CN117771175B

CN117771175B - 一种恩诺沙星纳米混悬剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN117771175B
Application number: CN202410199233.2A
Authority: CN
Inventors: 王琰; 李兴业
Original assignee: Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Current assignee: Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Filing date: 2024-02-23
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2044-02-23

Abstract

本发明涉及兽药技术领域，提供了一种恩诺沙星纳米混悬剂及其制备方法和应用。本发明将壳寡糖、柠檬醛和醇水混合溶剂混合进行缩合反应，得到壳寡糖‑柠檬醛衍生物；将壳寡糖‑柠檬醛衍生物、恩诺沙星、粘合剂、助悬剂和水混合进行剪切，得到初级混悬剂；将初级混悬剂进行均质，得到恩诺沙星纳米混悬剂。本发明采用壳寡糖‑柠檬醛衍生物为壳材对恩诺沙星进行包被，所得纳米混悬剂掩味效果好，性质稳定，且具有缓控释放特性，能够有效解决动物采食量下降的问题，保证动物体内的有效杀菌浓度，促进恩诺沙星的临床应用。

Description

一种恩诺沙星纳米混悬剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽药技术领域，尤其涉及一种恩诺沙星纳米混悬剂及其制备方法和应用。

背景技术

恩诺沙星是世界上第一个动物专用的氟喹诺酮类药物，属于氟喹诺酮类合成抗菌剂，是一种广泛采用的广谱抗生素，在预防和治疗动物细菌性疾病和支原体感染方面有良好的效果。恩诺沙星抗菌机制是抑制细菌DNA促旋酶和拓扑异构酶IV，终止细菌DNA复制、转录、修复和细菌细胞壁的染色体分裂，从而阻断细菌DNA复制，达到抑菌目的。

恩诺沙星具有抗菌杀菌作用迅速，口服吸收和组织分布极好，毒副作用小，血药浓度稳定的优点，但是由于水溶性差、味苦、刺激性大、易分解，使动物采食量严重下降，导致了动物体内达不到有效的杀菌浓度而使药物失效，长期使用可能产生耐药性增强的作用，所以大大限制了在兽医临床上的应用。

目前，常用的恩诺沙星制剂主要有注射液剂、混悬剂和片剂等，而传统的混悬剂直接将恩诺沙星与辅料和水混合，药物颗粒大，掩味效果差，稳定性差。现有技术中还有将恩诺沙星制成纳米混悬剂的报道，例如中国专利CN106265504A中提供了一种恩诺沙星纳米混悬剂，由恩诺沙星和稳定剂制备而成，该专利虽然得到了纳米胶体分散体，但是该体系不是包被结构，掩味效果较差，仍然无法解决动物采食量下降，导致动物体内达不到有效杀菌浓度的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种恩诺沙星纳米混悬剂及其制备方法和应用。本发明提供的恩诺沙星纳米混悬剂掩味效果佳，稳定性好，具有缓控释放特性，能够有效解决动物采食量下降的问题，保证动物体内的有效杀菌浓度，促进恩诺沙星的临床应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种恩诺沙星纳米混悬剂的制备方法，包括以下步骤：

将壳寡糖、柠檬醛和醇水混合溶剂混合进行缩合反应，得到壳寡糖-柠檬醛衍生物；

将所述壳寡糖-柠檬醛衍生物、恩诺沙星、粘合剂、助悬剂和水混合进行剪切，得到初级混悬剂；

将所述初级混悬剂进行均质，得到所述恩诺沙星纳米混悬剂。

优选的，所述壳寡糖的分子量为500~3200，聚合度为3~20；所述壳寡糖和柠檬醛的质量比为1:0.1~1。

优选的，所述醇水混合溶剂中的醇包括甲醇、乙醇和丁醇中的一种或多种；所述醇水混合溶剂中醇和水的体积比为1:0.1~10。

优选的，所述缩合反应的温度为0~80℃，时间为1~24h。

优选的，所述粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和泊洛沙姆中的一种或多种；所述助悬剂包括聚乙二醇、乙二醇和甘油中一种或多种；

优选的，所述壳寡糖-柠檬醛衍生物和恩诺沙星的质量比为1:0.1~1；所述壳寡糖-柠檬醛衍生物、粘合剂和助悬剂的质量比为1:0.01~0.5:0.01~0.5。

优选的，所述剪切的转速为1000~3000转/分钟；所述剪切的时间为10~100min。

优选的，所述均质的压力为100~1500bar，所述均质的循环次数为1~3次，每次的均质时间为1~60min。

本发明还提供了上述方案所述制备方法制备的恩诺沙星纳米混悬剂。

本发明还提供了上述方案所述的恩诺沙星纳米混悬剂在制备兽用抗菌药物中的应用。

本发明提供了一种恩诺沙星纳米混悬剂的制备方法，包括以下步骤：将壳寡糖、柠檬醛和醇水混合溶剂混合进行缩合反应，得到壳寡糖-柠檬醛衍生物；将所述壳寡糖-柠檬醛衍生物、恩诺沙星、粘合剂、助悬剂和水混合进行剪切，得到初级混悬剂；将所述初级混悬剂进行均质，得到所述恩诺沙星纳米混悬剂。本发明将壳寡糖和柠檬醛进行缩合反应，利用柠檬醛对壳寡糖进行功能化，得到一种两亲性聚合物（即壳寡糖-柠檬醛衍生物），利用该两亲性聚合物作为壳材，在粘合剂和助悬剂的作用下，两亲性聚合物壳材与恩诺沙星发生自组装，形成包被结构，将恩诺沙星包覆在内部，最后通过均质得到均一、稳定的纳米混悬剂。本发明制备的恩诺沙星纳米混悬剂具有包被结构，掩味效果好，性质稳定，且具有缓控释放特性。实施例结果表明，本发明制备的纳米混悬剂在口腔环境（中性环境）下的恩诺沙星释放率仅为6%，而当进入胃的酸性环境时，药物能够迅速释放，达到治疗的目的；并且，通过对家禽饮水速率的测试结果表明，添加本发明的恩诺沙星纳米混悬剂和添加市售恩诺沙星可溶性粉相比，家禽的饮水量大幅上升，几乎与清水的饮水量相当。综上所述，本发明能够有效解决动物采食量下降的问题，保证动物体内的有效杀菌浓度，促进恩诺沙星的临床应用。

附图说明

图1为实施例1制备的壳寡糖-柠檬醛衍生物的核磁氢谱图；

图2为实施例1制备的壳寡糖-柠檬醛衍生物的红外谱图；

图3为实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂干燥所得纳米颗粒的扫描电镜图；

图4为实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂的水合粒径（左）以及PDI（右）测试结果；

图5为实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂在不同pH值的PBS缓冲液中的释放性能测试结果。

具体实施方式

本发明提供了一种恩诺沙星纳米混悬剂的制备方法，包括以下步骤：

本发明将壳寡糖、柠檬醛和醇水混合溶剂混合进行缩合反应，得到壳寡糖-柠檬醛衍生物。在本发明中，所述壳寡糖的分子量优选为500~3200，更优选为1000~3200，进一步优选为1600或3200，所述壳寡糖的聚合度优选为3~20，更优选为10~20；所述壳寡糖和柠檬醛的质量比优选为1:0.1~1，更优选为1:0.1~0.3。

在本发明中，所述醇水混合溶剂中的醇优选包括甲醇、乙醇和丁醇中的一种或多种；所述醇水混合溶剂中醇和水的体积比优选为1:0.1~10，更优选为1:0.3~1，在本发明的具体实施例中，所述醇水混合溶剂更优选为乙醇水混合溶剂，进一步优选为体积分数为60%的乙醇水溶液；所述壳寡糖和醇水混合溶剂的质量体积比优选为1g:1~100mL，更优选为1g:1~20mL。

在本发明中，所述缩合反应的温度优选为0~80℃，时间优选为1~24h；所述缩合反应优选在搅拌条件下进行；缩合反应完成后，本发明优选将所得反应液中的溶剂旋蒸去除，得到壳寡糖-柠檬醛衍生物。

得到壳寡糖-柠檬醛衍生物后，本发明将所述壳寡糖-柠檬醛衍生物、恩诺沙星、助悬剂、粘合剂和水混合进行剪切，得到初级混悬剂。在本发明中，所述壳寡糖-柠檬醛衍生物和恩诺沙星的质量比优选为1:0.01~1，更优选为1:0.01~0.5；所述壳寡糖-柠檬醛衍生物、粘合剂和助悬剂的质量比优选为1:0.01~0.5:0.01~0.5，更优选为1:0.01~0.05:0.01~0.05，进一步优选为2:0.5:1、10:1:0.5或15:1:0.5；所述粘合剂优选包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和泊洛沙姆中的一种或多种；所述聚乙烯吡咯烷酮优选为聚乙烯吡咯烷酮K30（PVPK30），所述聚乙烯醇优选为PVA1788，所述泊洛沙姆优选为泊洛沙姆407和/或泊洛沙姆188；所述助悬剂优选包括聚乙二醇、乙二醇、甘油中一种或多种，所述聚乙二醇优选为PEG200和/或PEG400；所述壳寡糖-柠檬醛衍生物和水的质量比优选为2~15:78~96，更优选为2:95.5、10:83.5或15:78.5；在本发明中，所述壳寡糖-柠檬醛衍生物为一种两亲性聚合物，作为壳材使用。

在本发明中，所述剪切的转速优选为1000~3000转/分钟，更优选为2000转/分钟；所述剪切的时间优选为10~100min，更优选为10~50min；所述剪切过程中，壳寡糖-柠檬醛衍生物和恩诺沙星发生自组装，形成包被物，所述恩诺沙星被壳寡糖-柠檬醛衍生物包覆在内部。

得到初级混悬剂后，本发明将所述初级混悬剂进行均质，得到所述恩诺沙星纳米混悬剂。在本发明中，所述均质的压力优选为100~1500bar，更优选为400~700bar，所述均质的循环次数优选为1~3次，更优选为2~3次，每次的均质时间优选为1~60min，更优选为10~50min；所述均质优选在高压均质机中进行。

本发明还提供了上述方案所述制备方法制备的恩诺沙星纳米混悬剂；所述恩诺沙星混悬剂中包括恩诺沙星包被纳米颗粒、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和水，其中恩诺沙星包被纳米颗粒包括恩诺沙星和包被在所述恩诺沙星表面的壳寡糖-柠檬醛衍生物；所述恩诺沙星纳米混悬剂中恩诺沙星的质量分数优选为1%~10%。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

（1）称取10 g壳寡糖（分子量为1600，聚合度为10）和2 g柠檬醛，溶于100 mL体积比为60%的乙醇水溶液中，60℃条件下搅拌12h后，旋蒸除去溶剂，形成壳寡糖-柠檬醛衍生物11 g；

（2）将2g上述壳寡糖-柠檬醛衍生物，1 g恩诺沙星，0.5 g泊洛沙姆407，1 gPEG400加入95.5 g水中，2000转/分钟的转速下下剪切10 min，得到初级悬浮液；

（3）将所得初纳米混悬剂至于高压均质机中，在400 bar压力下，循环均质3次，每次均质的时间为10 min，得到恩诺沙星纳米混悬剂。

实施例2

（1）称取10 g壳寡糖（分子量为3200，聚合度为20）和2 g柠檬醛，溶于100 mL体积比为60%的乙醇水溶液中，60℃条件下搅拌12h后，旋蒸除去溶剂，形成壳寡糖-柠檬醛衍生物11 g；

（2）将10 g壳寡糖-柠檬醛衍生物，5 g恩诺沙星，1 g PVPK30，0.5 g PEG400加入83.5 g水中，2000转/分钟的转速下下剪切10 min，得到初级悬浮液；

（3）将所得初纳米混悬剂至于高压均质机中，在700 bar压力下，循环均质3次，每次均质的时间为10 min，得到恩诺沙星纳米混悬剂。

实施例3

（1）称取10 g壳寡糖（分子量为3200，聚合度为20）和5 g柠檬醛，溶于体积比为60%的100 mL的乙醇中，60℃条件下搅拌12h后，旋蒸除去溶剂，形成壳寡糖-柠檬醛衍生物15g；

