CN117783336A - 一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法 - Google Patents
一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117783336A CN117783336A CN202311804936.5A CN202311804936A CN117783336A CN 117783336 A CN117783336 A CN 117783336A CN 202311804936 A CN202311804936 A CN 202311804936A CN 117783336 A CN117783336 A CN 117783336A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- sample
- antibiotics
- volume
- intracellular
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 113
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 109
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 70
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims abstract description 47
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 40
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 30
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 15
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 15
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 11
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000000534 ion trap mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 claims description 4
- 101100293248 Xenopus laevis plp1-a gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100293249 Xenopus laevis plp1-b gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 abstract 1
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 8
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 229960001180 norfloxacin Drugs 0.000 description 7
- OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N norfloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GSDSWSVVBLHKDQ-UHFFFAOYSA-N 9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-oxo-2,3-dihydro-7H-[1,4]oxazino[2,3,4-ij]quinoline-6-carboxylic acid Chemical compound FC1=CC(C(C(C(O)=O)=C2)=O)=C3N2C(C)COC3=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 6
- 229960001699 ofloxacin Drugs 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- HKAMKLBXTLTVCN-UHFFFAOYSA-N simeton Chemical compound CCNC1=NC(NCC)=NC(OC)=N1 HKAMKLBXTLTVCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002044 Rhizophora apiculata Species 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001868 liquid chromatography-fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001575 tandem quadrupole mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,主要包括:从暴露于抗生素的细菌悬液中获取细胞外样品和细胞内样品;细胞外样品的前处理,具体包括细胞外样品的固相萃取与浓缩;细胞内样品的前处理,具体包括细胞内样品的超声萃取与浓缩;使用液相色谱串联质谱定量分析,得到细菌胞内外残留抗生素的浓度。本发明建立同步萃取‑真空离心浓缩‑超高效液相色谱串联质谱的细菌胞内外残留抗生素分析鉴定方法,提高了目标抗生素的回收效果和稳定性,突破了准确定量胞内外多重抗生素剂量的一大瓶颈,有利于加快抗生素浓度与抗性水平之间的剂量效应关系等相关研究进程。
