CN117797267A - 抗急性髓系白血病的级联靶向药及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗急性髓系白血病的级联靶向药及制备方法。本发明的级联靶向药由工程化的级联靶向递药系统和溶酶体功能干扰剂组成，其中溶酶体干扰剂封装在级联靶向递药系统里，所述级联靶向递药系统由载药元件和两个靶向元件组成；所述靶向元件包括分子识别配体和分子靶点；其中第一靶向元件的分子识别配体为第1核酸适配体，结合分子为靶点CD33；第二靶向元件的分子识别配体为第2核酸适配体，结合分子靶点为CD123。

Description

抗急性髓系白血病的级联靶向药及制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗急性髓系白血病的级联靶向药及制备方法。

背景技术

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)为起源于骨髓的髓系造血干/祖细胞的恶性疾病，是成年人急性白血病中最常见的形式。目前，AML的传统治疗方案以常规化疗和造血干细胞移植为主，辅以免疫治疗和分子靶向治疗。然而化疗存在毒性且易产生耐药；造血干细胞移植配型困难；CAR-T、免疫检查点抑制剂等免疫疗法目前在AML中疗效不佳；以维奈克拉为代表的新型靶向药物易出现耐药、复发等问题。因此目前AML的治疗处于瓶颈阶段，亟需开发新的治疗策略。

AML的发病机制涉及髓系干细胞克隆群的异常增殖及分化阻滞。尽管AML的复杂性和异质性很高，但在其形态学检查中可见一些共同的生物学特征。多数AML细胞中易见大量大小不一的颗粒，尤其是在粒系和单核系急性白血病中。有研究提示AML细胞中的大量颗粒与细胞器溶酶体高度相关。还有研究报道溶酶体介导了癌细胞的化疗耐药。溶酶体可将化疗药物隔离或泵出细胞外，从而阻止药物发挥作用。因此以溶酶体为靶点开发药物可能为白血病提供新的治疗策略。然而，除了红细胞以外，正常细胞中也含有溶酶体，目前存在的大多数溶酶体干扰剂都具有非特异性毒性，即在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成伤害。

申请号为CN202010504792.1，发明名称为“一种双靶向的酸敏感普鲁士蓝载药系统的制备方法及应用”的专利，该专利公开的双靶点实际上是透明质酸和CXCR4拮抗多肽E5。透明质酸用于和白血病表面的CD44分子特异性结合，然后将药物靶向递送到白血病细胞；CXCR4拮抗多肽E5起到有效阻断CXCR4/CXCL12介导的白血病细胞的迁移和粘附的功能。但CD44不仅是在白血病细胞表达，在正常的上皮细胞、内皮细胞及软骨中都有表达。因此该专利方法提供的靶向载药系统的靶向准确性还可以再提高。

申请号为CN201810246467.2，发明名称为“一种靶向载药纳米胶束及制备方法与应用”公开了一种通过纳米胶束载药来对抗白血病的方法，该专利的纳米胶束中装载的药物为小分子化药，包括阿霉素盐酸盐、盐酸伊达比星或盐酸米托蒽醌。然而阿霉素盐酸盐对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用。盐酸伊达比星对患者具有血液学毒性，使用该药的患者会出现严重的骨髓抑制。

综上所述，有必要提出治疗AML的新型药物策略，以期达到同时改善药物递送到靶细胞的准确性和减少药物对正常细胞的杀伤，以补充现有技术的不足。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种精准靶向白血病的工程化药物策略，具体技术方案如下。

一种抗急性髓系白血病的级联靶向药，所述级联靶向药由工程化的级联靶向递药系统和溶酶体功能干扰剂组成，所述级联靶向递药系统由载药元件和靶向元件组成，其中载药元件中装载所述溶酶体功能干扰剂；所述载药元件为过表达CXCR4的细胞膜囊泡；所述靶向元件包括分子识别配体和分子靶点，包括第一靶向元件和第二靶向元件；其中所述第一靶向元件的分子识别配体为第1核酸适配体，其一端特异性结合分子靶点CD33，3’端连接胆固醇插入到所述载药元件；所述第二靶向元件的分子识别配体为第2核酸适配体，其一端特异性结合分子靶点CD123，3’端连接胆固醇插入到所述载药元件；所述溶酶体功能干扰剂为L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯(LLOMe)。