（2）将15 g上述壳寡糖-柠檬醛衍生物，7 g恩诺沙星，1 g PVA1788，0.5 g甘油加入78.5 g水中，2000转/分钟的转速下下剪切10 min，得到初级悬浮液；

性能测试：

1、表征

图1为实施例1制备的壳寡糖-柠檬醛衍生物的核磁氢谱图，图1中：壳寡糖核磁化学位移：δ=3.00-4.00 ppm为糖环上-CH-与6位C上质子的化学位；柠檬醛核磁化学位移：δ=1.57、1.64、2.22 ppm为柠檬醛CH₃上质子的化学位移，δ=9.88为醛基-CHO上的质子位移；壳寡糖-柠檬醛衍生物核磁化学位移：δ=1.58、1.64、2.13 ppm为柠檬醛官能团上CH₃上质子的化学位移，δ=3.00-4.00 ppm为糖环上-CH-与6位C上质子的化学位，同时柠檬醛中醛基质子氢信号消失，说明亚胺衍生物的生成。

图2为实施例1制备的壳寡糖-柠檬醛衍生物的红外谱图。在柠檬醛的红外光谱中，2856 cm^-1可归属为醛基上的C-H伸缩振动，1670 cm^-1可归属为C=O的伸缩振动峰。在壳寡糖的红外光谱图中，3400 cm^-1处的特征吸收峰为-OH和-NH₂伸缩振动的叠加吸收峰；2878 cm^-1处的峰为残留乙酰基中-CH₃和-CH₂的C-H的伸缩振动；1620、1510和1377 cm^-1处的吸收峰分别为COS残留N-乙酰基中C=O的伸缩振动；壳寡糖-柠檬醛衍生物在1670 cm^-1处的吸收峰消失，而新出现1630 cm^-1峰，归属为为C=N键的伸缩振动；红外结果分析表明柠檬醛与壳寡糖发生了缩合反应。

图3为实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂干燥（100倍水稀释液滴加到硅片后自然挥干）所得纳米颗粒的扫描电镜图，扫描电镜结果表明，纳米颗粒的粒径为172±0.5 nm，PDI为0.11。

对实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂的水合粒径进行测试，测试结果如图4所示，图4中的结果显示恩诺沙星纳米混悬剂的水合粒径为173.7 ± 1.8 nm，PDI为0.18；此外，实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂稀释10倍后可悬浮稳定维持12h以上，说明其具有良好的稳定性。

2、纳米混悬剂的缓控释放特性测试

测试实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂在不同pH值（pH值为2、5、6或7.4）的PBS缓冲液中的释放性能，具体实验方法如下：取100mg实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂分散在含有pH=2、5、6、7.4的PBS缓冲溶液的100mL容量瓶中，并搅拌24小时，12000rpm离心30min后，用紫外可见分光光度计在335nm处测量上清液的吸光度强度，计算实际恩诺沙星含量（根据吸光度强度与盐酸恩诺沙星浓度在pH=2、5、6、7.4的PBS缓冲溶液中的线性关系计算得到的）。

测试结果如图5所示。根据图5可以看出，恩诺沙星在前200 min内释放较快，给药后体内血药浓度可迅速达到治疗浓度。但200 min后药物释放速率逐渐下降，并在接下来的10小时内继续缓慢释放。说明达到治疗浓度后，可以持续缓慢补充因代谢而损失的血药浓度，从而延长药物治疗时间，避免多次给药的最后期限。同时，本发明研究了纳米混悬剂在不同pH下的释放特性。pH=7.4、6、5、2时，10小时累积释放率分别是48.7%，88.3%，97.0%，99.0%，当纳米混悬剂口服时，由于口腔为中性环境，恩诺沙星的释放率在10分钟内释放仅为6%，阻止了恩诺沙星对味蕾的刺激，当进入胃的酸性（pH值范围1~3）环境时，十分钟内药物迅速释放达到70.7%（pH=2），达到及时治疗的目的。

3、体外抑菌性能评估

测试方法如下：使用MHB培养基将药物母液倍比稀释成浓度梯度，以100 μL/孔依次加入96孔U型板的前10列孔中。使用MHB培养基稀释检测菌株浓度约为1.5×10⁶ CFU/mL，100 μL/孔加入已加入药物的孔中。11列孔加入100 μL/孔的MHB培养基为阴性对照，第12列孔加入100 μL/孔的菌液为阳性对照。置于37℃培养18h后，观察读取结果，MIC值为肉眼观察下孔中无明显菌落生长对应的最小浓度，每一试验孔设置一个重复；其中采用的恩诺杀星标准品为中国兽医药品监察所对照品（99.7%），恩诺沙星纳米混悬剂为实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂。

测试结果如表1所示。

表1 体外抑菌测试结果

根据表1中的数据可以看出，本发明制备的恩诺沙星纳米混悬剂和恩诺沙星标准品相比，具有更好的抑菌效果。

采用相同的方法，对实施例2~实施例3制备的恩诺沙星纳米混悬剂进行缓控释放特性测试和体外抑菌性能评估，所得结果和实施例1相似，说明其均具有优异的缓控释放特性测试和体外抑菌性能。

4、饮水给药对家禽饮水速率影响

试验地点：河北省石家庄市某鸡场。

试验方法：（1）选择10000只20天肉鸡鸡舍9间；（2）实验组和对照组均按0.5 g/L药量混饮各备250 kg，另备清水对照组250kg，饮水前一个小时禁水，三小时后统计各鸡舍饮水量；（3）连续3天再重复上述试验，饮水量取平均值。测试结果见表2，表2中的恩诺沙星纳米混悬剂为实施例1制备的恩诺沙星纳米混悬剂。

表2 动物饲喂试验饮水量比较结果

组别采食量	市售某恩诺沙星可溶性粉	恩诺沙星纳米混悬剂	清水
				第1天	190（-6%）	203（1%）	201
第2天	174（17%）	201（-4%）	210
				第3天	142（-33%）	198（-6%）	211

注：表2中括号内为与清水对照饮水量减少的百分比。

根据表2中的测试结果可以看出，添加本发明的恩诺沙星纳米混悬剂的实验组和添加市售恩诺沙星可溶性粉的实验组相比，家禽的饮水量明显增加，并且和清水组的饮水量几乎相当，说明本发明的恩诺沙星纳米混悬剂具有良好的掩味效果，能够保证动物的进食量。

采用相同的方法，对实施例2~实施例3制备的恩诺沙星纳米混悬剂进行动物饲喂试验，结果表明动物饮水量均和清水组相当，能够保证动物的进食量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种恩诺沙星纳米混悬剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将壳寡糖、柠檬醛和醇水混合溶剂混合进行缩合反应，反应完成后将溶剂旋蒸去除，得到壳寡糖-柠檬醛衍生物；所述醇水混合溶剂中的醇为甲醇、乙醇和丁醇中的一种或多种；所述醇水混合溶剂中醇和水的体积比为1:0.1~10；

将所述初级混悬剂进行均质，得到所述恩诺沙星纳米混悬剂；

所述壳寡糖的分子量为500~3200，聚合度为3~20；

所述粘合剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和泊洛沙姆中的一种或多种；所述助悬剂为聚乙二醇、乙二醇和甘油中一种或多种；所述壳寡糖-柠檬醛衍生物和恩诺沙星的质量比为1:0.1~1；所述壳寡糖-柠檬醛衍生物、粘合剂和助悬剂的质量比为1:0.01~0.5:0.01~0.5；所述壳寡糖-柠檬醛衍生物和水的质量比为2~15:78~96。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述壳寡糖和柠檬醛的质量比为1:0.1~1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缩合反应的温度为0~80℃，时间为1~24h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述剪切的转速为1000~3000转/分钟；所述剪切的时间为10~100min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述均质的压力为100~1500bar，所述均质的循环次数为1~3次，每次的均质时间为1~60min。

6.权利要求1~5任意一项所述制备方法制备的恩诺沙星纳米混悬剂。

7.权利要求6所述的恩诺沙星纳米混悬剂在制备兽用抗菌药物中的应用。