CN1177938C - 选择性连接及扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种扩增特异靶核酸序列的方法，该方法包括：(1)形成一反应混合物，包括：(i)靶序列；(ii)引物，包括第一个引物，其3’末端至少有一部分与靶序列第一个末端的第一个区段基本上互补，第二个引物，其5’末端至少有一部分与靶序列第二个末端的第二个区段基本上互补，第二个引物的5’末端与第一个引物的3’末端相邻，以及第三个引物，其与第二个引物3’末端的的一个区段基本上互补；(iii)至少四种不同的核苷酸碱基；(iv)热稳定聚合酶及热稳定连接酶；以及(2)循环加热该反应混合物。

Description

选择性连接及扩增方法
发明领域
本发明涉及特异性核酸靶序列的体外扩增方法。本发明尤其涉及最初依赖于DNA聚合酶及连接酶共存活性以介导核酸靶扩增的方法。此方法可用于选择性扩增含有如点突变、缺失及插入的序列变异的核酸序列。
发明背景
许多遗传及获得性疾病与如点突变、缺失及插入等遗传变异有关。某些变异与疾病的发生直接相关，而其它与疾病危险率和/或预后相关联。有超过500种人类遗传疾病是由单基因突变所致。这些疾病包括囊性纤维化，肌营养不良，α1-抗胰蛋白酶缺陷，苯丙酮尿症，镰状细胞贫血或性状，及各种其它血红蛋白血症。进一步地，对某些共同多基因病症如粥样硬化性心脏病的易感性增加的个体已被证明与特定DNA序列多态性的遗传相关。癌症的发生被认为是由于参与细胞增殖或分化的基因中的遗传受损的累积所致。Ras原癌基因K-ras、N-ras及H-ras以及p53肿瘤抑制基因是人类癌症中经常突变的一些基因。这些基因的特异性突变导致转化可能性的提高。遗传分析有希望成为临床评价疾病危险系数、诊断疾病、预报病人预后或对治疗的反应及监控病人病程进展的途径。如此遗传试验的采用要依赖于开发对遗传变异的简单、廉价及快速的分析。
由于对如此试验开发兴趣的提高，在此领域已发表了许多参考资料，包括Abravaya，K.，Carrino，J.J.，Muldoon，S.and Lee H.H.(1995)用修饰的连接酶链反应(Gap-LCR)检测点突变.Nucleic Acids Research23，675-682；Barany，F(1991)使用克隆的热稳定连接酶进行遗传疾病检测及DNA扩增，Proc Natl Acad Sci 88，189-193；Belgrader，P.；Marino，M.M.；Lubin，M.and Barany，F.(1996)用于人类鉴定试验的多重PCR-连接酶检测反应分析，Genome Science and Technology 77-78；Eggerding，F.A.(1995)用于多重遗传分型的一步法偶联扩增和寡核苷酸连接程序，PCR Methods and Applications 4，337-345。
在美国专利No 5,593,840中揭示了一种检测特异核酸序列的方法。该专利中所揭示的方法是基于PCR及LCR的某些方面可被联合用于检测和扩增靶核酸序列这一发现。该方法包含使用三个引物，且第三个引物与第一个引物5’末端的至少一部分相互补。互补于第一个引物5’末端碱基的第三个引物的位置含有一修饰从而避免了如经聚合酶的链置换，这一点是该方法的基本特征。
关于PCR及LCR的进一步报道可见于US 4683202，US 4683195，US 4800159，US 4965188，US 5176995，EP 0320308及EP 0439182这些参考文献引入本文作参考。
发明概述
本发明开发了一种用于特异靶核酸序列扩增的灵敏及选择性方法。该方法涉及LCR及PCR二者。由于该方法涉及选择性连接及PCR所以被称为“SLAP”。
由此本发明的第一方面包括一种扩增特异靶核酸序列的方法，该方法包括：
(1)形成一反应混合物，包括：
  (i)靶序列；