进一步，所述级联靶向递药系统的载药量范围为每1μg过表达CXCR4的细胞膜囊泡装载0.011～0.15μg溶酶体功能干扰剂。

优选的，所述级联靶向递药系统的载药浓度为每1μg过表达CXCR4的细胞膜囊泡装载0.15μg溶酶体功能干扰剂。

进一步，所述细胞膜囊泡为骨髓间充质干细胞来源的细胞膜囊泡，粒径范围为100-300nm。其中，峰值约150nm。

进一步，所述第1核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述第2核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述载药元件与所述第一靶向元件和所述第二靶向元件的质量比分别为1:4(载药元件：第一靶向元件＝1:4；载药元件：第二靶向元件＝1:4)。

进一步，所述级联靶向药的剂型为注射剂。主要通过静脉进行注射，但并不局限于此，通过肌肉注射或腹腔注射的方式也可以实现。

上述抗急性髓系白血病的级联靶向药的制备方法，包括以下步骤：

S01:选择骨髓间充质干细胞来源的细胞膜囊泡作为野生载药元件，在所述细胞膜囊泡表面过表达CXCR4得到改造后的载药元件；

S02：选择CD33和CD123作为双分子靶点；

S03：分别合成与所述双分子靶点能以构象互补模式结合的核酸适配体，并在所述核酸适配体序列的3’端连接胆固醇，得到两个靶向元件；

S04：将步骤S01制备得到的载药元件和S03制备得到的两个靶向元件分别以质量比1:4的比例混合，共孵育后置于冰上轻摇得到所述级联靶向递药系统；

S05：利用物理或化学手段在S04制备的级联靶向递药系统的细胞膜囊泡上形成瞬时孔道，然后将所述的级联靶向递药系统与溶酶体功能干扰剂混合使所述溶酶体功能干扰剂从细胞膜囊泡上的孔道上进入所述细胞膜囊泡中，约37℃下静置至少1h使膜囊泡恢复，得到所述抗急性髓系白血病的级联靶向药。

进一步，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

进一步，在S05中细胞膜囊泡上形成瞬时孔道的手段包括超声、电穿孔、反复冻融或皂苷处理。

本发明还可以提供一种级联靶向递药系统在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。所述级联靶向递药系统用于装载溶酶体干扰剂，所述溶酶体干扰剂为LLOMe。

有益技术效果

1.本发明提供了一种抗急性髓系白血病的级联靶向药，该靶向药以溶酶体干扰剂LLOMe为基础，将其封装到一套工程化的级联靶向递药系统中，将原本具有非特异性毒性的溶酶体干扰剂改装成一种具有特异性毒性的级联靶向药。该级联靶向药实现了对白血病细胞里的溶酶体进行精准破坏，而避免破坏正常细胞里的溶酶体，提高了药物的靶向性和安全性。本发明提供的级联靶向药的“靶向”实际上有3个模块，而目前普通的靶向技术仅依靠单模块(如仅靶向肿瘤细胞)或双模块来实现，仅靶向肿瘤细胞或细胞器可能存在着靶器官、靶细胞不明以致药物疗效不佳、毒性过大的问题，因此本发明相较于现有技术提高了靶向的准确率和效率。

2.本发明提供的级联靶向药通过靶器官(骨髓)-靶细胞(白血病细胞)-靶细胞器(溶酶体)的路径进入白血病细胞并最终通过破坏溶酶体的方式杀伤/杀死白血病细胞。目前的主流研发观点认为，在普通小分子药物外面增加一个工程化的递药/载药系统，可能会在一定程度上削弱药物本身的效力。而本发明实验却证明该级联靶向药相较于LLOMe单药，对白血病细胞的杀伤能力相当，因此证明了本发明级联靶向药的有效性。

3.本发明提供的细胞囊泡制备方法简单、高效，在保持细胞膜囊泡生物活性的同时，一定程度上避免了常规提取方法步骤的繁琐和提取效率低下的问题，因此本发明级联靶向药具备产业化的前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明的级联靶向药在白血病动物模型中通过靶器官-靶细胞-靶细胞器的路径起作用的示意图；

图2为本发明的级联靶向药的结构示意图；

图3为CXCR4在BMSC中过表达情况验证(A为qRT-PCR法检测，B为Western blot检测)；

图4为CXCR4在细胞膜囊泡上过表达验证(A为过表达CXCR4的膜囊泡的TEM图，B为过表达CXCR4的膜囊泡的粒径大小表征，C为Western blot检测外泌体的标志物表达，D为Western blot检测CXCR4表达)；

图5为琼脂糖凝胶电泳验证胆固醇连接的适配体在CMV上的修饰；

图6为使用液相色谱-质谱联用仪测定级联靶向药的药物含量(A为LLOMe标准曲线，B为级联靶向载药系统载药后上清中LLOMe含量)；

图7为级联靶向递药系统骨髓归巢能力验证(A为白血病小鼠模型注射野生CMV和CXCR4-CMV后活体成像情况，B为白血病小鼠模型注射野生CMV和CXCR4-CMV后主要器官分布情况)；

图8为激光共聚焦检测适配体修饰的CMV对白血病原代细胞的靶向性(比例尺：20μm)；

图9为激光共聚焦检测Cas-CMV对白血病细胞和骨髓基质细胞的靶向性(比例尺：20μm)；

图10为激光共聚焦成像检测Cas-CMV在溶酶体中的共定位情况(比例尺：10μm)；

图11为Cas-CMV@LM对THP-1细胞的杀伤作用；

图12为Cas-CMV@LM对NB4细胞的杀伤作用；

图13为Cas-CMV@LM对THP-1细胞内溶酶体的影响；

图14为Cas-CMV@LM对NB4细胞内溶酶体的影响；

图15为CCK-8检测Cas-CMV@LM对骨髓基质细胞的毒性作用。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。

本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

名词解释

本发明所述的“级联靶向”是指本发明提供的递药系统通过靶器官(骨髓)-靶细胞(白血病细胞)-靶细胞器(溶酶体)的路径将所装载的药物最终精准递送到白血病细胞器(溶酶体)中。

本发明所述的“级联靶向药”是指将溶酶体功能干扰剂装载到工程化的级联靶向递药系统里，制备得到一种通过靶器官(骨髓)-靶细胞(白血病细胞)-靶细胞器(溶酶体)的路径进入白血病细胞并最终通过破坏溶酶体的方式杀伤/杀死白血病细胞的药物。

实施例1

本实施例提供一种抗急性髓系白血病的级联靶向药的制备方法示例，方法流程示意图见图1；级联靶向药结构示意图见图2。

下述所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

1.制备载药元件

1)选择骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSC)来源的细胞膜囊泡作为载药元件。BMSC或BMSC来源的细胞膜囊泡具有归巢到骨髓的特性，为进一步增强其归巢到骨髓的能力，首先在BMSC膜表面过表达趋化因子受体4(CXC chemokinereceptor4，CXCR4)。具体操作如下：

构建人CXCR4的过表达质粒，与辅助质粒同时转染293FT细胞48h后，收集CXCR4过表达慢病毒液。将CXCR4过表达病毒液转染BMSC细胞并做15天puro抗性筛选得CXCR4过表达的BMSC。使用qRT-PCR、Western blot验证了CXCR4的过表达效果，见图3。

表1qRT-PCR检测CXCR4的引物序列

如图3所示，与对照组(Vector组)相比，CXCR4过表达组(CXCR4-OE)中CXCR4的mRNA水平及蛋白水平均明显升高。

2)过表达CXCR4的BMSC细胞膜囊泡的提取

在10cm的培养皿中培养过表达CXCR4的BMSC细胞，当细胞达到90％融合度后，用磷酸盐缓冲盐溶液PBS(pH 7.4)洗涤3次，随后加入3ml含10μg/mL细胞松弛素B的低糖DMEM培养基，37℃孵育30min。(该步骤在保持与外泌体相似的生物学功能的同时，一定程度上避免了常规外泌体提取步骤复杂、提取效率低下的问题)。随后弃掉上清，加入2mL 0.25％(w/v)胰蛋白酶室温消化3min，通过加入相同体积的去外泌体胎牛血清使胰蛋白酶失活。

将混合物转移到15mL离心管中，涡旋30秒以分离细胞和细胞膜囊泡；随后200g，离心5min以去除细胞。收集上清液，2000g离心30min获得过表达CXCR4的细胞膜囊泡(CXCR4-CMV)。之后将这些细胞膜囊泡重新分散于PBS中以进行下一步的实验，或置于-80℃储存。使用TEM、NTA、Western blot对CXCR4-CMV进行表征(见图4)，结果显示CXCR4-CMV呈囊泡状结构，粒径峰值在150nm左右，且表达有外泌体的标志物(TSG101、Alix、CD9)。使用Westernblot进一步验证了CXCR4在CXCR4-CMV上的过表达。

2.制备靶向元件，以及靶向元件与载药元件连接

1)筛选双分子靶点：

CD33，Siglecs家族的糖基化跨膜蛋白，在90％以上的AML患者中都有表达，在正常造血干细胞上几乎不表达。然而，因为白血病本身具有高度异质性，CD33抗原在不同亚克隆之间和不同患者之间的表达也是不同的，这可能会造成单靶向药物在某些患者群体中的疗效不佳。鉴于此，为了提高对AML细胞的选择性，同时最大限度地减少对正常细胞的毒性，本发明进一步筛选了双分子靶点，以提高靶向效率。

CD123是异二聚体白细胞介素-3受体的亚基，其在各种血液系统恶性肿瘤中广泛表达，甚至在白血病干细胞上表达，同时在正常细胞中低表达，是本发明筛选的第二个分子靶点。

2)将靶向元件和载药元件连接：

首先利用核酸适配体特异性连接CD33或CD123。核酸适配体(apt)是一类具有特定三维构象的小分子RNA或单链DNA，其长度一般为20～80个碱基。同抗原-抗体反应一样，核酸适配体以构象互补模式特异性识别靶点，并以高亲和力与之结合。与抗体不同的是，核酸适配体在实际应用中具有免疫原性低、易穿透组织和细胞、化学稳定性高、易合成修饰等优点。本实施例涉及到的核酸适配体序列如下所示。

表2适配体序列

利用胆固醇(cholesterol)可插入囊泡膜的原理，在适配体的3’端连接胆固醇，得到靶向元件。un-modification是指3’端未连接胆固醇。

取上述CXCR4-CMV与连接有不同分子靶点的靶向元件以质量比1：4的比例混合，37℃孵育1h，快速放到冰上轻摇1h后得到级联靶向递药系统(Cas-CMV)，并且使用琼脂糖凝胶电泳进行验证(见图5)。

3.级联靶向递药系统载药

利用物理或化学手段在制备好的级联靶向递药系统的细胞膜囊泡上打孔，然后将小分子药物进行装载。本实施例采用超声方式作为示例，但并不仅限于此。

取药物LLOMe与Cas-CMV以质量比1：6的比例混合，超声3min，超声条件：20％振幅、超声30秒、冰上静置2min，共六个循环；超声完成后在37℃静置1h，使CMV膜恢复，最后2000g离心30min，将沉淀重悬于PBS中，获得载药的级联靶向的CMV(Cas-CMV@LM)，并使用液相色谱-质谱联用仪(LC/MS)测定LLOMe在CMV中的装载(图6)，测得其中负载的LLOMe浓度约15μg/100μg外泌体，即1μg的膜囊泡装载0.15μg的LLOMe。

实施例2

实施例1制备的级联靶向递药系统的靶向能力验证

1)CXCR4-CMV的骨髓归巢能力

购入5-6周龄NCG小鼠，尾静脉注射5×10⁶个AML原代白血病细胞建立人源化PDX小鼠模型，定期采血监测小鼠外周血human CD45％。建模成功后，按照试剂说明书对野生CMV和CXCR4-CMV(后面简称改造后CMV)进行DiR染色并重悬于PBS中，每只小鼠尾静脉注射40g染色的野生CMV或CXCR4-CMV，4h后使用小动物活体成像仪进行成像，以验证CXCR4-CMV的骨髓归巢能力，见图7。图中显示，CXCR4-CMV可在白血病小鼠骨髓部位(Bone)聚集，而野生CMV在骨髓部位无明显聚集现象，说明CXCR4促进了CMV的骨髓归巢。

2)Cas-CMV靶向白血病细胞

体外进行细胞摄取实验观察Cas-CMV对白血病细胞的靶向能力。首先验证双靶点适配体修饰对摄取的影响，按照试剂说明书使用10uM Dil染料对改造后CMV染色15min后获得Dil染色的改造后CMV并重悬于PBS中。随后将白血病病人原代细胞(AML#1)以4×10⁵个/孔接种于24孔板中，分别给予PBS(control)、rCD33-CMV、rCD123-CMV、CD33-CMV、CD123-CMV及Cas-CMV处理2h后(rCD33-CMV、rCD123-CMV为CD33、CD123随机适配体序列修饰的CMV，见表2)，使用激光共聚焦成像验证白血病细胞对CMV的摄取。图8显示白血病细胞对CD33、CD123随机适配体序列修饰的CMV(rCD33-CMV、rCD123-CMV)的摄取较少，且相较于单适配体组，双适配体修饰组(Cas-CMV)的荧光明显增强，说明双适配体修饰增加了CMV对白血病细胞的靶向性。

进一步在体外验证了Cas-CMV对白血病细胞的特异性靶向。将THP-1(白血病细胞)、NB4细胞(白血病细胞)以1×10⁵个/孔、以及骨髓基质细胞(HS-5)或人骨髓间充质干细胞BMSC以1×10⁴个/孔接种于24孔板中，随后使用上述Dil染色的Cas-CMV处理2h，使用激光共聚焦成像观察各型细胞对CMV的摄取。图9显示Cas-CMV可特异性靶向白血病细胞，而骨髓基质细胞和人骨髓间充质干细胞对Cas-CMV的摄取较弱。说明该级联靶向递药系统可将药物准确递送到白血病细胞。

3)Cas-CMV积聚在白血病细胞的溶酶体中

体外进行共定位实验观察Cas-CMV在溶酶体中的积聚情况。将THP-1和NB4细胞以1×10⁵个/孔接种于24孔板中，使用上述Dil染色的Cas-CMV分别处理3h及6h后，使用人LAMP1抗体对固定后的细胞进行免疫荧光染色(LAMP1是溶酶体常见的标志物)，最后使用激光共聚焦成像检测Cas-CMV与溶酶体的共定位情况,见图10。结果显示Cas-CMV与溶酶体在6h之内存在共点位，表明细胞摄取Cas-CMV后会转运至溶酶体。

实施例3

实施例1制备的级联靶向药的抗白血病作用验证

1)Cas-CMV@LM在体外杀伤白血病细胞

进行Calcein-AM/PI染色验证Cas-CMV@LM在体外对白血病细胞的抑制能力。其中Calcein-AM可染色活细胞，PI可染色死细胞。将THP-1或NB4细胞以5×10⁵个/孔接种于12孔板中，不同组细胞分别给予PBS(Control)、Cas-CMV、LLOMe和Cas-CMV@LM(每孔中加入的LLOMe量均为34μg/ml，相对应的，Cas-CMV加入的量约为200～230μg)处理4h，随后按照试剂说明书使用Calcein-AM/PI染料37℃染色20min，使用激光共聚焦显微镜观察细胞的死活情况。见图11-12，与PBS、Cas-CMV组相比，Cas-CMV@LM、LLOMe处理组PI阳性细胞明显增加，Calcein-AM阳性细胞明显减少，而PBS、Cas-CMV组无明显差异，表明CMV@LM有效地诱导白血病细胞发生死亡。

2)Cas-CMV@LM对白血病细胞溶酶体的影响

进一步，使用溶酶体探针(Lyso-Tracker Red)进行染色，以检测Cas-CMV@LM对白血病细胞溶酶体的影响。将THP-1和NB4细胞以1×10⁵个/孔接种于24孔板中，不同组细胞分别给予PBS(Control)、Cas-CMV和Cas-CMV@LM处理8h,药物处理浓度为34μg/ml。随后按照试剂说明书使用100nM溶酶体探针37℃孵育30min，使用激光共聚焦显微镜观察胞内溶酶体的变化。见图13-14，与PBS、Cas-CMV组相比，Cas-CMV@LM处理组溶酶体的红色荧光明显减弱，表明Cas-CMV将溶酶体干扰剂LLOMe准确递送到了白血病细胞溶酶体，使LLOMe这种具有非特异性杀伤效力的药具备了特异性杀伤能力。

3)Cas-CMV@LM的体外安全性

进一步，进行CCK8实验，以验证Cas-CMV@LM的体外安全性。分别将2×10³个HS-5细胞接种于96孔板中，不同组细胞分别给予PBS、Cas-CMV、LLOMe和Cas-CMV@LM(每孔中加入的LLOMe量均为34μg/ml，相对应的，Cas-CMV加入的量约为200～230μg)处理4h、8h、12h、24h。随后加入CCK8试剂检测细胞增殖情况。见图15，图显示Cas-CMV@LM在12h内对HS-5细胞无明显抑制作用，而LLOMe单药在12h对HS-5细胞具有一定毒性，表明CMV的靶向修饰可能使HS-5细胞对LLOMe的摄取减少从而减轻了LLOMe对骨髓基质细胞的毒性。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种抗急性髓系白血病的级联靶向药，其特征在于，所述级联靶向药由工程化的级联靶向递药系统和溶酶体功能干扰剂组成，所述级联靶向递药系统由载药元件和靶向元件组成，其中载药元件中装载所述溶酶体功能干扰剂；所述载药元件为过表达CXCR4的细胞膜囊泡；所述靶向元件包括分子识别配体和分子靶点，包括第一靶向元件和第二靶向元件；其中所述第一靶向元件的分子识别配体为第1核酸适配体，其一端特异性结合分子靶点CD33，3’

端连接胆固醇插入到所述载药元件；所述第二靶向元件的分子识别配体为第2核酸适配体，其一端特异性结合分子靶点CD123，3’端连接胆固醇插入到所述载药元件；所述溶酶体功能干扰剂为L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯。

2.如权利要求1所述的抗急性髓系白血病的级联靶向药，其特征在于，所述级联靶向递药系统的载药量范围为每1μg过表达CXCR4的细胞膜囊泡装载0.01～0.15μg的溶酶体功能干扰剂。

3.如权利要求1所述的抗急性髓系白血病的级联靶向药，其特征在于，所述细胞膜囊泡为骨髓间充质干细胞来源的细胞膜囊泡，粒径范围为100-300nm。

4.如权利要求1所述的抗急性髓系白血病的级联靶向药，其特征在于，所述第1核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求1所述的抗急性髓系白血病的级联靶向药，其特征在于，所述第2核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求1所述的抗急性髓系白血病的级联靶向药，其特征在于，所述载药元件与所述第一靶向元件和所述第二靶向元件的质量比均为1:4。

7.如权利要求1所述的急性髓系白血病的级联靶向药，其特征在于，所述级联靶向药的剂型为注射剂。

8.权利要求1-7任一项所述的抗急性髓系白血病的级联靶向药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S01:选择骨髓间充质干细胞来源的细胞膜囊泡作为野生载药元件，在所述细胞膜囊泡表面过表达CXCR4得到改造后的载药元件；

S02：选择CD33和CD123作为双分子靶点；

S03：分别合成与所述双分子靶点能以构象互补模式结合的核酸适配体，并在所述核酸适配体序列的3’端连接胆固醇，得到两个靶向元件；

S04：将步骤S01制备得到的载药元件和S03制备得到的两个靶向元件分别以质量比为1:4的比例混合，共孵育后置于冰上轻摇得到所述级联靶向递药系统；

S05：利用物理或化学手段在S04制备的级联靶向递药系统的细胞膜囊泡上形成瞬时孔道，然后将所述级联靶向递药系统与溶酶体功能干扰剂混合使所述溶酶体功能干扰剂从细胞膜囊泡上的孔道上进入所述细胞膜囊泡中，静置至少1h使膜囊泡恢复，得到所述抗急性髓系白血病的级联靶向药。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在S05中细胞膜囊泡上形成瞬时孔道的手段包括超声、电穿孔、反复冻融或皂苷处理。