Description
技术领域
本发明涉及科学管控抗生素及抗生素抗性基因风险评估技术领域,尤其涉及一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法。
背景技术
抗生素在预防和治疗人类和兽类疾病中发挥着重要作用,然而随着抗生素的长期过度使用,抗生素抗性问题日趋加剧并成为一场全球公共卫生危机。抗生素在环境中广泛残留,造成抗生素抗性已成为不容忽视的环境问题,严重威胁生态安全及人体健康。已有研究表明环境浓度抗生素对于诱导细菌产生和传播抗生素抗性起到了重要作用。环境中低于最小抑制浓度的抗生素可以在不同层面发挥作用:首先抗生素可以作为抗性的选择因子,富集现有的抗性细菌和筛选新发生的抗性;其次抗生素可以诱发细菌产生基因型和表型变异,这一过程通过诱导抗性发展等增加细菌适应性进化速率的方式展开;最后抗生素作为信号分子,能够影响细胞的多种生理生化活动,如生物膜的形成、毒性和基因表达等,因此环境浓度水平的抗生素可能会加速环境中抗生素抗性的出现和传播。
抗生素暴露促进微生物抗生素抗性进化,同时抗性又会调控抗生素胞内浓度,研究抗生素暴露与抗性发展之间的剂量效应关系对正确认识二者关系、有效管控其环境风险至关重要。但环境浓度抗生素诱导细菌产生抗生素抗性过程中的剂量效应关系并不明确,急需揭示细菌抗性进化的抗生素决定剂量及其阈值,从而为遏制环境中抗生素抗性发展提供理论基础。现有研究显示环境中抗生素浓度与抗性之间的相关性并不明确,难于得出统一结论,这可能是由于多以总残留浓度或细胞外残留浓度表征抗生素暴露浓度,而细菌胞内浓度对于抗性诱导更具决定作用。但细胞内基质复杂,准确定量胞内外多重抗生素剂量是识别抗性决定浓度的一大瓶颈。
现有技术能够检测环境中残留的痕量抗生素,方法准确灵敏高效。近年来高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)成为分析抗生素残留的主流技术,被广泛用于复杂基质中抗生素的测定,并取得了很好的检测效果。但分析鉴定方法多围绕环境样品中残留的抗生素展开,缺少对于微生物样品中胞内和胞外残留抗生素的检测方法,导致对于抗生素在微生物胞内外分配的认识不够清晰。因此建立并优化针对细菌胞内外残留抗生素的分析鉴定方法,对于提高抗生素细菌胁迫作用的认识十分重要。
综上所述,细菌胞内外残留抗生素的剂量表征对于研究抗生素暴露与抗性发展之间的剂量效应关系以及有效管控其环境风险非常重要。因此,亟需一种定量分析鉴定方法准确检测细菌胞内外残留抗生素浓度,突破以往抗生素暴露与抗性发展之间的剂量效应关系研究的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提出一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,包括以下步骤:
S1、从暴露于抗生素的细菌悬液中获取细胞外样品和细胞内样品;
S2、对获取到的细胞外样品进行前处理,具体包括细胞外样品的固相萃取与浓缩;
S3、对获取到的细胞内样品进行前处理,具体包括细胞内样品的超声萃取与浓缩;
S4、使用液相色谱串联质谱分别对萃取与浓缩后的细胞内样品与细胞外样品进行定量分析,得到细菌胞内外残留抗生素的浓度。
进一步地,所述步骤S1包括以下子步骤:
S1.1、将暴露于抗生素的混合均匀的含有细菌悬液的体积为V0的LB培养基转移至容积为Vl的无菌离心管中,在离心力为Fl、温度为Tl的条件下进行离心操作,离心时间为tlo;
S1.2、将离心后得到的细菌沉淀从培养液中分离出来,收集离心管中的Vw体积上清液作为细胞外样品,细菌沉淀作为细胞内样品留在离心管中。
进一步地,所述细胞外样品的固相萃取与浓缩具体包括:
S2.1、使用固相萃取从LB培养基预浓缩目标抗生素:根据固相萃取的流程首先依次用体积为Vjo的甲醇和体积为Vys、浓度为Cys的氯化氢以及体积为Vc的超纯水活化OasisHLB固相萃取柱;然后将离心得到的Vw体积上清液流经固相萃取柱,该过程使上清液自然缓慢滴下,再真空干燥固相萃取柱以利于后续洗脱和浓缩,待固相萃取柱完全抽干后,使用体积为Vjt的甲醇将抗生素洗脱至离心管中并真空抽干;
S2.2、用真空离心浓缩仪在温度为Tng、转速为Cng的条件下将所述步骤S2.1得到的体积为Vxg的洗脱液蒸发浓缩至体积为Vng,然后加入超纯水使细胞外样品总体积为Vtg。
进一步地,所述细胞内样品的超声萃取与浓缩具体包括:
S3.1、首先使用体积为Vy的有机溶剂重悬浮离心管中离心得到的细菌沉淀,其中所述有机溶剂为乙腈或甲醇,混合物涡旋时间为tw,超声时间为tc;然后在离心力为Fl、温度为Tl的条件下进行离心操作,离心时间为tlt,收集离心管中离心得到的上清液;
