如，间隙区域可将阵列的一个凹入部与阵列的另一个凹入部分开。彼此分开的两个凹入部可以是离散的，即彼此缺乏物理接触。在许多示例中，间隙区域是连续的，而凹入部是离散的，例如，如限定在其他连续表面中的多个凹入部的情况。在其他示例中，间隙区域和特征部是离散的，例如，由相应间隙区域分开的沟槽形状的多个凹入部的情况就是如此。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与凹入部的表面材料不同的表面材料。例如，凹入部可在其中具有聚合物水凝胶和引物组，并且间隙区域可不含聚合物水凝胶和引物组。
“文库片段”或“文库模板链”是要测序的单链脱氧核糖核酸序列。文库模板链可由较大的DNA样品制备，并且可被修饰以在每一端处包括分别与引物组中的引物的至少一部分互补的衔接子。文库模板链充当用于簇生成的模板，其产生多个扩增子。
如本文所用，“腈氧化物”是指“RaC≡N+O-”基团，其中Ra在本文定义。制备腈氧化物的示例包括通过用氯酰胺-T处理或通过碱基在酰亚胺氯[RC(Cl)＝NOH]上的作用或通过羟胺与醛之间的反应由醛肟原位生成。
如本文所用，“硝酮”是指基团，其中R1、R2和R3可以是本文所定义的Ra基团和Rb基团中的任一者，不同的是R3不是氢(H)。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即在核糖中缺少存在于2'位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可为嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可具有改变的磷酸主链、糖或核碱基中的任一者。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物，诸如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯主链修饰。
在一些示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料直接位于另一个部件或材料上。当一个直接在另一个上时，两个彼此接触。
在其它示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料间接位于另一个部件或材料上。所谓间接地，表示间隙或另外的部件或材料可位于两个部件或材料之间。
“图案化结构”是指包括以图案方式定位的表面化学物的单层基部支持物，或具有包括以图案方式定位的表面化学物的层的多层堆叠，该图案例如在凹入部中、跨单层基部支持物或层。相比之下，“非图案化结构”是指包括不以特定图案方式定位的表面化学物的单层基部支持物，或具有包括不以特定图案方式定位的表面化学物的层的多层堆叠，该图案跨单层基部支持物或层。表面化学物可包括聚合物水凝胶和本文所公开的引物组的一个示例。
如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”是指作为二氧化硅(SiO2)和有机硅(R2SiO)之间的杂交中间体(例如RSiO1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是如Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776-778页中所述的，该文献以引用方式全文并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RSiO3/2]n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。多面体低聚倍半硅氧烷的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。
如本文所用，术语“引物组”被定义为一起使得能够扩增文库片段的两个单链核酸序列(例如，单链DNA)。引物组中的引物在本文中可被称为扩增引物，因为它们充当文库片段扩增和簇生成的起点。引物组中的引物可包括与文库片段的一部分(例如，衔接子)互补的序列，使得其能够与文库片段杂交并且因此捕获文库片段。引物组的任何示例中的引物的5'末端可被修饰以允许与聚合物水凝胶的官能团进行偶联反应。引物组中的每个引物的长度可为任何数目的碱基长度并且可包括多种天然和/或非天然核苷酸。
本文所公开的引物组中的一些引物组包括核酸酶抗性引物。“核酸酶抗性引物”是在沿序列的一些点处包括核酸酶抗性修饰的单链核酸序列。“核酸酶抗性修饰”是对核酸序列的键、核苷酸类似物或一些其他改变，其赋予核酸酶抗性引物42A、42B。抗性可为针对内切核酸酶和/或外切核酸酶的抗性。
其他引物，如“测序引物”不是引物组的一部分，而是充当DNA合成的起始点。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。
如本文所用，“间隔层”是指将两个部件粘结在一起的材料。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料，或者可与有助于粘结的辐射吸收材料接触。
术语“基底”是指在其上引入表面化学物的单层基部支持物或多层结构。
“硫醇”官能团是指-SH。
如本文所用，术语“四嗪”和“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可为任选取代的。
如本文所用，“四唑”是指包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可为任选取代的。
流通池
本文所公开的流通池的一些示例包括基底、与该基底的至少一部分连接的聚合物水凝胶以及与该聚合物水凝胶连接的本文所公开的引物组的示例。在流通池的一个示例中，引物组选自由以下组成的组：i)包括第一切割位点的第一核酸酶抗性引物以及包括不同于该第一切割位点的第二切割位点的第二核酸酶抗性引物；ii)包括切割位点的第一核酸酶抗性引物以及无任何切割位点的第二核酸酶抗性引物。在流通池的另一个示例中，引物组包括具有第一切割位点和不同于该第一切割位点的第二切割位点的第一引物；以及具有该第一切割位点而无该第二切割位点的第二引物。
本文所公开的流通池的其他示例包括基底、与该基底的至少一部分连接的聚合物水凝胶以及与该聚合物水凝胶连接的第一核酸酶抗性锚寡核苷酸和第二核酸酶抗性锚寡核苷酸。
将参考图1A至图1C描述流通池的基底和聚合物水凝胶，同时将参考图2至图8描述不同的引物组，并且将参考图9至图11描述锚寡核苷酸。
流通池10的一个示例在图1A中以顶视图示出。流通池10可包括粘结在一起的两个图案化或非图案化结构、或粘结到盖(盖未示出)的一个图案化或非图案化结构。流动通道12位于两个图案化或非图案化结构之间，或者位于一个图案化或非图案化结构与盖之间。图1A所示的示例包括八个流动通道12。虽然图1A中示出了八个流动通道12，但是应当理解，流通池10中可包括任何数量的流动通道12(例如，单个流动通道12、四个流动通道12，等等)。每个流动通道12可以与另一个流动通道12分离，使得引入流动通道12中的流体不会流到相邻的流动通道12中。引入流动通道12中的流体的一些示例可以引入反应组分(例如，引物流体、DNA样品、聚合酶、测序引物、核苷酸等)、洗涤溶液、解封闭剂等。
每个流动通道12与入口和出口(未示出)流体连通。每个流动通道12的入口和出口可定位在流通池10的相对端处。相应流动通道12的入口和出口可以另选地沿流动通道12的长度和宽度定位在能够实现所需流体流动的任何位置。
入口允许将流体引入到流动通道12中，并且出口允许从流动通道12中引出流体。入口和出口中的每一者与流体控制系统(包括例如，储器、泵、阀、废物容器等)流体连接，该流体控制系统控制流体引入和排出。
流动通道12至少部分地由图案化结构或非图案化结构限定。这些结构中的每个结构包括基底，诸如单层基部支持物14(如图1B所示)或多层结构16(如图1C所示)。
合适的单层基部支持物14的示例包括环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的/>)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(Ta2O5)或其他钽氧化物(TaOx)、氧化铪(HfO2)、碳、金属、无机玻璃等。
多层结构16的示例包括基部支持物14和基部支持物16上的至少一个其他层18。多层结构16的一些示例包括玻璃或硅作为基部支持物14，其表面上具有钽氧化物(例如，五氧化二钽或另一种钽氧化物(TaOx))或另一种陶瓷氧化物的涂层18。多层结构16的其他示例包括基部支持物14(例如，玻璃、硅、五氧化二钽，或任何其他基部支持物材料)和作为另一层18的图案化树脂。应当理解，可选择性地沉积或者可沉积并图案化以形成凹入部20(参见图1B)和间隙区域22的任何材料可用于图案化树脂。
作为图案化树脂的一个示例，可以经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷将无机氧化物选择性地施加到基部支持物14。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta2O5)、氧化铝(例如Al2O3)、氧化硅(例如SiO2)、氧化铪(例如HfO2)等。
作为图案化树脂的另一个示例，可将聚合物树脂施加到基部支持物14，并且然后进行图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷树脂的树脂、不基于多面体低聚倍半硅氧烷的环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的)以及它们的组合。
在一个示例中，单个基部支持物14(无论是单独使用还是作为多层结构16的一部分使用)可为直径在约2mm至约300mm(例如，约200mm至约300mm)范围内的圆形片、面板、晶片、裸片等，或者可为最大尺寸至多约10英尺(约3米)的矩形片、面板、晶片、裸片等。例如，裸片的宽度范围可为约0.1mm至约10mm。虽然已经提供了示例性尺寸，但是应当理解，可使用具有任何合适尺寸的单个基部支持物。
在一个示例中，流动通道12具有大致矩形的构造(例如，带弯曲端部，如图1A所示)。可选择流动通道12的长度和宽度，使得流通池10的基部支持物14或多层结构16的一部分将流动通道12包围，并且可用于与盖(未示出)或另一个图案化或非图案化结构连接。
当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道12的壁的单独材料(未示出)时，流动通道12的深度可小至单层厚。对于其它示例，流动通道12的深度可为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度可在约10μm至约30μm的范围内。在又一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解的是，流动通道12的深度可大于、小于上文指定的值，或者介于这些值之间。
图1B和图1C描绘了流动通道12内的架构的示例。
图1B中所示的架构是非图案化结构。非图案化结构的基底可为单层基部支持物14或多层结构16。在图1B所示的示例中，泳道24被限定在单层基部支持物14的表面中。可替代地，泳道24可限定在多层结构16的表面中，例如层18中。
泳道24被形成于其中的基底的边缘区域26包围。边缘区域26提供两个非图案化结构可彼此连接或者一个非图案化结构可与盖连接的粘合区域。
泳道24可使用任何合适的图案化技术形成，如光刻、纳米压印光刻(NIL)、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。
泳道24为聚合物水凝胶28提供指定区域。
在一个示例中，聚合物水凝胶28包括丙烯酰胺共聚物。在该示例中，该丙烯酰胺共聚物具有以下结构：
其中：
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
RB为H或任选地取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自由以下组成的组：H和任选地取代的烷基；
-(CH2)p-中的每一者可任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；并且
m为在1至100,000范围内的整数。
由结构(I)表示的丙烯酰胺共聚物的一个具体示例是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(PAZAM)。
本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
丙烯酰胺共聚物的分子量可以在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可以为约312kDa。
在一些示例中，丙烯酰胺共聚物是线型聚合物。在一些其他的示例中，丙烯酰胺共聚物为轻度交联聚合物。
在一些示例中，聚合物水凝胶28可为结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺替换。在另一个示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用/>替换，其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基(而不是H，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括/>其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。
作为聚合物水凝胶28的另一个示例，结构(I)中反复出现的“n”特征可用包含具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替换：
其中R1为H或C1-C6烷基；R2为H或C1-C6烷基；L为包括直链的接头，其具有2至20个选自由以下组成的组的原子：碳、氧和氮，以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有与N连接的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个含碳环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。
作为仍另一个示例，聚合物水凝胶28可包含结构(III)和(IV)中的每一者的反复出现的单元：
其中R1a、R2a、R1b和R2b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；R3a和R3b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；并且每个L1和L2独立地选自任选地取代的亚烷基接头或任选地取代的杂亚烷基接头。
在又一个示例中，使用硝基氧介导的聚合形成丙烯酰胺共聚物，并且因此至少一些共聚物链具有烷氧基胺端基。在共聚物链中，术语“烷氧基胺端基”是指休眠种-ONR1R2，其中R1和R2中的每一者可以相同或不同，并且可独立地为直链或支链烷基或环结构，并且其中氧原子与共聚物链的其余部分连接。在一些示例中，还可以将烷氧基胺引入到一些重复出现的丙烯酰胺单体中，例如在结构(I)的位置RA处。因此，在一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基；并且在另一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基和至少一些侧链中的烷氧基胺基团。
