CN117757922A - 适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物spp1及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1及应用，属于医学生物检测领域，包括分子标志物SPP1及检测试剂以及试剂盒，作为用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物，可早期筛查异位骨化的患者，以期及早进行干预或预防，最大限度的延缓患者病情进展，降低致残率，本发明首次发现了对异位骨化具有较高诊断和治疗价值的分子标记物SPP1；通过标志物SPP1诊断试剂盒和相关药物的研制和应用，可以使异位骨化的早期诊疗更加方便易行，为临床医生快速并准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础。同时基于抑制SPP1细胞内含量显著缓解了间充质干细胞成骨分化，为异位骨化的治疗提供了新的治疗靶点。

Description

适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1及应用

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地说，是一种适用于组织异位骨化早期筛查、诊断以及治疗的分子标志物SPP1及其诊疗应用。

背景技术

异位骨化(Heterotopic ossification，HO)是在肌肉、肌腱或其他软组织内形成异位骨的病理过程。目前研究发现，HO主要发生在深度烧伤、骨折、全髋关节置换术等外伤后。同时，HO也是一些罕见遗传性疾病的典型症状，如进行性骨化纤维发育不良和进行性骨性异位增生(POH)。HO危害大，目前尚缺乏有效延缓退变的治疗方式，是全球亟待解决的公共健康问题。因此，深入揭示HO发生发展的关键分子机制对于开发HO的新诊疗方法具有重要的临床意义和社会价值。

为此，本发明提供了适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1及应用解决上述问题。

发明内容

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：SPP1在异位骨化中的应用，本发明的第一方面，提供适用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物：

构建小鼠异位骨化模型，分别在术后0，3，7，21天收集手术组织，进行单细胞测序和生物信息学分析,发现间充质干细胞在模型组的数量显著增加，尤其在术后7和21天呈逐渐上升趋势。进一步，对间充质干细胞进行细胞亚群分析，发现COL12A1阳性的间充质干细胞细胞比例在术后呈逐渐上升趋势，且在术后第七天达到高峰。对不同群的间充质干细胞进行功能分析，发现COL12A1阳性的间充质干细胞与异位骨化的形成密切相关，表达多种成骨分化相关的基因，包括Mef2C,Sox9，Tead1，和Mkx。并在体外细胞实验和动物实验中得到验证。进一步生物信息学分析发现巨噬细胞在异位骨化形成中扮演重要角色，细胞亚群分析表明SPP1阳性的巨噬细胞是促进COL12A1阳性的间充质干细胞发生异位骨化的最关键的细胞群，其细胞比例的变化趋势和COL12A1阳性的间充质干细胞细胞基本保持一致。小鼠跟腱组织流式分选和免疫荧光染色也进一步证实了单细胞测序揭示的SPP1阳性的巨噬细胞在手术之后变化特点。随后，进一步分析了巨噬细胞与间充质干细胞的细胞交互，表明巨噬细胞同通过分泌SPP1蛋白，作用于COL12A1阳性的间充质干细胞的Integrin受体，促进间充质干细胞成软骨和成骨相关基因的表达，促进异位骨化的发生。

进一步，对正常的后纵韧带组织和骨化的后纵韧带组织进行转录组测序分析，发现骨化的后纵韧带组织SPP1的表达显著增加。组织免疫荧光染色也证明了后纵韧带细胞表达Integrin受体。同时，对正常的黄韧带和骨化的黄韧带组织进行转录组测序分析同样得到相同的结论：骨化的黄韧带SPP1基因表达显著增加，且表达Integrin受体。

因此，SPP1可以作为跟腱，韧带等软组织骨化的一个标志性基因和蛋白，作为用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物。

本发明的第二方面，提供上述分子标志物SPP1在制备异位骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用。

优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为跟腱或韧带等软组织检测试剂或检测试剂盒。

所述的诊断试剂或试剂盒检测生物样品中SPP1的表达量，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。

优选的，所述的生物样品为跟腱或韧带等软组织。

所述的诊断试剂或试剂盒包括：对SPP1具有检测特异性的探针、抗体，基因芯片，或PCR引物。

优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为采用Real-time RT-PCR(q PCR)方法检测SPP1表达量的试剂或试剂盒。

优选的，所述的对SPP1具有检测特异性的物质为PCR引物的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供一种诊断异位骨化的试剂盒，所述的试剂盒中包括用于检测SPP1表达量的试剂。

优选的，所述的用于检测SPP1表达量的试剂为采用Real-timeRT-PCR方法检测SPP1表达量的试剂。

优选的，所述的试剂盒中包括：对SPP1具有检测特异性的PCR引物的核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供检测SPP1表达水平的试剂在制备异位骨化诊断或筛查用试剂盒中的用途。

本发明的第五方面，提供了利用阻断或降低SPP1来维持和/或改善异位骨化的方法：

一、构建Integrin受体阻断的间充质干细胞和小鼠模型。对于体外实验，在给予间充质干细胞SPP1处理的同时加入Integrin受体阻断剂(Cilengitide,西仑吉肽)，分别检测成骨相关基因(ALPL，COL1A1，OCN，RUNX2，IBSP以及SP7)的表达，同时结合ALP细胞染色和茜素红染色进一步评估各组细胞成骨能力，发现SPP1促进了间充质干细胞成骨的发生，而Cilengitide显著缓解了这一效应。细胞荧光染色也进一步明确了基因表达的结果。动物实验也发现，和对照组相比，Cilengitide给药组显著缓解了小鼠手术部位的炎症反应和异位骨化的形成。

二、所述步骤如下：

1.巨噬细胞SPP1基因特异性敲除小鼠的设计由江苏集萃药康生物科技股份有限公司辅助完成(合同号GJS072023033051)。

2.带有loxP位点的F0代与野生鼠互配获得F1代杂合子。

3.F1代杂合子(SPP1-flox/+)互配得到F2代纯(SPP1--flox/flox)。

4.F2代纯合子(SPP1-flox/flox)与全身/组织特异性工具鼠交配获得F3代(SPP1-flox/+,Lyz-Cre)。

5.F3代(SPP1-flox/+,Lyz-Cre)互配得到F4代(SPP1-flox/flox,Lyz-Cre)，即cKO/cKI纯合子。

6.分别对对照组(SPP1-Flox/Flox)和巨噬细胞SPP1基因特异性敲除(Lyz-Cre；SPP1-Flox/Flox)小鼠构建异位骨化模型，手术2月后取材，分别评估各组手术部位异位骨化发生的情况，发现，巨噬细胞SPP1基因特异性敲除(Lyz-Cre；SPP1-Flox/Flox)小鼠异位骨化发生的程度均较对照组较轻。

(三)有益效果

本发明提供了SPP1在异位骨化疾病中的应用。具备以下有益效果：

本发明可早期筛查异位骨化的患者，以期及早进行干预或预防，最大限度的延缓患者病情进展，降低致残率，本发明首次发现了对异位骨化具有较高诊断和治疗价值的分子标记物SPP1；通过标志物SPP1诊断试剂盒和相关药物的研制和应用，可以使异位骨化的早期诊疗更加方便易行，为临床医生快速并准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础。同时基于抑制SPP1细胞内含量显著缓解了间充质干细胞成骨分化，为异位骨化的治疗提供了新的治疗靶点。