S3.2、重复所述步骤S3.1中的萃取步骤nc次,将nc次离心所得上清液混合至离心管;
S3.3、对于使用乙腈作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为Tnc、转速为Cnc的条件下蒸发浓缩至体积为Vnc,再向离心管中加入甲醇使细胞内样品总体积至Vtc;对于用甲醇作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为Tnc、转速为Cnc的条件下蒸发浓缩至体积为Vtc。
进一步地,所述步骤S4具体包括:
在萃取与浓缩后的细胞内样品与细胞外样品中分别加入内标西玛通,再通过0.22μm过滤器进行过滤,然后进行液相色谱串联质谱定量分析,得到细菌胞内残留抗生素的浓度Cn0和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw0。
优选地,所述液相色谱串联质谱具体为:超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱。
进一步地,所述超高效液相色谱的分析条件参数包括进样体积Vj、液相色谱室的温度Ts、入口电压Ur、电喷雾电压Ud、帘气Plq、I号气帘气Pplp1、II号气帘气Pqlq2、离子源温度Tlzy、液相色谱流动相条件、所测目标抗生素的母离子与子离子对应的去簇电压、碰撞电压和碰撞室出口电压,所述液相色谱流动相条件包括流动相、流速、梯度洗脱条件、色谱柱和柱温。
进一步地,所述细菌胞内残留抗生素的浓度Cn0和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw0还需经过浓度换算转换为真实情况下的细菌胞内残留抗生素的浓度Cn1和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw1。
进一步地,所述浓度换算的方法为:
其中,Cjl表示培养基的菌落浓度。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)现有的抗生素分析鉴定方法多围绕环境样品中残留的抗生素展开,缺少对于微生物样品中胞内和胞外残留抗生素的检测方法,本发明则弥补了这一研究空白,解决了胞内外抗生素定量检测的技术难题;
(2)本发明准确灵敏高效,其中前处理方法具有很高的回收率和可重复性,提高了抗生素定量鉴定结果的可靠性;
(3)本发明有利于探究细菌胞内外残留抗生素的剂量表征对于研究抗生素暴露与抗性发展之间的剂量效应关系,从而为遏制环境中抗生素抗性发展提供理论基础,有助于环境抗生素风险的有效管控。
附图说明
图1为本发明的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法的流程图;
图2为本发明实施例1中洗脱液种类和洗脱液体积对细胞外样品抗生素的回收率结果图。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明,其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时,除非另有表示,不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。相反,它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的装置和方法的例子。应当理解的是,以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的,并不能限制本申请。
在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的,而非旨在限制本申请。在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式,除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解,本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
应当理解,尽管在本申请可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息,但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如,在不脱离本申请范围的情况下,第一信息也可以被称为第二信息,类似地,第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境,如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
下面结合附图,对本发明进行详细说明。在不冲突的情况下,下述的实施例及实施方式中的特征可以相互组合。
