CN117761227A - 用于过程色谱法中的故障模式检测的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了可用于实时预测或检测色谱过程中的故障的系统和方法。在一些实施例中，本公开提供了用于检测生物产品的离子交换色谱法中的过程色谱图中的非典型曲线的系统和方法。

Description

用于过程色谱法中的故障模式检测的系统和方法
相关申请
本申请要求于2018年2月15日提交的USSN 62/631,167的权益，所述文献的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及用于生物产品的纯化方法，包含实时检测色谱过程中的错误。
背景技术
在蛋白质色谱操作中成功地及时标识故障模式可能具有挑战性，这不仅是因为故障模式特定于与程序相关联的每个单元操作，而且还因为自动检测方法不容易获得。对于大规模制造来说尤其如此。因此，长期以来，一直需要一种在过程中进行可扩展的故障模式检测的系统和方法，但这种需要尚未得到满足。本公开提供了这种新颖系统和方法来解决这种需要。
发明内容
本公开提供了用于以自动化或半自动化的方式监测过程色谱图的系统和方法。在本公开的方法的一些实施例中，将积分体积窗内的测得的吸光强度与根据至少一个参考色谱图推断的最大吸光强度进行比较，此测得的吸光强度用于标识色谱基质的不稳定性，并且通过预测和/或标识即将发生的故障，所述方法在任何规模上提高过程性能。因此，本公开提供了用于色谱过程中的故障模式检测的方法和装置。
本公开提供了一种用于预测或检测色谱过程中的故障的方法，所述方法包括：(a)由色谱柱生成参考色谱图；(b)由所述色谱柱生成过程色谱图；以及(c)检测所述过程色谱图中的非典型曲线，其中所述非典型曲线指示色谱过程的潜在故障或实际故障。
在本公开的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括(d)生成警告信号。
在本公开的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括(e)重新装填所述色谱柱。
在本公开的方法的一些实施例中，所述色谱柱适用于离子交换色谱法。
在本公开的方法的一些实施例中，所述色谱柱适用于亲和色谱法。
在本公开的方法的一些实施例中，所述色谱柱适用于疏水相互作用色谱法。
在本公开的方法的一些实施例中，所述色谱过程的所述潜在故障或所述实际故障是由柱劣化引起的。在一些实施例中，所述柱劣化包括柱床破裂。
在本公开的方法的一些实施例中，当与所述参考色谱图上的相当的位置相比时，所述非典型曲线包括所述过程色谱图上的另外的峰。在一些实施例中，所述另外的峰在所述色谱过程中的洗涤步骤期间出现。在一些实施例中，所述洗涤步骤先于所述色谱过程中的洗脱步骤。在一些实施例中，所述另外的峰在所述洗涤步骤期间出现并且先于所述色谱过程中的所述洗脱步骤。
在本公开的方法的一些实施例中，包含在当与所述参考色谱图上的相当的位置相比时，所述非典型曲线包括所述过程色谱图上的另外的峰的实施例中，所述另外的峰的量值指示所述色谱过程的所述潜在故障或所述实际故障的严重程度。在一些实施例中，所述另外的峰的量值的增加指示所述色谱过程的所述潜在故障或所述实际故障的所述严重程度的增加。在一些实施例中，所述色谱过程的所述故障引起所述色谱柱的分离能力的损失。
在本公开的方法的一些实施例中，包含在当与所述参考色谱图上的相当的位置相比时，所述非典型曲线包括所述过程色谱图上的另外的峰的实施例中，当与所述参考色谱图上的相当的位置处的峰或凹处相比时，所述非典型曲线包括所述过程色谱图上锐度降低或量值减小的至少一个峰或至少一个凹处。在一些实施例中，所述过程色谱图上锐度降低或量值减小的所述至少一个峰或所述至少一个凹处在所述洗涤步骤期间出现。在一些实施例中，所述过程色谱图上锐度降低或量值减小的所述至少一个峰或所述至少一个凹处在所述洗脱步骤之后出现。
在本公开的方法的一些实施例中，包含在当与所述参考色谱图上的相当的位置相比时，所述非典型曲线包括所述过程色谱图上的另外的峰的实施例中，当与所述参考色谱图上的相当的第一位置处的峰或凹处相比时，所述非典型曲线包括所述过程色谱图上锐度降低或量值减小的第一峰或第一凹处，并且当与所述参考色谱图上的相当的第二位置处的峰或凹处相比时，所述非典型曲线包括所述过程色谱图上锐度降低或量值减小的第二峰或第二凹处。在一些实施例中，所述第一峰或所述第一凹处在所述洗脱步骤之后出现。在一些实施例中，所述第一峰或所述第一凹处对应于在收集步骤开始时出现的凹处。在一些实施例中，所述第二峰或所述第二凹处在所述收集步骤之后出现。在一些实施例中，所述第二峰或所述第二凹处包括带状峰。
在本公开的方法的一些实施例中，所述过程色谱图包括测得的吸光强度、最大吸光强度和积分体积窗。在一些实施例中，所述非典型曲线包括测得的吸光强度，所述测得的吸光强度在积分体积窗期间超过最大吸光强度。在一些实施例中，所述测得的吸光强度是在对应于紫外(UV)光的波长下确定的。在一些实施例中，所述测得的吸光强度是在介于260纳米(nm)与280nm之间的波长下确定的，所述范围包含端点。在一些实施例中，所述测得的吸光强度是在260nm的波长下确定的，从而提供A260值。在一些实施例中，所述测得的吸光强度是在280nm的波长下确定的，从而提供A280值。在一些实施例中，所述非典型曲线包括测得的吸光强度，所述测得的吸光强度在积分体积窗期间超过最大吸光强度，并且其中所述最大吸光强度的A260值或A280值为至少0.05。在本公开的方法的一些实施例中，所述非典型曲线包括测得的吸光强度，所述测得的吸光强度在积分体积窗期间不超过最大吸光强度，并且其中所述最大吸光强度的A260值或A280值为0.05或更小。
在本公开的方法的一些实施例中，在前一个柱过程的洗脱步骤期间测量非典型曲线和/或典型曲线的吸光强度的值。在一些实施例中，在对应于紫外(UV)光的波长下确定非典型曲线和/或典型曲线的吸光强度的值。在一些实施例中，所述测得的吸光强度是在介于260纳米(nm)与280nm之间的波长下确定的，所述范围包含端点。在一些实施例中，所述测得的吸光强度是在260nm的波长下确定的，从而提供A260值。在一些实施例中，所述测得的吸光强度是在280nm的波长下确定的，从而提供A280值。在一些实施例中，在指示非典型曲线的值之后发送信号，所述信号指示柱劣化。