附图说明

图1为本发明的小鼠跟腱组织异位骨化(HO)进展中的细胞变化特点展示图；

图2为本发明的细胞外基质(ECM)相关的间充质干细胞(MPC)具有多种成骨相关功能展示图；

图3为本发明的COL12A1⁺MPC通过向成骨细胞分化导致异位骨化的发生过程展示图；

图4为本发明的Spp1+macrophages巨噬细胞与MPC异位成骨关系展示图；

图5为本发明的SPP1⁺巨噬细胞通过SPP1-Integrin受体轴与Col12A1⁺MPC相互作用展示图；

图6为本发明的SPP1及其Integrin受体在骨化的黄韧带组织表达显著增加效果展示图；

图7为本发明的SPP1及其Integrin受体在骨化的后纵韧带组织表达显著增加效果图；

图8为本发明的特异性抑制ItGav/5和Itgb1/5抑制HO的体内和体外进展展示图；

图9为本发明的巨噬细胞特异性敲除SPP1显著缓解了小鼠跟腱异位骨化的进展图；

图10为本发明的体内抑制SPP1信号通路治疗异位骨化进展实验设计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，为了研究不同细胞群体在HO进展过程中的时间变化，我们对对照组和HO组的小鼠跟腱组织进行了一项无偏倚的单细胞测序分析，总共识别了15个不同的细胞群。根据细胞经典标志物的表达将细胞分组，包括MPC(PDGFRA，Prrx1)，巨噬细胞(Lyz2，APOE，Ccl8)，B细胞(IRF8,Siglech，Ly6d)，T细胞(CCL5，Nkg7，AW112010)，成纤维细胞(Igfbp6,APOD，Lgals7)，单核细胞(Acta1，Mylpf，Tnnc2)，粒细胞(Retnlg，S100A9，S100A8)，破骨细胞(CTSK，Mmp9，Acp5)，DC细胞(H2-Ab1，Aa，H2-Eb1)，内皮细胞(Mmrn1，Cldn5，Lyc1，Agp1，FABP4)，324SMC/周细胞(Tagln，Acta2，Rgs5)。红细胞(Hbb-B，HbA-A2,HBA-A1)，神经细胞(PMP22，MBP，MPZ)，以及神经肌肉相关细胞(Hspa1a，Gpx3，Chod1)(图1，A-C)。此外，我们还分析了对照组和HO组之间的分布差异。如图1所示，HO组间充质干细胞(MPC)和巨噬细胞的比例显著增加(图1，D，p<0.05)。此外，我们检测了所有这些细胞群的时间变化趋势，发现MPC的比例在术后第3天下降，但从术后第7天开始增加(图1，E)。巨噬细胞方面，术后第3天细胞数量急剧增加，之后逐渐减少。但HO组跟腱组织中巨噬细胞的比例均高于对照组(图1，A、B)。我们还计算了每个细胞群中排名靠前的标记基因，发现不同的细胞群表达不同的标记基因，这些标记基因可以作为细胞类型识别符号(图1，C)。以上结果提示，巨噬细胞/巨噬细胞比例异常升高可能与HO密切相关。

如图2所示，参与HO的形成在HO中，MPC经历异常的激活，导致成骨分化。在跟腱异位骨化的小鼠中，MPC成骨能力增强，并导致异位骨形成。因此，为了进一步深入研究MPC在HO中的作用，我们首先重点研究了对照组和HO组中的MPC。使用UMAP对MPC集群进行可视化，共鉴定出3个主要的MPC集群：Col12a1⁺MPC(Col12a1、Col2a1、Spp1和COL11a1)、Clec3b⁺MPC(Clec3b、Gsn、Tppp3和Tnxb)以及Mki67+MPC(STMN1、Ube2c、Cenpa和Hmgb2)(图2，A-D)。对照组与HO组比较，HO组COL12a1⁺MPC比例升高，Clec3b⁺MPC比例降低(图2，E)。对照组和HO组Mki67+MPC的比例无显著差异(图2，E)。时间分析显示COL12a1⁺MPC有逐渐增加的趋势(图2,E)。基因集变异分析(GSVA)显示，Col12a1⁺MPC具有多种与成软骨和成骨相关的功能，包括骨小梁形成、骨小梁形态发生、成骨、软骨细胞增殖和骨重塑(图2,G)。Mki67+MPC主要参与有丝分裂和细胞增殖(图2，G)。体内跟腱组织免疫荧光进一步证明了COL12a1⁺MPC在术后的变化特点(图2，H)。

如图3所示，为了更好地了解MPC在HO发育过程中的动态变化，我们使用在损伤后0、3、7和21天四个不同时间点收集的单细胞测序数据进行了细胞分化轨迹分析。如图3所示，我们确定了MPC基因表达变化的五种主要状态，这是在拟时序内绘制的(图3，A)。在拟时序也出现了三种主要的MPC类型，Mki67⁺MPC沿着轨迹分化为Col12a1⁺MPC和Clec3b⁺MPC(图3，B)。此外，还对细胞分化的代表性基因表达进行了伪时间定位。这个结果显示，COL12a1⁺MPC表达细胞外基质(ECM)代谢标记物，参与软骨形成和软骨内成骨(图3，C)。对各分支点基因相关功能随拟时序变化的分析表明，Col12a1⁺MPC轨迹与软骨发育和骨化密切相关，而Clec3b⁺MPC轨迹与伤口愈合和血管生成密切相关(图3，D)。另一方面，Mki67⁺MPC高表达与细胞周期相关的转录因子，如FOXM1、E2F1和MCM3(图3，E和F)。Clec3b⁺MPC高表达参与细胞迁移和伤口愈合的转录因子JunB、Fos和KLF6(图3，E和F)。这些结果表明，这三种类型的MPC在HO形成过程中具有不同的转录调控。对于COL12a1⁺MPC，其高表达成骨分化相关重要转录因子，包括Mef2C，SOX9,Tead1以及Mkx。通过体外成骨细胞实验也进一步证实了这些因子是间充质干细胞成骨分化过程中的重要调控因子(图3，G和H)。小鼠跟腱免疫荧光染色表明成骨分化关键因子Runx2主要表达与COL12a1⁺MPC，提示COL12A1⁺MPC通过向成骨细胞分化导致异位骨化的发生(图3，I)。因此，因此，ECM相关的COL12A1⁺MPC可能在触发和维持HO方面起着关键作用。

如图4所示，巨噬细胞是引起HO的另一个主要细胞群。然而，关于不同的巨噬细胞亚群对间充质祖细胞(MPC)异常分化的影响目前研究有限。为了探索巨噬细胞和HO之间的相关性并确定关键的巨噬细胞亚群，我们通过UAMP对巨噬细胞进行了可视化，发现了五种主要类型的HO相关的巨噬细胞，包括IL-1β⁺巨噬细胞(Thbs1，Hp，Chil3)，Cxc3cr1⁺巨噬细胞(Lyz1，CD74)，MRc1⁺巨噬细胞(Ccl7，MRc1，Folr2，Sepp1)，Spp1⁺巨噬细胞(Spp1，CTs1，GPNMB)和ISG15⁺巨噬细胞(IRF8，Cst3，NAAa，CD24a)(图4，A)。然后，我们评估了所有跟腱组织中巨噬细胞群体的时间变化特点，结果表明，肌腱切断后第3天，Spp1⁺巨噬细胞的比例升高，第7天达到高峰，并维持到第21天(图4，B)。肌腱切断后3d，IL-1β⁺巨噬细胞比例升高，7d后逐渐下降。相反，肌腱切断后至第21天，MRc1⁺巨噬细胞的比例一直维持在较低水平(图4，B)。基于上述结果提示Spp1⁺巨噬细胞与HO的相关性，我们检测了SPP1和巨噬细胞标志物F4/80在跟腱损伤部位的共存情况。流式细胞术表明肌腱切断后3天，Spp1⁺巨噬细胞在损伤部位早期浸润，第7天达到高峰，之后一直存在到损伤后3周，这与单细胞测序数据的结果一致(图4，C)。跟腱组织免疫荧光结果显示，肌腱切断后第7天，肢体损伤部位可见大量同时表达SPP1和F4/80的细胞(图4，D)。

如图5所示，为了探讨巨噬细胞在HO过程中的发育变化，我们对跟腱术后0、3、7和21天的跟腱组织单细胞测序数据进行了轨迹分析。如图5示，根据巨噬细胞基因表达的变化确定了四种主要状态，这是在拟时序内绘制的(图5，A和B)。5种主要类型的巨噬细胞也在拟时序内出现，其中MRC1⁺巨噬细胞位于分化起始分支，沿轨迹分化为spp1⁺巨噬细胞和IL-1β⁺巨噬细胞(图5，B)。此外，具有代表性的基因表达随伪时间动态变化在三种主要类型的巨噬细胞中也被展示。结果表明，在MRc1⁺巨噬细胞轨迹的分支上的细胞具有典型的M2巨噬细胞的标志物，这些标志物参与髓系白细胞的分化、对外部刺激的反应、血管生成和造血(图5，C和D)。IL-1β⁺巨噬细胞表达S100A8/9、肿瘤坏死因子、SAA3、IL-1β和NFκb1等标志物，参与炎症和趋化、NFκb信号和肿瘤坏死因子α信号的调节。这些发现与以前的研究一致，这些研究得出的结论是，炎症往往与HO的发生和恶化有关(图5，C和D)。Spp1⁺巨噬细胞中表达Spp1和糖酵解相关基因。拟时序内的基因功能分析表明，Spp1⁺巨噬细胞的运动轨迹与ECM的调节密切相关(图5，C和D)。进一步相互作用的频率和强度分析表明HO组巨噬细胞和MPC之间有很高的相关性(图5，E)。CellChat分析表明，Spp1与整合素受体(ItGav、ItGA5、Itgb1和Itgb5)的结合可能在调节Spp1⁺巨噬细胞和Col12a1+MPC之间的串扰中发挥更关键的作用(图5，F-H)。重要的是，CellChat的信号通路分析表明，SPP1+巨噬细胞和COL12A1+MPC之间的SPP1信号通路在HO组显著激活(图5，F-H)。

如图6所示，术中分别手机正常的黄韧带组织骨化的黄韧带组织，进行转录组测序，发现骨化的黄韧带组织细胞外基质，软骨发育和骨化相关的功能被显著激活(图6，A和B)。差异基因分析揭示SPP1在骨化的黄韧带组织表达显著增加(图6，C)。KEGG功能分析和基因互作分析也提示SPP1-Integrin交互与多种细胞通路激活相关(图6，D和E)。黄韧带组织免疫荧光染色提示骨化的黄韧带Integrin受体蛋白表达显著增加，尤其是ITGAV和ITGA 5(图6，F)。以上结果提示SPP1及其Integrin受体与黄韧带组织骨化密切相关。

如图7所示，术中分别收集正常的后纵韧带组织骨化的后纵韧带组织，进行转录组测序，发现骨化的后纵韧带组织细胞外基质，软骨发育和骨化相关的功能被显著激活(图7，A和B)。差异基因分析揭示SPP1在骨化的后纵韧带组织表达显著增加(图7，C)。KEGG功能分析和基因互作分析也提示SPP1-Integrin交互与多种细胞通路激活相关(图7，D和E)。黄韧带组织免疫荧光染色提示骨化的后纵韧带Integrin受体蛋白表达显著增加，包括ITGAV和ITGA 5(图7，F)。以上结果提示SPP1及其Integrin受体与后纵韧带组织骨化密切相关。

如图8所示，为了进一步研究SPP1-Integrin轴对MPC成骨分化的影响，我们分离和培养了小鼠MPC。RT-qPCR结果表明，SPP1增强了成骨分化培养基诱导的MPC成骨分化相关基因，包括ALP、COL1A1、OCN，IBSP，SP7，和Runx2(图8，A)。尽管如此，西伦吉德，一种有效的Integrin的抑制剂，特别是Itgav、ITGA5、Itgb1和Itgb5，显著抑制上述基因的表达(图8，A)。碱性磷酸酶染色和茜素红染色证实了Cilengitide对SPP1促进的成骨的抑制作用(图8，B)。细胞免疫荧光也进一步证实了Cilengitide对SPP1促进的成骨的抑制作用(图8，C和D)。在HO过程中，SPP1-Integrin信号通路在损伤部位被激活，ItGav/5和Itgb1/5特异性抑制HO的进展.我们的目的是通过在烧伤和肌腱切断前和之后立即静脉注射Cilengitide来探讨Integrin抑制对体外异位骨形成的疗效。在术后前两周使用Cilengitide治疗后，四肢损伤部位的炎症反应明显减轻，脚踝大小减小(图8，F)。在模型实验结束时，显微CT扫描显示，与PBS组相比，Cilengitide组异位骨体积显著减少，表明早期抑制SPP1信号的有效性(图8，G)。H&E染色和番红固绿染色显示烧伤和肌腱切断后3周损伤部位软骨前体减少(图8，G)。因此，特异性抑制ItGav/5和Itgb1/5阻断SPP1信号通路的激活可以有效抑制HO的体内和体外进展。

如图9所示，分别对对照组(SPP1-Flox/Flox)和巨噬细胞SPP1基因特异性敲除(Lyz-Cre；SPP1-Flox/Flox)小鼠构建异位骨化模型，手术2月后取材，分别评估各组手术部位异位骨化发生的情况，发现，巨噬细胞SPP1基因特异性敲除(Lyz-Cre；SPP1-Flox/Flox)小鼠异位骨化发生的程度均较对照组较轻。

如图10所示，体内构建小鼠跟腱yiwei骨化模型，同时给予Integrin受体阻断剂进行治疗，通过该小分子化合物探究阻断SPP1-integrin信号轴维持和/或改善异位骨化的效果示意图。

实施例1：SPP1可以作为跟腱，韧带等组织骨化的一个标志性基因和蛋白，作为用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物。

本发明实施例提供SPP1在异位骨化疾病(跟腱异位骨化，黄韧带异位骨化以及黄韧带异位骨化)中的应用，包括检测SPP1基因表达的产品在制备诊断异位骨化病变的工具中的应用。

一、研究对象

1)构建小鼠(C57雄性小鼠，6-8周龄)异位骨化模型。

2)对正常的后纵韧带组织和骨化的后纵韧带组织进行转录组测序分析，探究SPP1基因在异位骨化中的表达变化，结合组织免疫荧光染色也证明相关测序结果。两组样本的患者年龄、吸烟、饮酒等因素的分部差异无统计学意义(P>0.05)。

3)对正常的黄韧带组织和骨化的黄韧带组织进行转录组测序分析，探究SPP1基因在异位骨化中的表达变化，结合组织免疫荧光染色也证明相关测序结果。两组样本的患者年龄、吸烟、饮酒等因素的分部差异无统计学意义(P>0.05)。

二、研究方法

1.体外构建小鼠异位骨化模型，分别在术后0，3，7，21天收集手术组织，进行单细胞测序和生物信息学分析。进一步，对间充质干细胞进行细胞亚群分析，发现异位骨化相关的关键间充质干细胞细胞群及其比例和功能的变化。体外细胞实验和动物实验炎症上述发现的结果。随后，细胞交互分析巨噬细胞与间充质干细胞的细胞交互信号轴，并体内外进行验证，为治疗干预提供重要依据。

2.手术中摘取患者的后纵韧带和黄韧带组织，根据实验设计分别置于4％多聚甲醛固定，液氮固定，以及立即浸泡在无菌PBS中并立即转运至实验室进行细胞培养。

3.采用免疫组化和ELISA检测法分别对不同组韧带组织SPP1水平进行检测。

三、实验结果

构建小鼠异位骨化模型，分别在术后0，3，7，21天收集手术组织，进行单细胞测序和生物信息学分析,发现间充质干细胞在模型组的数量显著增加，尤其在术后7和21天呈逐渐上升趋势。进一步，对间充质干细胞进行细胞亚群分析，发现COL12A1阳性的间充质干细胞细胞比例在术后呈逐渐上升趋势，且在术后第七天达到高峰。对不同群的间充质干细胞进行功能分析，发现COL12A1阳性的间充质干细胞与异位骨化的形成密切相关，表达多种成骨分化相关的基因，包括Mef2C,Sox9，Tead1，和Mkx。并在体外细胞实验和动物实验中得到验证。进一步生物信息学分析发现巨噬细胞在异位骨化形成中扮演重要角色，细胞亚群分析表明SPP1阳性的巨噬细胞是促进异位骨化的最关键的细胞群，其细胞比例的变化趋势和COL12A1阳性的间充质干细胞细胞基本保持一致。小鼠跟腱组织流式分选和免疫荧光染色也进一步证实了明单细胞测序揭示的SPP1阳性的巨噬细胞在手术之后变化特点。随后，进一步分析了巨噬细胞与间充质干细胞的细胞交互，表明巨噬细胞同通过分泌SPP1蛋白，作用于COL12A1阳性的间充质干细胞的Integrin受体，促进间充质干细胞成软骨和成骨相关基因的表达，促进异位骨化的发生。

进一步，对正常的后纵韧带组织和骨化的后纵韧带组织进行转录组测序分析，发现骨化的后纵韧带组织SPP1的表达显著增加。组织免疫荧光染色也证明了后纵韧带细胞表达Integrin受体。同时，对正常的黄韧带和骨化的黄韧带组织进行转录组测序分析同样得到相同的结论：骨化的黄韧带SPP1基因表达显著增加，且表达Integrin受体。

因此，SPP1可以作为跟腱，韧带等组织骨化的一个标志性基因和蛋白，作为用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物。

实施例2：体内外实验利用阻断或降低SPP1来维持和/或改善异位骨化的方法：

一、研究对象

6-8周C57野生型小鼠分别构建异位骨化模型(n＝5)进行体内实验。

二、研究方法

1.小鼠间充质干细胞提取和培养

1)将小鼠间充质干细胞从胫骨和股骨骨髓中分离出来，其中特别要注意无菌操作。

2)在含有Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)的培养基中在37℃，5％CO2条件培养。3小时后小心去除未贴壁细胞并更换新鲜培养基。

3)当原代培养细胞几乎汇合时(一般2周左右)，将培养的细胞用0.5ml含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶在室温(25℃)下处理2分钟。

4)每3天更换一次培养基，再过7天左右(总培养时间约3周)就可以获得纯化的MPC群(第1天出现的骨髓细胞的纺锤形形态,集落的数量和大小似乎在第4-10天逐渐增加,在培养骨髓细胞21天时更多融合的MPC)。

2.异位骨化模型的构建：

1)术前准备：采用高压蒸汽灭菌锅对手术器械进行消毒(121℃，30分钟)，随后将消毒后的器械放入65℃的烘箱中进行过夜烘干，以待备用。同时，准备手术台(约60厘米X60厘米)、术中无影灯、气体麻醉机、缝线缝针、无痛碘伏、生理盐水、无菌纱布、一次性无菌手术衣、一次性无菌手套、消毒酒精等。

2)动物准备：实验前一周购买30只雄性C57BL/6J小鼠(周龄6-8周)，置于实验室公共动物饲养房(SPF级)，按照5只一笼进行分配，提供充足的食物和水，动物房光照按照白天-黑夜每间隔12小时进行循环。

3)术前麻醉：将实验小鼠首先放入麻醉机诱导盒进行麻醉前诱导，麻醉机氧流量控制在0.4L/分钟，异氟烷浓度控制在4％比例，待小鼠昏迷后，取出进行经气管内麻醉进行维持(1.5％异氟烷，0.4L/分钟氧气)，待小鼠心跳、呼吸稳定后，进行手术。

4)备皮：使用小型动物修剪器在下肢表面刮除手术区域，用纸巾擦去刮掉的皮毛。推荐手术时使用盐酸金四环素眼药膏涂抹眼周围防止角膜干燥。

5)暴露小鼠跟腱：依次剪开小鼠下肢皮肤，钝性分离皮下筋膜，逐层暴露小鼠跟腱。然后横向间剪断小鼠跟腱。同时采用60℃对小鼠皮肤进行热损伤。

6)缝合切口：逐层缝合皮下筋膜和皮肤(5.0缝线)，在手术部位涂抹盐酸金四环素眼药膏。将术后动物放于温板上等待麻醉苏醒。然后放于动物饲养房正常饲养。

7)术后观察：术后三天每天观察手术动物状态，直到动物状态趋于稳定。手术2个月后拍摄下肢CT和组织学染色评估。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1，其特征在于：包括分子标志物SPP1，所述分子标志物SPP1可以作为跟腱，韧带等软组织骨化的一个标志性基因和蛋白，作为用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物。

2.适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：提供分子标志物SPP1在制备异位骨化的诊断试剂或试剂盒。

3.根据权利要求2所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的诊断试剂或试剂盒为跟腱或韧带组织检测试剂或检测试剂盒；

所述的诊断试剂或试剂盒检测生物样品中SPP1的表达量，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。

4.根据权利要求3所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的生物样品为跟腱或韧带等软组织；

所述的诊断试剂或试剂盒包括：对SPP1具有检测特异性的探针、抗体，基因芯片，或PCR引物。

5.根据权利要求4所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的诊断试剂或试剂盒为采用Real-time RT-PCR(q PCR)方法检测SPP1表达量的试剂或试剂盒。

6.根据权利要求5所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的对SPP1具有检测特异性的物质为PCR引物的核苷酸序列。

7.根据权利要求5所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的试剂盒中包括用于检测SPP1表达量的试剂；

所述的用于检测SPP1表达量的试剂为采用Real-timeRT-PCR方法检测SPP1表达量的试剂。

8.根据权利要求5所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的试剂盒中包括：对SPP1具有检测特异性的PCR引物的核苷酸序列。