根据现有文献调研,可见涉及的方法或技术存在缺点。现有多种分析方法用于检测样品中的抗生素,包括伏安法、流动注射电化学发光法、分光光度法和液相色谱法等。与液相色谱联用的检测器主要包括质谱检测器、紫外-可见检测器、荧光检测器和光二极管阵列检测器等。有研究采用超声辅助萃取(UAE)、SPE和高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)建立了红树林沉积物中CIP、左氧氟沙星(LEV)和NOR的分析方法,检测限分别为1.10、3.33和0.26μg/kg。近年来高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)成为分析抗生素残留的主流技术,被广泛用于复杂基质中抗生素的测定。常用的质谱检测器包括串联四级杆质谱、离子阱质谱和飞行时间质谱等,离子源常用电喷雾离子源。这些高效液相色谱-串联质谱的检测方法同样取得了非常好的检测效果。但分析鉴定方法多围绕环境样品中残留的抗生素展开,缺少对于微生物样品中胞内和胞外残留抗生素的检测方法,导致对于抗生素在微生物胞内外分配的认识不够清晰。本发明则突破了这一技术瓶颈,实现了细胞内外残留抗生素的准确定量分析鉴定。
本发明的基本原理具体包括:首先从暴露于抗生素的细菌悬液中获取细胞外样品和细胞内样品;随后对细胞外样品进行固相萃取与浓缩等前处理,对细胞内样品进行超声萃取与浓缩等前处理;最后使用超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱进行定量分析,得到细菌胞内外抗生素残留浓度。
参见图1,本发明的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,具体包括以下步骤:
S1、从暴露于抗生素的细菌悬液中获取细胞外样品和细胞内样品。
S1.1、将暴露于抗生素的混合均匀的含有细菌悬液的体积为V0的LB培养基转移至容积为Vl的无菌离心管中,在离心力为Fl、温度为Tl的条件下进行离心操作,离心时间为tlo。
S1.2、将离心后得到的细菌沉淀从培养液中分离出来,收集离心管中的Vw体积上清液作为细胞外样品等待后续萃取与浓缩,细菌沉淀作为细胞内样品留在离心管中等待后续萃取与浓缩。
S2、对获取到的细胞外样品进行前处理,具体包括细胞外样品的固相萃取与浓缩。
本实施例中,细胞外样品的固相萃取与浓缩具体包括:
S2.1、使用固相萃取从LB培养基预浓缩目标抗生素:根据固相萃取的流程首先依次用体积为Vjo的甲醇和体积为Vys、浓度为Cys的氯化氢(HCl)以及体积为Vc的超纯水活化Oasis HLB固相萃取柱;然后将离心得到的Vw体积上清液流经固相萃取柱,该过程使上清液自然缓慢滴下,再真空干燥固相萃取柱以利于后续洗脱和浓缩,待固相萃取柱完全抽干后,使用体积为Vjt的甲醇将抗生素洗脱至离心管中并真空抽干。
S2.2、用真空离心浓缩仪在温度为Tng、转速为Cng的条件下将步骤S2.1得到的体积为Vxg的洗脱液蒸发浓缩至体积为Vng,然后加入超纯水使细胞外样品总体积为Vtg。
S3、对获取到的细胞内样品进行前处理,具体包括细胞内样品的超声萃取与浓缩。
本实施例中,细胞内样品的超声萃取与浓缩具体包括:
S3.1、首先使用体积为Vy的有机溶剂重悬浮离心管中离心得到的细菌沉淀,其中有机溶剂为乙腈或甲醇,混合物涡旋时间为tw,超声时间为tc;然后在离心力为Fl、温度为Tl的条件下进行离心操作,离心时间为tlt,收集离心管中离心得到的上清液。
S3.2、重复步骤S3.1中的萃取步骤nc次,将nc次离心所得上清液混合至离心管。
应当理解的是,将步骤S1.2中的细菌沉淀加入有机溶剂后进行超声萃取,所以细胞内的抗生素就进入上清液中,收集上清液后重复离心和超声萃取是为了将胞内抗生素全部收集到;第一次离心完取走上清液后,再加去有机溶剂进行第二次离心,然后再取走第二次的上清液,以此类推,将nc次离心所得的全部上清液混合至离心管。
S3.3、对于使用乙腈作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为Tnc、转速为Cnc的条件下蒸发浓缩至体积为Vnc,再向离心管中加入甲醇使细胞内样品总体积至Vtc。对于用甲醇作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为Tnc、转速为Cnc的条件下蒸发浓缩至体积为Vtc。
S4、使用液相色谱串联质谱分别对萃取与浓缩后的细胞内样品与细胞外样品进行定量分析,得到细菌胞内外残留抗生素的浓度。
具体地,在萃取与浓缩后的细胞内样品与细胞外样品中分别加入内标西玛通(Simeton),再通过0.22μm过滤器进行过滤,然后进行液相色谱串联质谱定量分析,得到细菌胞内残留抗生素的浓度Cn0和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw0。
优选地,液相色谱串联质谱具体为:超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱。
进一步地,超高效液相色谱的分析条件参数包括进样体积Vj、液相色谱室的温度Ts、入口电压Ur、电喷雾电压Ud、帘气Plq、I号气帘气Pplp1、II号气帘气Pqlq2、离子源温度Tlzy、液相色谱流动相条件、所测目标抗生素的母离子与子离子对应的去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)和碰撞室出口电压(CXP)。其中,液相色谱流动相条件包括流动相、流速(Cldx)、梯度洗脱条件、色谱柱和柱温(Tz)。
