CN117757818A - 烟草多酚氧化酶NtPPO6及其编码基因、基因编辑载体和应用 - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了烟草多酚氧化酶NtPPO6及其编码基因、基因编辑载体和应用。本发明的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6，其核苷酸序列为：(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。经检测发现，在烟草中敲除NtPPO6基因，可以显著降低烟草植株中多酚氧化酶的活性，提高烟草植株中绿原酸的含量；而且敲除NtPPO6基因的烟草植株株高增加，平均叶片减少，中部最大叶宽、顶叶宽、顶叶长增加。
Description
技术领域
本发明涉及烟草多酚氧化酶NtPPO6及其编码基因、基因编辑载体和应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
多酚氧化酶(PPO，polyphenol oxidase)是在自然界中广泛存在的一类铜结合酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。根据其底物的特异和作用机制，可分为三类：酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)、儿茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)和漆酶(EC 1.10.3.2)。
多酚氧化酶具有多种功能：(1)参与了植物的生长和发育过程，如花朵开放、果实成熟和叶片的黄化等；(2)将植物中多酚类物质(如酪酸、儿茶酚等)转化为具有较高活性的氧化产物，如喹啉、喹啉醇等，这种氧化反应通常以分子氧为底物，产生的氧化产物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌和抗肿瘤等；(3)多酚底物被PPO氧化，被认为是许多水果和蔬菜在收获、储存、运输和加工过程中棕色变色的主要原因，因此抑制多酚氧化酶的活性可以提高食品的保鲜性和品质；(4)多酚氧化酶还可以应用于环境保护领域，能够催化工业废水和水体中的有机物的氧化降解，从而减少水体污染；(5)多酚氧化酶还可以用于处理农药和有机污染物的土壤和废物。正是由于多酚氧化酶应用领域逐渐扩大，人们对多酚氧化酶的研究也越来越深入。
植物中的多酚氧化酶基因不仅功能复杂，而且多以基因家族的形式存在。目前研究者们在马铃薯、番茄、玉米、大豆、丹参、烟草等植物中均鉴定出多个多酚氧化酶，如在茄科经济作物茄子中找到6个PPO基因；番茄中发现7个PPO基因；马铃薯中有2个PPO基因。红三叶草中找到至少6个PPO基因，Cai等发现高粱中存在8个不同的PPO基因，但葡萄藤中只发现一个PPO基因。而根据对普通烟草基因组数据库中序列同源性分析表明，烟草中多酚氧化酶基因可能有12～14个。申请公布号为CN107653256A的中国发明专利公开了一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用，具体公开了一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的核苷酸序列，并证明该多酚氧化酶基因NtPPO1与烟草褐变相关。但是，由于烟草中多酚氧化酶基因功能复杂，目前对烟草多酚氧化酶基因家族的研究不够深入，多数的多酚氧化酶基因功能是未知的。
发明内容
本发明的第一个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6，以解决现有技术中烟草多酚氧化酶基因家族有部分成员未知的问题。
本发明的第二个目的是提供烟草多酚氧化酶NtPPO6，以解决现有技术中烟草多酚氧化酶家族有部分成员未知的问题。
本发明的第三个目的是提供基因编辑载体，以解决现有技术中无合适的研究工具研究NtPPO6基因功能的问题。
本发明的第四个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用，以解决现有技术中对烟草多酚氧化酶基因家族研究不够深入，而导致存在多酚氧化酶基因功能在烟草中未知的问题。
本发明的第五个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用，以解决现有技术中对烟草多酚氧化酶基因家族研究不够深入，而导致存在多酚氧化酶基因功能在烟草中未知的问题。
为了实现上述目的，本发明烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6所采用的技术方案是：
烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6，其核苷酸序列为：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
或(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
上述技术方案的有益效果在于：本发明在前期研究的基础上，以普通烟草不同时期叶片的cDNA为模板，利用PCR技术，克隆获得了烟草多酚氧化酶的同源基因，命名为NtPPO6。本发明通过对NtPPO6基因的克隆、烟草多酚氧化酶NtPPO6氨基酸序列分析、NtPPO6基因的表达模式分析和NtPPO6基因编辑烟草植株的构建发现，在烟草植株中敲除NtPPO6基因后能显著降低叶片中多酚氧化酶的活性，说明其确实为多酚氧化酶基因家族成员。本发明发现的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6，丰富了烟草多酚氧化酶基因家族，为研究烟草中多酚氧化酶功能奠定基础。
为了实现上述目的，本发明烟草多酚氧化酶NtPPO6所采用的技术方案是：
烟草多酚氧化酶NtPPO6，其氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
上述技术方案的有益效果在于：本发明通过分析烟草多酚氧化酶NtPPO6的氨基酸结构，预测其为烟草多酚氧化酶家族成员，通过构建NtPPO6基因编辑烟草植株，通过检测其叶片中多酚氧化酶的活性，发现敲除NtPPO6基因后，烟草叶片中多酚氧化酶的含量显著下降，证明了烟草多酚氧化酶NtPPO6确实参与调控烟草中的多酚氧化酶活性。
为了实现上述目的，本发明基因编辑载体所采用的技术方案是：
基因编辑载体，所述基因编辑载体中包含根据NtPPO6基因所设计的靶位点敲除序列，所述NtPPO6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述技术方案的有益效果在于：利用基因编辑技术，根据NtPPO6基因设计敲除序列，构建基因编辑载体，转化烟草后，检测发现NtPPO6基因成功敲除，说明本发明构建的基因编辑载体能有效敲除NtPPO6基因，为后续该基因功能的研究提供良好的工具。
作为进一步地改进，依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：
NtPPO6-C-F：5’-GATTGTCCCCTACTCTTACACAATG-3’；
NtPPO6-C-R：5’-AAACCATTGTGTAAGAGTAGGGGAC-3’。
为了实现上述目的，本发明烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用所采用的技术方案是：
烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用。
上述技术方案的有益效果在于：本发明通过基因编辑技术，构建基因编辑载体，转入烟草中，成功敲除NtPPO6基因，获得NtPPO6基因敲除的烟草植株。通过后续检测发现NtPPO6基因敲除的烟草植株的叶片中绿原酸含量显著提高，为获得绿原酸含量增加的烟草品种奠定基础。
作为进一步地改进，在获得绿原酸含量升高的烟草品种中的应用。
为了实现上述目的，本发明烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用所采用的技术方案是：
烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用。
上述技术方案的有益效果在于：本发明通过构建NtPPO6基因敲除的烟草植株，经观察发现NtPPO6基因敲除后，烟草植株株高增加，平均叶片减少，中部最大叶宽、顶叶宽、顶叶长增加。而烟草叶片较大，株高较高，造成其下部叶片透光性不是很良好，同时由于烟草叶片开片较大，也会影响烟田的通风情况。目前针对烟草株型尤其是节间性状育种的研究还比较少，而本发明证明NtPPO6基因能调控烟草植物的株高、叶片数，这为通过改善烟草的透光性、通风性，最终提高烟草的光合利用率及烟草的总产量提供了一个重要的研究方向，为烟叶品质改善、烟草品种遗传改良提供遗传材料和理论依据。本发明的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6在植物株型育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。
作为进一步地改进，抑制NtPPO6基因的表达，烟草植株株高增加，平均叶片减少，中部最大叶宽、顶叶宽、顶叶长增加。
附图说明
图1为本发明实验例1中NtPPO6基因克隆的凝胶电泳图(其中，M为Marker 2000；1为NtPPO6基因扩增产物)；
图2为本发明实验例2中氨基酸序列分析比对图；
图3为本发明实验例3中NtPPO6基因在不同组织中的表达特征图；
图4为本发明实验例4中NtPPO6基因敲除的靶位点示意图(20bp靶位点后面为PAM区域，+显示是正义链，星号显示指SgRNA的相对位置)；
图5为本发明实验例5中针对T0代NtPPO6基因敲除烟草植株敲除靶位点测序结果；
图6为本发明实验例6中T2代NtPPO6基因敲除烟草植株表型图；
图7为本发明实验例6中T2代NtPPO6基因敲除烟草植株叶片中多酚氧化酶的活性分析图(其中，Con代表正常对照的烟草植株，其余为NtPPO6基因敲除的不同个体植株)；
图8为本发明实验例7中T2代NtPPO6基因敲除烟草植株中部叶成熟期叶片中绿原酸含量图(其中，Con代表正常对照的烟草植株，其余为NtPPO6基因敲除的不同个体植株)。
具体实施方式
本发明在前期研究的基础上，以普通烟草不同时期叶片的cDNA为模板，利用PCR技术，克隆获得了烟草多酚氧化酶的同源基因，命名为NtPPO6。本发明通过对NtPPO6基因的克隆和表达模式的分析发现，在烟草植株中抑制该基因的表达能显著提高叶片中绿原酸的活性。本发明发现的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6，丰富了烟草多酚氧化酶基因家族，为研究烟草中多酚氧化酶功能奠定基础。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
下述实施例中，如无特殊说明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
烟草：烟草K326，一种常见烟草材料。
载体：CRISPER/Cas9质粒，现有分子生物学研究实验中常见和常用的基因编辑用质粒载体，可由公开渠道获得，实施例中所采用质粒(pORE-Cas9/gRNA)由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室惠赠提供。
DH5α感受细胞购自上海生工生物工程技术服务有限公司；LBA4404农杆菌菌株为分子生物学中常用菌株，可公开获得。
引物序列合成及基因测序工作，由北京六合华大生物工程有限公司提供完成。
实验试剂：
DNA/RNA提取试剂盒购自Gene Answer公司，胶回收试剂盒/反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
实验设备：
凝胶电泳仪(Bio-Rad)、PCR仪(Biometra)、移液枪(Eppendorf)和UVP凝胶成像系统(GelDoc-It310)均为分子生物学实验中常用仪器设备。
烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6的实施例1
本实施例中的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
烟草多酚氧化酶NtPPO6的实施例1
本实施例中的烟草多酚氧化酶NtPPO6的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
基因编辑载体的实施例1
本实施例的基因编辑载体包含根据NtPPO6基因所设计的靶位点敲除序列，所述NtPPO6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：
NtPPO6-C-F：5’-GATTGTCCCCTACTCTTACACAATG-3’；
NtPPO6-C-R：5’-AAACCATTGTGTAAGAGTAGGGGAC-3’。
烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用的实施例1
本实施例中将包含根据NtPPO6基因所设计的靶位点敲除序列的基因编辑载体转化烟草植株后，构建获得NtPPO6基因敲除的烟草植株，该株系叶片中绿原酸的含量显著增加。
烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用的实施例1
本实施例通过基因工程的手段，在烟草中敲除烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6，烟草植株株高增加，平均叶片减少，中部最大叶宽、顶叶宽、顶叶长增加。
实验例1烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6序列的克隆
本发明在前期研究基础上，利用Primer Premier 6软件设计上下游引物，以普通烟草不同时期叶片的cDNA为模板，利用PCR技术，克隆获得了烟草多酚氧化酶的同源基因，命名为NtPPO6。烟草NtPPO6基因的克隆获得过程的具体实施操作如下：
1、引物设计
具体PCR扩增用引物序列设计如下：
NtPPO6-F：5'-ATGGCTTCTTCATTTGTTC-3'(SEQ ID NO.3所示)，
NtPPO6-R：5'-TTAACAAGGGACCAACTG-3'(SEQ ID NO.4所示)。
以烟草K326不同生长发育时期的叶片作为样品，提取RNA(参考Gene Answer RNA提取试剂盒说明书进行提取)，并参考反转录试剂盒(Takara)说明书，将所提取RNA反转录为cDNA备用。
2、PCR扩增
以上述步骤1中所制备cDNA为模板，利用所设计引物进行PCR扩增，PCR扩增时25μL反应体系设计如下：cDNA 2μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、PremixTaq 12.5μL和ddH2O9.7μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，DNA Maker选用DL2000，电泳条件120V/20min，然后在紫外扫描仪下观察，PCR电泳结果如图1所示。目的DNA片段用DNA胶回收试剂盒(Takara)回收，测定浓度后-20℃保存备用或直接进行后续实验操作。
3、测序并分析NtPPO6基因
用纯化回收的目的片段连接pMD19-T载体，4℃过夜，并转化感受态细胞DH5α，挑取白色单菌落，37℃控温摇床摇菌12h左右(200r/min)；以微量菌液为模板进行PCR验证是否为阳性克隆。含有目的片段的重组质粒由北京六合华大生物科技有限公司测序，获得烟草NtPPO6基因的核苷酸序列。
测序结果表明：烟草NtPPO6基因，包括1737个碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
对该碱基序列分析，结果表明：烟草NtPPO6基因所编码的多酚氧化酶包括578个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实验例2烟草多酚氧化酶NtPPO6氨基酸序列分析
烟草多酚氧化酶NtPPO6与其他物种包括绒毛状烟草、黄灯笼辣椒、枸杞、番茄、本氏烟、PPO的氨基酸序列进行比对，发现NtPPO6和其他物种PPO的氨基酸序列高度相似，与绒毛状烟草NtomPPO、黄灯笼辣椒CcPPO、枸杞LfPPO、番茄SlPPO、本氏烟NbPPO的序列相似性分别为93.77％，57.41％，58.02％，56.51％和56.68％。
另外通过Pfam分析发现NtPPO6具有PPO氧化酶典型的结构域，如图2所示：其在160-365位氨基酸序列具有Tyrosinase结构域(PF00264)，在372-423位氨基酸具有PPO1_DWL结构域(PF12142)，在445-575位氨基酸序列之间具有PPO1_KFDV结构域(PF12143)。
实验例3烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6在烟草中表达模式的分析
借助于实时荧光定量PCR(BIO-RAD，USA)技术，本实验例对烟草植株中烟草NtPPO6基因的表达模式进行了初步分析，具体实施操作如下：
1、荧光定量PCR引物设计及样品制备
实时荧光定量PCR分析时，以L25作为内参基因，特异引物序列设计如下：
NtPPO6-Q-F：5'-TTCAAGCCACAACCAAGA-3'(SEQ ID NO.5所示)；
NtPPO6-Q-R：5'-TCACATCCAATTCCACATTC-3'(SEQ ID NO.6所示)；
L25-F：5'-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3'(SEQ ID NO.7所示)；
L25-R：5'-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3'(SEQ ID NO.8所示)；
分别以K326盛花期的老叶、老叶叶脉、新叶、新叶叶脉、侧根、须根、茎、腋芽、花蕾、花萼、雄蕊、雌蕊及子房为样品，分别提取RNA并反转录为cDNA作为模板样品备用。
2、荧光定量PCR检测
荧光定量PCR时，所用仪器为美国伯乐公司的Bio-Rad CFX96，反应体系20μL：10μLSYBR Premix Ex TaqTM、1μL正向引物、1μL反向引物、2μL cDNA、6μL ddH2O。
扩增程序为：94℃30s预变性；94℃5s变性，60℃20s退火，72℃20s延伸，45个循环。反应结束后所得相对表达量结果用2-△△CT法进行分析计算，设定空白对照组(Con)相对表达量为1。所有数据是至少3次独立实验结果的平均值。选择SPSS18.0软件，使用Duncan’s测验(P<0.05)做显著性统计分析。
荧光定量检测结果如图3所示。由图中可以看出，NtPPO6基因在普通烟草K326盛花期的腋芽中表达量最高，在花蕾中的表达量也比较高，在其它组织中的表达量较低，在老叶叶脉、茎和子房中则不表达。
实验例4基因编辑载体的构建
根据实验例1测序所得NtPPO6基因的基因组和编码区序列，参考基因编辑靶位点设计原则，在NtPPO6基因的第一个外显子序列上设计20bp左右的靶位点，如图4所示，分别设计敲除的引物序列如下：
NtPPO6-C-F：5'-GATTGTCCCCTACTCTTACACAATG-3'(SEQ ID NO.9所示)；
NtPPO6-C-R：5'-AAACCATTGTGTAAGAGTAGGGGAC-3'(SEQ ID NO.10所示)。
首先，PCR扩增获取靶位点的DNA双链；20μL反应体系计如下：上、下游引物各4μL(50μmol/L)、Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)4μL、ddH2O补足至20μL。
反应程序：95℃5min；每8s下降0.1℃，直至25℃；反应产物4℃保存备用。
第二，将上述PCR反应得到的退火产物与质粒pORE-Cas9/gRNA(预先用BsaI酶切)进行连接。10μL连接体系为：酶切载体3μL、退火产物2μL、Solution I 5μL。反应条件为16℃连接30min。
第三，将上述连接产物转化DH5α感受态细胞并进行抗性筛选培养(37℃培养12h左右)。
最后，挑选阳性克隆进行菌落PCR鉴定后，进一步将鉴定正确的质粒送北京六合华大基因科技有限公司进行测序鉴定，以确保质粒重组正确。
需要说明的是，菌落PCR鉴定中，针对NtPPO6基因编辑载体，鉴定用引物对核苷酸序列为：
U26-jiance-F：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'(SEQ ID NO.11所示)，
NtPPO6-C-R：5'-AAACCATTGTGTAAGAGTAGGGGAC-3'(SEQ ID NO.10所示)。
实验例5农杆菌转化及NtPPO6基因编辑烟草植株的构建
将实验例4中测序成功的单菌落扩大培养，提取质粒，并利用电转法将基因编辑载体转入农杆菌LBA4404中，再侵染烟草植株中获得NtPPO6基因敲除的基因编辑烟草植株。具体实施方式如下：
1、农杆菌感受态制备：
(1)挑取单菌落的农杆菌LBA4404在2mL LB(含20mg/mL Rif)中28℃培养过夜；
(2)取生长良好的菌液2mL(含25mg/L Rif)接种于50mL LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600＝0.5左右；
(3)将菌液转移至50mL离心管内，冰上放30分钟后，4℃5000rpm离心5min以收集菌体；
(4)用10mL 0.15M预冷的氯化钠溶液轻悬菌体后，4℃5000rpm离心5min收集菌体；
(5)加入20mL预冷的20mM氯化钙溶液悬浮菌体完成感受态细胞制备。将制备完成的感受态细胞以100μL/管分装后，-80℃保存备用。
2、质粒转化农杆菌：
(1)取1μL基因编辑载体，加入含100μL的农杆菌感受态细胞的离心管中，冰上放置30分钟后，转入液氮速冻1分钟，随后37℃温育5分钟；
(2)向步骤(1)中的感受态细胞中加入1mL LB液体培养基，28℃震荡培养3小时；培养结束后，5000rpm离心1分钟，弃去上清(培养基)，加入200μL LB液体培养基，重悬沉淀；
(3)取200μL重悬菌液均匀地涂于含20mg/L Rif和50mg/L卡那霉素(Kan)的LB固体平板上，28℃培养2-3天后，挑选阳性质粒扩增后进行菌落PCR鉴定，确保质粒转化正确，并将转化正确的重组菌株保存备用。对转化正确菌株进一步摇菌扩增、离心收集菌体后，再用MSO重悬制备作为转染液备用。
3、转化烟草：
(1)取生长旺盛的K326烟草叶片，消毒灭菌后剪成1cm2左右小块，置于培养基中预培养2天后，置于步骤(2)所制备的侵染液中充分侵染10-15min左右；
(2)将上述侵染后叶块置于培养基中暗培养4天后，转入培养基中诱导分化，以诱导形成丛生不定芽切(期间，根据需要每隔10天更换1次培养基，同时培养基中加入有抗生素进行抗性筛选)；
(3)待不定芽长至1-2cm时，将丛生不定芽分切成单个小芽，并进一步转入培养基中诱导生根；
(4)待根系发育生长完成后，将组培苗取出，转移到盛有疏松无菌土的花盆中，常规管理培养。
4、PCR检测Cas9基因片段是否插入烟草植株中：
针对转化后的转基因组培再生苗，采集适量再生烟株叶片作为样品，提取其基因组DNA，采用PCR方法检测确认外源DNA片段是否插入到植物基因组中。
PCR扩增验证时，引物设计如下：
Cas9-F:5'-GGGACCCTAAGAAGTACGGC-3'(SEQ ID NO.12所示)；
Cas9-R:5'-TATTCTCGGCCTGCTCTCTG-3'(SEQ ID NO.13所示)。
25μL反应体系设计为：基因上、下游引物各1μL(10μmol/L)、DNA模板1μL(100ng/μL)、10×Taq Buffer(Mg2+)2.5μL、dNTPs 2μL(2.5mmol/L)、Taq DNA polymerase 0.25μL、ddH2O补足至25μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
PCR结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定外源DNA片段(Cas9蛋白基因)是否插入植物基因组中。
5、NtPPO6基因敲除的烟草植株的进一步验证
针对步骤4初步PCR筛选确定的NtPPO6基因敲除阳性植株，为进一步确定目的基因是否成功被编辑并发生突变，并具体确认突变类型，本发明做了进一步检测鉴定，具体情况简介如下。
(1)根据NtPPO6基因序列及靶位点位置，设计检测用引物对如下：
NtPPO6-BJ-F:5'-ggagtgagtacggtgtgcTTCCAAGTATCATGCAACCA-3'(SEQ ID NO.14所示)，
NtPPO6-BJ-R:5'-gagttggatgctggatggGGATAGGAGGACAACAAGTG-3'(SEQ ID NO.15所示).
(2)以上述Cas9阳性转基因植物DNA为模板，进行PCR扩增：
50μL扩增体系设计为：上、下游引物各2μL(10μmol/L)、DNA模板2μL(100ng/μL)、10×Taq Buffer(Mg2+)5μL、dNTPs 4μL(2.5mmol/L)、Taq DNA polymerase 0.5μL、ddH2O补足至50μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
对PCR扩增产物进行电泳检测后，回收、纯化PCR产物，并送西安青雪生物科技有限公司进行Hi-TOM测序，根据测序结果比对分析基因的突变率。
部分测序结果如图5所示。分析结果表明：针对NtPPO6基因敲除的烟草植株，在20株T0代植株中有2种类型的基因突变，分别是1个碱基的插入，以及1个碱基的插入和1个碱基的删除。这些碱基突变均发生在敲除的靶位点上，而野生型植株的NtPPO6基因未检测到任何突变。这说明T0代植株已经实现了以碱基删除或者插入的形式对NtPPO6基因进行突变。
为了验证相关表型能否稳定的遗传到下一代，收集T0代阳性植株的种子，继续种植后获得T2代植株，并进行检测分析。结果表明：T0代植株能稳定的遗传到T2代。
实验例6NtPPO6基因敲除烟草植株表型及多酚氧化酶活性分析
1、表型观察：
NtPPO6基因敲除T2代烟草植株的中部叶成熟期表型观察结果如图6所示，NtPPO6基因敲除烟草植株和对照K326相比，株高平均增加了7cm，平均叶片数减少了3片，中部最大叶宽增加了4.7cm，顶叶宽增加了5.7cm，顶叶长增加了6.1cm，其它的如的茎围，中部最大叶叶长变化不大。
2、多酚氧化酶活性检测：
采用多酚氧化酶检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)检测多酚氧化酶的活性，酶活测定结果如图7所示。由图7可以看出，NtPPO6基因敲除T2代烟草植株的中部叶成熟期叶片中多酚氧化酶的活性，和对照(K326)相比多酚氧化酶活性显著降低如图7，分别降低了39.55％、24.50％、36.38％、30.31和26.38％。研究初步揭示NtPPO6基因功能，证明通过基因编辑抑制NtPPO6基因表达能够下调多酚氧化酶的活性。
实验例7NtPPO6基因敲除烟草植株绿原酸含量检测
采用GC-MS分析方法，本发明检测了NtPPO6基因敲除烟草植株中绿原酸含量情况，检测时，HPLC-UV绝对定量分析条件：色谱柱Symmetry C18(4.6×250mm，5μm)，检测波长340nm，进样量5μL，流速1.0mL/min；
流动相A为水/甲醇/乙酸(44/5/1，v/v/v)，流动相B为甲醇/水/乙酸(44/5/1，v/v/v)；
梯度洗脱：
0～15.0min，10％B-30％B；
15.0～26.0min，30％B-90％B；
26.0～28.0min，90％B；
28.1-35.0min，10％B。
检测结果如图8所示，由图中可以看出，T2代NtPPO6基因敲除烟草植株(7-6-9、7-6-10、7-6-12、7-6-15、7-6-18)和对照(K326)相比，中部叶成熟期中部叶片绿原酸含量分别升高了27.64％、41.11％、32.35％、42.66％及44.95％，和对照比均达到差异显著水平(p<0.01)。这一结果表明，NtPPO6基因在烟草叶片成熟期绿原酸调控中具有重要的作用。
最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6，其特征在于：其核苷酸序列为：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
或(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
2.烟草多酚氧化酶NtPPO6，其特征在于：其氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
3.基因编辑载体，其特征在于：所述基因编辑载体中包含根据NtPPO6基因所设计的靶位点敲除序列，所述NtPPO6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的基因编辑载体，其特征在于：依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：
NtPPO6-C-F：5’-GATTGTCCCCTACTCTTACACAATG-3’；
NtPPO6-C-R：5’-AAACCATTGTGTAAGAGTAGGGGAC-3’。
5.一种如权利要求1所述的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或权利要求3或4所述的基因编辑载体在烟草品种育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用，其特征在于：在获得绿原酸含量升高的烟草品种中的应用。
7.一种如权利要求1所述的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或权利要求3或4所述的基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用。
8.根据权利要求7所述的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用，其特征在于：抑制NtPPO6基因的表达，烟草植株株高增加，平均叶片减少，中部最大叶宽、顶叶宽、顶叶长增加。
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