CN117737026A - 与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的ggpps突变蛋白 - Google Patents
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Abstract
本申请属于小麦基因工程技术领域，具体涉及GGPPS定向突变蛋白专利申请事宜。所述GGPPS突变蛋白，与现有如SEQ ID No.1所示小麦GGPPS蛋白氨基酸序列相比，其213位点和/或269位点发生了单位点或双位点突变。本基于组合活性中心饱和突变策略CAST，结合计算机技术对蛋白结构信息的深入模拟，通过对酶蛋白结构与底物相互作用的氨基酸残基的模拟改造，以及通过相关突变体库的构建和筛选，最终实现了对GGPPS结构的进一步优化。基于相关验证实验，不仅证实了相关分析筛选结果的正确性，同时也为进一步的基于基因工程技术的小麦新品种培育奠定了良好的技术基础，同时也为其他作物改良提供了借鉴和参考。
Description
技术领域
本申请属于小麦基因工程技术领域，具体涉及GGPPS定向突变蛋白专利申请事宜。
背景技术
类胡萝卜素作为一种质体色素，不仅与植物光合作用、生长发育活动密切相关，而且由于其是人和动物体内维生素A的前体，且人和动物人不能够直接合成类胡萝卜素，必须从外界途径摄入，因此类胡萝卜素也与人和动物的各种生命活动高度相关。
对类胡萝卜素的代谢途径研究表明：作为类胡萝卜素、叶绿素和赤霉素等萜类物质的共同前体的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)，先被八氢番茄红素(phytoene)合酶(phytoene synthase，PSY)催化形成类胡萝卜素中间物质的八氢番茄红素，再被用于合成各种类型的类胡萝卜素。
其中作为前体物质C20的GGPP以3分子异戊烯基焦磷酸（IPP）和1分子烯丙基异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)为底物，在牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPP synthase，GGPPS)作为限速酶作用下缩合生成。进一步对植物GGPPS基因家族的大量研究表明，该家族成员不仅编码萜类合成通路上游的重要酶蛋白，而且还直接参与调控植物萜类合成的各个通路，在调控植物生理活动方面发挥着核心作用。
小麦（Triticum aestivumL.）作为重要的粮食作物之一，占世界作物种植面积的1/5，是全球40%人口的主要食粮。因此，对于小麦中类胡萝卜素合成通路的深入研究、以及相关改造，不仅对于小麦新品种培育、对于进一步改善人类营养需求途径，都具有十分重要的技术意义。
发明内容
本申请通过对小麦牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPP synthase，GGPPS)结构研究，目的在于为小麦GGPPS基因改造、以及具有更高酶活的GGPPS和更高类胡萝卜素含量的小麦新品种培育奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案简述如下。
与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的GGPPS突变蛋白，所述GGPPS突变蛋白，与现有如SEQ ID No.1所示小麦GGPPS蛋白氨基酸序列相比，其213位点和/或269位点发生了单位点或双位点突变，从而可以提高GGPPS酶活；
所述单位点突变，包括两种类型：
对于213位点：对GGPPS酶结构分析表明，由于213位点位于酶的 “催化口袋处”，原213位点的缬氨酸Val（V）突变为丙氨酸Ala（A）、半胱氨酸Cys（C）或者苏氨酸Thr（T）后，有利于底物与酶活口袋的结合；即：单位点突变蛋白GGPPS-213的213位点为丙氨酸Ala（A）、半胱氨酸Cys（C）或者苏氨酸Thr（T），GGPPS具有更高的酶活；
对于269位点：对GGPPS酶结构分析表明，由于269位点位于酶分子表面，原269位点的赖氨酸Lys（K）突变为甲硫氨酸Met（M）、天冬酰胺Asn（N）、谷氨酰胺Glu（Q）或精氨酸Arg（R）后，有利于形成GGPPS同源二聚体；即：单位点突变蛋白GGPPS-269的269位点为甲硫氨酸Met（M）、天冬酰胺Asn（N）、谷氨酰胺Glu（Q）或者为精氨酸Arg（R），GGPPS具有更强的蛋白稳定性；
所述双位点突变，为213位点和269位点同时发生突变；其中原213位点的缬氨酸Val（V）突变为丙氨酸Ala（A）、半胱氨酸Cys（C）或者苏氨酸Thr（T）中任意一个，同时，原269位点的赖氨酸Lys（K）突变为甲硫氨酸Met（M）、天冬酰胺Asn（N）、谷氨酰胺Glu（Q）或精氨酸Arg（R）中任意一个；此时，双位点突变蛋白GGPPS-213-269对应的GGPPS具有更高的酶活且具有更强的蛋白稳定性；
也即，双位点突变蛋白GGPPS-213-269在213和269位点组合（共12种）为：213A-269M、213A-269N、213A-269Q、213A-269R、213C-269M、213C-269N、213C-269Q、213C-269R、213T-269M、213T-269N、213T-269Q或213T-269R；
其中优选组合（8种）为：213A-269M、213A-269N、213A-269Q、213A-269R、213C-269M、213C-269N、213C-269Q和213C-269R；
所述与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的GGPPS突变蛋白在小麦育种中的应用，利用GGPPS突变蛋白对应的编码基因培育具有更高GGPPS酶活和/或更好GGPPS稳定性的小麦品种；
所述GGPPS突变蛋白，用于色素类物质的合成；所述色素类物质具体为β-胡萝卜素。
作为合成生物学的关键性技术之一，定向生物进化技术近年得到了较为快速发展。该技术可广泛用于酶的活性设计和优化，在指导生物酶结构优化和改进等方面具有十分广阔的应用前景和应用潜力。
本申请中，基于组合活性中心饱和突变策略 (Combinatorial active-sitesaturation test，CAST) ，结合计算机技术对蛋白结构信息的深入模拟，通过对酶蛋白结构与底物相互作用的氨基酸残基的模拟改造，以及通过相关突变体库的构建和筛选，最终实现了对GGPPS结构的进一步优化。
研究表明，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPP synthase，GGPPS)作为色素类物质类胡萝卜素合成过程中关键的限速酶，结构分析表明，其第213位和第269位是生物酶活和结构稳定的关键性位点。基于这一结构分析和进一步的大肠杆菌的验证实验，不仅证实了相关分析筛选结果的正确性，同时也为进一步的基于基因工程技术的小麦新品种培育奠定了良好的技术基础，同时也为其他作物改良提供了新的技术借鉴和参考。
附图说明
图1为细菌颜色互补实验原理图；PAC-94N质粒上含有PSY、PDS以及LCY-B三个基因，而大肠杆菌体内可以合成IPP和DMAPP，但不能产生GGPP；在将连接有具有酶活的GGPPS基因的质粒与PAC-94N质粒共同转化大肠杆菌后，即可在大肠杆菌体内催化产生β-胡萝卜素，使大肠杆菌由白色转化成黄色；
图2为针对GGPPS-213单位点饱和突变的细菌颜色互补实验结果；第213位氨基酸位点发生了突变，由野生型的缬氨酸Val（V）突变为其余19种氨基酸，与PAC-94N质粒共同转化大肠杆菌BL21（DE3）后，经IPTG诱导，菌液颜色发生了明显变化；检测时，以空的pET32b作为阴性对照，可以看出，部分突变体相较于野生型GGPPS在OD440处吸光值有明显提升；
图3为GGPPS-269单位点饱和突变的细菌颜色互补实验结果；
图4 为GGPPS-213/269两位点组合突变的细菌颜色互补实验结果；
图5为部分典型突变类型的细菌颜色互补实验汇总结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌（E.coli）BL21(DE3)、pGEM-T质粒、pET-32b(+)、PAC-94N质粒，均为现有基因工程技术中常见和常用生物材料，可由公开渠道获得；
小麦品种：中国春，现有小麦遗传学研究中常用品种，可由公开渠道获得。
实施例1
本申请以小麦中牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGPPS)蛋白为改造对象，作为研究基础，本实施例首先就现有小麦牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGPPS)基因的克隆获得过程简介如下。
首先，根据现有公开的GGPPS基因序列（GenBank：XM_044467171.1），设计PCR扩增用引物序列如下：
正向引物：5’- GAAGTTTCCCCTCTTTGCTTCT -3’，
反向引物：5’- ACCTAACTCATGTGGCATTTGT -3’；
随后，提取小麦RNA（以中国春叶片为样品），并反转录为cDNA为模板，然后利用上述引物进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行电泳检测后，回收、纯化，并将回收纯化后的PCR产物与pGEM-T质粒进行连接；
随后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后，挑选并鉴定阳性克隆，以获得重组正确的克隆质粒pGEMT-GGPPS。
为便于后续GGPPS的表达制备，发明人进一步利用pET-32b(+)质粒构建了重组表达载体，具体过程参考为：
首先，设计一对含有HindⅢ和XhoⅠ酶切位点的引物序列如下：
正向引物：5’-CGACGACGATTTAAGCTTATGGCAGCGTTCCACC-3’，
反向引物：5’-CGAACAGCTGCCTCGAGTTAGTTCTGCCGATAGGC-3’；
随后，以上述克隆质粒pGEMT-GGPPS为模板，进行PCR扩增，以获得GGPPS基因，并对PCR扩增产物进行回收、纯化；
随后，对pET-32b(+)质粒进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切，回收酶切产物后与GGPPS基因回收产物进行连接；
最后，将连接产物转化DH5α感受态细胞，过夜培养后，挑选阳性克隆进行鉴定，将鉴定正确重组表达质粒载体重新命名为：pET-32b(+)-GGPPS。
更进一步地，为便于后续实验过程中相关突变位点的检测和分析，利用上述重组表达质粒pET-32b(+)-GGPPS和PAC-94N质粒，发明人构建了一个验证用工程菌株，具体构建过程简介如下。
首先，将上述所构建的重组载体pET-32b(+)-GGPPS与PAC-94N质粒共转化E.coliBL21(DE3) 表达菌株（同时，以空载体pET-32b(+)与PAC-94N质粒共转化作为阴性对照菌株）；
随后，过夜培养后，挑选阳性克隆进行鉴定，对于测序正确的阳性克隆菌株进行保藏或者进行进一步β-胡萝卜素含量检测。
需要解释的是，上述实验过程中，相关具体操作参考现有技术常规操作即可，不再赘述。
另外，就β-胡萝卜素含量检测原理简要解释如下：
大肠杆菌自身不能产生GGPP，而PAC-94N质粒则含有β-胡萝卜素合成通路的所有基因，但不含牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶编码基因（示意图如图1所示），因此，在将重组载体pET-32b(+)-GGPPS与PAC-94N质粒共转化时，则可催化产生GGPP的菌株由白色转变为黄色，而且酶活性越强菌株，黄色越深，在GGPPS表达完成后，离心收集菌体并进一步通过丙酮萃取，使用分光光度计测量萃取获得溶液OD440的吸光值，即可对最终产物β-胡萝卜素含量进行测定。
需要说明的是，现有GGPPS，由356个氨基酸组成，序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLVAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRKYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN
对应的GGPPS编码基因（1071个核苷酸），具体序列如下：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCGTCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCAAGTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA。
实施例2
小麦GGPPS结构研究和优化过程中，借助于计算机模拟技术，发明人对小麦GGPPS进行同源建模。建模过程中，其最优模板为3kro，分值为0.993（TM-score用来衡量两个蛋白结构模型的匹配度，分值由0到1，1意味着完美的匹配），根均方差偏离值（RMSD）为0.36 Å，序列一致性（IDEN）为74.9%，蛋白结构覆盖度（Cov）为99.7 %。
分析研究过程中，使用Rosetta_docking程序分别将底物C5-DMAPP、C10-GPP、C15-FPP对接至GGPPS催化口袋。通过寻找受体小分子化合物和酶作用的最佳结合位置，从而预测其结合模式。最终分析结果表明：其第213位氨基酸位点位于酶的催化口袋，氨基酸替换后可进一步提高底物与酶活口袋结合能力，并且这些位点参与了酶活调控；而第269位氨基酸位点位于酶分子表面，有利于蛋白形成二聚体。
基于上述计算机模拟结构分析，发明人进一步构建了针对这2个位点的GGPPS饱和突变体文库，具体构建过程简介如下。
首先，根据上述2个位点设计点突引物序列如下：
V213A-F ：5’-GGATCAGAGGGCCTCGCCGCCGGCCAGG-3’，
V213C-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCTGCGCCGGCCAGG-3’，
V213D-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCGACGCCGGCCAGG-3’，
V213E-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCGAGGCCGGCCAGG-3’，
V213F-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCTTCGCCGGCCAGG-3’，
V213G-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCGGCGCCGGCCAGG-3’，
V213H-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCCACGCCGGCCAGG-3’，
V213I-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCATCGCCGGCCAGG-3’，
V213K-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCAAGGCCGGCCAGG-3’，
V213L-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCCTCGCCGGCCAGG-3’，
V213M-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCATGGCCGGCCAGG-3’，
V213N-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCAACGCCGGCCAGG-3’，
V213P-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCCCCGCCGGCCAGG-3’，
V213Q-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCCAGGCCGGCCAGG-3’，
V213R-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCCGCGCCGGCCAGG-3’，
V213S-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCTCAGCCGGCCAGG-3’，
V213T-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCACCGCCGGCCAGG-3’，
V213W-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCTGGGCCGGCCAGG-3’，
V213Y-F：5’-GGATCAGAGGGCCTCTACGCCGGCCAGG-3’，
V213-R：5’-GAGGCCCTCTGATCCGATGCAGCGCGC-3’；
K269A-F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCGCCTACGCGAGATC-3’，
K269C-F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCTGCTACGCGAGATC-3’，
K269D-F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCGACTACGCGAGATC-3’，
K269E- F ：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCGAGTACGCGAGATC-3’，
K269F- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCTTCTACGCGAGATC-3’，
K269G- F ：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCGGCTACGCGAGATC-3’，
K269H- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCCACTACGCGAGATC-3’，
K269I- F ：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCATCTACGCGAGATC-3’，
K269L- F ：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCCTCTACGCGAGATC-3’，
K269M- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCATGTACGCGAGATC-3’，
K269N- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCAACTACGCGAGATC-3’，
K269P- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCCCCTACGCGAGATC-3’，
K269Q- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCCAGTACGCGAGATC-3’，
K269R- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCCGCTACGCGAGATC-3’，
K269S- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCAGCTACGCGAGATC-3’，
K269T- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCACCTACGCGAGATC-3’，
K269V- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCGTCTACGCGAGATC-3’，
K269W- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCTGGTACGCGAGATC-3’，
K269Y- F：5’-CAGATTGAGCGGTTGCGCTACTACGCGAGATC-3’，
K269-R：5’-GCGCAACCGCTCAATCTGCTCTTCTGAGCC-3’；
随后，以实施例1所构建pET-32b(+)-GGPPS为模板，然后分别以上述所设计的点突引物，进行全质粒PCR；
再后，将PCR扩增产物进行DpnI酶消化，随后将消化后的产物转化E.coli DH5α，挑选单克隆测序，鉴定获得点突成功的阳性克隆，抽提质粒，再将不同突变类型质粒与PAC-94N质粒共同转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化结束后，将菌液涂布于含有氨苄青霉素（100 μg/L）和氯霉素（34 μg/L）的平板，最终获得饱和突变文库。
在上述饱和突变文库中，挑选成功转入双质粒的E.coli BL21(DE3)阳性单克隆，培养于含有氨苄青霉素（100 μg/L）和氯霉素（34 μg/L）的LB液体培养基（1ml）里培养过夜后，再取过夜培养的菌液500μl接种到含有20ml的LB液体培养基里（氨苄青霉素100 μg/L+氯霉素34 μg/L），37℃、200rpm培养3h至OD600=0.6后，加入终浓度为0.2mM 的IPTG，16℃诱导表达20小时后，离心弃上清，对沉淀进行拍照后，采用2ml的丙酮重悬，测量OD440值。
以突变前的野生型为对照，筛选吸光度明显增强的突变类型即为GGPPS活性提高突变类型。
基于上述筛选过程和方法，最终确定：
针对第213位点：当原有的213位点的缬氨酸Val（V）突变为丙氨酸Ala（A）、半胱氨酸Cys（C）或者苏氨酸Thr（T）；
针对第269位点：当原有的269位点的赖氨酸Lys（K）突变为甲硫氨酸Met（M）、天冬氨酸Asn（N）、谷氨酰胺Glu（Q）或者精氨酸Arg（R）时，小麦牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶GGPPS活性有明显提高。
部分实验筛选结果如图2、图3所示，具体而言：
第213位缬氨酸Val（V）突变为丙氨酸Ala（A）、半胱氨酸Cys（C）或者苏氨酸Thr（T），或者当第269位赖氨酸Lys（K）突变为甲硫氨酸Met（M）、天冬氨酸Asn（N）、谷氨酰胺Glu（Q）或者精氨酸Arg（R）时，菌体颜色或者说β-胡萝卜素合成量明显提升，此时即可证明特定位点特定突变后，小麦GGPPS酶活得到了显著提升。
进一步地，基于前述单位点突变筛选结果，发明人将第213位和第269位进行了不同组合形式的同时双突变，并进行了进一步实验检测。
部分实验筛选验证结果如图4、图5所示。可以看出：不同突变蛋白组合情况下，菌体颜色或者说β-胡萝卜素合成量也均有明显变化；比较明显效果而言：
当：第213位缬氨酸Val(V)突变为A的同时，第269位点突变为甲硫氨酸Met（M）、天冬氨酸Asn（N）、谷氨酰胺Glu（Q）或者精氨酸Arg（R）；
或者当：第213位缬氨酸Val(V)突变为C的同时，第269位点突变为甲硫氨酸Met（M）、天冬氨酸Asn（N）、谷氨酰胺Glu（Q）或者精氨酸Arg（R）时，菌体颜色或者说β-胡萝卜素合成量明显提升，即小麦GGPPS酶活显著提升。
并且：当第213位突变为半胱氨酸Cys（C），且第269位突变为精氨酸Arg（R）时，突变后GGPPS酶活具有最高活性。
上述结果表明，针对特定位点的定向突变进化方式，可以较好提高GGPPS酶活，从而为进一步提高小麦及其他作物中β-胡萝卜素含量奠定良好基础。
需要说明的是，特定突变位点突变后的GGPPS氨基酸及对应的编码基因序列，可参考如下（基于对应的编码基因，可结合基因工程技术进一步用于小麦品种改良或者小麦品种培育）：
针对213位点：
当213位点突变为A时，其氨基酸序列为：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLAAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRKYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN*；
其对应碱基编码序列为：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCGCCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCAAGTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA；
当213位点突变为C时，其氨基酸序列为：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLCAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRKYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN*；
其对应碱基编码序列为：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCTGCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCAAGTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA；
当213位点突变为T时，其氨基酸序列为：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLTAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRKYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN*；
其对应碱基编码序列为：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCACCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCAAGTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA；
针对269位点：
当269位点突变为M时，其氨基酸序列为：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLVAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRMYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN*；
其对应碱基编码序列为：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCGTCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCATGTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA；
当269位点突变为N时，其氨基酸序列为：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLVAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRNYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN*；
其对应碱基编码序列为：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCGTCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCAACTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA；
当269位点突变为Q时，其氨基酸序列为：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLVAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRQYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN*；
其对应碱基编码序列为：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCGTCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCCAGTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA；
当269位点突变为R时，其氨基酸序列为：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLVAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRRYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN*；
其对应碱基编码序列为：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCGTCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCCGCTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA。
其他双位点的具体碱基序列参考上述即可，例如，针对两位点突变蛋白GGPPS-213C/269R，其氨基酸序列为：
MAAFHPLVASRVRLTTPLLPVAAPAAAAAAGVSFHRRRFSAIVAAATAPAATGFDFNSYMGERAVAVNSALDAAVPAGEPPAALHEAMRYALLAGGKRVRPALCLAACVVSGGREAWAMAPAAAVEMVHTMSLVHDDLPCMDDDNLRRGKPTCHVMYGEPIAVLAGDALLALAFQHMASVDSYPPDVDPAKHTARVVRAIGELARCIGSEGLCAGQVVDLEMTGSTETVPLDRLEYIHLHKTAALLEASVVIGAIIGGGSEEQIERLRRYARSIGLLFQVVDDILDVTKSSEELGKTAGKDLASDKTTYPKLLGLEKSREFAEKLLSDAKEQLADFDKEKAAPLLYLANYIAYRQN*;
此时，对应编码碱基序列为：
ATGGCAGCGTTCCACCCCCTGGTCGCCTCGCGCGTCCGCCTCACCACCCCGCTCCTCCCCGTCGCCGCGCCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCGGGGTCTCCTTCCACCGGCGCCGCTTCTCCGCCATCGTCGCCGCGGCGACCGCGCCCGCGGCCACCGGGTTCGACTTCAACTCCTACATGGGGGAGCGGGCGGTGGCCGTGAACAGCGCCCTGGACGCGGCCGTCCCGGCCGGCGAGCCCCCCGCGGCGCTCCACGAAGCGATGCGCTACGCGCTGCTGGCCGGGGGCAAGCGCGTGCGCCCGGCCCTCTGCCTGGCCGCCTGCGTCGTGTCCGGCGGCCGCGAGGCCTGGGCGATGGCCCCCGCCGCCGCGGTCGAGATGGTGCACACCATGTCGCTCGTGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACGACGACAACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCTGCCACGTCATGTACGGCGAGCCCATCGCCGTGCTCGCCGGCGACGCCCTGCTCGCGCTCGCCTTCCAGCACATGGCCAGCGTCGACTCCTACCCTCCGGATGTCGACCCCGCCAAGCACACCGCCCGCGTCGTCCGGGCCATTGGTGAGCTCGCGCGCTGCATCGGATCAGAGGGCCTCTGCGCCGGCCAGGTTGTTGATCTGGAGATGACTGGCTCAACTGAGACTGTACCACTTGACCGCCTTGAGTACATCCATCTGCACAAGACTGCTGCCTTGCTTGAGGCCTCAGTGGTTATTGGAGCAATCATCGGGGGTGGCTCAGAAGAGCAGATTGAGCGGTTGCGCCGCTACGCGAGATCAATTGGGTTGCTGTTCCAGGTGGTTGATGACATTCTTGATGTGACCAAGTCATCAGAGGAGCTAGGGAAGACAGCTGGGAAGGACTTGGCGAGTGACAAAACGACATACCCCAAGTTACTAGGGTTGGAGAAGTCACGGGAATTTGCGGAGAAGTTGCTTTCTGATGCAAAGGAGCAACTTGCTGATTTTGATAAAGAGAAGGCAGCACCGCTATTGTACTTGGCCAATTATATTGCCTATCGGCAGAACTAA。
Claims (5)
1.与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的GGPPS突变蛋白，其特征在于，所述GGPPS突变蛋白，与现有如SEQ ID No.1所示小麦GGPPS蛋白氨基酸序列相比，其213位点和/或269位点发生了单位点或双位点突变；
所述单位点突变，包括两种类型：
对于213位点：对GGPPS酶结构分析表明，由于213位点位于酶的 “催化口袋处”， 原213位点的缬氨酸Val突变为丙氨酸Ala、半胱氨酸Cys或者苏氨酸Thr后，有利于底物与酶活口袋的结合；即：单位点突变蛋白GGPPS-213的213位点为丙氨酸Ala、半胱氨酸Cys或者苏氨酸Thr；
对于269位点：对GGPPS酶结构分析表明，由于269位点位于酶分子表面，原269位点的赖氨酸Lys突变为甲硫氨酸Met、天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Glu或精氨酸Arg后，有利于形成GGPPS同源二聚体；即：单位点突变蛋白GGPPS-269的269位点为甲硫氨酸Met、天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Glu或者为精氨酸Arg；
所述双位点突变，为213位点和269位点同时发生突变；其中原213位点的缬氨酸Val突变为丙氨酸Ala、半胱氨酸Cys或者苏氨酸Thr，同时，原269位点的赖氨酸Lys突变为甲硫氨酸Met、天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Glu或精氨酸Arg。
2.如权利要求1所述与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的GGPPS突变蛋白，其特征在于，所述双位点突变，双位点突变蛋白GGPPS-213-269在213和269位点组合为：213A-269M、213A-269N、213A-269Q、213A-269R、213C-269M、213C-269N、213C-269Q、213C-269R、213T-269M、213T-269N、213T-269Q或213T-269R。
3.权利要求1或2所述与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的GGPPS突变蛋白在小麦育种中的应用，其特征在于，利用GGPPS突变蛋白对应的编码基因培育具有更高GGPPS酶活和/或更好GGPPS稳定性的小麦品种。
4.如权利要求3所述与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的GGPPS突变蛋白在小麦育种中的应用，其特征在于，所述GGPPS突变蛋白，用于色素类物质的合成。
5.如权利要求4所述与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的GGPPS突变蛋白在小麦育种中的应用，其特征在于，所述色素类物质为β-胡萝卜素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202311780796.2A CN117737026A (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | 与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的ggpps突变蛋白 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311780796.2A CN117737026A (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | 与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的ggpps突变蛋白 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN117737026A true CN117737026A (zh) | 2024-03-22 |
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ID=90252500
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| CN202311780796.2A Pending CN117737026A (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | 与小麦籽粒中类胡萝卜素含量相关的ggpps突变蛋白 |
Country Status (1)
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-
2023
- 2023-12-22 CN CN202311780796.2A patent/CN117737026A/zh active Pending
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