进一步地,细菌胞内残留抗生素的浓度Cn0和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw0还需经过浓度换算转换为真实情况下的细菌胞内残留抗生素的浓度Cn1和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw1。
进一步地,浓度换算的方法为:
其中,Cjl表示培养基的菌落浓度。
本发明建立了细菌胞内、外残留抗生素的超声萃取/固相萃取-超高效液相色谱串联质谱分析鉴定方法,突破了由于细胞内基质复杂导致的无法准确定量胞内外多重抗生素剂量的技术瓶颈。除此之外,本发明有助于帮助人们了解抗生素在胞内外的分布情况,阐明抗生素剂量与细菌抗性之间的剂量关系,在环境抗生素风险管控领域具有良好的应用前景。
以下通过具体实施例结合附图对本发明的技术方案做进一步阐述说明。需要注意的是,下述的具体实施例仅是作为举例说明,本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
本实施例考虑了细胞外样品前处理中洗脱液种类和洗脱液体积对细胞外样品回收率的影响,具体包括如下步骤:
(1)从暴露于抗生素的大肠杆菌悬液中获取细胞外样品:
将混合均匀的含有细菌悬液的体积为3mL的LB培养基转移至容积为15mL的无菌离心管中,在离心力为15000g、温度为4℃的条件下进行离心操作,离心时间为10min。
将离心后得到的细菌沉淀从培养液中分离出来,收集离心管中3mL体积上清液作为细胞外样品等待后续萃取与浓缩。
(2)细胞外样品的固相萃取与浓缩:
使用固相萃取从LB培养基预浓缩目标抗生素。根据固相萃取的流程首先依次用体积为3mL的甲醇、体积为3mL、浓度为0.1M的HCl和体积为6mL的超纯水活化Oasis HLB固相萃取柱。然后将离心得到的3mL上清液流经固相萃取柱,该过程使上清液自然缓慢滴下,再真空干燥固相萃取柱以利于后续洗脱和浓缩。待固相萃取柱完全抽干后,使用体积分别为2、4、6、8、10mL的甲醇(MeOH)或含0.1%甲酸的甲醇(MeOH+0.1%FA)将抗生素洗脱至离心管中并真空抽干。
用真空离心浓缩仪在温度为60℃、转速为1500r/min的条件下将体积为6mL的洗脱液蒸发浓缩至体积为900μL,然后加入超纯水使细胞外样品总体积为1mL。
(3)细菌胞外残留抗生素浓度定量检测:
在萃取与浓缩后的细胞外样品中分别加入内标Simeton,通过0.22μm过滤器进行过滤,然后使用超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱定量分析。其中,该液相色谱的一些参数设置为:样品进样体积为5μL,液相色谱室的温度设置为4℃,采用正离子模式下的ESI源多反应监测模式(MRM),入口电压-10V,电喷雾电压4500V,帘气35psi,I号气帘气55psi,II号气帘气55psi,离子源温度550℃,液相色谱流动相条件包括的流动相、流速(Cldx)、梯度洗脱条件、色谱柱和柱温(Tz)的设置如表1所示。
表1:高效液相色谱分析条件参数
本实施例中,选择3种环境中典型的氟喹诺酮抗生素环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)作为待测抗生素进行定量分析。3种抗生素的母离子、子离子m/z值,以及经过优化后每个离子对的去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)和碰撞室出口电压(CXP)如表2所示,其中m/z值为质荷比,体现在设置质谱参数中DP\CE\CXP的设置。经过超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱检测即可得到大肠杆菌胞外残留抗生素的浓度。得到的回收率结果如图2所示,从中可以看出选择6mL甲醇洗脱固相萃取柱上的抗生素效果最好。
表2:正离子模式下的ESI源多反应监测模式(MRM)离子信息及优化条件参数
实施例2
本实施例考察了细胞内样品超声萃取时不同萃取剂和萃取次数对细胞内样品抗生素回收率的影响,具体步骤如下:
(1)从暴露于抗生素的大肠杆菌悬液中获取细胞内样品:
将混合均匀的含有细菌悬液的体积为3mL的LB培养基转移至容积为15mL的无菌离心管中,在离心力为15000g、温度为4℃的条件下进行离心操作,离心时间为10min。
将离心后得到的细菌沉淀从培养液中分离出来,细菌沉淀作为细胞内样品留在离心管中等待后续萃取与浓缩。
(2)细胞内样品的超声萃取与浓缩:
细菌培养液离心后,使用体积为2mL的有机溶剂(乙腈或甲醇)重悬浮离心管中离心得到的细菌沉淀,混合物涡旋时间为1min,超声时间为10min。然后在离心力为15000g、温度为4℃的条件下进行离心操作,离心时间为5min,收集离心管中离心得到的上清液。
重复上述萃取步骤1~3次,将每次离心所得上清液混合至离心管。
对于使用乙腈作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为60℃、转速为1500r/min的条件下蒸发浓缩至体积为800μL,再向离心管中加入甲醇使细胞内样品总体积至1mL。对于使用甲醇作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为60℃、转速为1500r/min的条件下蒸发浓缩至体积为1mL。
(3)细菌胞内残留抗生素浓度定量检测:
在萃取与浓缩后的细胞内样品中分别加入内标Simeton,通过0.22μm过滤器进行过滤,然后使用超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱定量分析。其中,该液相色谱的一些参数设置为:样品进样体积为5μL,液相色谱室的温度设置为4℃,采用正离子模式下的ESI源多反应监测模式(MRM),入口电压-10V,电喷雾电压4500V,帘气35psi,I号气帘气55psi,II号气帘气55psi,离子源温度550℃,液相色谱流动相条件包括的流动相、流速(Cldx)、梯度洗脱条件、色谱柱和柱温(Tz)的设置如表1所示。
表3:萃取次数和萃取剂对细胞内样品抗生素的回收率
本实施例中,选择3种环境中典型的氟喹诺酮抗生素环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)作为待测抗生素进行定量分析。3种抗生素的母离子、子离子m/z值,以及经过优化后每个离子对的去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)和碰撞室出口电压(CXP)如表2所示。经过超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱检测即可得到大肠杆菌胞内抗生素的回收率,其结果如表3所示。从表3中可以看出萃取相同次数时乙腈萃取的回收率优于甲醇,于是选用乙腈进行萃取。针对萃取次数,发现使用乙腈萃取两次时,3种抗生素均具有较好的回收率,于是实验最终选择4mL乙腈超声萃取大肠杆菌胞内残留抗生素。
实施例3
本实施例基于超声萃取/固相萃取-超高效液相色谱串联质谱的细菌胞内外残留抗生素的分析鉴定方法,具体包括以下步骤:
(1)从暴露于抗生素的大肠杆菌悬液中获取细胞外样品和细胞内样品:
将暴露于抗生素的混合均匀的含有细菌悬液的体积为3mL的LB培养基转移至容积为15mL的无菌离心管中,在离心力为15000g、温度为4℃的条件下进行离心操作,离心时间为10min。
将离心后得到的细菌沉淀从培养液中分离出来,收集离心管中3mL体积上清液作为细胞外样品等待后续萃取与浓缩,细菌沉淀作为细胞内样品留在离心管中等待后续萃取与浓缩。
(2)对获取到的细胞外样品进行固相萃取与浓缩:
使用固相萃取从LB培养基预浓缩目标抗生素:根据固相萃取的流程首先依次用体积为3mL的甲醇、体积为3mL、浓度为0.1M的HCl和体积为6mL的超纯水活化Oasis HLB固相萃取柱;然后将离心得到的3mL上清液流经固相萃取柱,该过程使上清液自然缓慢滴下,再真空干燥固相萃取柱以利于后续洗脱和浓缩,待固相萃取柱完全抽干后,使用体积为6mL的甲醇将抗生素洗脱至离心管中并真空抽干。
用真空离心浓缩仪在温度为60℃、转速为1500r/min的条件下将体积为6mL的洗脱液蒸发浓缩至体积为900μL,然后加入超纯水使细胞外样品总体积为1mL。
(3)对获取到的细胞内样品进行超声萃取与浓缩:
首先使用体积为2mL的乙腈重悬浮离心管中的细菌沉淀,混合物涡旋时间为1min,超声时间为10min;然后在离心力为15000g、温度为4℃的条件下进行离心操作,离心时间为5min,收集离心管中离心得到的上清液。
重复上述萃取步骤2次,将2次离心所得上清液混合至离心管。
对于使用乙腈作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为60℃、转速为1500r/min的条件下蒸发浓缩至体积为800μL,再向离心管中加入甲醇使细胞内样品总体积至1mL。
(4)细菌胞内外残留抗生素浓度定量检测:
在萃取与浓缩后的细胞内外样品中分别加入内标Simeton,再通过0.22μm过滤器过滤,然后使用超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱定量分析。其中,该液相色谱的一些参数设置为:样品进样体积为5μL,液相色谱室的温度设置为4℃,采用正离子模式下的ESI源多反应监测模式(MRM),入口电压-10V,电喷雾电压4500V,帘气35psi,I号气帘气55psi,II号气帘气55psi,离子源温度550℃,液相色谱流动相条件包括的流动相、流速(Cldx)、梯度洗脱条件、色谱柱和柱温(Tz)的设置如表1所示。
本实施例中,选择3种环境中典型的氟喹诺酮抗生素环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)作为待测抗生素进行定量分析。3种抗生素的母离子、子离子m/z值,以及经过优化后每个离子对的去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)和碰撞室出口电压(CXP)如表2所示。经超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱检测和浓度换算即可得到真实情况下大肠杆菌胞内外抗生素的浓度,其结果如表4所示。
表4:大肠杆菌胞内外残留抗生素的浓度