  (ii)引物，包括第一个引物，其3’末端至少有一部分与靶序列第一个末端的第一个区段基本上互补，第二个引物，其5’末端至少有一部分与靶序列第二个末端的第二个区段基本上互补，第二个引物的5’末端与第一个引物的3’末端相邻，以及第三个引物，
其与第二个引物3’末端的一个区段基本上互补；
  (iii)至少四种不同的核苷酸碱基；
  (iv)热稳定聚合酶及热稳定连接酶；以及
(2)循环加热该反应混合物。
本发明的另一方面包括一种在含有核酸的样本中检测特异靶核酸序列的方法，包括：
(1)形成反应混合物，包括：
  (i)怀疑包括靶序列的核酸样本；
  (ii)引物，包括第一个引物，其3’末端至少有一部分与靶序列第一个末端的第一个区段基本上互补，第二个引物，其5’末端至少有一部分与靶序列第二个末端的第二个区段基本上互补，第二个引物的5’末端与第一个引物的3’末端相邻，以及第三个引物，其与第二个引物3’末端的的一个区段基本上互补；
  (iii)至少四种不同的核苷酸碱基；
  (iv)热稳定聚合酶及热稳定连接酶；以及
(2)循环加热该反应混合物；以及
(3)检测代表特异靶核酸序列存在的扩增产物的存在与否。
在本发明的一优选实施方案中，此方法进一步包括在循环加热反应混合物之后，进行基本上灭活热稳定聚合酶，接着进行第二轮热循环反应混合物的步骤。
在本发明的一优选实施方案中，第三个引物基本上与之互补的第二个引物的区段是随机序列。
在另一优选实施方案中，反应混合物包括第4个引物，其具有与第一个引物5’末端的区段相同的序列。
本发明的方法可用于简单地扩增选择的序列，也可用于检测特异序列的存在，如检测突变的存在，等位基因，检测特异微生物或病毒的存在等。靶序列可由此源于任何来源，如人及非人类动物、细菌、酵母、真菌及病毒。
本文所用的术语“随机序列”意指与靶序列不相关的序列。
本说明书除非上下文另外要求，术语“包括”意指包括规定的元素或整体或元素或整体的集合，但不排除任何其它元素或整体或元素或整体的集合。
发明详述(选择性连接及PCR(SLAP)策略)
为更清楚地了解本发明的性质，参考以下实施本发明方法的非限制性一般论述及实施例阐述本发明的优选形式。
附图说明：
图1：在3引物系统中引物的SLAP-排列。
图2：SLAP引物中变异碱基的位置。
图3：SLAP。
图4：选择性连接及PCR。
图5：4引物系统中引物的SLAP-排列。
图6：用通用引物的扩增-4引物系统。
下面阐述SLAP扩增的一般策略并在图1-3中举例示出。
可用3个引物进行此方法，这些引物是5’连接引物(5’LP)，3’连接引物(3’LP)及通用引物(GP)[图1]。LP完全或部分互补于靶序列。GP与位于LP末端如3’LP的3’末端的随机序列(RS)互补。5’LP的3’末端及3’LP的5’末端可与靶序列上紧邻的区域杂交(图2A(ii)和B)，或与被一个或多个核苷酸的间隔隔开的两个区域杂交(图2A(i))。LP中变异碱基的存在使此方法可用于筛选单一点突变(碱基取代)。变异碱基与野生型序列配对或与特异碱基取代配对，变异碱基可位于5’LP的3’末端或其附近(图2A)或位于3’LP的5’末端(图2B)。
LP的其它特征可包括：
(i)5’LP具有3’羟基，如此其能与3’LP连接(图2A(ii)和B)，或在与3’LP连接前经DNA聚合酶延伸(图2A(i))，5’LP的5’末端可被修饰(如羟基化)，如此其在此末端不能与其它片段连接。
(ii)3’LP的5’末端被磷酸化，以使其能与5’LP或5’LP的延伸产物连接。3’LP的3’末端可被修饰(如磷酸化)以防止被DNA聚合酶延伸和/或在此末端与其它片段连接。
SLAP扩增所需步骤以图3例解。反应的所有步骤在一个试管内进行，且所有试剂在反应开始时就存在。各步骤由反应温度的变化而部分介导。反应策略包括一个利用共存的选择性连接及选择性PCR的初始阶段。此反应阶段要求热稳定连接酶和DNA聚合酶活性。PCR由一种序列特异引物(5’LP)和一种通用引物(GP)介导。初始阶段之后，加热反应以使DNA聚合酶变性。由于连接酶与DNA聚合酶相比是过量的，所以能保留明显的连接酶活性，且在反应第二阶段经连接反应产生单链产物。PCR所需的试剂如DNA聚合酶，通用引物及dNTP的量在反应的第二阶段以有限量存在以利于连接反应而非PCR。包含于反应内的各步骤在以下进一步详述。实施例阐述了与图2A(i)例解相似的引物排列的步骤(图3)。
步骤1：DNA变性；
将基因组DNA(靶模板)经高温加热使其单链化。
步骤2：选择性延伸(填补GAP)/选择性连接及通用PCR；
将5’LP和3’LP与变性的DNA模板退火。5’LP与3’末端完全配对，其经DNA聚合酶(如DNA聚合酶，Stoffel片段)延伸，然后经热稳定连接酶与3’LP连接。
在此初始阶段期间连接与聚合共存。经
a)用DNA聚合酶延伸5’LP以填补缺口，随后与3’LP连接(图3a)；或
b)用靶序列作模板经DNA聚合酶延伸5’LP(图3b)而产生一条链。
用3’GP延伸以产生互补链。模板可以是a)经聚合酶延伸5’LP后与3’LP连接形成的产物；或b)经用靶序列作模板经聚合酶延伸5’LP后形成的产物。经3’GP延伸形成的产物，由于其拷贝3’LP(图3c)，在随后的PCR回合可经聚合酶进一步延伸(图3d)。由于PCR是通用的，所以预期所有产物将几乎等效扩增。
步骤3：DNA聚合酶的变性
提高温度以使DNA聚合酶变性，由于连接酶在初始是过量的，因而仍存在明显的连接酶活性。剩余的PCR试剂如残存活性的DNA聚合酶，通用引物及dNTPs能使缺口填满，但不足以保持经PCR的有效扩增。
步骤4：经连接产生单链产物
在最终阶段形成的主要产物是单链产物，其由(延伸的)5’LP与3’LP的连接而得。
检测
单链连接产物的检测可由各种方法包括用寡核苷酸捕获进行。产物检测的一种方法包括标记3’LP，并用寡核苷酸捕获产物，该寡核苷酸与位于连接位点5′一侧的区段杂交。
捕捉寡核苷酸可以是特异于靶基因的(与靶序列互补)或通用的(与LP上的随机序列互补)。
SLAP的可变策略
(1)一种SLAP的可变策略如图4例解。
如上所述进行步骤1和2(变性加选择性连接和PCR)。在此可变策略中，3’LP附着至固相。5’LP可用报道分子(R)如荧光素标记。在SLAP之后将反应液相弃去，洗反应容器，与反应容器壁相接的标记产物的存在表明突变的存在。特异序列可以经用第二种报道分子标记的寡核苷酸的杂交加以证实。
(2)SLAP另一可变策略如图5例解。
SLAP可以用4种引物进行，除3引物系统中的引物外，还可包括第4个引物。此引物是5’通用引物，其具有与位于5’LP的5’末端的随机序列相同的序列。该引物仅可扩增由3’GP延伸产生的产物(图6)。5’GP引物及3’GP引物的引入，意味着PCR由两种通用引物介导，且不太依赖于连接步骤的效率。
实施例
方法：
使用SLAP方案以检测K-ras原癌基因的密码子12的第1位的点突变。人细胞系Calu I[ATCC HTB54]及T24[ATCC HTB4]得自美国典型培养物保藏中心。T24是K-ras的密码子12为野生型的人膀胱癌细胞系。Calu 1是肺腺癌细胞系，且K-ras的密码子12是杂合的，即同时具有野生型(GGT)及突变(TGT)序列(Ref 1)。基因组DNA提取自Calu 1和T24细胞，提取方法是在高温将细胞在裂解缓冲液中温育，加入另一种缓冲液及与DNA结合的阳离子聚合物(USPatent No.5,582,988)。然后将此聚合物/DNA复合物离心至管底，经加入NaOH并在高温温育将DNA从聚合物中洗脱出。将此NaOH/DNA溶液经加入等摩尔的在Tris缓冲液中的HCl以中和，如此最终DNA溶液处于10mM Tris(pH7-7.5)及20mM NaCl中。用列于下表1的LP和GP经SLAP扩增DNA样本。下划线的序列是与K-ras原癌基因同源的，在标为5KLP3X的LP中的黑体字碱基是特异于K-ras原癌基因野生型(X＝G)或特异突变(X＝A或T)的。标为5KLP3X的引物系列在其5’和3’末端均具羟基，引物3BKLP4在5’末端磷酸化及在3’末端生物素酰化。通用引物3GP4与3BKLP4的3’区互补。