应当理解，可使用其他分子来形成聚合物水凝胶28，只要它们能够被期望的化学物质(例如，引物组或锚寡核苷酸)官能化即可。用于聚合物水凝胶28的合适材料的一些示例包括官能化硅烷，诸如降冰片烯硅烷、叠氮硅烷、炔官能化硅烷、胺官能化硅烷、马来酰亚胺硅烷，或者具有可以分别与期望的化学成分连接的官能团的任何其它硅烷。
用于聚合物水凝胶28的合适材料的仍其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。用于聚合物水凝胶28的合适材料的仍其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括树枝状聚合物(例如，多臂聚合物或星形聚合物)。例如，单体(例如，丙烯酰胺等)可以无规或嵌段方式掺入到树枝状体的支链(臂)中。
聚合物水凝胶28与下面的单层基部支持物14或多层结构16的连接可以通过共价键合来进行。在一些情况下，单层基部支持物14或多层结构16可首先活化，例如，通过硅烷化或等离子体灰化来活化。共价连接有助于在流通池10的整个寿命中在各种用途期间将引物组或锚寡核苷酸维持在期望的区域中。
为了将聚合物水凝胶28引入到泳道24中，可产生聚合物水凝胶28的混合物，并且然后将其施加到单层基部支持物14或多层结构16上。在一个示例中，聚合物水凝胶28可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂或者浸渍或浸涂或者正压或负压下材料流或者另一种合适的技术将混合物施加到基底表面。这些类型的技术将聚合物水凝胶28毯覆式地沉积在泳道24中和边缘区域26上。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将聚合物水凝胶28特定地沉积在泳道24中而不是沉积在边缘区域26上。
根据聚合物水凝胶28的化学性质，可将所施加的混合物暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。
然后，可执行抛光，以便从边缘区域26中去除聚合物水凝胶28，同时使在泳道24中在表面上的聚合物水凝胶28至少基本上完整。该抛光过程可用化学浆料(包含例如研磨剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该化学浆料可从边缘区域26中去除聚合物水凝胶28，而不会对这些区域26下面的基底造成有害影响。另选地，可利用不包括磨料颗粒的溶液执行抛光。
该化学浆料可用于化学机械抛光系统，以对边缘区域26的表面进行抛光。抛光头/抛光垫或其他抛光工具能够对可能存在于边缘区域26之上的聚合物水凝胶28进行抛光，与此同时使聚合物水凝胶28在泳道24中至少基本上完整。作为一个示例，抛光头可为Strasbaugh ViPRR II抛光头。
清洁和干燥过程可在抛光之后进行。清洁过程可利用水浴和超声处理。水浴可维持在约22℃至约30℃范围内的相对较低的温度。干燥过程可包括旋转干燥，或通过另一种合适技术进行的干燥。
在一些示例中，聚合物水凝胶28包括与其连接的引物组中的引物30、32(参考图2、图4和图6进一步描述)。在其他示例中，聚合物水凝胶28包括与其连接的锚寡核苷酸34(参考图9至图11进一步描述)。
在一些示例中，可将引物30、32或锚寡核苷酸34预接枝到聚合物水凝胶28上。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。在其他示例中，引物30、32或锚寡核苷酸34没有预接枝到聚合物水凝胶28上。在这些示例中，可在将聚合物水凝胶28应用于泳道24之后对引物30、32或锚寡核苷酸34进行接枝。
当在施加聚合物水凝胶28之后进行接枝时，可使用任何合适的接枝技术来实现接枝。作为示例，接枝可以通过以下方式来实现：流通式沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配，或通过另一种合适的方法。一些示例利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包括引物30、32、水、缓冲液和催化剂。其他示例利用锚寡核苷酸溶液或混合物，该混合物可包含锚寡核苷酸34、水、缓冲液和催化剂。利用接枝方法中的任一种接枝方法，引物30、32或锚寡核苷酸34与聚合物水凝胶28的反应性基团连接，并且对边缘区域26不具有亲和力。
现在参考图1C，描绘了流动通道12内的架构的另一个示例。在该示例中，该架构包括图案化结构。该图案化结构包括限定在基底表面中的多个凹入部20，这些凹入部由间隙区域22彼此隔离。多个凹入部20中的每个凹入部具有施加在其中的聚合物水凝胶28。
在一些示例中，图案化结构的基底是多层结构16，并且凹入部20被限定在层18中。尽管图1C所示的基底是多层结构16，但是应当理解，可使用单层基部支持物14(其中凹入部20将形成于限定在单层基部支持物14中的泳道24中)。
凹入部20可使用任何合适的图案化技术形成，如光刻、纳米压印光刻(NIL)、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。
可设想凹入部20和间隙区域22的许多不同的布局，包括规则的、重复的和不规则的图案。在一个示例中，多个凹入部20和间隙区域22被设置成创建六边形网格以实现紧密的堆积和改进的密度。其它布局可包括例如矩形布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以是呈行和列的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可为凹入部20和间隙区域22的重复布置。在仍其他示例中，布局或图案可为凹入部20和间隙区域22的随机布置。
布局或图案可相对于限定区域内的凹入部20的密度(数量)来表征。例如，多个凹入部20可以大约2百万个/mm2的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm2、约1,000个/mm2、约100,000个/mm2、约1百万个/mm2、约2百万个/mm2、约5百万个/mm2、约1千万个/mm2、约5千万个/mm2或更大或更小的密度。还应当理解，该密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间，或者可以使用其它密度(在给定范围之外)。例如，高密度阵列可被表征为具有分开小于约100nm的多个凹入部20，中等密度阵列可被表征为具有分开约400nm至约1μm的多个凹入部20，并且低密度阵列可被表征为具有分开大于约1μm的多个凹入部20。
多个凹入部20的布局或图案也可根据或另选地根据平均节距，或从多个凹入部20中的一个凹入部的中心至相邻凹入部20的中心的间距(中心到中心间距)或从多个凹入部20中的一个凹入部的右边缘至相邻凹入部20的左边缘的间距(边缘到边缘间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.15μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。特定图案的平均节距可介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在一个示例中，凹入部20具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。
每个凹入部20的大小可通过其体积、开口面积、深度和/或直径(当凹入部20为圆形时)和/或长度和宽度来表征。例如，体积可以在约1×10-3μm3至约100μm3的范围内，例如，为约1×10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3，或更大，或更小。又如，开口面积可以在约1×10-3μm2至约100μm2的范围内，例如，为约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、至少约10μm2，或更大，或更小。再如，深度可以在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm，或更大，或更小。又如，深度可以在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm，或更大，或更小。再如，长度和宽度中的每一者或直径可以在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm，或更大，或更小。
图1B和图1C两者中的架构可包括边缘区域26，这些边缘区域限定间隙样区域，这些间隙样区域延伸流动通道12的长度并且将一个流动通道12与相邻的流动通道12分离和/或限定流通池10的周界。边缘区域26提供两个非图案化结构可彼此连接或者一个非图案化结构可与盖连接的粘合区域。
凹入部20为聚合物水凝胶28提供指定区域。可使用聚合物水凝胶28的任何示例，并且可通过本文参考图1B所描述的技术形成该聚合物水凝胶的任何示例。
为了将聚合物水凝胶28引入到凹入部20中，可生成聚合物水凝胶28的混合物，并且然后将其施加到多层结构16上。在一个示例中，聚合物水凝胶28可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂或者浸渍或浸涂或者正压或负压下材料流或者另一种合适的技术将混合物施加到基底表面。这些类型的技术将聚合物水凝胶28毯覆式地沉积在凹入部20中和间隙区域22上。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将聚合物水凝胶28特定地沉积在凹入部20中而不是沉积在间隙区域22上。
根据聚合物水凝胶28的化学性质，可将所施加的混合物暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。
然后，可执行抛光，以便从间隙区域22中去除聚合物水凝胶28，同时使在凹入部20中在表面上的聚合物水凝胶28至少基本上完整。该抛光过程可用化学浆料(包含例如研磨剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该化学浆料可从间隙区域22中去除聚合物水凝胶28，而不会对这些区域22下面的基底造成有害影响。另选地，可利用不包括磨料颗粒的溶液执行抛光。
该化学浆料可用于化学机械抛光系统，以对间隙区域22的表面进行抛光。抛光头/抛光垫或其他抛光工具能够对可能存在于间隙区域22之上的聚合物水凝胶28进行抛光，与此同时使聚合物水凝胶28在凹入部20中至少基本上完整。作为一个示例，抛光头可为Strasbaugh ViPRR II抛光头。
清洁和干燥过程可在抛光之后进行。清洁过程可利用水浴和超声处理。水浴可维持在约22℃至约30℃范围内的相对较低的温度。干燥过程可包括旋转干燥，或通过另一种合适技术进行的干燥。
在沉积和抛光聚合物水凝胶28之前，可如本文所述使单层基部支持物14或多层结构16活化。
凹入部20中的聚合物水凝胶28还包括与其连接的引物30、32或锚寡核苷酸34。引物30、32或锚寡核苷酸34可为预接枝的或可通过任何合适的技术接枝，如参考图1B所述。
本文参考图2至图8描述了引物30、32的不同示例。引物30、32中的一些引物是核酸酶抗性引物(例如，引物42A、42B或42C、42D)，并且引物中的一些其它引物可以是或不是核酸酶抗性的(例如，引物68A、68B)。
本文参考图9至图11描述了锚寡核苷酸34的不同示例。
引物组#1和使用方法
图2示出了可用于本文所公开的流通池10的示例中的引物组40A之一的示例。
引物组40A包括：第一核酸酶抗性引物42A，该第一核酸酶抗性引物包括第一序列44A、连接在第一序列44A的3'端处的第一切割位点46A、以及掺入第一序列44A与第一切割位点46A之间的第一核酸酶抗性修饰48A；和第二核酸酶抗性引物42B，该第二核酸酶抗性引物包括不同于第一序列44A的第二序列44B、掺入第二序列44B的3'端处的第二核酸酶抗性修饰48B、以及连接在第二序列44B与第二核酸酶抗性修饰48B之间的第二切割位点46B，其中第二切割位点46B不同于第一切割位点46A。
核酸酶抗性引物42A、42B的序列44A、44B可包括P5和P7引物序列、P15和P7引物序列、或本文所述的PA引物序列、PB引物序列、PC引物序列和PD引物序列的任何组合。作为示例，核酸酶抗性引物42A、42B可包括一个PA引物序列和一个PB、PC或PD引物序列的任何组合、或一个PB引物序列和一个PC或PD引物序列的任何组合、或一个PC引物序列和一个PD引物序列的任何组合。
这些引物序列中的任何两个引物序列可分别用作核酸酶抗性引物42A、42B的主要或一级序列(即，序列44A、44B)，并且相应的切割位点46A、46B和核酸酶抗性修饰48A、48B可在期望的位置处掺入到相应的核酸序列44A、44B中。
切割位点46A、46B使核酸酶抗性引物42A、42B在掺入切割位点46A、46B的相应位置处可切割。合适的切割位点46A、46B的示例包括酶促可切割的核碱基或化学可切割的核碱基、经修饰的核碱基或者接头(例如，核碱基之间的接头)，如本文所述。切割位点46A、46B的一些具体示例包括尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤或烯丙基-核苷酸(例如，烯丙基-T、烯丙基-A、烯丙基-C、烯丙基-G)。切割位点46A、46B彼此不同，并且因此通过不同的切割化学被切割。这使核酸酶抗性引物42A、42B的切割是正交的，这意味着一个核酸酶抗性引物42A可被切割，而另一个核酸酶抗性引物42B保持未切割，直到引入合适的切割剂为止。
以下示例说明了一些示例性序列44A、44B，其中P5、P7和P15说明了示例性切割位点46A、46B。
P5引物序列为：
P5:5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(SEQ.ID.NO.1)
P7引物序列可为：
P7#1:5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGAnAT(SEQ.ID.NO.2)
P7#2:5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACnAGAT(SEQ.ID.NO.3)
其中两个序列中的n都是8-氧代鸟嘌呤。因此，当从3'端起的第5个位置中的核苷酸是鸟嘌呤时，从3'端起的第3个位置中的n是8-氧代鸟嘌呤(SEQ.ID.NO.2)，并且当从3'端起的第3个位置中的核苷酸是鸟嘌呤时，从3'端起的第5个位置中的n是8-氧代鸟嘌呤(SEQ.ID.NO.3)。
P15引物序列为：
P15:5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAnCTACAC(SEQ.ID.NO.4)
其中n是烯丙基-T。
上述其他引物序列(PA-PD)包括：
PA 5’→3’
GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG(SEQ.ID.NO.5)
cPA(PA’)5’→3’
CTCAACGGATTAACGAAGCGTTCGGACGTGCCAGC(SEQ.ID.NO.6)
PB 5’→3’
CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT(SEQ.ID.NO.7)
cPB(PB’)5’→3’
AGTTCATATCCACCGAAGCGCCATGGCAGACGACG(SEQ.ID.NO.8)
PC 5’→3’
ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT(SEQ.ID.NO.9)
cPC(PC’)5’→3’
AGTTGCGGATTCGACGCGTTGATATTAGCGGCCGT(SEQ.ID.NO.10)
PD 5’→3’
GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC(SEQ.ID.NO.11)
cPD(PD’)5’→3’
GCTGCATCGAATAGTCCGGCTAACGTAACGCGGC(SEQ.ID.NO.12)
本文所公开的切割位点46A、46B中的任一个可掺入到SEQ.ID.NO.5至SEQ.ID.NO.12中的合适位置中。在本文所公开的示例中的任一者中，切割位点46A、46B的位置至少部分地取决于核酸酶抗性引物42A、42B是否用于另外的扩增和测序过程、用于再生等。在这些情况下，在切割之后，应保留足够的序列44A、44B用于杂交、扩增、夹板连接、延伸和/或要进行的任何其他过程。
核酸酶抗性修饰48A、48B使核酸酶抗性引物42A、42B对外切核酸酶和/或内切核酸酶的3'→5'酶促活性具有抗性。合适的核酸酶抗性修饰48A、48B的示例包括硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、反向核苷酸、肽核酸、吗啉代、2'-O-甲基和包括亚磷酰胺C3间隔子的核苷酸。这些核酸酶抗性修饰48A、48B中的一些核酸酶抗性修饰，例如定位在核酸酶抗性引物42A、42B的3'端处的反向核苷酸，也可抑制一些聚合酶的延伸活性。当使用这些类型的核酸酶抗性修饰48A、48B时，可在参考图3A至图3E描述的方法中使用可读取此类反向核苷酸的聚合酶。
如所提及的，引物序列(P5、P7、PA等)中的任一者可用作核酸酶抗性引物42A的主要或一级序列44A。切割位点46A掺入在引物序列44A的3'端处，并且因此可连接在末端处或末端附近。具体位置可取决于所使用的主要或一级序列44A和切割位点46A；以及，如上所述，其中将涉及序列44A的剩余部分的过程(例如，另一轮扩增和测序)。作为示例，尿嘧啶可在从引物序列44A的3'端起的第七个位置处掺入到P5序列中(参见SEQ.ID.NO.1)，或者8-氧代鸟嘌呤可在从引物序列44A的3'端起的第三个或第五个位置处掺入到P7序列中(参见SEQ.ID.NOS.2和3)，或者烯丙基-核苷酸可在引物序列44A的3'端处掺入到P15序列中。在核酸酶抗性引物42A中，核酸酶抗性修饰48A相对于切割位点46A定位在5'处。核酸酶抗性修饰48A的位置至少部分地取决于核酸酶抗性引物42A、42B是否用于另外的扩增和测序过程、用于再生等。在这些情况下，在核酸酶消化/切割之后，应保留足够的序列44A用于杂交、扩增、夹板连接、延伸等。应当理解，可将单个核酸酶抗性修饰48A或多个核酸酶抗性修饰48A掺入到序列44A中。作为一个示例，可以从相对于切割位点46A的位置为5'的位置处开始，将三个或更多硫代磷酸酯键连续地掺入引物序列44A中。这种数量的硫代磷酸酯键可增加核酸酶抗性引物42A的核酸酶抗性。
还如所提及的，引物序列(P5、P7、PA等)中的任一者可用作核酸酶抗性引物42B的主要或一级序列44B。核酸酶抗性修饰48B掺入引物序列44B的3'端处，并且因此可连接在末端处或末端附近。具体定位可取决于所使用的核酸酶抗性修饰48B；以及，如上所述，其中将涉及序列44B的剩余部分的过程(例如，另一轮扩增和测序)。作为一个示例，可将三个硫代磷酸酯键掺入从引物序列44B的3'端处开始的第一至第三核苷酸位置中。作为另一个示例，可将反向核苷酸掺入从引物序列44B的3'端起的第二个位置处。在核酸酶抗性引物42B中，切割位点46B相对于核酸酶抗性修饰48B定位在5'处。例如，在P5中，尿嘧啶可掺入从引物序列44B的3'端起的第七个位置处，或者在P7中，8-氧代鸟嘌呤可掺入从引物序列44B的3'端起的第三个或第五个位置处，只要核酸酶抗性修饰48B相对于切割位点46B定位在3'处即可。
在引物组40A的一些示例中，第一核酸酶抗性修饰48A和第二核酸酶抗性修饰48B是相同类型的核酸酶抗性修饰。相比之下，切割位点46A、46B是不同的。在一个示例中，第一核酸酶抗性修饰48A和第二核酸酶抗性修饰48B两者选自由以下组成的组：硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、反向核苷酸、肽核酸、吗啉代、2'-O-甲基和包括亚磷酰胺C3间隔子的核苷酸；并且第一切割位点46A和第二切割位点46B中的每一者包括独立地选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸。
核酸酶抗性引物42A、42B中的每一者的5'末端还可包括具有末端炔烃基团或另一种合适的末端官能团的接头，该末端官能团可与聚合物水凝胶28的表面官能团连接。在一个示例中，核酸酶抗性引物42A、42B用己炔基5'封端。除了期望的末端官能团之外，接头还可包括10个核苷酸或更少、聚乙二醇链、烷基基团或碳链、具有邻二醇的脂肪族接头、肽接头，等等。接头的一个示例是聚T间隔区，但是也可以使用其他核苷酸。在一个示例中，间隔子具有末端炔烃基团的6T至10T间隔子。
如所提及的，涉及引物组40A的方法的示例示意性地示出于图3A至图3E中。尽管这些附图示出了单个引物组40A，但是应当理解，流通池10将包括若干引物组40A，并且在该方法期间可利用引物组40A中的所有或一些引物组。
图3A至图3E所示的方法使得能够从两个不同样品中进行单次读取。该示例性方法包括将第一样品引入到本文所公开的包括引物组40A的流通池10的一个示例中；扩增第一样品的第一文库片段，从而产生第一多个第一样品文库片段扩增子50(图3A)和第二多个第一样品文库片段扩增子52，这些第一多个第一样品文库片段扩增子分别与多个第一核酸酶抗性引物42A连接，这些第二多个第一样品文库片段扩增子分别与多个第二核酸酶抗性引物42B连接；将第一切割位点切割流体引入到流通池10中，从而在第一切割位点46A处切割第一核酸酶抗性引物42A，由此去除第一多个第一样品文库片段扩增子50(图3B)；对第二多个第一样品文库片段扩增子52进行测序(图3B)，从而产生多个第一样品文库片段新生链(未示出)；将核酸酶引入流通池10，从而切割第二多个第一样品文库片段扩增子52和多个新生链(图3C)；将第二样品引入到流通池10中；扩增第二样品的第二文库片段，从而产生第一多个第二样品文库片段扩增子54和第二多个第二样品文库片段扩增子56，这些第一多个第二样品文库片段扩增子分别与第二多个第一核酸酶抗性引物42A连接，这些第二多个第二样品文库片段扩增子与第二多个第二核酸酶抗性引物42B连接(图3D)；将第二切割位点切割流体引入到流通池10中，从而在第二切割位点46B处切割第二核酸酶抗性引物，由此去除第二多个第二样品文库片段扩增子56；以及对第一多个第二样品文库片段扩增子54进行测序(图3E)，从而产生多个第二样品文库片段新生链(未示出)。
在开始图3A至图3E所示的方法之前，可由第一核酸样品和第二核酸样品(例如，DNA样品或RNA样品)制备相应的文库片段。DNA核酸样品可被片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的DNA片段。RNA核酸样品可用于合成互补DNA(cDNA)，并且cDNA可被片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的cDNA片段。在制备期间，可将衔接子添加到任何片段的末端。通过减少循环扩增，可在衔接子中引入不同的基序，诸如测序引物结合位点、索引，以及与核酸酶抗性引物42A、42B的至少一部分互补的区域。在一些示例中，来自单个核酸样品的片段具有添加至其的相同衔接子。最终文库片段包括DNA或cDNA片段和两端处的衔接子。来自相应样品的DNA或cDNA片段表示要进行测序的部分。
在图3A至图3E所示的方法开始时，将包括第一样品文库片段的第一样品引入到流通池10中。使多个第一样品文库模板与例如固定在聚合物水凝胶28上的两种类型的核酸酶抗性引物42A、42B之一杂交。
然后可进行扩增，即簇生成。在扩增的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶(未示出)通过3'延伸从杂交引物复制文库片段。使原始文库片段变性，留下固定在聚合物水凝胶28上的拷贝(例如，第一多个第一样品文库片段扩增子50)。等温桥扩增或一些其它形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，扩增子50循环以与相邻的互补核酸酶抗性引物42A、42B杂交，并且聚合酶拷贝所拷贝的模板以形成第二多个第一样品文库片段扩增子52。第一多个第一样品文库片段扩增子50和第二多个第一样品文库片段扩增子52形成双链桥，如图3A所示。尽管未示出，但这些双链桥被变性以形成两个单链第一样品文库片段扩增子50、52。单链第一样品文库片段扩增子50、52循环并与相邻的互补引物42A、42B杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环(未示出)。通过等温变性和扩增循环对每个第一文库片段扩增子50、52重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。
扩增导致形成固定在聚合物水凝胶28上的若干个扩增子50、52。扩增/成簇的该示例称为桥扩增，并且是可执行的扩增的一个示例。应当理解，可使用其他扩增技术，诸如排除扩增(ExAmp)工作流程(Illumina Inc.)。
然后，将第一切割位点切割流体引入到流通池10中。该切割流体能够去除第一多个第一样品文库片段扩增子50，而不去除第二多个第一样品文库片段扩增子52。切割流体的活性组分将取决于核酸酶抗性引物42A的切割位点46A。作为示例，当第一切割位点46A是尿嘧啶时，第一切割位点切割流体可包括USERTM酶，其是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII(其留下3'磷酸)的混合物或分离自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的酶(其留下脱保护的3'端基团)；当第一切割位点46A是8-氧代鸟嘌呤时，第一切割位点切割流体可包括甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(FPG)；并且当第一切割位点46A是烯丙基-核苷酸时，第一切割位点切割流体可包括钯和三(羟丙基)膦(THP)。切割后，位于切割位点46A的5'端的核酸酶抗性引物42A的部分66A保持与聚合物水凝胶28连接。
在一个示例中，第一多个第一样品文库片段扩增子50是通过特异性碱基切割去除的反向扩增子，留下第二多个第一样品文库片段扩增子52，作为正向扩增子。
然后，对第二多个第一样品文库片段扩增子52进行测序。将分别与扩增子52的序列的互补部分杂交的测序引物58引入到流通池10中。在测序引物58的杂交期间，扩增子50也可与保留的引物42A的部分66A重新杂交，如图3B所示。
测序引物58使扩增子52准备好使用掺入混合物进行测序。掺入混合物可包括多种全功能核苷酸(FFN)、聚合酶和液体载体。掺入混合物的液体载体可以是水和/或离子盐缓冲液，诸如毫摩尔至摩尔浓度的柠檬酸盐溶液、氯化钠、氯化钾、磷酸盐缓冲盐水等，和其他缓冲液，诸如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)。液体载体还可包括旨在用于掺入反应的催化金属，诸如Mg2+、Mn2+、Ca2+等。可使用单一催化金属或催化金属的组合，并且总量可在约0.01mM至约100mM的范围内。
全功能核苷酸包含核苷酸、与该核苷酸的糖连接的3'OH封端基团和与该核苷酸的碱基连接的荧光团。
核苷酸可为本文所述的任何核苷酸。
3'OH封端基团可与核苷酸中糖分子的3'氧原子连接。3'OH封端基团可为仅允许在每个测序循环中发生单碱基掺入的可逆终止剂。可逆终止剂会阻止附加的碱基掺入与扩增子52互补的新生链中。这使得能够检测和识别单个掺入的碱基。随后可去除3'OH封端基团，使得能够在每个扩增子52处发生另外的测序循环。不同的3'OH封端基团的示例包括3'-ONH2可逆终止剂、3'-O-烯丙基可逆终止剂(即，-CH＝CHCH2)和3'-O-叠氮甲基可逆终止剂(即，-CH2N3)。其他合适的可逆终止剂包括邻硝基苄基醚、烷基邻硝基苄基碳酸酯、酯部分、其他烯丙基部分、缩醛(例如，叔丁氧基-乙氧基)、MOM(—CH2OCH3)部分、2,4-二硝基苯亚磺酰基、四氢呋喃醚、3'磷酸、醚、-F、-H2、-OCH3、-N3、-HCOCH3和2-硝基苯碳酸酯。
全功能核苷酸的荧光团与核苷酸的碱基连接。荧光团可为任何光学可检测部分，包括发光部分、化学发光部分、荧光部分、荧光底物部分、发色团部分和/或发色部分。合适的光学可检测部分的一些示例包括荧光素标记、罗丹明标记、花菁标记(例如，Cy3、Cy5等)和家族的荧光染料以及其他荧光和荧光底物染料。荧光团可使用任何合适的接头分子与核苷酸的碱基连接。在一个示例中，接头分子是式-((CH2)2O)n-的间隔基团，其中n为介于2与50之间的整数。接头分子包括切割位点。
在一个示例中，掺入混合物包括不同的FFN的混合物，其包括不同的碱基，例如A、T、G、C(以及U或I)。对于不同的FFN，也可能需要使用不同类型的荧光团。例如，可选择荧光团，使得每个荧光团吸收激发辐射和/或以与其他荧光团可区别的波长发射荧光。此类可区别的类似物提供了同时监测不同荧光团在同一反应混合物中存在的能力。在一些示例中，掺入混合物中的四种FFN之一可不包括荧光团，而其它三种标记FFN包括不同的荧光团。
可使用可接受全功能核苷酸并且可成功地将全功能核苷酸的碱基掺入到沿扩增子52的新生链中的任何聚合酶。在一些情况下，还可选择聚合酶以读取核酸酶抗性修饰48A、48B。例如，可以选择损伤旁路(lesion bypass)聚合酶，如人聚合酶δ，以读取一些核酸酶抗性修饰48A、48B，包括吗啉代和反向核苷酸。其他示例性聚合酶包括来自家族A的那些聚合酶，诸如Bsu聚合酶、Bst聚合酶、Taq聚合酶、T7聚合酶和许多其他聚合酶；来自家族B和B2的聚合酶，诸如Phi29聚合酶和其他高度加工性聚合酶(家族B2)、Pfu聚合酶(家族B)、KOD聚合酶(家族B)、9oN(家族B)和许多其他聚合酶；来自家族C的聚合酶，诸如大肠杆菌DNAPol III，以及许多其他来自家族D的聚合酶，诸如激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)DNAPol II和许多其他聚合酶；来自家族X的聚合酶，诸如DNA Polμ、DNA Polβ、DNA Polσ和许多其他聚合酶。
在该示例性方法中，掺入混合物的任何示例例如经由入口引入到流通池10中。当将掺入混合物引入到流通池10中时，混合物进入流动通道12并接触存在扩增子52的表面化学物。这些聚合酶中的一种或多种聚合酶可用于拷贝硫代磷酸酯修饰。
使掺入混合物在流通池10中温育，并通过聚合酶将FFN掺入到沿扩增子52产生的新生链(未示出)中。在掺入期间，通过相应的聚合酶将FFN之一掺入一条新生链中，该新生链延伸一个测序引物58并与扩增子52中的一个扩增子互补。以模板链依赖性方式进行掺入，并且因此添加到新生链中的FFN的顺序和类型的检测可用于确定扩增子52的序列。在单个测序循环期间，在跨泳道24或凹入部20的扩增子52中的至少一些扩增子中发生掺入。因此，跨流通池10的扩增子52中的至少一些扩增子中，相应的聚合酶通过掺入混合物中的FFN中的一者来使杂交的测序引物58延伸。
掺入的FFN包括由于存在3'OH封端基团而引起的可逆终止特性，一旦已添加FFN，就终止新生链上的进一步测序引物延伸。在温育和掺入期望的时间之后，可在洗涤循环期间从流通池10中去除掺入混合物。洗涤循环可以涉及流通技术，其中洗涤溶液(例如，缓冲液)(例如，通过泵或其他合适的机构)被引导进入、通过、然后离开流动通道12。
在不进行进一步掺入的情况下，可通过成像事件检测最近掺入的FFN。在成像事件期间，照明系统(未示出)可向包括表面化学物的流通池表面提供激发光。掺入的FFN的荧光团响应于激发光而发射光信号。
在进行成像后，将混合物引入到流通池10中，该混合物能够i)从掺入的FFN中去除3'OH阻断基团，以及ii)从FFN中切割荧光团。混合物中3'OH封端基团和合适的解封剂/组分的示例可包括：可通过碱水解去除的酯部分；可用Nal、三甲基氯硅烷和Na2S2O3或用Hg(II)的丙酮/水溶液移除的烯丙基部分；可用膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))切割的叠氮甲基；可用酸性条件切割的缩醛，诸如叔丁氧基-乙氧基；可用LiBF4和CH3CN/H2O切割的MOM(—CH2OCH3)部分；可用亲核试剂诸如苯硫酚和硫代硫酸盐切割的2,4-二硝基苯亚磺酰基；可用Ag(I)或Hg(II)切割的四氢呋喃基醚；以及可被磷酸酶(例如多核苷酸激酶)切割的3'磷酸。切割混合物中合适的荧光团切割剂/组分的示例可包括：可切割邻位二醇的高碘酸钠；可切割叠氮甲基键的膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))；可切割烯丙基的钯和THP；可切割酯部分的碱基；或任何其它合适的切割剂。
洗涤可在各种流体递送步骤之间发生。然后可以重复测序循环n次以将测序引物58延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。
在对扩增子52进行测序后，将核酸酶引入到流通池10中以切割第二多个第一样品文库片段扩增子52和多个新生链(图3C)。核酸酶可为外切核酸酶或内切核酸酶。核酸酶具有3'→5'活性。在一个示例中，核酸酶选自由以下组成的组：外切核酸酶I、热不稳定外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶、核酸酶P1、外切核酸酶III、外切核酸酶V、核酸酶BAL-31、DNA酶I和微球菌核酸酶。如图3C所示，核酸酶去除第一样品链(例如，扩增子52和与其连接的新生链)，但不去除核酸酶抗性引物42B或核酸酶抗性引物42A的剩余部分。这是由于以下事实：核酸酶抗性修饰48A、48B对核酸酶消化/切割不敏感，并且因此保护其免受核酸酶消化/切割。
在去除第一样品链后，可将具有3'-磷酸酶活性的酶(例如，DNA磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK)等)引入到流通池10中。当3'端是磷酸时，这是期望的。这种类型的酶处理3'磷酸端，从而将它们转化成3'-羟基。核酸酶抗性引物42A、42B的剩余部分准备好用于第二样品。
将包括第二样品文库片段的第二样品引入到流通池10中。第二文库片段的扩增可如本文所述进行，该扩增产生第一多个第二样品文库片段扩增子54和第二多个第二样品文库片段扩增子56，这些第一多个第二样品文库片段扩增子分别与第二多个第一核酸酶抗性引物42A连接，这些第二多个第二样品文库片段扩增子分别与第二多个第二核酸酶抗性引物42B连接。这在图3D中描绘。
然后，将第二切割位点切割流体引入到流通池10中。该切割流体能够去除第二多个第二样品文库片段扩增子56，而不去除第一多个第二样品文库片段扩增子54。切割流体的活性组分将取决于核酸酶抗性引物42B的切割位点46B。作为示例，当第二切割位点46B是尿嘧啶时，第二切割位点切割流体可包括USERTM酶，其是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII(其留下3'磷酸)的混合物或分离自激烈热球菌的酶(其留下脱保护的3'端基团)；当第二切割位点46B是8-氧代鸟嘌呤时，第二切割位点切割流体可包括甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(FPG)；并且当第二切割位点46B是烯丙基-核苷酸时，第二切割位点切割流体可包括钯和三(羟丙基)膦(THP)。
将另一测序引物58'引入到流通池10中，并且如本文所述对第一多个第二样品文库片段扩增子54进行测序。
在图3A至图3E所示的方法的一个具体示例中，第一切割位点46A中的每个第一切割位点包括尿嘧啶核碱基；第一切割位点切割流体包含尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物或分离自激烈热球菌的酶；第二切割位点46B中的每个第二切割位点包括8-氧代鸟嘌呤核碱基；第二切割位点切割流体包含甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶；并且核酸酶选自由以下组成的组：外切核酸酶I、热不稳定外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶、核酸酶P1、外切核酸酶III、外切核酸酶V、核酸酶BAL-31、DNA酶I和微球菌核酸酶。
引物组#2和使用方法
图4示出了可用于本文所公开的流通池10的示例中的另一个引物组40B的示例。引物组40B包括两个核酸酶抗性引物42C、42D，其中的一个包括切割位点46C，并且另一个不包括切割位点。引物组40B包括：第一核酸酶抗性引物42C，该第一核酸酶抗性引物包括第一序列44C、连接在第一序列44C的3'端处的切割位点46C、以及掺入第一序列44C与切割位点46C之间的第一核酸酶抗性修饰48C；以及第二核酸酶抗性引物42D，该第二核酸酶抗性引物包括不同于第一序列44C的第二序列44D以及掺入第二序列44D的3'端处的第二核酸酶抗性修饰48B。
核酸酶抗性引物42C、42D的序列44C、44D可包括本文所述的序列中的任何序列，前提是当用作引物42D时，切割位点46C不包括在P5、P7或P15中。这些引物序列中的任何两个引物序列可分别用作核酸酶抗性引物42C、42D的主要或一级序列(即，序列44C、44D)。切割位点46C和核酸酶抗性修饰48C可掺入到核酸序列序列44C中的期望位置处，而核酸酶抗性修饰48D可掺入到核酸序列44D中的期望位置处。
切割位点46C使核酸酶抗性引物42C在切割位点46C所掺入的位置处可切割。本文针对切割位点46A、46B所述的示例中的任何示例可用于除烯丙基-核苷酸之外的切割位点46C，因为聚合酶延伸用于产生核酸酶抗性引物42C。核酸酶抗性引物42D不包括切割位点。
核酸酶抗性修饰48C、48D使核酸酶抗性引物42C、42D对外切核酸酶和/或内切核酸酶的3'→5'酶促活性具有抗性。核酸酶抗性修饰48A、48B的示例中的任何示例可用于核酸酶抗性修饰48C、48D。
如所提及的，引物序列(P5、P7、PA等)中的任一者可用作核酸酶抗性引物42C的主要或一级序列44C。切割位点46C掺入在引物序列44C的3'端处，并且因此可连接在末端处或末端附近。具体定位可取决于所使用的切割位点46C，以及序列44C的剩余部分将涉及的过程(例如，再生)，例如，如本文关于切割位点46A所述。在核酸酶抗性引物42C中，核酸酶抗性修饰48C相对于切割位点46C定位在5'处。应当理解，单个核酸酶抗性修饰48C或多个核酸酶抗性修饰48C可掺入到序列44C中。作为一个示例，可以从相对于切割位点46C的位置为5'的位置处开始，将三个或更多硫代磷酸酯键连续地掺入引物序列44C中。
还如所提及的，引物序列(P5、P7、PA等)中的任一者可用作核酸酶抗性引物42D的主要或一级序列44D。核酸酶抗性修饰48D掺入引物序列44D的3'端处，并且因此可连接在末端处或末端附近。具体定位可取决于所使用的核酸酶抗性修饰48D，以及序列44D的剩余部分将涉及的过程(例如，另一轮扩增和测序)。作为一个示例，可将三个硫代磷酸酯键掺入从引物序列44D的3'端处开始的第一至第三核苷酸位置中。作为另一个示例，可将反向核苷酸掺入从引物序列44D的3'端起的第二个位置处。
在引物组40B的一些示例中，第一核酸酶抗性修饰48C和第二核酸酶抗性修饰48D是相同类型的核酸酶抗性修饰。在一个示例中，第一核酸酶抗性修饰48C和第二外切核酸酶抗性修饰48D是相同类型的核酸酶抗性修饰并且选自由以下组成的组：硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、反向核苷酸、肽核酸、吗啉代、2'-O-甲基和包括亚磷酰胺C3间隔子的核苷酸；并且第一核酸酶抗性引物42C的切割位点46C包括独立地选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基核苷酸。
核酸酶抗性引物42C、42D中的每一者的5'末端还可包括具有末端炔烃基团或另一种合适的末端官能团的接头(例如，polyT间隔子)，该末端官能团可与聚合物水凝胶28的表面官能团连接。
涉及引物组40B的方法的示例示意性地示出于图5A至图5D中。尽管这些附图示出了单个引物组40B，但是应当理解，流通池10将包括若干引物组40B，并且在该方法期间可利用引物组40B中的所有或一些引物组。
图5A至图5D所示的方法使得能够从任何数量的样品中进行单次读取。该示例性方法包括将第一样品引入到本文所公开的包括引物组40B的流通池10的一个示例中；扩增第一样品的文库片段，从而产生第一多个第一样品文库片段扩增子50(图5A)和第二多个第一样品文库片段扩增子52，这些第一多个第一样品文库片段扩增子分别与多个第一核酸酶抗性引物42C连接，这些第二多个第一样品文库片段扩增子分别与多个第二核酸酶抗性引物42D连接；将切割流体引入到流通池10中，从而在切割位点46C处切割第一核酸酶抗性引物42C，由此去除第一多个第一样品文库片段扩增子50(图5B)；对第二多个第一样品文库片段扩增子52进行测序(图5B)，从而产生多个第一样品文库片段新生链(未示出)；将核酸酶引入流通池10，从而切割所述第二多个第一样品文库片段扩增子52和多个第一样品文库片段新生链(图5C)；将多个再生寡核苷酸60引入到流通池10中(图5D)，由此再生寡核苷酸60中的至少一些再生寡核苷酸的第一部分62分别与第一核酸酶抗性引物42C中的至少一些第一核酸酶抗性引物的剩余部分66C杂交，其中每个再生寡核苷酸60还包括与第一核酸酶抗性引物42C的切割部分互补的第二部分64；以及引发沿所杂交的再生寡核苷酸60的相应第二部分64的聚合酶延伸，以使第一核酸酶抗性引物42C中的至少一些第一核酸酶抗性引物的切割部分再生。
图5A至图5D所示的方法中使用的文库片段可使用任何合适的技术制备。
在图5A至图5D所示的方法开始时，将包括第一样品文库片段的第一样品引入到流通池10中。使多个第一样品文库模板与例如固定在聚合物水凝胶28上的两种类型的核酸酶抗性引物42C、42D之一杂交。
然后，可如本文所述进行扩增，即簇生成。扩增导致形成固定在聚合物水凝胶28上的若干个扩增子50、52。
然后，将切割流体引入到流通池10中。该切割流体能够去除第一多个第一文库片段扩增子50，而不去除第二多个第一文库片段扩增子52，因为引物42D不包括切割位点。切割流体的活性组分将取决于核酸酶抗性引物42C的切割位点46C。可使用本文所公开的切割流体的任何示例。切割后，位于切割位点46C的5'端的核酸酶抗性引物42C的部分66C保持与聚合物水凝胶28连接。
引入测序引物58并如本文所述对第二多个第一文库片段扩增子52进行测序。
在对扩增子52进行测序后，将核酸酶引入到流通池10中以切割第二多个第一文库片段扩增子52和与其连接的多个新生链(图5C)。核酸酶可为外切核酸酶或内切核酸酶。核酸酶具有3'→5'活性。在一个示例中，核酸酶选自由以下组成的组：外切核酸酶I、热不稳定外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶、核酸酶P1、外切核酸酶III、外切核酸酶V、核酸酶BAL-31、DNA酶I和微球菌核酸酶。如图5C所示，核酸酶去除第一样品链(例如，扩增子52和与其连接的新生链)，但不去除核酸酶抗性引物42D或核酸酶抗性引物42C的剩余部分66C。这是由于以下事实：核酸酶抗性修饰48C、48D对核酸酶消化/切割不敏感，并且因此保护其免受核酸酶消化/切割。
在去除第一样品链后并且当3'端是磷酸时，可将具有3'-磷酸酶活性的酶(例如，DNA磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK)等)引入到流通池10中。该酶处理磷酸端，从而将它们转化成3'-羟基。
在该示例性方法中，将核酸酶抗性引物42C的剩余部分66C暴露于重新引入切割位点46C并且因此使核酸酶抗性引物42C再生的处理。为了使核酸酶抗性引物42C再生，将再生寡核苷酸60引入到流通池10中。每个再生寡核苷酸60包括与核酸酶抗性引物42C的剩余部分66C互补的第一部分62以及与核酸酶抗性引物42C的由切割流体切割的部分互补的第二部分64。因此，再生寡核苷酸60的序列取决于核酸酶抗性引物42C的序列。
在使得再生寡核苷酸60的第一部分62能够分别与第一核酸酶抗性引物42C中的至少一些第一核酸酶抗性引物的剩余部分66C杂交的条件下引入再生寡核苷酸60。
然后，将包含切割位点46C、核苷酸和聚合酶的混合物引入到流通池10中。可调节流通池10的温度以引发聚合酶链式反应(PCR)。使用再生寡核苷酸60的第二部分64作为模板，聚合酶使剩余部分66C的3'端能够进行PCR延伸。因为PCR延伸反应由再生寡核苷酸60的第二部分64引导并且第二部分64与核酸酶抗性引物42C的由切割流体切割的部分互补，所以沿第二部分64的聚合酶延伸使至少第一核酸酶抗性引物42C的切割位点46C再生。在一个示例中，PCR延伸掺入切割位点46C和来自混合物的核苷酸以使第一核酸酶抗性引物42C再生。
一旦第一核酸酶抗性引物42C再生，再生寡核苷酸60变性，并且流通池10表面可暴露于另一样品以用于扩增和测序。因此，可用新的样品重复图5A至图5D所示的方法。该方法的一个示例涉及：在聚合酶延伸之后，将第二样品引入到流通池10中(从图5D移动回到图5A)；扩增第二样品的文库片段，从而产生第一多个第二样品文库片段扩增子(例如，扩增子54)和第二多个第二样品文库片段扩增子(例如，扩增子56)，这些第一多个第二样品文库片段扩增子分别与第二多个第一核酸酶抗性引物42C连接，这些第二多个第二样品文库片段扩增子与第二多个第二核酸酶抗性引物42D连接；将切割流体引入到流通池10中，从而在(再生的)切割位点46C处切割(再生的)第一核酸酶抗性引物42C，由此去除第一多个第二样品文库片段扩增子54；以及对第二多个第二样品文库片段扩增子56进行测序，从而产生多个第二样品文库片段新生链(未示出)。
在对扩增子56进行测序后，将核酸酶引入到流通池10中以切割第二多个第二文库片段扩增子56和与其连接的多个新生链(图5C)。在去除第二样品链后，可将具有3'-磷酸酶活性的酶(例如，T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK))引入到流通池10中以产生3'-羟基。然后，将核酸酶抗性引物42C的剩余部分66C暴露于再次重新引入切割位点46C并且使核酸酶抗性引物42C再生的处理。图5A至图5D所示的方法可针对任何期望数目的样品重复。
在图5A至图5D所示的方法的一个具体示例中，第一切割位点46C包括尿嘧啶核碱基；切割流体包含尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物或分离自激烈热球菌的酶；并且核酸酶选自由以下组成的组：外切核酸酶I、热不稳定外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶、核酸酶P1、外切核酸酶III、外切核酸酶V、核酸酶BAL-31、DNA酶I和微球菌核酸酶。
引物组#3和使用方法
图6示出了可用于本文所公开的流通池10的示例中的另一个引物组40C的示例。引物组40C包括两个引物68A、68B，其中一个包括不同的第一切割位点46D和第二切割位点46E，并且另一个包括第一切割位点46D而无第二切割位点46E。切割位点46D在引物68A、68B中的每一者中是相同的。
引物68A包括第一序列44E、连接在第一序列44E的3'端处的切割位点46E、以及掺入第一序列44E与切割位点46E之间的另一切割位点46D。第一序列44E可为本文所述的引物序列中的任何引物序列(例如，P5、P7、P15等)，并且第一序列44E的至少一部分70A被配置为在该方法的示例期间与再生寡核苷酸60'(参见图7E)或第一再生夹板84(参见图8)杂交。可通过在引物68A的3'端的末端位置处或在部分70A的3'端处掺入核酸酶抗性修饰的任何示例来使该引物68A具有核酸酶抗性。在引物68A的3'端的末端位置处，核酸酶抗性修饰可使得能够消化经扩增和经测序的链，同时留下完整的引物68A的剩余部分用于再生。在部分70A的3'端处，核酸酶抗性修饰可使部分70A的所有核苷酸能够具有内切核酸酶抗性。
引物68B包括不同于第一序列44E的第二序列44F以及连接在第二序列44F的3'端处的切割位点46D。第二序列44F可为本文所述的不同于第一序列44E的引物序列中的任何引物序列(例如，P5、P7、P15等)，并且第二序列44F的至少一部分70B被配置为在该方法的示例期间与再生寡核苷酸60'(参见图7F)或第二再生夹板84'(参见图8)杂交。可通过在引物68B的3'端的末端位置处或部分70B的3'端处掺入核酸酶抗性修饰的任何示例来使该引物68B具有核酸酶抗性。在引物68B的3'端的末端位置处，核酸酶抗性修饰可使得能够消化经扩增和经测序的链，同时留下完整的引物68B的剩余部分用于再生。在部分70B的3'端处，核酸酶抗性修饰可使部分70B的所有核苷酸能够具有内切核酸酶抗性。
在引物组40C的一个示例中，(引物68A、68B的每一者中的)第一切割位点46D是限制位点；并且(引物68A中的)第二切割位点46E包括选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸。限制位点的一些示例对选自由以下组成的组的限制酶敏感：≥6碱基切割物限制内切核酸酶、切口酶等。一些示例性6碱基切割物包括AcII、Afel、Nspl、HaeII、Tatl和例如可从新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs Inc.)、赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)等商购获得的其他碱基切割物。一些示例性7碱基切割物包括BspQI和SapI，并且一些示例性8碱基切割物包括NotI、FseI和PacI。
在引物组40C的另一个示例中，(引物68A、68B中的每一者中的)第一切割位点46D和(引物68A中的)第二切割位点46E各自包括独立地选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸。当引物68A、68B通过聚合酶延伸再生时(图7E)，切割位点46D、46E不是烯丙基-核苷酸。当引物68A、68B通过夹板连接再生时(图8)，切割位点46D、46E可为烯丙基-核苷酸。
无论第一切割位点46D是限制位点或与第二切割位点46E呈正交的切割位点，在引物68A中，第一切割位点46D相对于第二切割位点46E定位在5'处，并且部分70A相对于第一切割位点46D定位在5'处。在引物68B中，部分70A相对于第一切割位点46D定位在5'处。对于该引物组40C，第二切割位点46E用于扩增后的线性化，并且第一切割位点46D用于在测序后去除扩增子54和与其连接的新生链。
引物68A、68B中的每一者的5'末端还可包括具有末端炔烃基团或另一种合适的末端官能团的接头(例如，polyT间隔子)，该末端官能团可与聚合物水凝胶28的表面官能团连接。
涉及引物组40C的方法的两个示例示意性地示出于图7A至图7F中。涉及引物组40C的方法的另一个示例示意性地示出于图7A至图7D和图8中。尽管这些附图示出了单个引物组40C，但是应当理解，流通池10将包括若干引物组40C，并且在该方法期间可利用引物组40C中的所有或一些引物组。
图7A至图7F以及图7A至图7D和图8所示的方法使得能够从任何数目的样品中进行单次读取。这些示例性方法包括将第一样品引入到本文所公开的包括引物组40C的流通池10的一个示例中；扩增第一样品的第一文库片段，从而产生第一多个第一样品文库片段扩增子50和第二多个第一样品文库片段扩增子52，这些第一多个第一样品文库片段扩增子分别与多个第一引物68A连接，这些第二多个第一样品文库片段扩增子分别与多个第二引物68B连接(图7A)；将切割流体引入到流通池10中，由此在第二切割位点46E处切割第一引物68A，由此去除第一多个第一样品文库片段扩增子50(图7B)；对第二多个第一样品文库片段扩增子52进行测序(图7B)，从而产生多个第一样品文库片段新生链74(图7C)；将第二切割流体引入到流通池10中，从而在第一引物68A和第二引物68B的相应第一切割位点46D处切割这些第一引物和这些第二引物中的每一者，并且留下与聚合物水凝胶28连接的第一引物68A和第二引物68B的剩余部分66D、66E(图7C和图7D)；以及依序(图7E和图7F)或同时(图8)：i)使第一引物68A中的至少一些第一引物的切割部分72A(参见图7A)在第一引物68A中的至少一些第一引物的剩余部分66D处再生，以及ii)使第二引物68B中的至少一些第二引物的切割部分72B(参见图7A)在第二引物68B中的至少一些第二引物的剩余部分78B处再生。图7A至图7F所示的方法描绘了引物组40C的依序再生，并且图7A至图7D和图8所示的方法描绘了引物组40C的同时再生。
现在将描述图7A至图7F的方法。
在一个示例性方法中，第一切割位点46D、46E中的每一者都是限制位点。
在另一个示例性方法中，第一切割位点46D、46E中的每一者是独立地选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-胸腺嘧啶(其中第二切割位点46E不同于第一切割位点46D、46E)。
参考图7A至图7F描述这些示例中的每个示例。
图7A至图7F所示的方法中使用的文库片段可使用任何合适的技术制备。
在图7A至图7F所示的方法开始时，将包括第一样品文库片段的第一样品引入到流通池10中。使多个第一样品文库模板与例如固定在聚合物水凝胶28上的两种类型的引物68A、68B之一杂交。
在图7A至图7F所示的方法的两个示例中，然后可如本文所述进行扩增，即簇生成。扩增导致形成固定在聚合物水凝胶28上的若干个扩增子50、52。
在图7A至图7F所示的方法的两个示例中，然后将切割流体引入到流通池10中。切割流体的活性组分将取决于引物68A的第二切割位点46E。该切割流体能够去除第一多个第一文库片段扩增子50，而不去除第二多个第一文库片段扩增子52，因为引物68B不包括存在于引物68A中的切割位点46E。由于两个引物68A、68B的切割位点46D与引物68A的第二切割位点46E化学正交，因此在这些方法中，切割位点46D不易受到此时引入到流通池10中的切割流体的影响。可使用本文所公开的切割流体的任何示例。切割后，位于第二切割位点46E的5'端的引物68A的一部分保持与聚合物水凝胶28连接，如图7B所示。
引入测序引物58并如本文所述对第二多个第一文库片段扩增子52进行测序。图7C示出了在测序期间沿扩增子52产生的新生链74的示例。如所描绘的，引物68A在测序完成后可保持单链的。
在对扩增子52中的至少一些扩增子进行测序后，将第二切割流体引入到流通池10中以在它们相应的第一切割位点46D处切割第一引物68A和第二引物68B中的每一者，这使第一引物68A和第二引物68B的剩余部分66D、66E与聚合物水凝胶28连接。该第二切割流体还切割第二多个第一文库片段扩增子52和与其连接的多个新生链74。暴露于第二切割流体之后的流通池表面示出于图7D中。第二切割流体的组分将取决于引物68A、68B的第一切割位点46D。
图7C示意性地示出了在暴露于第二切割流体期间的流通池表面。
在图7C所示的一个示例中，第一切割位点46D中的每个第一切割位点是限制位点，并且第二切割流体包含：多个第一寡核苷酸78A，每个第一寡核苷酸78A与第一引物68A的至少一部分互补；多个第二寡核苷酸78B，每个第二寡核苷酸78B与第二引物68B的至少一部分互补；以及限制酶(未示出)。
在该示例中，第二切割流体中的限制酶将取决于用作切割位点46D的限制位点。如本文所述，限制酶可选自由以下组成的组：≥6碱基切割物限制内切核酸酶、切口酶等。一些示例性6碱基切割物包括AcII、Afel、Nspl、HaeII、Tatl和例如可从新英格兰生物实验室公司、赛默飞世尔科技公司等商购获得的其他碱基切割物。
在第二切割流体的该示例中，第一寡核苷酸78A和第二寡核苷酸78B分别与第一引物68A和第二引物68B的切割位点46D(即，限制位点)互补，并且与第一引物68A和第二引物68B中每一者的至少一部分互补，该至少一部分位于切割位点46D的5'端。第一寡核苷酸78A和第二寡核苷酸78B的序列使得它们能够分别与测序后为单链的第一引物68A和第二引物68B中的至少一些杂交。在对扩增子52进行测序后，引物68B是单链的，并且因此第二寡核苷酸78B与引物68B中的至少一些引物的至少一部分杂交。引物68A中的一些引物与相应的扩增子52杂交，并且因此在切割位点46D处具有双链部分，该双链部分为限制酶切割提供基底。引物68A中的其他引物不参与扩增，并且因此不与相应的扩增子52杂交。这些引物68A在扩增和测序后保持单链的，并且因此第一寡核苷酸78A与这些引物68A中的至少一些引物的至少一部分杂交。图7C示出了当使用第二切割流体的该示例时可能发生的两种可能的杂交。
当第二切割流体的此示例位于流通池10中时，将流通池10暴露于第一温度i)以引发：多个第一寡核苷酸78A中的至少一些第一寡核苷酸与在测序后为单链的第一引物68A中的至少一些第一引物的相应杂交；多个第二寡核苷酸78B中的至少一些第二寡核苷酸与在测序后为单链的第二引物68B中的至少一些第二引物的相应杂交；或两者；并且暴露于第二温度ii)以引发限制酶的双链切割活性。第一温度和第二温度可相同或不同。在一个示例中，杂交和消化温度都可为约37℃。当不同时，第一温度高于第二温度，并且第二温度(即，消化温度)足够低以防止杂交的引物68A和扩增子52、杂交的引物68A和第一寡核苷酸78A、以及杂交的引物68B和第二寡核苷酸78B去杂交(变性)。作为示例，杂交可在约60℃进行，并且消化可在约37℃进行，或者杂交可在约40℃进行，并且消化可在约25℃进行。
限制酶的切割活性在切割位点46D处切割双链部分，由图7C中的闪电符号表示。切割后，可升高流通池10的温度以使保持与引物68A、68B的剩余部分杂交的链部分(例如，扩增子52和/或寡核苷酸78A、78B的部分)变性。变性使第一引物68A中的至少一些第一引物的剩余部分66D和第二引物68B中的至少一些第二引物的剩余部分66E成为单链的，如图7D所示。可用洗涤流体冲洗流通池10，以去除所有切割的和变性的链。
在图7C所示的另一个示例中，第一切割位点46D中的每个第一切割位点包括选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核碱基，并且第二切割流体包含多个第一寡核苷酸78A，每个第一寡核苷酸78A与第一引物68A的至少一部分互补；多个第二寡核苷酸78B，每个第二寡核苷酸78B与第二引物68B的至少一部分互补；以及切除酶(未示出)。
在该示例中，第二切割流体中的切除酶将取决于用作切割位点46D的核碱基。合适的切除酶的示例包括USERTM酶、分离自激烈热球菌的酶、FPG等。
在第二切割流体的该示例中，第一寡核苷酸78A和第二寡核苷酸78B分别与第一引物68A和第二引物68B的切割位点46D(即，核碱基)互补，并且与第一引物68A和第二引物68B中每一者的至少一部分互补，该至少一部分位于切割位点46D的5'端。第一寡核苷酸78A和第二寡核苷酸78B的序列使得它们能够分别与测序后为单链的第一引物68A和第二引物68B中的至少一些杂交。在对扩增子52进行测序后，引物68B是单链的，并且因此第二寡核苷酸78B与引物68B中的至少一些引物的至少一部分杂交。引物68A中的一些引物与相应的扩增子52杂交，并且因此在切割位点46D处具有双链部分，该双链部分为切除酶切割提供基底。引物68A中的其他引物不参与扩增，并且因此不与相应的扩增子52杂交。这些引物68A在扩增和测序后保持单链的，并且因此第一寡核苷酸78A与这些引物68A中的至少一些引物的至少一部分杂交。图7C示出了当使用第二切割流体的该示例时可能发生的两种可能的杂交。
当第二切割流体的此示例位于流通池10中时，将流通池10暴露于第一温度i)以引发：多个第一寡核苷酸78A中的至少一些第一寡核苷酸与在测序后为单链的第一引物68A中的至少一些第一引物的相应杂交；多个第二寡核苷酸78B中的至少一些第二寡核苷酸与在测序后为单链的第二引物68B中的至少一些第二引物的相应杂交；或两者；并且暴露于第二温度ii)以引发切除酶的双链切割活性。第一温度和第二温度可相同或不同。在一个示例中，杂交和切除温度都可为约37℃。当不同时，第一温度高于第二温度，并且第二温度(即，切除温度)足够低以防止杂交的引物68A和扩增子52、杂交的引物68A和第一寡核苷酸78A、以及杂交的引物68B和第二寡核苷酸78B去杂交(变性)。
切除酶的切割活性在切割位点46D处切割引物68A、68B，由图7C中的闪电符号表示。切割后，可升高流通池10的温度以使保持与引物68A、68B的剩余部分杂交的链(例如，扩增子52和/或寡核苷酸78A、78B)变性。变性使第一引物68A中的至少一些第一引物的剩余部分66D和第二引物68B中的至少一些第二引物的剩余部分66E成为单链的，如图7D所示。可用洗涤流体冲洗流通池10，以去除所有切割的和变性的链。
当使用具有切除酶的切割流体时，可将具有3'-磷酸酶活性的另外的酶(例如，DNA磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK))引入到流通池10中。该酶处理磷酸端，从而将它们转化成3'-羟基。
图7A至图7F所示的方法然后涉及引物68A、68B的切割部分72A、72B(参见图7A)的依序再生。第一引物68A中的至少一些第一引物的切割部分72A和第二引物68B中的至少一些第二引物的切割部分72B的依序再生涉及：如图7E所示，将多个第一再生寡核苷酸60'引入到流通池10中，由此第一再生寡核苷酸60'中的至少一些第一再生寡核苷酸的第一部分80A分别与第一引物68A中的至少一些第一引物的剩余部分66D杂交，并且其中每个第一再生寡核苷酸60'还包括与第一引物68A的切割部分72A互补的第二部分82A；以及引发沿所杂交的第一再生寡核苷酸60'的相应第二部分82A的聚合酶延伸，以使第一引物68A中的至少一些第一引物的切割部分72A再生；以及如图7F所示，将多个第二再生寡核苷酸60”引入到流通池中，由此第二再生寡核苷酸60”中的至少一些第二再生寡核苷酸的第一部分80B分别与第二引物68B中的至少一些第二引物的剩余部分66E杂交，其中每个第二再生寡核苷酸60”还包括与第二引物68B的切割部分72B互补的第二部分82B；以及引发沿所杂交的第二再生寡核苷酸60”的相应第二部分82B的聚合酶延伸，以使第二引物68B中的至少一些第二引物的切割部分72B再生。
如图7E所示，每个再生寡核苷酸60'包括与引物68A的剩余部分66D的至少一部分70A互补的第一部分80A和与引物68A的由切割流体切割的部分互补的第二部分82A。因此，再生寡核苷酸60'的序列取决于第一引物68A的原始序列。
在使得再生寡核苷酸60'的第一部分80A能够分别与引物68A中的至少一些引物的剩余部分66D的至少部分70A杂交的条件下引入再生寡核苷酸60'。再生寡核苷酸60'将不与第二引物68B的剩余部分66E杂交，因为这些部分66E具有与第一引物68A的剩余部分66D的序列不同的序列。
然后，将包含切割位点46D、46E、核苷酸和聚合酶的混合物引入到流通池10中。可调节流通池10的温度以引发聚合酶链式反应(PCR)。使用再生寡核苷酸60'的第二部分82A作为模板，聚合酶使剩余部分66D的3'端能够进行PCR延伸。因为PCR延伸反应由再生寡核苷酸60'的第二部分82A引导并且第二部分82A与引物68A的由切割流体切割的部分互补，所以沿第二部分82A的聚合酶延伸使至少第一引物68A的切割位点46D、46E再生。在一个示例中，PCR延伸掺入切割位点46D、46E和来自混合物的核苷酸以使第一引物68A再生。
一旦第一引物68A再生，再生寡核苷酸60'变性，并且第二引物68B再生。
如图7F所示，每个再生寡核苷酸60”包括与引物68B的剩余部分66E的至少一部分70B互补的第一部分80B和与引物68A的由第二切割流体切割的部分互补的第二部分82B。因此，再生寡核苷酸60”的序列取决于第一引物68B的原始序列。
在使得再生寡核苷酸60”的第一部分80B能够分别与引物68B中的至少一些引物的剩余部分66E的至少部分70B杂交的条件下引入再生寡核苷酸60”。再生寡核苷酸60”将不与再生的第一引物68A杂交，因为这些引物68A具有与第二引物68B的剩余部分66E的序列不同的序列。
然后，将包含切割位点46D、核苷酸和聚合酶的混合物引入到流通池10中。可调节流通池10的温度以引发聚合酶链式反应(PCR)。使用再生寡核苷酸60”的第二部分82B作为模板，聚合酶使剩余部分66E的3'端能够进行PCR延伸。因为PCR延伸反应由再生寡核苷酸60”的第二部分82B引导并且第二部分82B与引物68B的由第二切割流体切割的部分互补，所以沿第二部分82B的聚合酶延伸使至少第二引物68B的切割位点46D再生。在一个示例中，PCR延伸掺入切割位点46D和来自混合物的核苷酸以使第二引物68B再生。
一旦第二引物68B再生，再生寡核苷酸60”变性，并且流通池10表面可暴露于另一样品以用于扩增和测序。因此，可用新的样品重复图7A至图7F所示的方法。该方法的一个示例涉及：将第二样品引入到流通池10中(从图7F移动回到图7A)，并且如本文所述进行扩增、引入第一切割流体、测序、引入第二切割流体以及引物68A、68B依序再生。
现在将描述图7A至图7D和图8的方法。在该示例性方法中，可如参考图7A所述进行样品引入和扩增，可如参考图7B所述进行扩增子50的切割和扩增子52的测序，并且可如参考图7C和图7D所述进行链切割(用第二切割流体的任何示例)和去除以产生剩余部分66D、66E。
图7A至图7D和图8的方法然后涉及引物68A、68B的切割部分72A、72B(参见图7A)的同时再生。第一引物68A中的至少一些第一引物的切割部分72A和第二引物68B中的至少一些第二引物的切割部分72B的同时再生涉及：将包括第一再生夹板84和第二再生夹板84'的多个再生夹板84、84'引入到流通池10中，由此第一再生夹板84的夹板部分86A分别与第一引物68A中的至少一些第一引物的剩余部分66D杂交，并且第二再生夹板84'的夹板部分86B分别与第二引物68B中的至少一些第二引物的剩余部分66D杂交，每个第一再生夹板84还包括与夹板部分86A杂交并且具有第一引物68A的切割部分72A的序列的第一连接部分88A，并且每个第二再生夹板84'还包括与夹板部分86B杂交并且具有第二引物68B的切割部分72B的序列的第二连接部分88B；以及引发第一连接部分88A中的至少一些第一连接部分与第一引物68A中的至少一些第一引物的剩余部分66D的连接，以及第二连接部分88B中的至少一些第二连接部分与第二引物68B中的至少一些第二引物的剩余部分66E的连接。
如图8所示，再生夹板84、84'中的每一者包括夹板部分86A、86B和分别在夹板部分86A、86B的5'端处杂交的连接部分88A、88B。在再生夹板84中，夹板部分86A的在5'端处的序列的部分与连接部分88A互补，并且夹板部分86A的在3'端处的序列的部分与第一引物68A的剩余部分66D的至少一部分70A互补。夹板部分86A的在3'端处的序列的部分与部分70A杂交，并且因此将连接部分88A引导到与第一引物68A的剩余部分66D连接的位置中。
类似地，在再生夹板84'中，夹板部分86B的在5'端处的序列的部分与连接部分88B互补，并且夹板部分86A的在3'端处的序列的部分与第二引物68B的剩余部分66E的至少一部分70B互补。夹板部分86B的在3'端处的序列的部分与部分70B杂交，并且因此将连接部分88B引导到与第二引物68B的剩余部分66E连接的位置中。
再生夹板84的连接部分88A的序列与第一引物68A的在图7A至图7D所示的方法期间被切割的部分的序列相同。类似地，再生夹板84'的连接部分88B的序列与第二引物68B的在图7A至图7D所示的方法期间被切割的部分的序列相同。因此，连接部分88A、88B与剩余部分66D、66E的相应连接使引物68A、68B再生。
在使得再生夹板84、84'能够分别与部分70A、70B杂交的条件下引入再生夹板84、84'。将包含再生夹板84、84'和连接酶90的混合物引入到流通池10中。合适的连接酶90的示例包括大肠杆菌连接酶(E.Coli ligase)(centaur公司(centaur)方案)、T4DNA连接酶、TaqDNA连接酶等。可调节流通池10的温度以引发杂交和连接。连接酶使得连接部分88A、88B的5'端能够与剩余部分66D、66E的3'端进行相应的夹板辅助连接。
一旦第一引物68A和第二引物68B再生，夹板部分86A、86B变性，并且流通池准备好暴露于第二(或随后的)样品。
流通池产生试剂盒
流通池表面的一些示例包括与聚合物水凝胶28连接的锚寡核苷酸34。这些流通池10可包括在试剂盒中，该试剂盒使得期望的引物30、32能够在测序之前被接枝以及在测序后被去除。因此，流通池表面是可重复使用的。
在一个示例中，流通池再生试剂盒包括流通池10，该流通池包括：基底(例如，14或16)；和聚合物水凝胶28，该聚合物水凝胶与该基底的至少一部分连接；和核酸酶抗性锚寡核苷酸34(它们的示例示出于图9、图10和图11中)；和引物流体，该引物流体包含：要分别与第一核酸酶抗性寡核苷酸34中的至少一些第一核酸酶抗性寡核苷酸连接的多个第一引物30；以及要分别与第二核酸酶抗性寡核苷酸34中的至少一些第二核酸酶抗性寡核苷酸连接的多个第二引物32。
核酸酶抗性寡核苷酸34的所有示例包括短核苷酸序列(例如，包括约10个核苷酸至约50个核苷酸)，该短核苷酸序列包括掺入3'端处的核酸酶抗性修饰的任何示例。在一个示例中，核酸酶抗性锚寡核苷酸34中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸包括选自由以下组成的组的3'端核酸酶抗性修饰：硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、反向核苷酸、肽核酸、吗啉代、2'-O-甲基、3'端磷酸化核苷酸和包括亚磷酰胺C3间隔子的核苷酸。
短核苷酸序列的3'端也能够与第一引物30和第二引物32连接。还选择短核苷酸序列，使得其不能与第一引物30和第二引物32杂交。核酸酶抗性锚寡核苷酸34中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸还在5'端处包括可被接枝到聚合物水凝胶28的官能团。
引物流体包含位于流体载体中的引物30、32。流体载体可包括水、缓冲剂和催化剂。缓冲液可为离子盐缓冲液，诸如毫摩尔至摩尔浓度的柠檬酸盐溶液、氯化钠、氯化钾、磷酸盐缓冲盐水等，和其他缓冲液，诸如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)。液体载体还可包括旨在用于连接反应的催化金属，诸如Mg2+、Mn2+、Ca2+等。可使用单一催化金属或催化金属的组合，并且总量可在约0.01mM至约100mM的范围内。
在这些示例中，引物30和32可分别包括P5和P7引物序列、P15和P7引物序列、或本文所述的PA引物序列、PB引物序列、PC引物序列和PD引物序列的任何组合。引物30和32的5'端也能够与核酸酶抗性寡核苷酸34的3'端连接。
在这些示例中，引物30和32可包括正交切割位点(例如，尿嘧啶和氧代-鸟嘌呤)，使得正向和反向扩增子可通过暴露于不同的切割剂而被去除。
现在将参考图9、图10和图11描述核酸酶抗性寡核苷酸34和引物30、32的组合的若干示例。图9、图10和图11中所示的方法(该方法利用核酸酶抗性寡核苷酸34和引物30、32的组合)涉及：将引物流体引入到流通池10中，该流通池包括基底、与该基底的至少一部分连接的聚合物水凝胶28、以及与聚合物水凝胶28连接的核酸酶抗性锚寡核苷酸34(在附图中的每个附图中的A和B处示出)；引发引物流体中的第一引物30与核酸酶抗性锚寡核苷酸34中的至少一些核酸酶抗性锚寡核苷酸的连接以及引物流体中的第二引物32与核酸酶抗性锚寡核苷酸34中的至少一些其他核酸酶抗性锚寡核苷酸的连接(在附图中的每个附图中的C处示出)；使用第一引物30和第二引物32进行测序操作(在附图中的每个附图中的D处示出)；以及在该测序操作之后，切割第一引物30和第二引物32以暴露核酸酶抗性锚寡核苷酸34(在附图中的每个附图中的E和A处示出)。
图9中示出了两个示例组合。
在图9所示的一个示例中，核酸酶抗性锚寡核苷酸34A中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的(参见图9中的A)，并且第一引物30A中的每个第一引物和第二引物32A中的每个第二引物是3'端磷酸封端的和5'端腺苷酸化的(参见图9中的B)。5'腺苷酸化端可与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A的3'-羟基连接(参见图9中的C)。这些引物30A、32A的连接可通过以下来引发：用引物流体引入连接酶，该连接酶选自由T4 RNA连接酶I和热稳定的5'App连接酶组成的组；以及将流通池10的温度调节至连接酶的反应温度。作为示例，当使用T4 RNA连接酶I时，温度可为约25℃，并且当使用热稳定的5'App连接酶时，温度可为约65℃。流通池10可暴露于洗涤循环以去除任何未连接的引物30A、32A。
在进行测序操作之前，该方法还包括使第一引物30A和第二引物32A在3'端处脱保护(参见图9中的D)。可通过引入具有3'-磷酸酶活性的酶(例如，T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK)或碱性磷酸酶(AP或ALP))使磷酸封端的3'端脱保护。这些酶处理磷酸端，从而将它们转化成3'-羟基，并且使它们准备好用于如本文所述的扩增和测序。
如图9中的“E”处所示，可如本文所述进行扩增和测序。可如本文所述对包括文库片段的样品进行引入、扩增、线性化(例如，使用用于所产生的扩增子50、52之一的合适的切割剂)和测序。
一旦测序完成并且进行任何期望的洗涤循环，可将流通池10暴露于核酸酶和碱性磷酸酶处理以切割第一引物30A和第二引物32A(参见图9中的F)。核酸酶具有3'→5'活性。在涉及3'端磷酸封端的和5'端腺苷酸化的引物30A、32A的示例中，切割可通过引入DNA酶I和外切核酸酶I来进行。由于核酸酶抗性锚寡核苷酸34A对外切核酸酶活性具有抗性，第一引物30A和第二引物32A的切割暴露出核酸酶抗性锚寡核苷酸34A(参见图9中的A)。
图9所示的流通池表面可在如本文所述的引物30A、32A连接、扩增、测序和切割的一个或多个另外的轮次中重复使用。
在图9所示的另一个示例中，核酸酶抗性锚寡核苷酸34A中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的(参见图9中的A)，并且第一引物30B和第二引物32B是3'端磷酸封端的和5'端磷酸封端的(参见图9中的B)。5'端磷酸可与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A的3'-羟基连接(参见图9中的C)。可通过用引物流体引入T4 RNA连接酶I以及将流通池10的温度调节至用于T4 RNA连接酶I的反应温度(例如，约25℃)来引发这些引物30B、32B的连接。流通池10可暴露于洗涤循环以去除任何未连接的引物30B、32B。
在进行测序操作之前，该方法还包括使第一引物30B和第二引物32B在3'端处脱保护(参见图9中的D)。可通过引入具有3'-磷酸酶活性的酶(例如，T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK)或碱性磷酸酶(AP或ALP))使磷酸封端的3'端脱保护。这些酶处理磷酸二酯端，从而将它们转化成3'-羟基，并且使它们准备好用于如本文所述的扩增和测序。
如图9中的“E”处所示，可如本文所述进行扩增和测序。可如本文所述对包括文库片段的样品进行引入、扩增、线性化(例如，使用用于所产生的扩增子50、52之一的合适的切割剂)和测序。
一旦测序完成并且进行任何期望的洗涤循环，可将流通池10暴露于核酸酶和碱性磷酸酶处理以切割第一引物30B和第二引物32B(参见图9中的F)。核酸酶具有3'→5'活性。在涉及3'端磷酸封端的和5'端磷酸封端的引物30B、32B的示例中，切割可通过引入DNA酶I和外切核酸酶I来进行。由于核酸酶抗性锚寡核苷酸34A对核酸酶活性具有抗性，第一引物30B和第二引物32B的切割暴露出核酸酶抗性锚寡核苷酸34A(参见图9中的A)。
图9所示的流通池表面可在如本文所述的引物30B、32B连接、扩增、测序和切割的一个或多个另外的轮次中重复使用。
现在参考图10，核酸酶抗性锚寡核苷酸34A中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的(参见图10中的A)；第一引物30C中的每个第一引物是3'端羟基封端的和5'端磷酸封端的并且与相应的夹板92杂交，该夹板具有与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A之一杂交的部分94(参见图10中的B)；并且第二引物32C中的每个第二引物是3'端羟基封端的和5'端磷酸封端的并且与相应的夹板96杂交，该夹板具有与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A之一杂交的部分98(参见图10中的B)。夹板92包括在引物30C的5'端处杂交的第二部分，并且夹板96包括在引物32C的5'端处杂交的第二部分。
夹板92和96的部分94和98可具有相同的序列，该序列与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A的序列互补。当引入引物流体时，可加热流通池10以引发部分94和98与不同核酸酶抗性锚寡核苷酸34A的相应杂交。因此，部分94、96可将相应引物30C、32C引导到用于与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A连接的位置中。
引物30C、32C的磷酸封端的5'端可分别与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A的3'-羟基连接(参见图10中的C)。这些引物30C、32C的连接可通过以下来引发：用引物流体引入连接酶，该连接酶选自由T4 RNA连接酶II和PBCV-1DNA连接酶组成的组；以及将流通池10的温度调节至连接酶的反应温度。作为示例，用于T4 RNA连接酶II的合适温度为约37℃，并且用于PBCV-1DNA连接酶的合适温度为约37℃。一旦完成连接，可使流通池10达到合适的温度以使夹板92、96变性。流通池10可暴露于洗涤循环以去除未连接的引物30C、32C(具有与其连接的夹板92、96)和变性的夹板92、96。
如图10中的“D”处所示，可如本文所述进行扩增和测序。因为引物30C、32C是3'羟基封端的，所以在扩增和测序之前不进行另外的脱保护。可如本文所述对包括文库片段的样品进行引入、扩增、线性化(例如，使用用于所产生的扩增子50、52之一的合适的切割剂)和测序。
一旦测序完成并且进行任何期望的洗涤循环，可将流通池10暴露于核酸酶和碱性磷酸酶处理以切割第一引物30C和第二引物32C(参见图10中的E)。核酸酶具有3'→5'活性。在涉及3'端羟基封端的和5'端磷酸封端的引物30C、32C的示例中，切割可通过引入DNA酶I和外切核酸酶I来进行。由于核酸酶抗性锚寡核苷酸34A对核酸酶活性具有抗性，第一引物30C和第二引物32C的切割暴露出核酸酶抗性锚寡核苷酸34A(参见图10中的A)。
图10所示的流通池表面可在如本文所述的夹板杂交和引物30C、32C连接、扩增、测序和切割的一个或多个另外的轮次中重复使用。
在图11所示的示例中，核酸酶抗性锚寡核苷酸34B中的每个是核酸酶抗性锚寡核苷酸3'端磷酸封端的(参见图11中的A)；并且第一引物30D中的每个第一引物和第二引物32D中的每个是第二引物3'端羟基封端的和5'端羟基封端的(参见图11中的B)。5'端羟基可与核酸酶抗性锚寡核苷酸34B的3'-磷酸连接(参见图11中的C)。可通过用引物流体引入RtcB连接酶以及将流通池10的温度调节至用于RtcB连接酶的反应温度(例如，37℃)来引发这些引物30D、32D的连接。流通池10可暴露于洗涤循环以去除任何未连接的引物30D、32D。
如图11中的“D”处所示，可如本文所述进行扩增和测序。因为引物30D、32D是3'端羟基封端的，所以在扩增和测序之前不进行另外的脱保护。可如本文所述对包括文库片段的样品进行引入、扩增、线性化(例如，使用用于所产生的扩增子50、52之一的合适的切割剂)和测序。
一旦测序完成并且进行任何期望的洗涤循环，可将流通池10暴露于核酸酶和碱性磷酸酶处理以切割第一引物30D和第二引物32D(参见图11中的E)。核酸酶具有3'→5'活性。在涉及3'端羟基封端的和5'端磷酸封端的引物30D、32D的示例中，切割可通过引入DNA酶II或微球菌核酸酶(MNase)来进行。由于核酸酶抗性锚寡核苷酸34A对核酸酶活性具有抗性，因此第一引物30D和第二引物32D的切割暴露出核酸酶抗性锚寡核苷酸34A(参见图11中的A)。
图11所示的流通池表面可在如本文所述的引物30D、32D连接、扩增、测序和切割的一个或多个另外的轮次中重复使用。
在图9至图11所示的示例中的任何示例中，应理解i)核酸酶抗性锚寡核苷酸34A、34B中的每一者的3'端可包括RNA寡核苷酸或2'-O-甲基；或ii)多个第一引物30A、30B和多个第二引物32A、32B中的每一者的5'端包括RNA寡核苷酸或2'-O-甲基；或iii)i)和ii)两者。在核酸酶抗性锚寡核苷酸34A、34B的3'末端处或第一引物30A、30B和多个第二引物32A、32B的5'末端处添加RNA寡核苷酸或2'-O-甲基可改进连接的效率。
在具有参考图9、图10和图11描述的流通池表面的任何示例中，该方法可涉及：将第二引物流体引入到流通池10中；引发第二引物流体中的第三引物(类似于30A、30B、30C或30D)与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A、34B中的至少一些核酸酶抗性锚寡核苷酸的连接以及第二引物流体中的第四引物(类似于32A、32B、32C或32D)与核酸酶抗性锚寡核苷酸34A、34B中的一些其他核酸酶抗性锚寡核苷酸的连接；以及使用这些第三引物和第四引物进行第二测序操作。
附加说明
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“一种示例”等意指结合该示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。
Claims (39)
1.一种引物组，所述引物组包括：
第一核酸酶抗性引物，所述第一核酸酶抗性引物包括：
第一序列；
第一切割位点，所述第一切割位点连接在所述第一序列的3'端处；和
第一核酸酶抗性修饰，所述第一核酸酶抗性修饰掺入所述
第一序列与所述第一切割位点之间；和
第二核酸酶抗性引物，所述第二核酸酶抗性引物包括：
第二序列，所述第二序列不同于所述第一序列；
第二核酸酶抗性修饰，所述第二核酸酶抗性修饰掺入所述第二序列的3'端处；和
第二切割位点，所述第二切割位点连接在所述第二序列与所述第二核酸酶抗性修饰之间，其中所述第二切割位点不同于所述第一切割位点。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述第一核酸酶抗性修饰和所述第二核酸酶抗性修饰是相同类型的核酸酶抗性修饰。
3.根据权利要求2所述的引物组，其中：
所述第一核酸酶抗性修饰和所述第二核酸酶抗性修饰选自由以下组成的组：硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、反向核苷酸、肽核酸、吗啉代、2'-O-甲基和包括亚磷酰胺C3间隔子的核苷酸；并且
所述第一切割位点和所述第二切割位点中的每一者包括独立地选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸。
4.一种可重复使用的流通池，所述可重复使用的流通池包括：
基底；
聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶与所述基底的至少一部分连接；和
引物组，所述引物组与所述聚合物水凝胶连接，所述引物组选自由以下组成的组：
i)包括第一切割位点的第一核酸酶抗性引物；以及
包括不同于所述第一切割位点的第二切割位点的第二核酸酶抗性引物；以及
ii)包括切割位点的第一核酸酶抗性引物；以及
无任何切割位点的第二核酸酶抗性引物。
5.根据权利要求4所述的可重复使用的流通池，其中：
所述引物组为i)；
所述第一核酸酶抗性引物包括：
第一序列；
所述第一切割位点，所述第一切割位点连接在所述第一序列的3'端处；和
第一核酸酶抗性修饰，所述第一核酸酶抗性修饰掺入所述
第一序列与所述第一切割位点之间；并且
所述第二核酸酶抗性引物包括：
第二序列，所述第二序列不同于所述第一序列；
第二核酸酶抗性修饰，所述第二核酸酶抗性修饰掺入所述第二序列的3'端处；和
所述第二切割位点，所述第二切割位点连接在所述第二序列与所述第二核酸酶抗性修饰之间。
6.根据权利要求5所述的可重复使用的流通池，其中：
所述第一核酸酶抗性修饰和所述第二核酸酶抗性修饰是相同类型的核酸酶抗性修饰；
所述第一核酸酶抗性修饰和所述第二核酸酶抗性修饰选自由以下组成的组：硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、反向核苷酸、肽核酸、吗啉代、2'-O-甲基和包括亚磷酰胺C3间隔子的核苷酸；并且
所述第一切割位点和所述第二切割位点中的每一者包括独立地选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸。
7.根据权利要求4所述的可重复使用的流通池，其中：
所述引物组为ii)；
所述第一核酸酶抗性引物包括：
第一序列；
所述切割位点，所述切割位点连接在所述第一序列的3'端处；和
第一核酸酶抗性修饰，所述第一核酸酶抗性修饰掺入所述
第一序列与所述切割位点之间；并且
所述第二核酸酶抗性引物包括：
第二序列，所述第二序列不同于所述第一序列；和
第二核酸酶抗性修饰，所述第二核酸酶抗性修饰掺入所述第二序列的3'端处。
8.根据权利要求7所述的可重复使用的流通池，其中：
所述第一核酸酶抗性修饰和第二外切核酸酶抗性修饰是相同类型的核酸酶抗性修饰；
所述第一核酸酶抗性修饰和所述第二核酸酶抗性修饰选自由以下组成的组：硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、反向核苷酸、肽核酸、吗啉代、2'-O-甲基和包括亚磷酰胺C3间隔子的核苷酸；并且
所述第一核酸酶抗性引物的所述切割位点包括选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸。
9.一种方法，所述方法包括：
将第一样品引入到流通池中，所述流通池包括：
基底；
聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶与所述基底的至少一部分连接；
多个引物组，所述多个引物组与所述聚合物水凝胶连接，所述多个引物组中的每个引物组包括：包括第一切割位点的第一核酸酶抗性引物以及包括不同于所述第一切割位点的第二切割位点的第二核酸酶抗性引物；
扩增所述第一样品的第一文库片段，从而产生第一多个第一样品文库片段扩增子和第二多个第一样品文库片段扩增子，所述第一多个第一样品文库片段扩增子分别与多个所述第一核酸酶抗性引物连接，所述第二多个第一样品文库片段扩增子分别与多个所述第二核酸酶抗性引物连接；
将第一切割位点切割流体引入到所述流通池中，从而在所述第一切割位点处切割所述第一核酸酶抗性引物，由此去除所述第一多个第一样品文库片段扩增子；
对所述第二多个第一样品文库片段扩增子进行测序，从而产生多个第一样品文库片段新生链；
将核酸酶引入所述流通池，从而切割所述第二多个第一样品文库片段扩增子和所述多个第一样品文库片段新生链；
将第二样品引入到所述流通池中；
扩增所述第二样品的第二文库片段，从而产生第一多个第二样品文库片段扩增子和第二多个第二样品文库片段扩增子，所述第一多个第二样品文库片段扩增子分别与第二多个所述第一核酸酶抗性引物连接，所述第二多个第二样品文库片段扩增子与第二多个所述第二核酸酶抗性引物连接；
将第二切割位点切割流体引入到所述流通池中，从而在所述第二切割位点处切割所述第二核酸酶抗性引物，由此去除所述第二多个第二样品文库片段扩增子；以及
对所述第一多个第二样品文库片段扩增子进行测序，从而产生多个第二样品文库片段新生链。
10.根据权利要求9所述的方法，其中：
所述第一切割位点中的每个第一切割位点包括尿嘧啶核碱基；
所述第一切割位点切割流体包含尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物或分离自激烈热球菌的酶；
所述第二切割位点中的每个第二切割位点包括8-氧代鸟嘌呤核碱基；
所述第二切割位点切割流体包含甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶；并且
所述核酸酶选自由以下组成的组：外切核酸酶I、热不稳定外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶、核酸酶P1、外切核酸酶III、外切核酸酶V、核酸酶BAL-31、DNA酶I和微球菌核酸酶。
11.一种方法，所述方法包括：
将第一样品引入到流通池中，所述流通池包括：
基底；
聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶与所述基底的至少一部分连接；和
多个引物组，所述多个引物组与所述聚合物水凝胶连接，所述多个引物组中的每个引物组包括：包括切割位点的第一核酸酶抗性引物以及无任何切割位点的第二核酸酶抗性引物；
扩增所述第一样品的文库片段，从而产生第一多个第一样品文库片段扩增子和第二多个第一样品文库片段扩增子，所述第一多个第一样品文库片段扩增子分别与多个所述第一核酸酶抗性引物连接，所述第二多个第一样品文库片段扩增子分别与多个所述第二核酸酶抗性引物连接；
将切割流体引入到所述流通池中，从而在所述切割位点处切割所述第一核酸酶抗性引物，由此去除所述第一多个第一样品文库片段扩增子；
对所述第二多个第一样品文库片段扩增子进行测序，从而产生多个第一样品文库片段新生链；
将核酸酶引入到所述流通池中，从而切割所述第二多个第一样品文库片段扩增子和所述多个第一样品文库片段新生链；
将多个再生寡核苷酸引入到所述流通池中，由此所述再生寡核苷酸中的至少一些再生寡核苷酸的第一部分分别与所述第一核酸酶抗性引物中的至少一些第一核酸酶抗性引物的剩余部分杂交，其中每个再生寡核苷酸还包括与所述第一核酸酶抗性引物的切割部分互补的第二部分；以及
引发沿所杂交的再生寡核苷酸的相应第二部分的聚合酶延伸，以使所述第一核酸酶抗性引物中的所述至少一些第一核酸酶抗性引物的所述切割部分再生。
12.根据权利要求11所述的方法，其中：
所述切割位点包括尿嘧啶核碱基；
所述切割流体包含尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物；并且
所述核酸酶选自由以下组成的组：外切核酸酶I、热不稳定外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶、核酸酶P1、外切核酸酶III、外切核酸酶V、核酸酶BAL-31、DNA酶I和微球菌核酸酶。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述沿所述再生寡核苷酸的所述第二部分的聚合酶延伸使至少所述第一核酸酶抗性引物的所述切割位点再生。
14.根据权利要求11所述的方法，所述方法还包括：
在所述聚合酶延伸后，将第二样品引入到所述流通池中；
扩增所述第二样品的文库片段，从而产生第一多个第二样品文库片段扩增子和第二多个第二样品文库片段扩增子，所述第一多个第二样品文库片段扩增子分别与第二多个所述第一核酸酶抗性引物连接，所述第二多个第二样品文库片段扩增子与第二多个所述第二核酸酶抗性引物连接；
将所述切割流体引入到所述流通池中，从而在所述切割位点处切割所述第一核酸酶抗性引物，由此去除所述第一多个第二样品文库片段扩增子；以及
对所述第二多个第二样品文库片段扩增子进行测序，从而产生多个第二样品文库片段新生链。
15.一种流通池，所述流通池包括：
基底；
聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶与所述基底的至少一部分连接；和
引物组，所述引物组与所述聚合物水凝胶连接，所述引物组包括：
具有第一切割位点和不同于所述第一切割位点的第二切割位点的第一引物；以及
具有所述第一切割位点而无所述第二切割位点的第二引物。
16.根据权利要求15所述的流通池，其中：
所述第一切割位点是限制位点；并且
所述第二切割位点包括选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸。
17.根据权利要求15所述的流通池，其中所述第一切割位点和所述第二切割位点各自包括独立地选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸。
18.根据权利要求15所述的流通池，其中所述第一引物和所述第二引物是核酸酶抗性引物。
19.一种方法，所述方法包括：
将第一样品引入到流通池中，所述流通池包括：
基底；
聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶与所述基底的至少一部分连接；和
多个引物组，所述多个引物组与所述聚合物水凝胶连接，所述引物组中的每个引物组包括：具有第一切割位点和不同于所述第一切割位点的第二切割位点的第一引物，以及具有所述第一切割位点而无所述第二切割位点的第二引物；
扩增所述第一样品的第一文库片段，从而产生第一多个第一样品文库片段扩增子和第二多个第一样品文库片段扩增子，所述第一多个第一样品文库片段扩增子分别与多个所述第一引物连接，所述第二多个第一样品文库片段扩增子分别与多个所述第二引物连接；
将切割流体引入到所述流通池中，从而在所述第二切割位点处切割所述第一引物，由此去除所述第一多个第一样品文库片段扩增子；
对所述第二多个第一样品文库片段扩增子进行测序，从而产生多个第一样品文库片段新生链；
将第二切割流体引入到所述流通池中，从而在所述第一引物和所述第二引物的相应第一切割位点处切割所述第一引物和所述第二引物中的每一者，并且留下与所述聚合物水凝胶连接的所述第一引物的剩余部分和所述第二引物的剩余部分；以及
依序或同时：i)使所述第一引物中的至少一些第一引物的切割部分在所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述剩余部分处再生，以及ii)使所述第二引物中的至少一些第二引物的切割部分在所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述剩余部分处再生。
20.根据权利要求19所述的方法，其中：
所述第一切割位点中的每个第一切割位点是限制位点；
所述第二切割流体包含：
多个第一寡核苷酸，每个第一寡核苷酸与所述第一引物的所述剩余部分互补；
多个第二寡核苷酸，每个第二寡核苷酸与所述第二引物的所述剩余部分互补；和
限制酶；并且
当所述第二切割流体位于所述流通池中时，将所述流通池暴露于第一温度i)以引发：所述多个第一寡核苷酸中的至少一些第一寡核苷酸与在测序后为单链的所述第一引物中的至少一些第一引物的相应杂交；所述多个第二寡核苷酸中的至少一些第二寡核苷酸与在测序后为单链的所述第二引物中的至少一些第二引物的相应杂交；或两者；并且暴露于第二温度ii)以引发所述限制酶的双链切割活性。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括变性以使所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述剩余部分以及所述第二引物中的至少一些第二引物的所述剩余部分成为单链的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中：
所述方法涉及所述切割部分的依序再生；并且
依序使所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述切割部分以及所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述切割部分再生涉及：
将多个第一再生寡核苷酸引入到所述流通池中，由此所述第一再生寡核苷酸中的至少一些第一再生寡核苷酸的第一部分分别与所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述剩余部分杂交，其中每个第一再生寡核苷酸还包括与所述第一引物的所述切割部分互补的第二部分；
引发沿所杂交的第一再生寡核苷酸的相应第二部分的聚合酶延伸，以使所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述切割部分再生；
将多个第二再生寡核苷酸引入到所述流通池中，由此所述第二再生寡核苷酸中的至少一些第二再生寡核苷酸的第一部分分别与所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述剩余部分杂交，其中每个第二再生寡核苷酸还包括与所述第二引物的所述切割部分互补的第二部分；以及
引发沿所杂交的第二再生寡核苷酸的相应第二部分的聚合酶延伸，以使所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述切割部分再生。
23.根据权利要求21所述的方法，其中：
所述方法涉及所述切割部分的同时再生；并且
同时使所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述切割部分以及所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述切割部分再生涉及：
将包括第一再生夹板和第二再生夹板的多个再生夹板引入到所述流通池中，由此所述第一再生夹板的夹板部分分别与所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述剩余部分杂交，并且所述第二再生夹板的夹板部分分别与所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述剩余部分杂交，每个第一再生夹板还包括与所述夹板部分杂交并且具有所述第一引物的所述切割部分的序列的第一连接部分，并且每个第二再生夹板还包括与所述夹板部分杂交并且具有所述第二引物的所述切割部分的序列的第二连接部分；以及
引发所述第一连接部分中的至少一些第一连接部分与所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述剩余部分的连接，以及所述第二连接部分中的至少一些第二连接部分与所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述剩余部分的连接。
24.根据权利要求19所述的方法，其中：
所述方法涉及所述切割部分的依序再生；
所述第一切割位点中的每个第一切割位点包括选自由以下组成的组的核碱基：尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤和烯丙基-核苷酸；并且
所述第二切割流体包含：
多个第一寡核苷酸，每个第一寡核苷酸与所述第一引物的所述剩余部分互补；
多个第二寡核苷酸，每个第二寡核苷酸与所述第二引物的所述剩余部分互补；和
切除酶；并且
当所述第二切割流体位于所述流通池中时，将所述流通池暴露于第一温度i)以引发：所述多个第一寡核苷酸中的至少一些第一寡核苷酸与在测序后为单链的所述第一引物中的至少一些第一引物的相应杂交；所述多个第二寡核苷酸中的至少一些第二寡核苷酸与在测序后为单链的所述第二引物中的至少一些第二引物的相应杂交；或两者；并且暴露于第二温度ii)以引发所述切除酶的双链切割活性。
25.根据权利要求24所述的方法，所述方法还包括变性以使所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述剩余部分以及所述第二引物中的至少一些第二引物的所述剩余部分成为单链的。
26.根据权利要求25所述的方法，其中依序使所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述切割部分以及所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述切割部分再生涉及：
将多个第一再生寡核苷酸引入到所述流通池中，由此所述第一再生寡核苷酸中的至少一些第一再生寡核苷酸的第一部分分别与所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述剩余部分杂交，其中每个第一再生寡核苷酸还包括与所述第一引物的所述切割部分互补的第二部分；
引发沿所杂交的第一再生寡核苷酸的相应第二部分的聚合酶延伸，以使所述第一引物中的所述至少一些第一引物的所述切割部分再生；
将多个第二再生寡核苷酸引入到所述流通池中，由此所述第二再生寡核苷酸中的至少一些第二再生寡核苷酸的第一部分分别与所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述剩余部分杂交，其中每个第二再生寡核苷酸还包括与所述第二引物的所述切割部分互补的第二部分；以及
引发沿所杂交的第二再生寡核苷酸的相应第二部分的聚合酶延伸，以使所述第二引物中的所述至少一些第二引物的所述切割部分再生。
27.一种流通池产生试剂盒，所述流通池产生试剂盒包括：
流通池，所述流通池包括：
基底；
聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶与所述基底的至少一部分连接；和
核酸酶抗性锚寡核苷酸，所述核酸酶抗性锚寡核苷酸与所述聚合物水凝胶连接；和
引物流体，所述引物流体包含：
多个第一引物，所述多个第一引物分别与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的至少一些核酸酶抗性锚寡核苷酸连接；和
多个第二引物，所述多个第二引物分别与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的至少一些其他核酸酶抗性锚寡核苷酸连接。
28.根据权利要求27所述的流通池产生试剂盒，其中：
所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的；并且
所述第一引物中的每个第一引物和所述第二引物中的每个第二引物是3'端磷酸封端的和5'端腺苷酸化的。
29.根据权利要求27所述的流通池产生试剂盒，其中：
所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的；
所述第一引物中的每个第一引物是3'端羟基封端的和5'端磷酸封端的并且与相应的夹板杂交，所述夹板具有与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸之一杂交的部分；并且
所述第二引物中的每个第二引物是3'端羟基封端的和5'端磷酸封端的并且与相应的夹板杂交，所述夹板具有与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸之一杂交的部分。
30.根据权利要求27所述的流通池产生试剂盒，其中：
所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端磷酸封端的；并且
所述第一引物中的每个第一引物和所述第二引物中的每个第二引物是3'端羟基封端的和5'端羟基封端的。
31.根据权利要求27所述的流通池产生试剂盒，其中：
所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的；并且
所述第一引物中的每个第一引物和所述第二引物中的每个第二引物是3'端磷酸封端的和5'端磷酸封端的。
32.根据权利要求27所述的流通池产生试剂盒，其中所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸包括选自由以下组成的组的3'端核酸酶抗性修饰：硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、反向核苷酸、肽核酸、吗啉代、2'-O-甲基、3'端磷酸化核苷酸和包括亚磷酰胺C3间隔子的核苷酸。
33.根据权利要求27所述的流通池产生试剂盒，其中：
i)所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸的3'端包括RNA寡核苷酸或2'-O-甲基；或者
ii)所述多个第一引物中的每个第一引物和所述多个第二引物中的每个第二引物的5'端包括RNA寡核苷酸或2'-O-甲基；或者
iii)i)和ii)两者。
34.一种方法，所述方法包括：
将引物流体引入到流通池中，所述流通池包括：
基底；
聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶与所述基底的至少一部分连接；和
核酸酶抗性锚寡核苷酸，所述核酸酶抗性锚寡核苷酸与所述聚合物水凝胶连接；
引发所述引物流体中的第一引物与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的至少一些核酸酶抗性锚寡核苷酸的连接以及所述引物流体中的第二引物与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的至少一些其他核酸酶抗性锚寡核苷酸的连接；
使用所述第一引物和所述第二引物进行测序操作；以及
在所述测序操作之后，切割所述第一引物和所述第二引物以暴露所述核酸酶抗性锚寡核苷酸。
35.根据权利要求34所述的方法，其中：
所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的；
所述第一引物中的每个第一引物和所述第二引物中的每个第二引物是3'端磷酸封端的和5'端腺苷酸化的；
引发所述第一引物和所述第二引物的连接涉及：
用所述引物流体引入连接酶，所述连接酶选自由T4 RNA连接酶I和热稳定的5'App连接酶组成的组；以及
将所述流通池的温度调节至用于所述连接酶的反应温度；并且
在进行所述测序操作之前，所述方法还包括使所述第一引物和所述第二引物在所述3'端处脱保护。
36.根据权利要求34所述的方法，其中：
所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的；
所述第一引物中的每个第一引物是3'端羟基封端的和5'端磷酸封端的并且与相应的夹板杂交，所述夹板具有与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸之一杂交的部分；
所述第二引物中的每个第二引物是3'端羟基封端的和5'端磷酸封端的并且与相应的夹板杂交，所述夹板具有与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸之一杂交的部分；并且
引发所述第一引物和所述第二引物的连接涉及：
用所述引物流体引入连接酶，所述连接酶选自由T4 RNA连接酶II和PBCV-1DNA连接酶组成的组；以及
将所述流通池的温度调节至用于所述连接酶的夹板连接反应温度。
37.根据权利要求34所述的方法，其中：
所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端磷酸封端的；
所述第一引物中的每个第一引物和所述第二引物中的每个第二引物是3'端羟基封端的和5'端羟基封端的；并且
引发所述第一引物和所述第二引物的连接涉及：
用所述引物流体引入RtcB连接酶；以及
将所述流通池的温度调节至用于所述RtcB连接酶的反应温度。
38.根据权利要求34所述的方法，其中：
所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的每个核酸酶抗性锚寡核苷酸是3'端羟基封端的；
所述第一引物中的每个第一引物和所述第二引物中的每个第二引物是3'端磷酸封端的和5'端磷酸封端的；并且
引发所述第一引物和所述第二引物的连接涉及：
用所述引物流体引入T4 RNA连接酶I；以及
将所述流通池的温度调节至用于所述T4 RNA连接酶I的反应温度。
39.根据权利要求34所述的方法，所述方法还包括：
将第二引物流体引入到流通池中；
引发所述第二引物流体中的第三引物与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的至少一些核酸酶抗性锚寡核苷酸的连接以及所述第二引物流体中的第四引物与所述核酸酶抗性锚寡核苷酸中的一些其他核酸酶抗性锚寡核苷酸的连接；以及
使用所述第三引物和所述第四引物进行第二测序操作。
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