综上所述,本发明通过基于超声萃取/固相萃取-超高效液相色谱串联质谱的分析鉴定方法就可进行细菌胞内外残留抗生素的定量分析。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、从暴露于抗生素的细菌悬液中获取细胞外样品和细胞内样品;
S2、对获取到的细胞外样品进行前处理,具体包括细胞外样品的固相萃取与浓缩;
S3、对获取到的细胞内样品进行前处理,具体包括细胞内样品的超声萃取与浓缩;
S4、使用液相色谱串联质谱分别对萃取与浓缩后的细胞内样品与细胞外样品进行定量分析,得到细菌胞内外残留抗生素的浓度。
2.根据权利要求1所述的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,所述步骤S1包括以下子步骤:
S1.1、将暴露于抗生素的混合均匀的含有细菌悬液的体积为V0的LB培养基转移至容积为Vl的无菌离心管中,在离心力为Fl、温度为Tl的条件下进行离心操作,离心时间为tlo;
S1.2、将离心后得到的细菌沉淀从培养液中分离出来,收集离心管中的Vw体积上清液作为细胞外样品,细菌沉淀作为细胞内样品留在离心管中。
3.根据权利要求1所述的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,所述细胞外样品的固相萃取与浓缩具体包括:
S2.1、使用固相萃取从LB培养基预浓缩目标抗生素:根据固相萃取的流程首先依次用体积为Vjo的甲醇和体积为Vys、浓度为Cys的氯化氢以及体积为Vc的超纯水活化Oasis HLB固相萃取柱;然后将离心得到的Vw体积上清液流经固相萃取柱,该过程使上清液自然缓慢滴下,再真空干燥固相萃取柱以利于后续洗脱和浓缩,待固相萃取柱完全抽干后,使用体积为Vjt的甲醇将抗生素洗脱至离心管中并真空抽干;
S2.2、用真空离心浓缩仪在温度为Tng、转速为Cng的条件下将所述步骤S2.1得到的体积为Vxg的洗脱液蒸发浓缩至体积为Vng,然后加入超纯水使细胞外样品总体积为Vtg。
4.根据权利要求1所述的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,所述细胞内样品的超声萃取与浓缩具体包括:
S3.1、首先使用体积为Vy的有机溶剂重悬浮离心管中离心得到的细菌沉淀,其中所述有机溶剂为乙腈或甲醇,混合物涡旋时间为tw,超声时间为tc;然后在离心力为Fl、温度为Tl的条件下进行离心操作,离心时间为tlt,收集离心管中离心得到的上清液;
S3.2、重复所述步骤S3.1中的萃取步骤nc次,将nc次离心所得上清液混合至离心管;
S3.3、对于使用乙腈作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为Tnc、转速为Cnc的条件下蒸发浓缩至体积为Vnc,再向离心管中加入甲醇使细胞内样品总体积至Vtc;对于用甲醇作为有机溶剂进行萃取的细胞内样品,在真空离心浓缩仪中,在温度为Tnc、转速为Cnc的条件下蒸发浓缩至体积为Vtc。
5.根据权利要求1所述的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,所述步骤S4具体包括:
在萃取与浓缩后的细胞内样品与细胞外样品中分别加入内标西玛通,再通过0.22μm过滤器进行过滤,然后进行液相色谱串联质谱定量分析,得到细菌胞内残留抗生素的浓度Cn0和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw0。
6.根据权利要求1或5所述的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,所述液相色谱串联质谱具体为:超高效液相色谱串联三重四极杆线性离子阱质谱。
7.根据权利要求6所述的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,所述超高效液相色谱的分析条件参数包括进样体积Vj、液相色谱室的温度Ts、入口电压Ur、电喷雾电压Ud、帘气Plq、I号气帘气Pplp1、II号气帘气Pqlq2、离子源温度Tlzy、液相色谱流动相条件、所测目标抗生素的母离子与子离子对应的去簇电压、碰撞电压和碰撞室出口电压,所述液相色谱流动相条件包括流动相、流速、梯度洗脱条件、色谱柱和柱温。
8.根据权利要求5所述的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,所述细菌胞内残留抗生素的浓度Cn0和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw0还需经过浓度换算转换为真实情况下的细菌胞内残留抗生素的浓度Cn1和细菌胞外残留抗生素的浓度Cw1。
9.根据权利要求9所述的细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法,其特征在于,所述浓度换算的方法为:
其中,Cjl表示培养基的菌落浓度。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311804936.5A CN117783336A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311804936.5A CN117783336A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117783336A true CN117783336A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90380874