在本公开的方法的一些实施例中，在前一个柱过程的洗脱步骤期间测量非典型曲线和/或典型曲线的吸光强度的值。在一些实施例中，通过评估洗出液在洗脱步骤期间的pH水平确定非典型曲线和/或典型曲线的吸光强度的值。在一些实施例中，pH指示非典型曲线，因为pH值高于典型曲线的预期值。在一些实施例中，pH指示非典型曲线，因为pH值低于典型曲线的预期值。在一些实施例中，在指示非典型曲线的值之后发送信号，所述信号指示柱劣化。
在本公开的方法的一些实施例中，所述积分体积窗在1L与5,000L之间出现，所述范围包含端点。在本公开的方法的一些实施例中，所述积分体积窗在1000L与3,000L之间出现，所述范围包含端点。在本公开的方法的一些实施例中，所述积分体积窗在1000L与2500L之间出现，所述范围包含端点。在一些实施例中，所述积分体积窗在1250L与2250L之间出现，所述范围包含端点。在一些实施例中，所述积分体积窗在1600L与1800L之间出现，所述范围包含端点。在本公开的方法的一些实施例中，所述积分体积窗在1L、10L、100L、250L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、4000L、5000L或其之间的任意升数的体积上出现。
在本公开的方法的一些实施例中，所述色谱柱包括Q琼脂糖凝胶阴离子交换树脂。
在本公开的方法的一些实施例中，(a)生成所述参考色谱图的所述步骤包括：(1)在足以使包括多种预定分析物的起始组合物的至少一种分析物与基质可逆结合的条件下，使所述起始组合物与包括所述基质的分离组合物接触，以产生分析物结合的柱和第一废物组合物，其中所述色谱柱包括所述分离组合物；(2)使(1)的所述分析物结合的柱与洗涤组合物接触，以产生经过纯化的分析物结合的柱和第二废物组合物，其中仅所述起始组合物的所述至少一种分析物保持与所述基质结合；(3)使(2)的所述经过纯化的分析物结合的柱与洗脱组合物接触，以产生经过洗脱的分析物组合物，其中所述起始组合物的所述至少一种分析物从所述基质释放到所述洗脱组合物中；(4)收集所述经过洗脱的分析物组合物；(5)在进行步骤(1)到(4)中的每个步骤的同时，使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物与紫外(UV)光接触；(6)测量所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物对所述UV光的吸光度，以产生所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物的吸光度值；以及(7)通过将所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物的所述吸光度值绘制为横穿所述色谱柱的液体的体积的函数来生成色谱图。
在本公开的方法的一些实施例中，所述(b)生成所述过程色谱图的所述步骤包括：(1)在足以使包括多种测试分析物的起始组合物的至少一种分析物与基质可逆结合的条件下，使所述起始组合物与包括所述基质的分离组合物接触，以产生分析物结合的柱和第一废物组合物，其中所述色谱柱包括所述分离组合物；(2)使(1)的所述分析物结合的柱与洗涤组合物接触，以产生经过纯化的分析物结合的柱和第二废物组合物，其中仅所述起始组合物的所述至少一种分析物保持与所述基质结合；(3)使(2)的所述经过纯化的分析物结合的柱与洗脱组合物接触，以产生经过洗脱的分析物组合物，其中所述起始组合物的所述至少一种分析物从所述基质释放到所述洗脱组合物中；(4)收集所述经过洗脱的分析物组合物；(5)在进行步骤(1)到(4)中的每个步骤的同时，使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物与紫外(UV)光接触；(6)测量所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物对所述UV光的吸光度，以产生所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物的吸光度值；以及(7)通过将所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物的所述吸光度值绘制为横穿所述色谱柱的液体的体积的函数来生成色谱图。
在本公开的方法的一些实施例中，生成色谱图的步骤(a)或(b)包括接触步骤(5)和测量步骤(6)，并且此外，所述接触步骤(5)和所述测量步骤(6)是连续的。在一些实施例中，所述接触步骤(5)和所述测量步骤(6)是同时的、顺序的或交替的并且是连续的。
在本公开的方法的一些实施例中，所述色谱柱包括基质，并且所述基质包括树脂。
在本公开的方法的一些实施例中，并且特别地，参考生成色谱图的步骤(a)或(b)，测试分析物是生物组合物。在一些实施例中，所述生物组合物是在治疗人受试者的方法中使用的治疗性组合物。在一些实施例中，所述生物组合物包括治疗性蛋白质。
在本公开的方法的一些实施例中，所述警告信号以电子方式传送到处理器，并且所述处理器可操作地连接到所述色谱柱。在一些实施例中，所述处理器接收所述警告信号并中断所述色谱过程或阻止启动进一步的色谱过程，直到解决所述色谱柱的所述潜在故障或所述实际故障。
根据下面的详细描述，本发明的另外的方面和实施例将变得显而易见。
附图说明
图1表示参考色谱图，即，历史标准。
图2表示另一个参考色谱图。
图3表示显示了不规则的洗涤2峰的色谱图。
图4表示显示了不规则的洗涤2峰、不规则的洗脱峰以及带状峰的锐度的损失的色谱图。
图5表示故障色谱图。存在洗涤2峰。
图6表示典型与非典型VEGF-Trap Q色谱图的比较。在洗涤2达到635升时，大部分非典型UV迹线的吸光度≥0.05au。
图7表示另外的非典型VEGF-Trap Q色谱图，即，洗涤2峰实例。
图8表示另外的典型VEGF-Trap Q色谱图。在洗涤2达到635升时，UV迹线的吸光度不超过0.05。
具体实施方式
在蛋白质色谱操作中，尤其是在大规模制造中，成功地及时标识故障模式可能具有挑战性，这不仅是因为故障模式特定于与程序相关联的每个单元操作，而且是因为在缺乏本公开的组合物和方法的情况下，自动检测方法不容易获得。
本公开提供了一种新颖的用于故障模式检测的观察系统和方法。这种新的色谱柱监测的观察系统和方法旨在当柱未执行其预期功能时提示操作员。本公开的观察系统和方法在积分时间自动监测系统信号，以确定柱是否以最佳方式运行。如果系统未能满足验收标准，则会向操作员显示消息，指示操作员将事件添加到质量管理系统中并且为进一步调查和可能的补救留出余地。对于要监测的每个唯一的色谱单元操作，所监测信号、显著信号强度和积分时间窗全都是根据经验确定的。
色谱法
本公开的系统和方法可以用于制备型或分析型色谱法。在一些实施例中，本公开的方法用于纯化可以在用于治疗疾病的组合物中使用的蛋白质。尤其是对于那些涉及用于大规模或大量纯化治疗性蛋白质的制备型色谱法的方法，纯化过程的效率至关重要。本公开的系统和方法可以以任何规模使用。然而，当正在进行大量制备操作并且系统故障(如当分离组合物应捕获有价值的分析物时，色谱柱允许有价值的分析物穿过分离组合物)导致损失有价值的产物和宝贵的生产时间时，本公开的系统和方法特别有用。本公开的系统和方法实时地预测并检测色谱过程中的故障，并且由于已经标识了故障过程而能够恢复功能并在使用故障过程执行另外的工作之前返回到有效且可靠的纯化。
本公开涵盖任何形式的色谱法。作为一种技术，色谱法是从混合物中分离组分的方法。分离通过分配流动相和固定相来实现。本文所描述的包括测试分析物的起始组合物(任选地还用于进行制备)属于流动相。本文所描述的包括基质的分离组合物属于固定相。本公开的示例性基质可以包括能够基于化学性质(电荷)和/或物理性质(尺寸)分离流动相的元素的任何材料。
在本公开的一些实施例中，包含在制备治疗性蛋白质的方法中使用的色谱过程可以包含但不限于柱色谱法和平面色谱法。在一些优选实施例中，色谱过程可以包含但不限于柱色谱法。
柱色谱法
本公开涵盖任何形式的柱色谱法，包含湿法和干法。在干法中，分离组合物包括干燥基质，所述干燥基质随后与液体起始组合物接触，所述液体起始组合物最佳地润湿整个基质，并且直到整个过程结束才允许基质干燥。在湿法中，分离组合物包括基质和洗脱液的悬浮液或浆液，所述悬浮液或浆液引入到柱中并且随后与液体起始组合物接触。
离子交换色谱法
在本公开的一些实施例中，分离组合物可以包括能够基于电荷分离流动相的元素的任何材料。例如，分离组合物可以包括与来自起始组合物的带电蛋白质分析物可逆结合的基质。因此，分离基质可以适用于阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法，并且可以包括分别具有净负电荷或净正电荷的基质。在本公开的一些实施例中，分离组合物包括包含琼脂糖凝胶或Q琼脂糖凝胶的基质。在本公开的一些实施例中，色谱柱是Q柱。
亲和色谱法
在本公开的一些实施例中，分离组合物可以包括能够基于结合配偶体之间的特异性相互作用来分离流动相的元素的任何材料，所述结合配偶体包含但不限于抗原/抗体结合配偶体、酶/底物结合配偶体、受体/配体结合配偶体、蛋白质/蛋白质结合配偶体、蛋白质/核酸结合配偶体和核酸/核酸结合配偶体。例如，分离组合物可以包括基质，所述基质通过包括结合配偶体的一个配偶体(例如，来自起始组合物的分析物)而与结合配偶体的另一个配偶体可逆结合。举例来说，分离组合物可以包括基质，所述基质包括起始组合物的分析物与其特异性结合以从起始材料选择性地纯化抗体分析物的抗原。通过进一步说明，分离组合物可以包括基质，所述基质包括VEGF-Trap与其选择性地结合以从起始材料选择性地纯化VEGF-Trap分析物的VEGF蛋白表位。
疏水相互作用色谱法(HIC)
在本公开的一些实施例中，分离组合物可以包括能够基于移动相的元素的相对疏水性来分离所述元素的任何材料。HIC可以用于选择性地纯化蛋白质分析物，同时由于使用了条件并且使用了在较少变性条件下操作的基质而保持所述蛋白质分析物的生物活性。在一些实施例中，含有疏水区和亲水区的本公开分析物在高盐缓冲液中与HIC柱接触。缓冲液中的盐会减少起始材料中分析物溶质的溶剂化。随着溶剂化减少，变得暴露的疏水区会被介质吸附。起始材料中的分子的疏水性越高，促进结合所需的盐就越少。逐渐降低的盐梯度可以用于按疏水性增加的顺序从柱上洗脱样品。本公开的洗脱缓冲液还可以包括温和的有机改性剂或温和的去污剂。
尺寸排阻色谱法(SEC)
在本公开的一些实施例中，分离组合物可以包括能够基于流动相的元素的相对尺寸或在一些情况下基于相对分子量来分离所述元素的任何材料。SEC可以用于选择性地纯化大分子或大分子复合物，如蛋白质和聚合物。在一些实施例中，例如，在使用水溶液将流动相输送穿过柱的那些实施例中，所述技术被称为凝胶过滤色谱法。在一些实施例中，例如，在将有机溶剂用作穿过柱的流动相的那些实施例中，所述技术被称为凝胶渗透色谱法。在一些实施例中，色谱柱装填有细的多孔珠粒，所述珠粒由例如葡聚糖聚合物(Sephadex)、琼脂糖(Sepharose)或聚丙烯酰胺(Sephacryl或BioGel P)构成。这些珠粒的孔径用于估计大分子的大小。凝胶过滤色谱法可以用于分馏蛋白质分析物和其它水溶性聚合物，而凝胶渗透色谱法可以用于基于分子量分布来分馏有机可溶性聚合物。
高效液相色谱法(HPLC)
在本公开的一些实施例中，分离组合物可以包括能够基于流动相的元素与分离组合物的吸附材料的相互作用来分离所述元素(这使不同组分的流速不同并且使组分在从柱流出时被分离)的任何材料。流动相中的分析物可以例如通过疏水相互作用、离子相互作用或偶极-偶极相互作用来分离。HPLC依靠泵使含有流动相的加压液体溶剂穿过填充有固体吸附材料的柱。在一些实施例中，作为柱的活性组分，吸附剂包括由固体颗粒制成的颗粒材料(例如，二氧化硅或聚合物)。示例性粒径包含2-50微米的颗粒，这种较小的尺寸可以使HPLC色谱法具有优越的分辨能力。在一些实施例中，加压流动相是如水、乙腈和/或甲醇等溶剂的混合物。在一些实施例中，HPLC泵使多种溶剂以随时间变化的比例混合在一起，从而在流动相中生成梯度组合物。在一些实施例中，流动相的水性组分含有酸(如甲酸、磷酸或三氟乙酸)或盐以帮助分离样品组分。在一些实施例中，HPLC包括分配色谱法、正相色谱法、置换色谱法、反相色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法或水性正相色谱法。
快速蛋白质液相色谱法(FPLC)
在本公开的一些实施例中，分离组合物可以包括能够基于流动相的元素对分离组合物的不同亲和力来分离所述元素的任何材料。快速蛋白质液相色谱法(FPLC)是用于分离蛋白质分析物的混合物的液相色谱法的一种形式。在一些实施例中，因为流动相的不同组分对流动相和固定相(分离组合物)具有不同的亲和力，所以可以进行分离。在一些实施例中，流动相是水溶液或缓冲液。缓冲液流速可以通过正排量泵来控制。在一些实施例中，缓冲液流速是恒定的，并且缓冲液的组成是变化的。在一些实施例中，固定相是由例如琼脂糖珠粒等珠粒构成的树脂。普通技术人员将能够根据特定应用的流动相和分析物来改变固定相的珠粒尺寸和表面配体。
在一些实施例中，FPLC包括离子交换色谱法。例如，固定相树脂在第一缓冲液(运行缓冲液)中时通过电荷相互作用与蛋白质分析物结合，但在第二缓冲液(洗脱缓冲液)中时解离。含有一种或多种蛋白质分析物的混合物溶解于第一缓冲液中并且泵入到柱中。感兴趣的蛋白质与树脂结合，而其它组分则在第一缓冲液中运送出去。缓冲液的总流速保持恒定。随着时间的推移，洗脱缓冲液的百分比根据经过编程的浓度变化从0％逐渐增加到100％，以产生梯度。在沿梯度的某一点处，结合的蛋白质分析物中的每种结合的蛋白质分析物解离并在洗出液中出现。然后，洗出液穿过检测器。示例性检测器可以测量洗出液的盐浓度(通过电导率)和洗出液的蛋白质浓度(通过紫外光的吸收)。
加压
在本公开的方法的一些实施例中，流动相流过固定相受重力控制。在一些实施例中，将重力色谱法用于单步骤纯化，如脱盐和亲和力应用。典型的重力柱包括可操作地连接到底部具有出口的色谱柱的顶部缓冲液储存器元件。使用缓冲液储存器与柱之间的旋塞阀或管夹来控制流量。可以使用流量适配器最小化样品上样的变化性。在一些实施例中，重力色谱法包括分配色谱法、正相色谱法、置换色谱法、反相色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法或水性正相色谱法。
在本公开的方法的一些实施例中，色谱法包括低压色谱法。在一些实施例中，低压色谱系统是在小于50psi(～3巴)的压力下操作的系统。低压色谱法可以用于不需要高分辨率的蛋白质分离。
在本公开的方法的一些实施例中，色谱法包括中压色谱法。在一些实施例中，中压色谱系统是在高达3,500psi(24Mpa)的压力下操作的系统。中压色谱系统产生足够的压力，以容纳更高分辨率的例如使用5-15μm珠粒的固定相组合物。在一些实施例中，中压色谱法包括分配色谱法、正相色谱法、置换色谱法、反相色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法或水性正相色谱法。
在本公开的方法的一些实施例中，色谱法包括高压色谱法，例如，HPLC。
流动相
本公开涵盖任何形式的流动相，包含但不限于洗脱液、溶剂、无菌溶剂和药学上可接受的载剂。本公开的洗脱组合物可以包括药学上可接受的载剂。
固定相
本公开涵盖任何形式的固定相，包含但不限于二氧化硅、氧化铝(Al2O3)、纤维素、琼脂糖凝胶和Q琼脂糖凝胶。本公开的示例性分离组合物可以包括基质、聚合物、树脂、蛋白质或其组合。在一些实施例中，分离组合物包括琼脂糖凝胶或Q琼脂糖凝胶。
色谱图
本文所使用的色谱图是色谱仪的视觉输出。通常，洗出液的保留时间和/或流出量表示在色谱图的x轴上，并且信号绘制在y轴上。示例性信号包含但不限于电导、吸光度和质谱法，并且对应于检测器对离开色谱仪的分析物的响应。在一些实施例中，此信号与通过色谱仪分离的特定分析物的浓度成比例。
在一个示例性实施例中，将通过吸光度测量的蛋白质浓度绘制在色谱图的y轴上。溶液中的许多蛋白质吸收光，例如，280nm波长的紫外光，这可以用于计算样品中的蛋白质浓度。取决于蛋白质，可以考虑另外的波长的光。例如，包括血红素基团或荧光团的蛋白质可以用不同波长的光进行检测。普通技术人员将能够为特定分析物选择合适的检测系统。
生物样品
在本公开的方法的一些实施例中，分析物包括蛋白质、肽、核酸或病毒。在一些实施例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。在一些实施例中，病毒是腺病毒和腺相关病毒或慢病毒。
实例
实例1：VEGF Trap的纯化
将VEGF-Trap用作示例性分析物进行纯化，图1-8描绘了示例性参考色谱图(图1和2)以及具有非典型曲线的示例性过程色谱图(图3到5)两者。
简而言之，图1-8的色谱图是通过以下生成的：在足以使包括多种分析物(VEGF-Trap分析物以及多种污染物(例如，宿主细胞蛋白、DNA和唾液酸化差的蛋白))的起始组合物的至少一种VEGF-Trap蛋白与基质(在此实例中，Q琼脂糖凝胶)可逆结合的条件下，使起始组合物与包括所述基质的分离组合物接触，以产生分析物结合的柱和第一废物组合物，其中色谱柱包括分离组合物。然后，使分析物结合的柱与第一洗涤组合物接触，以产生经过纯化的分析物结合的柱和第二废物组合物，其中起始组合物的VEGF-Trap蛋白保持与基质结合。使分析物结合的柱与第二洗涤组合物接触，以产生经过纯化的分析物结合的柱和第三废物组合物，其中在描绘了典型曲线的参考色谱图中，起始组合物的VEGF-Trap蛋白保持与基质结合。为了生成描绘非典型曲线的过程色谱图，使分析物结合的柱与第二洗涤组合物接触，以产生经过纯化的分析物结合的柱和第三废物组合物，其中在描绘了非典型曲线的过程色谱图中，仅起始组合物的VEGF-Trap蛋白保持与基质结合，然而，第三废物组合物包括污染物或VEGF-Trap蛋白。在参考色谱图和过程色谱图两者中，使经过纯化的分析物结合的柱与洗脱组合物接触，以产生经过洗脱的分析物组合物，其中起始组合物的所述至少一种分析物从基质释放到洗脱组合物中。在参考色谱图和过程色谱图两者中，收集经过洗脱的分析物组合物。在进行上述操作中的每个操作的同时，使第一废物组合物、第二废物组合物、第三废物组合物和经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物与紫外(UV)光接触。同时或依次测量第一废物组合物、第二废物组合物、第三废物组合物和经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物对UV光的吸光度，以产生第一废物组合物、第二废物组合物、第三废物组合物和经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物的吸光度值。将第一废物组合物、第二废物组合物、第三废物组合物和经过洗脱的分析物组合物中的每种组合物的吸光度值绘制为横穿色谱柱的液体的体积的函数以生成色谱图。色谱图的生成与色谱过程实时发生，并且在色谱图上出现了另外的峰时，确定出现了非典型曲线。非典型曲线的出现使检测器和/或处理器将警告信号发送到可操作地连接到色谱柱的处理器，所述处理器进而阻止后续的色谱过程，直到可以解决柱的故障。

Claims (65)

1.一种用于检测色谱过程中的柱故障的方法，所述方法包括：
(a)在足以使VEGF-Trap蛋白与基质可逆结合并且在基质与洗脱组合物接触时从基质洗脱的条件下，使包含多种预定分析物和VEGF-Trap蛋白的参考样品与包含含有基质的分离组合物的色谱柱接触，
其中使VEGF-Trap蛋白与基质接触产生VEGF-Trap蛋白结合的柱和第一废物组合物，并且所述VEGF-Trap蛋白结合的柱与洗涤组合物接触，以产生经过纯化的VEGF-Trap蛋白结合的柱和第二废物组合物，
从而通过将至少第一废物组合物、第二废物组合物和经过洗脱的VEGF-Trap蛋白的吸光度值绘制为横穿色谱柱的液体的体积的函数，由色谱柱生成参考色谱图，其中所述绘制随着组合物离开色谱柱而连续发生；
(b)在足以使VEGF-Trap蛋白与基质可逆结合并且在基质与洗脱组合物接触时从基质洗脱的条件下，使包含多种测试分析物和VEGF-Trap蛋白的过程样品与包含含有基质的分离组合物的色谱柱接触，
其中使VEGF-Trap蛋白与基质接触产生VEGF-Trap蛋白结合的柱和第一废物组合物，并且所述VEGF-Trap蛋白结合的柱与洗涤组合物接触，以产生经过纯化的VEGF-Trap蛋白结合的柱和第二废物组合物，
从而通过将至少第一废物组合物的吸光度值绘制为横穿色谱柱的液体的体积的函数，由色谱柱生成过程色谱图，其中所述绘制随着组合物离开色谱柱而连续发生；
(c)比较过程色谱图与参考色谱图，从而检测所述过程色谱图中的非典型曲线，其中所述非典型曲线包含一个或多个指示柱故障的特征，所述特征选自：
当与参考色谱图上的相当的位置相比时，过程色谱图上的另外的峰；和
在积分体积窗期间超过最大吸光强度的测得的吸光强度，其中所述最大吸光强度从至少一个参考色谱图推断，
其中所述一个或多个指示柱故障的特征在色谱柱与洗脱组合物接触的步骤之前发生；
(d)当检测到非典型曲线时生成警告信号；以及
(e)当检测到非典型曲线时中断所述色谱过程，直到所述柱故障得到解决。
2.根据权利要求1所述的方法，其中解决所述柱故障包括(f)重新装填所述色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述色谱过程包括：
a)离子交换色谱法；
b)亲和色谱法；或
c)疏水相互作用色谱法。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述柱故障是由柱劣化引起的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述柱劣化包括柱床破裂。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述色谱过程包括在洗脱步骤之前的洗涤步骤，并且其中所述另外的峰在洗涤步骤期间出现。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述另外的峰的量值指示所述色谱过程的柱故障的严重程度。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述另外的峰的量值的增加指示所述柱故障的严重程度的增加。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述柱故障引起所述色谱柱的分离能力的损失。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在对应于紫外光的波长下确定的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在介于260纳米(nm)与280nm之间的波长下确定的，所述范围包含端点。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在260nm的波长下确定的，从而提供A260值，或者所述测得的吸光强度是在280nm的波长下确定的，从而提供A280值。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述最大吸光强度的A260值或A280值为至少0.05。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述参考色谱图包括测得的吸光强度，所述测得的吸光强度在积分体积窗期间不超过最大吸光强度，并且其中所述最大吸光强度的A260值或A280值为0.05或更小。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述积分体积窗：
a)在1000L与2500L之间出现，所述范围包含端点；
b)在1250L与2250L之间出现，所述范围包含端点；或
c)在1600L与1800L之间出现，所述范围包含端点。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述色谱柱包括阴离子交换树脂。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中(a)生成参考色谱图的步骤包括：
(1)使所述经过纯化的VEGF-Trap蛋白结合的柱与洗脱组合物接触，其中所述VEGF-Trap蛋白从所述基质释放到所述洗脱组合物中，以产生经过洗脱的VEGF-Trap蛋白；
(2)收集所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白；
(3)使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白中的每种与紫外光接触；
(4)测量所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白中的每种对所述紫外光的吸光度，以产生所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白中的每种的吸光度值；以及
(5)通过将所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白中的每种的所述吸光度值绘制为横穿所述色谱柱的液体的体积的函数来生成色谱图。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中(b)生成过程色谱图的步骤包括：
(1)使经过纯化的VEGF-Trap蛋白结合的柱与洗脱组合物接触，其中所述VEGF-Trap蛋白从所述基质释放到所述洗脱组合物中，以产生经过洗脱的VEGF-Trap蛋白；
(2)收集所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白；
(3)使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白中的每种与紫外光接触；
(4)测量所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白中的每种对所述紫外光的吸光度，以产生所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白中的每种的吸光度值；以及
(5)通过将所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白中的每种的所述吸光度值绘制为横穿所述色谱柱的液体的体积的函数来生成色谱图。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中接触步骤(3)和测量步骤(4)是连续的。
20.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述基质包括树脂。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述VEGF-Trap蛋白用于治疗人受试者的方法中。
22.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述警告信号以电子方式传送到处理器，并且其中所述处理器可操作地连接到所述色谱柱。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述处理器接收所述警告信号并中断所述色谱过程或阻止启动进一步的色谱过程，直到所述色谱柱的柱故障得到解决。
24.一种用于检测色谱过程中的柱故障的方法，所述方法包括：
(a)在足以使治疗性蛋白与基质可逆结合并且在基质与洗脱组合物接触时从基质洗脱的条件下，使包含多种预定分析物和治疗性蛋白的参考样品与包含含有基质的分离组合物的色谱柱接触，
其中使治疗性蛋白与基质接触产生治疗性蛋白结合的柱和第一废物组合物，并且
所述治疗性蛋白结合的柱与洗涤组合物接触，以产生经过纯化的治疗性蛋白结合的柱和第二废物组合物，
从而通过将至少第一废物组合物、第二废物组合物和经过洗脱的治疗性蛋白的吸光度值绘制为横穿色谱柱的液体的体积的函数，由色谱柱生成参考色谱图，其中所述绘制随着组合物离开色谱柱而连续发生；
(b)在足以使治疗性蛋白与基质可逆结合并且在基质与洗脱组合物接触时从基质洗脱的条件下，使包含多种测试分析物和治疗性蛋白的过程样品与包含含有基质的分离组合物的色谱柱接触，
其中使治疗性蛋白与基质接触产生治疗性蛋白结合的柱和第一废物组合物，并且
所述治疗性蛋白结合的柱与洗涤组合物接触，以产生经过纯化的治疗性蛋白结合的柱和第二废物组合物，
从而通过将至少第一废物组合物的吸光度值绘制为横穿色谱柱的液体的体积的函数，由色谱柱生成过程色谱图，其中所述绘制随着组合物离开色谱柱而连续发生；
(c)比较过程色谱图与参考色谱图，从而检测所述过程色谱图中的非典型曲线，其中所述非典型曲线包含一个或多个指示柱故障的特征，所述特征选自：
当与参考色谱图上的相当的位置相比时，过程色谱图上的另外的峰；和
在积分体积窗期间超过最大吸光强度的测得的吸光强度，其中所述最大吸光强度从至少一个参考色谱图推断，
其中所述一个或多个指示柱故障的特征在色谱柱与洗脱组合物接触的步骤之前发生；
(d)当检测到非典型曲线时生成警告信号；以及
(e)当检测到非典型曲线时中断所述色谱过程，直到所述柱故障得到解决。
25.根据权利要求24所述的方法，其中解决所述柱故障包括(f)重新装填所述色谱柱。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述色谱过程包括：
a)离子交换色谱法；
b)亲和色谱法；或
c)疏水相互作用色谱法。
27.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述柱故障是由柱劣化引起的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述柱劣化包括柱床破裂。
29.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述色谱过程包括在洗脱步骤之前的洗涤步骤，并且其中所述另外的峰在洗涤步骤期间出现。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述另外的峰的量值指示所述色谱过程的柱故障的严重程度。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述另外的峰的量值的增加指示所述柱故障的严重程度的增加。
32.根据权利要求24所述的方法，其中所述柱故障引起所述色谱柱的分离能力的损失。
33.根据权利要求24所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在对应于紫外光的波长下确定的。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在介于260纳米(nm)与280nm之间的波长下确定的，所述范围包含端点。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在260nm的波长下确定的，从而提供A260值，或者所述测得的吸光强度是在280nm的波长下确定的，从而提供A280值。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述最大吸光强度的A260值或A280值为至少0.05。
37.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述参考色谱图包括测得的吸光强度，所述测得的吸光强度在积分体积窗期间不超过最大吸光强度，并且其中所述最大吸光强度的A260值或A280值为0.05或更小。
38.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述积分体积窗：
a)在1000L与2500L之间出现，所述范围包含端点；
b)在1250L与2250L之间出现，所述范围包含端点；或
c)在1600L与1800L之间出现，所述范围包含端点。
39.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述色谱柱包括阴离子交换树脂。
40.根据权利要求24或25所述的方法，其中(a)生成参考色谱图的步骤包括：
(1)使所述经过纯化的治疗性蛋白结合的柱与洗脱组合物接触，其中所述治疗性蛋白从所述基质释放到所述洗脱组合物中，以产生经过洗脱的治疗性蛋白；
(2)收集所述经过洗脱的治疗性蛋白；
(3)使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的治疗性蛋白中的每种与紫外光接触；
(4)测量所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的治疗性蛋白中的每种对所述紫外光的吸光度，以产生所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的治疗性蛋白中的每种的吸光度值；以及
(5)通过将所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的治疗性蛋白中的每种的所述吸光度值绘制为横穿所述色谱柱的液体的体积的函数来生成色谱图。
41.根据权利要求24或25所述的方法，其中(b)生成过程色谱图的步骤包括：
(1)使经过纯化的治疗性蛋白结合的柱与洗脱组合物接触，其中所述治疗性蛋白从所述基质释放到所述洗脱组合物中，以产生经过洗脱的治疗性蛋白；
(2)收集所述经过洗脱的治疗性蛋白；
(3)使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的治疗性蛋白中的每种与紫外光接触；
(4)测量所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的治疗性蛋白中的每种对所述紫外光的吸光度，以产生所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的治疗性蛋白中的每种的吸光度值；以及
(5)通过将所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的治疗性蛋白中的每种的所述吸光度值绘制为横穿所述色谱柱的液体的体积的函数来生成色谱图。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中接触步骤(3)和测量步骤(4)是连续的。
43.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述基质包括树脂。
44.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述治疗性蛋白用于治疗人受试者的方法中。
45.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述治疗性蛋白是VEGF-Trap蛋白。
46.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述警告信号以电子方式传送到处理器，并且其中所述处理器可操作地连接到所述色谱柱。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述处理器接收所述警告信号并中断所述色谱过程或阻止启动进一步的色谱过程，直到所述色谱柱的柱故障得到解决。
48.一种用于检测色谱过程中的柱故障的方法，所述方法包括通过系统执行的以下步骤：
(a)在足以使VEGF-Trap蛋白与基质可逆结合并且在基质与洗脱组合物接触时从基质洗脱的条件下，使包含多种分析物和VEGF-Trap蛋白的参考样品与包含含有基质的分离组合物的色谱柱接触，
从而通过将至少第一废物组合物、第二废物组合物和经过洗脱的分析物组合物的吸光度值绘制为横穿色谱柱的液体的体积的函数，由色谱柱生成参考色谱图，
其中所述绘制随着组合物离开色谱柱而连续发生；
(b)在足以使VEGF-Trap蛋白与基质可逆结合并且在基质与洗脱组合物接触时从基质洗脱的条件下，使包含多种分析物和VEGF-Trap蛋白的过程样品与包含含有基质的分离组合物的色谱柱接触，
从而通过将至少第一废物组合物和至少第二废物组合物的吸光度值绘制为横穿色谱柱的液体的体积的函数，由色谱柱生成过程色谱图，
其中所述绘制随着组合物离开色谱柱而连续发生；
(c)比较过程色谱图与参考色谱图，从而检测所述过程色谱图中的非典型曲线，
其中所述非典型曲线包含当与所述参考色谱图上的相当的位置处的凹处相比时，所述过程色谱图上锐度降低或量值减小的至少一个凹处；
(d)当检测到非典型曲线时生成警告信号；以及
(e)当检测到非典型曲线时中断所述色谱过程，并且直到所述柱故障得到解决。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述过程色谱图上锐度降低或量值减小的至少一个凹处刚好在收集步骤之前出现。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述过程色谱图上锐度降低或量值减小的至少一个凹处刚好在带状峰之前出现。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述色谱过程包括：
a)离子交换色谱法；
b)亲和色谱法；或
c)疏水相互作用色谱法。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述柱故障是由柱劣化引起的。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述柱劣化包括柱床破裂。
54.根据权利要求48所述的方法，其中所述柱故障引起所述色谱柱的分离能力的损失。
55.根据权利要求48所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在对应于紫外(UV)光的波长下确定的。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在介于260纳米(nm)与280nm之间的波长下确定的，所述范围包含端点。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述测得的吸光强度是在260nm的波长下确定的，从而提供A260值，或者所述测得的吸光强度是在280nm的波长下确定的，从而提供A280值。
58.根据权利要求48所述的方法，其中所述色谱柱包括阴离子交换树脂。
59.根据权利要求48所述的方法，其中(a)生成参考色谱图的步骤包括：
(1)使VEGF-Trap蛋白与基质结合，产生VEGF-Trap蛋白结合的柱和第一废物组合物；
(2)使(1)的VEGF-Trap蛋白结合的柱与洗涤组合物接触，其中所述VEGF-Trap蛋白保持与基质结合，产生经过纯化的VEGF-Trap蛋白结合的柱和第二废物组合物；
(3)使(2)的经过纯化的VEGF-Trap蛋白结合的柱与洗脱组合物接触，其中所述VEGF-Trap蛋白从所述基质释放到所述洗脱组合物中，以产生经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物；
(4)收集所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物；
(5)与步骤(1)-(4)中的每个同时，使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种与紫外(UV)光接触；
(6)测量所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种对所述UV光的吸光度，以产生所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种的吸光度值；以及
(7)通过将所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种的所述吸光度值绘制为横穿所述色谱柱的液体的体积的函数来生成色谱图。
60.根据权利要求59所述的方法，其中接触步骤(5)和测量步骤(6)是连续的。
61.根据权利要求48所述的方法，其中(b)生成过程色谱图的步骤包括：
(1)使VEGF-Trap蛋白与基质结合，产生VEGF-Trap蛋白结合的柱和第一废物组合物；
(2)使(1)的VEGF-Trap蛋白结合的柱与洗涤组合物接触，其中所述VEGF-Trap蛋白保持与基质结合，产生经过纯化的VEGF-Trap蛋白结合的柱和第二废物组合物；
(3)使(2)的经过纯化的VEGF-Trap蛋白结合的柱与洗脱组合物接触，其中所述VEGF-Trap蛋白从所述基质释放到所述洗脱组合物中，以产生经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物；
(4)收集所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物；
(5)与步骤(1)-(4)中的每个同时，使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种与紫外(UV)光接触；
(6)测量所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种对所述UV光的吸光度，以产生所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种的吸光度值；以及
(7)通过将所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种的所述吸光度值绘制为横穿所述色谱柱的液体的体积的函数来生成色谱图，
其中生成过程色谱图与使所述第一废物组合物、所述第二废物组合物和所述经过洗脱的VEGF-Trap蛋白组合物中的每种与紫外(UV)光接触同时发生。
62.根据权利要求61所述的方法，其中接触步骤(5)和测量步骤(6)是连续的。
63.根据权利要求48所述的方法，其中所述警告信号以电子方式传送到处理器，并且其中所述处理器可操作地连接到所述色谱柱。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述处理器接收所述警告信号并中断所述色谱过程或阻止启动进一步的色谱过程，直到柱故障得到解决。
65.根据权利要求48-64中任一项所述的方法，其中解决柱故障包括重新装填所述色谱柱。
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