表1  SLAP所用的引物序列
引物 功能  序列
5KLP3G 特异于G(野生型)的5′LP CAGTTAGGCCTCTCACTAGA ATAAACT TGTGGTAGTTGGAGCTG
5KLP3A 特异于A(突变)的5′LP CAGTTAGGCCTCTCACTAGA ATAAACT TGTGGTAGTTGGAGCTA
5KLP3T 特异于T(突变)的5′LP CAGTTAGGCCTCTCACTAGA ATAAACT TGTGGTAGTTGGAGCTT
3BKLP4 3′LP GGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACTGATCTTCGAATTCACACG
3GP4 用于PCR的GP CGTGTGAATTCGAAGATCAG
将来自T24，Calu 1及用T24以1∶10，1∶102，1∶103比例(重量)稀释的Calu 1的基因组DNA经SLAP在100μl总体积扩增。反应物包括：基因组DNA，(1μg)，5pmole 3GP4，5pmole 3BKLP4，5pmole 5KLP3G或5KLP3A或5KLP3T，12.5μM每种dNTP(dATP，dCTP，dTTP，dGTP，)100U Ampligase热稳定DNA连接酶(100U/μl，Epicentre Technologies)及5U AmpiTaqR DNA聚合酶，Stoffel片段(10U/μl；Perkin Elmer)，在1×Ampligase反应缓冲液中(25mMKCl，20mM Tris-HCl(pH8.3)，0.5mM NAD，10mM MgCl2及0.01％Triton X-100)，对照反应缺少DNA或Ampligase热稳定DNA连接酶，将反应物置于GeneAmp PCR系统2400(Perkin Elmer)内，在94℃加热2分钟，然后进行在94℃20秒，在64℃20秒的循环20次(每次循环在64℃所用时间多5秒)。之后，将反应物在99.9℃加热5分钟，然后进行下一轮在94℃20秒，在64℃2分钟的20次循环。
将每个反应的25μl等份不经随后操作在5％Nusieve GTG凝胶(FMC Bioproducts，Rockland，MD)中经电泳而分析。凝胶用Stratagene Eagle Eye II图象系统照相。
还将此反应进行比色分析。该分析与Findlay等[2]所述相似。经与寡核苷酸探针杂交而特异捕捉SLAP扩增子，该探针共价地与乳胶珠吸附。将此乳胶珠/寡核苷酸复合物应用于在Periodontal Surecell空白对照中不连续的位置，捕捉寡核苷酸序列为：
SKCapD1 GCTCCAACTACCACAAGTTTATTCTAGTGAGAG
SKCapD2 AGCTCCAACTACCACAAGTTTATTCTAGTGAGA
Kcap3 GCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAG
寡核苷酸SKCapD1和SKCapD2互补于5’LP序列的一部分。寡核苷酸KCap3互补于位于3’LP的3’侧的K-ras基因外显子1序列的一部分(未经用列于表1的引物经SLAP方案扩增)，Kcap3探针由此提供了非特异性扩增和/或杂交的阴性对照。
将三种寡核苷酸乳胶珠的等份(0.25％在1.20μl 10mM Tris 1mMEDTA，pH7.4，25℃)施加在Surecell膜上不连续的位点，每Surecell孔中都有三种寡核苷酸。将寡核苷酸乳胶珠干燥15分钟。用180μl 50mM KCl，10mM Tris(pH8.3 25℃)及10mM MgCl2稀释每个反应的25μl的等份。稀释的SLAP产物在95℃变性6分钟，并加到Surecell孔。然后将Surecell在50℃温育5分钟以使SLAP扩增物与捕捉寡苷酸杂交。用300μl 50mM KCl，10mM Tris(pH8.3 25℃)及10mMMgCl2在50℃洗孔。将杂交的扩增物与150μl结合有辣根过氧化物酶(EC 1.11.1.7)的链霉抗生物素蛋白缀合物反应，并在室温下温育2分钟。重复洗涤步骤以使非特异性相互作用降至最低，加入200μlLeucodye/H2O2，并在室温下将Surecell温育2分钟。固定化复合物在染料分子从无色变至蓝色的氧化转变中作为催化剂。用200μl 0.1％NaN3中止反应。对所得着色斑点经与色图比较加以目视评价，并分级为0(无色)至10(深蓝)。用180μl 50mM KCl，10mM Tris(pH8.325℃)及10mM MgCl2稀释每种SLAP反应的另一25μl等份，并不先在95℃变性施加于Surecell膜，如上述进行检测。
结果：
对Calu 1和T24的SLAP分析的5％Nusieve凝胶的检测结果示于下表2。88bp片段的存在是在K-ras的密码子12的第1位存在特异序列的诊断依据。在不含DNA或不含连接酶的反应中没有诊断性产物。在所有反应中都存在42bp产物，这种小产物由产生3BKLP4的互补链的3GP4的延伸而形成。
表2  SLAP的结果。
5′LP  T24DNA  Calu 1DNA   无DNA     1∶10Calu 1：T24     1∶100Calu 1：T24     1∶1000Calu 1：T24
5KLP3G  88bp42bp  88bp42bp    42bp     88bp42bp     88bp42bp     88bp42bp
5KLP3T  42bp  88bp42bp    42bp     88bp42bp     88bp42bp     42bp
5KLP3A  42bp  42bp    42bp
5KLP3G(无DNA连接酶)  42bp  42bp
5KLP3T(无DNA连接酶)5KLP3A(无DNA连接酶)  42bp42bp  42bp42bp
在含有连接酶，DNA聚合酶及5’LP 5KLP3G和T24 DNA，Calu1DNA及用T24 DNA稀释的Calu1 DNA三者之一的反应中存在88bp诊断性产物。这表明在K-ras的密码子12的第1位具有G的野生型等位基因存在于来自T24和Calu1细胞系的DNA中。88bp诊断性产物还存在于含连接酶，DNA聚合酶及5’LP5KLP3T和Calu1DNA，或用T24 DNA以1∶10和1∶100(重量)稀释的Calu 1 DNA的反应中，但不存在于含有T24 DNA或用T24 DNA以1∶1000(重量)稀释的Calu 1 DNA的反应中，这表明在Calu 1 DNA而不是在T24 DNA中密码子12的第1位存在由G至T的突变。Calu 1细胞系因而是杂合的，在K-ras的密码子12的第1位包含野生型(G)及突变(T)碱基。由SLAP分析获得的结果与文献所报导的这些细胞系中的密码子12的序列一致，并示出当经标准琼脂糖凝胶电泳分析时，此方案可在至少200个野生型等位基因背景下检测出一个突变等位基因。
经在Surecell上检测的SLAP反应的分析结果示于表3，用SKCapD1或SKCap D2对产物的检测是在K-ras的密码子12的第1位存在特异序列的诊断依据，在不含DNA或不含连接酶的反应中未检出诊断性产物。用捕捉寡核苷酸探针Kcap3无检测物，表明没有非特异性扩增或杂交。
表3  经Surecell分析SLAP的结果
模板和5′LP         变性的SLAP产物          未变性的SLAP产物
SKCapD1  SKCapD2  Kcap3  SKCapD1  SKCapD2  Kcap3
无DNA
5KLP3G5KLP3T5KLP3A     0     0     0     0     0     0
    0     0     0     0     0     0
    0     0     0     0     0     0
Calu 1 DNA
5KLP3G5KLP3T5KLP3A     6-7     6-7     0     4-5     4-5     0
    8     8     0     6-7     6-7     0
    0     0     0     0     0     0
T24DNA
5KLP3G     7-8     7-8     0     3-4     3-4     0
5KLP3T     0     0     0     0     0     0
5KLP3A     0     0     0     0     0     0
1∶10 Calu 1：T24
5KLP3G     7-8     7-8     0     4-5     4-5     0
5KLP3T     5-6     5-6     0     3-4     3-4     0
1∶100 Calu 1：T24
5KLP3G     7-8     7-8     0     4-5     4-5     0
5KLP3T     3-4     3-4     0     1     1     0
1∶1000 Calu 1：T24
5KLP3G 7-8 7-8 0 3-4 3-4 0
5KLP3T     1     1     0     0     0     0
根据对在施加于膜之前被变性的SLAP产物的Surecell分析，在含有连接酶、DNA聚合酶及5’LP 5KLP3G和T24 DNA或Calu 1DNA或用T24 DNA稀释的Calu 1 DNA的反应中检测出诊断性产物。这表明在K-ras的密码子12的第1位具有G的野生型等位基因存在于来自T24和Calu1细胞系的DNA中。诊断性产物还存在于含连接酶，DNA聚合酶及5’LP5 KLP3T和Calu 1 DNA，或用T24 DNA以1∶10、1∶100和1∶1000(重量)稀释的Calu 1 DNA的反应中，但不存在于含有T24 DNA的反应中，这表明在Calu 1 DNA而不是在T24 DNA中密码子12的第1位存在由G至T的突变。Calu 1细胞系因而是杂合的，其在K-ras的密码子12的第1位包含野生型(G)及突变(T)碱基。得自Surecell分析的结果与先前公布的这些细胞系中K-ras的序列相一致。
在先将样本变性或不变性后应用于Surecell膜观测到诊断性产物的检测图式相同，除了除非SLAP产物被变性否则5’LP5 KLP3T在含有用T24 DNA以1∶1000稀释的Calu1 DNA的反应中未检测到诊断性产物。诊断性产物从在施加于Surecell膜前未被变性的SLAP产物中检测出的事实表明：单链产物经由SLAP方案产生。
总之，由SLAP分析获得的结果与文献所报导的这些细胞系中的密码子12的序列一致，并示出当经Surecell分析时，此方案可在至少2000个野生型等位基因背景下检测出一个突变等位基因，当经标准凝胶电泳分析时，此方案可在至少200个野生型等位基因背景下检测出一个突变等位基因
讨论：
SLAP提供了一种简单而快速的适用于分析与疾病相关的遗传突变的方法。在SLAP期间，连接酶和DNA聚合酶的活性促进小到一个碱基变化的特异序列的选择性扩增。SLAP反应在反应初始时包含所有试剂，包括两种酶。此反应可在一密闭系统进行以在扩增期间降低污染机会。
SLAP具有其它利用PCR及连接反应以介导突变序列检测等方案所不具备的优点。在初始阶段突变模板经共存的连接及PCR以选择性扩增，此反应选择性扩增突变序列，是因为连接酶及DNA聚合酶仅在介导该方法的引物与模板在突变碱基位置配对时才起作用。在第二阶段，产生突变的特异性单链产物。由于在反应结束时存在的连接产物至少一部分是单链的，因而在检测例如用寡核苷酸捕捉前不需要变性或其它操作。选择性扩增所需步骤数的减少使SLAP分析劳动强度降低并更易于自动化。另外由于GP是通用的，预期所有PCR链几乎等效产生。在SLAP期间形成的产物量因而不十分依赖于初始连接步骤的效率。这提高了SLAP在含几个基因/突变特异性LP的多重反应中检测多重突变的适用性。这将使得能在一个反应中同时分析多个基因和/或外显子。或者，如果只有一个5’LP包含在反应中，则可鉴别出精确的核苷酸取代。如果该反应在96孔培养板中进行，且每孔中5’LP不同，几乎可同时筛选出90个碱基，特异性突变可被鉴别且在分析中可包括对照反应。
SLAP可与许多捕捉及检测系统共存。这使整个方案可以自动化，并能迅速分析大量样本。捕捉系统包括(1)与乳胶珠或磁珠附着的互补寡核苷酸；(2)用亲和素或链亲和素捕捉的生物素酰化引物；(3)用抗地高辛抗体捕捉的地高辛标记的产物；(4)在GCN4包被的培养板上捕捉的带GCN4识别标记的PCR引物。检测系统包括：(1)用链亲和素/辣根过氧化物酶显色的生物素酰化引物；(2)用如异硫氰酸荧光素或碱性磷酸酶等分子直接标记；(3)用抗地高辛抗体检测的地高辛标记的产物。
本领域技术人员应意识到可对如具体实施方案所示的本发明在不超过所述本发明范围之内做各种改变和/或修改，本文的实施方案因而被认为是举例性的而非限制性的。
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Claims (6)

1.一种扩增特异靶核酸序列的方法，该方法包括：
(1)形成一反应混合物，包括：
(i)靶序列；
(ii)引物，包括第一个引物，其3’末端至少有一部分与靶序列第一个末端的第一个区段基本上互补，第二个引物，其5’末端至少有一部分与靶序列第二个末端的第二个区段基本上互补，第二个引物的5’末端与第一个引物的3’末端相邻，以及第三个引物，其与第二个引物3’末端的一个区段基本上互补，其中第二个引物的与第三个引物基本上互补的区段是随机序列；
(iii)至少四种不同的核苷酸碱基；
(iv)热稳定聚合酶及热稳定连接酶；以及
(2)循环加热该反应混合物。
2.如权利要求1的方法，其中该方法还包括在循环加热反应混合物之后，进行基本上灭活热稳定聚合酶，接着进行第二轮热循环反应混合物的步骤。
3.如权利要求1的方法，其中反应混合物包括第四个引物，其具有与第一个引物5’末端的区段相同的序列。
4.一种在含有核酸的样本中检测特异靶核酸序列的方法，包括：
(1)形成反应混合物，包括：
(i)怀疑包括靶序列的核酸样本；
(ii)引物，包括第一个引物，其3’末端至少有一部分与靶序列第一个末端的第一个区段基本上互补，第二个引物，其5’末端至少有一部分与靶序列第二个末端的第二个区段基本上互补，第二个引物的5’末端与第一个引物的3’末端相邻，以及第三个引物，其与第二个引物3’末端的一个区段基本上互补，其中第二个引物的与第三个引物基本上互补的区段是随机序列；
(iii)至少四种不同的核苷酸碱基；
(iv)热稳定聚合酶及热稳定连接酶；
(2)循环加热该反应混合物；以及
(3)检测代表特异靶核酸序列存在的扩增产物的存在与否。
5.如权利要求4的方法，其中该方法还包括在循环加热反应混合物之后，进行基本上灭活热稳定聚合酶，接着进行第二轮热循环反应混合物的步骤。
6.如权利要求4的方法，其中反应混合物包括第四个引物，其具有与第一个引物5’末端的区段相同的序列。
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