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311804936.5A Pending CN117783336A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117783336A (zh) |
-
2023
- 2023-12-26 CN CN202311804936.5A patent/CN117783336A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6668415B2 (ja) | 微生物学的分析用の装置及び方法 | |
US10497549B2 (en) | Methods for mass spectrometry of mixtures of proteins or polypeptides using proton transfer reaction | |
CA2495378C (en) | Method for characterizing biomolecules utilizing a result driven strategy | |
CN106093261B (zh) | 一种鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法 | |
CN109682897B (zh) | 一种同时测定环境水样中多种内分泌干扰物的方法 | |
Singh et al. | Development of a targeted adductomic method for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbon DNA adducts using online column‐switching liquid chromatography/tandem mass spectrometry | |
WO2022262132A1 (zh) | 一种样品未知成分的液质联用非靶向分析方法 | |
CN111562327A (zh) | 一种基于分子网络的废水中致毒有机污染物非目标筛查分析的方法 | |
CN109342624A (zh) | 固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖水体中15种抗生素的方法 | |
CN113702558A (zh) | 一种水环境中微量雌激素类物质的检测方法 | |
CN112326812A (zh) | 同位素稀释-OnlineSPE-HRMS同时检测地下水中五种农药的方法 | |
US8497471B2 (en) | Mass spectrometry assay for thiopurine-S-methyl transferase activity and products generated thereby | |
CN108663455B (zh) | 一种基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法及应用 | |
Gao et al. | Rapid method for quantification of seven synthetic pigments in colored Chinese steamed buns using UFLC-MS/MS without SPE | |
CN109655538A (zh) | 一种同时检测奶粉中多氯联苯和邻苯二甲酸酯的方法 | |
CN117783336A (zh) | 一种细菌胞内外残留抗生素的定量分析鉴定方法 | |
CN109444293B (zh) | 一种新鲜烟叶中内源水溶性b族维生素的检测方法 | |
CN111781291A (zh) | 一种水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法 | |
CN110702829A (zh) | 一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法 | |
CN109001333A (zh) | 液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法 | |
CN111474279B (zh) | 检测大环内酯抗生素化合物的方法和试剂盒 | |
CN113533570A (zh) | 一种沉积物中有机磷阻燃剂主要代谢产物的分析方法 | |
CN115078554A (zh) | 一种同时检测多种鞘磷脂代谢物的方法 | |
CN111272901A (zh) | 一种贝类中亲脂性毒素的高分辨质谱检测方法 | |
CN112444570A (zh) | 顶空固相微萃取气质联用检测四氯化钛中有机物的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |