CN117777310A - 一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法 - Google Patents
一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117777310A CN117777310A CN202311795785.1A CN202311795785A CN117777310A CN 117777310 A CN117777310 A CN 117777310A CN 202311795785 A CN202311795785 A CN 202311795785A CN 117777310 A CN117777310 A CN 117777310A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chromatography
- nacl
- column
- chromatographic
- aqueous solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 95
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 47
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 35
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 26
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 20
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 20
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 12
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 11
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 11
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 11
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 229940124280 l-arginine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 102100038968 WAP four-disulfide core domain protein 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 abstract description 7
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 abstract description 6
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 abstract description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 5
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 abstract description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 abstract description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 238000012444 downstream purification process Methods 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 abstract 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 5
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 108700019309 factor VIII-Fc fusion Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种重组人凝血因子VIII‑Fc融合蛋白的纯化方法，包括采用三步层析法进行纯化：所述样品先经粗纯步骤Protein A亲和层析，以有效去除HCP、内毒素等杂质且维持较高的目的蛋白收率；然后再使用疏水层析和阴离子交换层析来进一步精细纯化，以有效去除所述样品中的Fc片段、残留的HCP和其它痕量杂质，并将各杂质含量控制在用药安全范围以内，且维持较高的目的蛋白收率和活性。本发明方法在分离纯化目的蛋白时具有良好的重现性和稳定性，适用于重组人凝血因子VIII‑Fc融合蛋白的下游纯化工艺以用于生产制备为防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗的药物。
Description
技术领域
本发明属于蛋白分离纯化领域，具体涉及一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法。
背景技术
血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病,病症多为自发性或轻度外伤后出血不止,轻则造成患者终生残疾,重则短时间即可危及患者生命。血友病尚无根治办法,目前的治疗方法主要为替代疗法,通过长期输注血浆、缺失的凝血因子的方式来治疗。人凝血因子VIII(coagulation factor VIII，FVIII)是内源性凝血途径中一种重要的凝血因子，作为凝血因子IXa的辅因子，参与凝血因子X的激活。FVIII遗传性缺乏将导致甲型血友病(或血友病A)。静注FVIII制品替代治疗甲型血友病，是当前的主要治疗手段。由于静注天然结构的FVIII在体内半衰期短，预防性治疗需要一周静注3-4次，开发长效FVIII有助于提高治疗便利性和患者依从性。长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白能明显提高FVIII的稳定性和体内半衰期，达到降低预防性治疗每周用药频次的目的。
凝血因子VIII(FVIII)是多结构的大分子糖蛋白，成熟的蛋白质分子量约为280kDa，包含6个结构域为A1-A2-B-A3-C1-C2，除了B结构域外其他结构域在FⅧ蛋白的功能中发挥着关键作用，每个结构域都有针对凝血级联反应中不同组分的特定结合位点。在细胞内加工过程中，全长的人FⅧ(hFⅧ)蛋白在多个位点发生蛋白水解，产生2条多肽链，即分子量约为90-200kDa的重链(A1-A2-B)和分子量约为80kDa的轻链(A3-C1-C2)。2条链通过金属依赖性的非共价结合作用形成二聚体。在血液中与血管性血友病因子(vonWillebrandFactor，vWF)结合形成FⅧ/vWF复合物。经过活化后FVIII参与凝血级联反应。
目前，凝血因子VIII的纯化工艺普遍存在工艺复杂、成本高、纯度低的问题(Stefan Winge等,Protein Expression and Purification,2015,115:165-175)。现行的大多数工艺均采用了针对凝血因子VIII表位的抗体配基亲和层析，例如GE公司开发出新型纯化填料VIII select，填料成本较高，亲和配基的安全性也许进一步考察。蛋白A亲和层析广泛应用于单抗药物的生产，但其洗脱条件往往是强酸性缓冲液，凝血因子VIII在此条件下往往会损失大部分的生物学活性。因此，本领域亟待开发一种安全可靠、高效便捷、成本低廉且适于工业应用的纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的新方法。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
取含重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的发酵液依次进行亲和层析、疏水层析和阴离子交换层析，收集阴离子交换层析液，即得。
进一步地，所述发酵液是经澄清过滤和/或S/D病毒灭活后的发酵液。
进一步地，所述亲和层析的步骤包括：
取发酵液上样于以蛋白A亲和介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体，加Tris至pH 6.9-7.1，得亲和层析液；
所述淋洗液淋洗三次，第一次淋洗的淋洗液是由10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％ PS80组成的pH 6.6-7.8的水溶液，第二次淋洗的淋洗液是由20mM L-His-HCl,20mM CaCl2,100-400mM NaCl,0.02％PS80组成的pH4.9-6.1的水溶液，第三次淋洗的淋洗液是由10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％ PS80组成的pH 6.6～7.8的水溶液；每次淋洗5个柱体积。
更进一步地，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％PS80组成的pH 6.6-7.8的水溶液；
和/或，所述层析柱的载量不超过60000IU/ml填料，且发酵液保留时间不低于5min；
和/或：所述蛋白A亲和介质选自AT ProteinADiamond Plus、Nmab Pro、PraestoJetted A50、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX中的一种。
更进一步地，所述洗脱缓冲液是由10-30mM L-His-HCl，10-30mM CaCl2,200-800mM L-Arg，100-300mM NaCl,以及0.01％-0.05％ PS80或PS20组成的pH 4.0-4.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.025AU/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.100AU/mm结束收集。
进一步地，所述疏水层析的步骤包括：
取亲和层析时收集的亲和层析液，上样于以丁基疏水层析介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体，得疏水层析液；
所述淋洗液是由20mM His,20mM CaCl2,1.4M NaCl，0.02％PS80组成的pH 6.4-7.6的水溶液；淋洗5个柱体积。
更进一步地，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由20mM His,20mM CaCl2,1.4M NaCl,0.02％PS80组成的pH 6.4-7.6的水溶液；
和/或，所述层析柱的载量不超过8mg/ml填料，且亲和层析液保留时间不低于6min；
和/或：所述丁基疏水层析介质包括Butyl Bestarose HP、UniHR Butyl 30L中的一种。
更进一步地，所述洗脱缓冲液是由10-30mM His,10-30mM CaCl2,100-300mMNaCl,100-500mM L-Arg,以及0.01％-0.05％ PS80或PS20组成的pH 6.4-7.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.010AU/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.020AU/mm结束收集。
进一步地，所述阴离子交换层析的步骤包括：
取疏水层析时收集的疏水层析液，上样于以季铵盐类强阴离子交换层析介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体；
所述淋洗液淋洗二次，第一次淋洗的淋洗液是由20mM His,20mM CaCl2,50mMNaCl组成的pH 6.4-7.6的水溶液，第二次淋洗的淋洗液是由20mM His,20mM CaCl2,310mMNaCl组成的pH 6.4 -7.6的水溶液；第一次淋洗3个柱体积，第二次淋洗5个柱体积。
更进一步地，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由20mM His,20mM CaCl2,50mM NaCl组成的pH 6.4-7.6的水溶液；
和/或：所述层析柱的载量不超过12mg/ml填料，且疏水层析液保留时间不低于6min；
和/或：所述季铵盐类强阴离子交换层析介质选自Poros XQ、Q Bestarose HP、NanoGel 50Q中的一种。
和/或，所述洗脱缓冲液是由10-30mM His,10-30mM CaCl2,350-800mM NaCl组成的pH 6.4-7.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.025AU/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.025AU/mm结束收集。
本发明的有益效果:
本发明利用层析工艺的优化，通过对亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析淋洗条件、洗脱条件等参数的控制，达到了高效纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的目的。其中，解决了传统的ProteinA亲和层析强酸性洗脱条件造成重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白生物学活性不可逆地丧失的问题。利用本发明三步层析法纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白具有收率高，质量佳的特点。三步层析法纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白500L生物反应器发酵规模，NP8F04批原液收率687IU/g上清重量，HCD＜0.2pg/1000IU,HCP＜128ng/mg，SEC纯度达99.7％。
本发明方法是一种收率高，质量佳，工艺可靠的重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法，具有非常好的产业化推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为亲和层析图谱。
图2为疏水层析图谱。
图3为阴离子交换层析图谱。
图4为三步层析法制得原液SEC-HPLC检测结果。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得,其中涉及到的PS80是聚山梨酯80(又名吐温80)，PS20是聚山梨酯20(又名吐温20)；
本发明涉及到的含重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的发酵液是按照专利ZL202111620095.3“一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法”公开的方法由3L生物反应器发酵制得。
重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
注：下划线标记区域是A1，下划线/>标记区域是A2，下划线/>标记区域是A3，下划线/>标记区域是C1，下划线/>标记区域是C2。方框内区域为Fc片段。氨基酸序列不含信号台肽。
人凝血因子VIII活性由COAMATIC Factor Ⅷ试剂盒(购自Chromogenix公司)或APTT法进行测定。
实施例1、亲和层析纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白
重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白由3L生物反应器发酵制得，发酵液经深层过滤后用于蛋白A亲和介质(Nmab Pro介质)层析，通过此步层析，可有效去除培养基成分、培养过程添加物、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸等杂质，可高特异性地处理上清液，获得相对高纯度的目的蛋白。首先使用平衡缓冲液：10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％PS80,pH 6.6-7.8平衡层析柱5个柱体积(CV)。将上清液上样到平衡后的层析柱中，载量不超过60000IU/ml填料，并保证保留时间不低于5min。上样完毕后，第一次淋洗：使用淋洗液10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％ PS80,pH 6.6-7.8淋洗层析柱5个柱体积(CV)；第二次淋洗：使用淋洗液20mM L-His-HCl,20mM CaCl2,100-400mM NaCl,0.02％PS80,pH 4.9-6.1淋洗层析柱5个柱体积(CV)；第三次淋洗：使用淋洗液10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％ PS80,pH 6.6-7.8淋洗层析柱5个柱体积(CV)。使用洗脱缓冲液：10-30mM L-His-HCl,10-30mM CaCl2,200-800mM L-Arg,100-300mM NaCl,0.01％-0.05％ PS80或PS20,pH 4.0-4.6。紫外吸光值≥0.025AU/mm时开始收集目的蛋白，过封顶后，当紫外吸光值≥0.100AU/mm结束收集目的蛋白。洗脱后立即用1M Tris中和至pH 6.9-7.1。检测样品活性收率达70.68％。层析图谱见图1。
实施例2、疏水层析纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白
实施例1中亲和层析洗脱后的样品采用丁基疏水层析介质(UniHR Butyl 30L)介质结合模式进行样品精纯，通过此步层析，可去除大部分工艺相关杂质如HCP、HCD、Fc片段和聚集体。首先使用平衡缓冲液：20mM His,20mM CaCl2,1.4M NaCl,0.02％PS80,pH 6.4-7.6平衡层析柱5个柱体积(CV)。将上清液上样到平衡后的层析柱中，载量不超过8mg/ml填料，并保证保留时间不低于6min。上样完毕后，淋洗：使用淋洗液20mM His,20mM CaCl2,1.4M NaCl,0.02％PS80,pH 6.4-7.6淋洗层析柱5个柱体积(CV)。使用洗脱缓冲液：10-30mMHis,10-30mM CaCl2,100-300mM NaCl,100-500mM L-Arg,0.01％-0.05％ PS80或PS20,pH6.4-7.6。紫外吸光值≥0.010AU/mm时开始收集目的蛋白，过封顶后，当紫外吸光值≥0.020AU/mm结束收集目的蛋白。检测样品活性收率达65.29％。层析图谱见图2。
实施例3、阴离子交换层析纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白
重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白由10L生物反应器发酵制得，发酵液经离心过滤、亲和层析。疏水层析后采用季铵盐类强阴离子交换层析介质(Poros XQ)进行样品精纯，通过此步层析，可有效去除低分子量片段、高分子量聚集体以及部分宿主细胞蛋白。首先使用平衡缓冲液：20mM His,20mM CaCl2,50mM NaCl,pH 6.4-7.6平衡层析柱5个柱体积(CV)。将上清液上样到平衡后的层析柱中，载量不超过12mg/ml填料，并保证保留时间不低于6min。上样完毕后，第一次淋洗：使用淋洗液20mM His,20mM CaCl2,50mM NaCl,pH 6.4-7.6，淋洗层析柱3个柱体积(CV)；第二次淋洗：使用淋洗液20mM His,20mM CaCl2,310mMNaCl,pH 6.4-7.6淋洗层析柱5个柱体积(CV)；。使用洗脱缓冲液：10-30mM His,10-30mMCaCl2,350-800mM NaCl pH 6.4-7.6。紫外吸光值≥0.025AU/mm时开始收集目的蛋白，过封顶后，当紫外吸光值≥0.025AU/mm结束收集目的蛋白。检测样品活性收率达62.48％。层析图谱见图3。
实施例4、三步层析法纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白
重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白由500L生物反应器发酵制得。发酵液经深层过滤和S/D病毒灭活后得到的上清液用于后续融合蛋白的分离或纯化。
本实施例采用三步层析法重复了三个批次对重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白进行纯化，分别为亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析，采用GE公司的全自动液相层析系统AKTA Process。
第一步，亲和层析：采用蛋白A亲和介质(Nmab Pro)进行样品捕获。首先使用平衡缓冲液：10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％PS80,pH 6.6-7.8平衡层析柱5个柱体积(CV)。将上清液上样到平衡后的层析柱中，载量不超过60000IU/ml填料，并保证保留时间不低于5min。上样完毕后，第一次淋洗：使用淋洗液10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mMNaCl,0.02％ PS80,pH 6.6-7.8淋洗层析柱5个柱体积(CV)；第二次淋洗：使用淋洗液20mML-His-HCl,20mM CaCl2,100-400mM NaCl,0.02％ PS80,pH 4.9-6.1淋洗层析柱5个柱体积(CV)；第三次淋洗：使用淋洗液10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％ PS80,pH6.6-7.8淋洗层析柱5个柱体积(CV)。使用洗脱缓冲液：10-30mM L-His-HCl,10-30mMCaCl2,200-800mM L-Arg,100-300mM NaCl,0.01％-0.05％ PS80或PS20,pH 4.0-4.6。紫外吸光值≥0.025AU/mm时开始收集目的蛋白，过封顶后，当紫外吸光值≥0.100AU/mm结束收集目的蛋白。洗脱后立即用1M Tris中和至pH 6.9-7.1。三批检测样品活性收率达60％以上，SEC纯度达54％以上，一致性良好。
第二步，疏水层析：采用丁基疏水层析介质(UniHR Butyl 30L)结合模式进行样品精纯。首先使用平衡缓冲液：20mM His,20mM CaCl2,1.4M NaCl,0.02％PS80,pH 6.4-7.6平衡层析柱5个柱体积(CV)。将上清液上样到平衡后的层析柱中，载量不超过8mg/ml填料，并保证保留时间不低于6min。上样完毕后，淋洗：使用淋洗液20mM His,20mM CaCl2,1.4MNaCl,0.02％PS80,pH 6.4-7.6淋洗层析柱5个柱体积(CV)。使用洗脱缓冲液：10-30mM His,10-30mM CaCl2,100-300mM NaCl,100-500mM L-Arg,0.01％-0.05％ PS80或PS20,pH 6.4-7.6。紫外吸光值≥0.010AU/mm时开始收集目的蛋白，过封顶后，当紫外吸光值≥0.020AU/mm结束收集目的蛋白。三批检测样品活性收率达73％以上，SEC纯度达90％以上，一致性良好。
第三步，阴离子交换层析：采用季铵盐类强阴离子交换层析介质(Poros XQ)进行样品精纯。首先使用平衡缓冲液：20mM His,20mM CaCl2,50mM NaCl,pH 6.4-7.6平衡层析柱5个柱体积(CV)。将上清液上样到平衡后的层析柱中，载量不超过12mg/ml填料，并保证二者接触时间不低于6min。上样完毕后，第一次淋洗：使用淋洗液20mM His,20mM CaCl2,50mMNaCl,pH 6.4-7.6，淋洗层析柱3个柱体积(CV)；第二次淋洗：使用淋洗液20mM His,20mMCaCl2,310mM NaCl,pH 6.4-7.6淋洗层析柱5个柱体积(CV)；。使用洗脱缓冲液：10-30mMHis,10-30mM CaCl2,350-800mM NaCl pH 6.4-7.6。紫外吸光值≥0.025AU/mm时开始收集目的蛋白，过封顶后，当紫外吸光值≥0.100AU/mm结束收集目的蛋白。三批检测样品活性收率达75％以上，SEC纯度达96％以上，一致性良好。
三批三步层析法纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白主要指标如下表：
之后，经除病毒过滤、超滤等工艺步骤制得重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白原液。三步层析法纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白NP8F04批原液收率687IU/g上清重量，HCD＜0.2pg/1000IU,HCP＜128ng/mg，SEC纯度达99.7％，见图4。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、亲和层析淋洗条件研究
重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白由500L生物反应器发酵制得。选用ATProteinADiamond Plus(博格隆)作为亲和层析填料，评价有无淋洗步骤2对亲和层析产品收率和质量的影响，如下表：
淋洗2步骤可以有效降低亲和层析工艺洗脱产品HCP残留水平，并且维持较高的活性收率和良好的产品质量。
实验例2、亲和层析洗脱条件研究
重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白由500L生物反应器发酵制得。选用AT ProteinADiamond Plus(博格隆)作为亲和层析填料，洗脱后用1M Tris立即中和至pH 6.9-7.1，评价洗脱pH对亲和层析产品收率和质量的影响，如下表：
传统的ProteinA亲和层析强酸性洗脱条件造成重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白生物学活性不可逆地丧失，无法用于洗脱重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。本专利的洗脱条件能够维持较高的活性收率和良好的产品质量，达到纯化重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的目的。
Claims (10)
1.一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
取含重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的发酵液依次进行亲和层析、疏水层析和阴离子交换层析，收集阴离子交换层析液，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液是经澄清过滤和/或S/D病毒灭活后的发酵液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析的步骤包括：
取发酵液上样于以蛋白A亲和介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体，加Tris至pH 6.9-7.1，得亲和层析液；
所述淋洗液淋洗三次，第一次淋洗的淋洗液是由10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mMNaCl,0.02％PS80组成的pH 6.6-7.8的水溶液，第二次淋洗的淋洗液是由20mM L-His-HCl,20mM CaCl2,100-400mM NaCl,0.02％PS80组成的pH4.9-6.1的水溶液，第三次淋洗的淋洗液是由10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％PS80组成的pH 6.6～7.8的水溶液；每次淋洗5个柱体积。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由10mM L-His-HCl,20mM CaCl2,50mM NaCl,0.02％PS80组成的pH 6.6-7.8的水溶液；
和/或，所述层析柱的载量不超过60000IU/ml填料，且发酵液保留时间不低于5min；
和/或：所述蛋白A亲和介质选自AT ProteinADiamond Plus、Nmab Pro、PraestoJetted A50、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX中的一种。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液是由10-30mM L-His-HCl，10-30mM CaCl2,200-800mM L-Arg，100-300mM NaCl,以及0.01％-0.05％PS80或PS20组成的pH 4.0-4.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.025AU/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.100AU/mm结束收集。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疏水层析的步骤包括：
取亲和层析时收集的亲和层析液，上样于以丁基疏水层析介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体，得疏水层析液；
所述淋洗液是由20mM His,20mM CaCl2,1.4M NaCl，0.02％PS80组成的pH 6.4-7.6的水溶液；淋洗5个柱体积。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由20mM His,20mM CaCl2,1.4M NaCl,0.02％PS80组成的pH6.4-7.6的水溶液；
和/或，所述层析柱的载量不超过8mg/ml填料，且亲和层析液保留时间不低于6min；
和/或：所述丁基疏水层析介质包括Butyl Bestarose HP、UniHR Butyl 30L中的一种。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液是由10-30mM His,10-30mMCaCl2,100-300mM NaCl,100-500mM L-Arg,以及0.01％-0.05％PS80或PS20组成的pH 6.4-7.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.010AU/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.020AU/mm结束收集。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的步骤包括：
取疏水层析时收集的疏水层析液，上样于以季铵盐类强阴离子交换层析介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体；
所述淋洗液淋洗二次，第一次淋洗的淋洗液是由20mM His,20mM CaCl2,50mM NaCl组成的pH 6.4-7.6的水溶液，第二次淋洗的淋洗液是由20mM His,20mM CaCl2,310mM NaCl组成的pH 6.4-7.6的水溶液；第一次淋洗3个柱体积，第二次淋洗5个柱体积。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由20mM His,20mM CaCl2,50mM NaCl组成的pH 6.4-7.6的水溶液；
和/或：所述层析柱的载量不超过12mg/ml填料，且疏水层析液保留时间不低于6min；
和/或：所述季铵盐类强阴离子交换层析介质选自Poros XQ、Q BestaroseHP、NanoGel50Q中的一种。
和/或，所述洗脱缓冲液是由10-30mM His,10-30mM CaCl2,350-800mM NaCl组成的pH6.4-7.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.025AU/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.025AU/mm结束收集。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311795785.1A CN117777310A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311795785.1A CN117777310A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117777310A true CN117777310A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90387641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311795785.1A Pending CN117777310A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117777310A (zh) |
-
2023
- 2023-12-25 CN CN202311795785.1A patent/CN117777310A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5259951A (en) | Process for the purification of factor VIII and factor VIII obtained by said process | |
| US5872099A (en) | High molecular and low molecular fractions of von Willebrand Factor | |
| JP2930243B2 (ja) | 低温殺菌され精製されたフオン・ビルブラント因子濃縮物およびその調製方法 | |
| CZ287186B6 (en) | Process for preparing concentrate free of aggregation of immunoglobulins G | |
| TW201425331A (zh) | 高純度及優良產量之正確折疊之恩博（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ） | |
| EP0469985B1 (en) | Process for manufacturing von Willebrand factor having a very high purity | |
| US4164495A (en) | Method of recovering immunoglobulin using a polyol and an alkanoic acid | |
| US6579723B1 (en) | Method of recovering highly purified vWF or factor VIII/vWF-complex | |
| US4670544A (en) | Process for the manufacture of the cold insoluble globulin and pharmaceutical preparation containing it | |
| EP0148843B1 (en) | A concentrate of the antihemophilic factor viii and a process for producing it | |
| US4534906A (en) | Removal of impurities from human leukocyte interferon preparations | |
| EP0651770A1 (en) | Antihemophilic factor stabilization | |
| EP0032655B2 (en) | A process in purification and concentration of the factor viii-complex | |
| CN103153333A (zh) | 补体因子h的纯化方法 | |
| AU635535B2 (en) | Gel filtration of heat treated factor viii | |
| RU2157240C2 (ru) | Способ получения иммуноглобулинов из фракций, которые образуются при фракционировании человеческой плазмы крови | |
| KR101080622B1 (ko) | Ｖｉｉｉ:ｃ 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물 및 이의 제조방법 | |
| USRE31268E (en) | Method of recovering immunoglobulin using a polyol and an alkanoic acid | |
| CN117777310A (zh) | 一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法 | |
| EP0328132B1 (en) | Therapeutic agent for thrombocytopenia | |
| Middleton | Polyelectrolytes and preparation of factor VIIIC | |
| US5177191A (en) | Gel filtration of factor VIII | |
| EP0321835B1 (en) | Gel filteration of factor VIII | |
| JPH09502728A (ja) | α▲下１▼−酸性糖タンパク質の精製方法及び精製物 | |
| Smith et al. | Advances in Plasma Fractionation and in the Production of Factor VIII Concentrates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |