CN117736996A - 一种car-t细胞培养基及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CAR‑T细胞培养基及其培养方法，涉及生物医药技术领域，包括以下组分：血小板裂解物、L‑谷氨酰胺、烟酰胺、I L7和I L15，所述血小板裂解物的浓度为2～5％，所述L‑谷氨酰胺的浓度为1～5mM，所述烟酰胺浓度为1～5mM，所述I L7浓度为5～10μM，所述I L15浓度为5～10μM。本发明培养基中添加有血小板裂解物、L‑谷氨酰胺、烟酰胺、I L7和I L15，可以使被培养的CAR‑T细胞获得更高的增殖能力、更低的耗竭指标以及更多的幼稚型表型，增强了抗肿瘤能力。

Description

一种CAR-T细胞培养基及其培养方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种CAR-T细胞培养基及其培养方法。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)是将嵌合抗原受体(CAR)导入T细胞，通过对癌细胞表面抗原进行特异性识别达到对癌细胞特异性杀伤的效果，近年来，该疗法被认为是最有希望攻克癌症的疗法之一，其有很多其他疗法无法比拟的优势。

然而，自体CAR-T由于需要使用患者自身的T细胞，因此只适用于那些可以提取足够数量且质量良好的T细胞的患者。而且，对于一些晚期病例或者存在T细胞功能缺陷的患者，其T细胞的数量和质量可能无法满足治疗的需求，同时，由于自体CAR-T的治疗周期长，价格高昂，使得其应有范围受到了较大的限制，故需要探索新的方法来克服这些缺点，以实现CAR-T细胞治疗的广泛应用，因此通用型CAR-T应运而生。

通用型CAR-T是利用健康捐献者的T细胞改造成CAR-T细胞，但由于健康捐献者和患者体内的T细胞存在差异，可能会引发移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)，即异体的CAR-T细胞可能会攻击患者的正常组织，同时，供体的基因编码受体所没有的抗原，被受体的免疫细胞识别后引起排斥反应，既宿主抗移植物反应(host versusgraft reaction,HVGR)。通用型CAR-T细胞通过将T细胞TCR、HLA-I、HLA-II敲除来避免这些问题，但基因敲除对细胞会造成不可逆的伤害，导致细胞扩增的能力大大下降，同时增加细胞的耗竭，幼稚型的T细胞表型也明显减少。

近年来，通过改变细胞因子等能够相对提高幼稚性CAR-T细胞的比例，但幼稚性CAR-T细胞比例有限，细胞扩增数量也没有得到更好的解决。因此，如何获得分化状态低、抗肿瘤能力强的CAR-T细胞是目前过继性细胞免疫治疗领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CAR-T细胞培养基及其培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种CAR-T细胞培养基，包括以下组分：血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、I L7和I L15。

本发明培养基为CAR-T细胞制备过程中不同阶段(T细胞活化阶段、CAR-T细胞持续培养阶段、CAR-T细胞培养后期阶段)使用的培养基，该培养基培养的CAR-T细胞中的幼稚性CAR-T细胞占比较不含有血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、I L7和I L15的CAR-T细胞培养基显著提高并且可以增加抗肿瘤效果。

本发明培养基还包括其他组分，其他组分均为本领域常规使用的在T细胞活化阶段使用的培养基的常规组分，在X-vivo培养基中在不同阶段添加血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、IL7和IL15。

作为本发明进一步的方案：所述血小板裂解物的浓度为2～5％。

作为本发明再进一步的方案：所述L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM。

作为本发明再进一步的方案：所述烟酰胺浓度为1～5mM。

作为本发明再进一步的方案：所述I L7浓度为5～10μM。

作为本发明再进一步的方案：所述I L15浓度为5～10μM。

一种CAR-T细胞培养方法，基于上述的CAR-T细胞培养基，所述方法包括在T细胞活化阶段，使用CAR-T细胞培养基进行活化，活化时间为24～48小时。

一种CAR-T细胞培养方法，基于上述的CAR-T细胞培养基，所述方法包括在CAR-T细胞持续培养阶段，使用CAR-T细胞培养基进行培养，培养时间为1～14天。

一种CAR-T细胞培养方法，基于上述的CAR-T细胞培养基，所述方法包括在通用型CAR-T细胞培养后期阶段，使用CAR-T细胞培养基进行培养，培养时间为36～48小时。

一种CAR-T细胞培养基的应用，在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明中，CAR-T细胞的制备包括三个步骤：(1)T细胞的活化和CAR转染；(2)敲除基因并扩增培养通用型CAR-T细胞；(3)培养后期，即培养结束前1-2天，添加血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、I L7和I L15来实现技术效果。

本发明中，涉及的T细胞为现有所有类型的T细胞；涉及的CAR为现有所有类型的CAR；涉及的CAR转染T细胞的方法为现有所有所知的技术，比如慢病毒转染，脂质体转染等；涉及的通用型CAR-T细胞敲除的方法为现有所有所知的方法，比如CRI SPR/Cas9方法、TALEN法等。

本发明中，“CAR-T细胞培养后期阶段”指的是CAR-T细胞持续培养结束前1-2天，将添加物加入培养基中继续培养一段时间。

本发明还提供了一种CAR-T细胞培养基制备的CAR-T细胞或CART细胞制品，该CAR-T细胞或CAR-T细胞制品较一般培养基培养的CAR-T细胞或CAR-T细胞制品中，幼稚性CAR-T的占比较多，可以有效扩增细胞数量，增强抗肿瘤效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明培养基中添加有血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、I L7和I L15，可以使被培养的CAR-T细胞获得更高的增殖能力、更低的耗竭指标以及更多的幼稚型表型，增强了抗肿瘤能力。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的使用不同培养基培养的CAR-T细胞的细胞表型分析图；

图2为本发明实施例提供的使用不同培养基培养的CAR-T细胞的细胞耗竭情况分析图；

图3为本发明实施例提供的使用不同培养基培养的CAR-T细胞的细胞增殖分析图；

图4为本发明实施例提供的使用不同培养基培养的CAR-T细胞不同效靶比条件下的肿瘤杀伤能力分析图；

图5为本发明实施例提供的动物水平实验获得的小鼠皮下移植瘤体积变化结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-5，本发明提供了，

实施例1

一种CAR-T细胞培养基，包括以下组分：血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、IL7和IL15。用于通用型CAR-T细胞培养、CAR-T细胞培养或T细胞培养。

本发明提供的再一个实施例中，血小板裂解物的浓度为2～5％。

优选的，血小板裂解物的浓度为2％。

本发明提供的再一个实施例中，L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM。

优选的，L-谷氨酰胺的浓度为2mM。

本发明提供的再一个实施例中，烟酰胺浓度为1～5mM。

优选的，烟酰胺浓度为1mM。

本发明提供的再一个实施例中，I L7浓度为5～10μM。

优选的，I L7浓度为5μM。

本发明提供的再一个实施例中，I L15浓度为5～10μM。

优选的，I L15浓度为10μM。

实施例2

一种CAR-T细胞培养方法，基于上述的CAR-T细胞培养基，方法包括在T细胞活化阶段，使用CAR-T细胞培养基进行活化，活化时间为24～48小时。

优选的，在T细胞活化阶段，使用CAR-T细胞培养基进行活化，活化时间为24小时。

实施例3

一种CAR-T细胞培养方法，基于上述的CAR-T细胞培养基，方法包括在CAR-T细胞持续培养阶段，使用CAR-T细胞培养基进行培养，培养时间为1～14天。

优选的，培养时间为1天。

具体地，可以在CAR-T细胞制备的各个阶段的培养基中均添加血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、I L7和I L15，也可以在各个阶段分别添加血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、I L7和I L15。

实施例4

一种CAR-T细胞培养方法，基于上述的CAR-T细胞培养基，方法包括在通用型CAR-T细胞培养后期阶段，使用CAR-T细胞培养基进行培养，培养时间为36～48小时。

优选的，培养时间为48小时。

实施例5

一种CAR-T细胞培养基的应用，在制备抗肿瘤药物中的应用。具体为在制备抗肿瘤的CAR-T细胞或CAR-T细胞制品时作为添加剂的应用，通过提高幼稚型CAR-T细胞的占比，提高抗肿瘤效果。

实验例1

制备通用型CAR-T，通过添加不同类型的培养基，对添加不同类型培养基的各实验例进行细胞的表型、耗竭情况和细胞增殖进行测试。

具体包括以下步骤：

1)将用于病毒包装的293T细胞在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，所用培养基为含有10％Gibco胎牛血清的DMEM培养基。

2)在正式包病毒的前一天，将培养的293T细胞以1×107的细胞数在T75细胞瓶中进行传代。

3)当293T细胞达到70-80％的融合度且均匀分布于培养瓶中时，开始进行慢病毒包装。

4)准备制备质粒和转染试剂稀释液，漩涡震荡混匀PEI40K转染试剂。

5)准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。

6)充分混匀。

7)将转染试剂稀释液(离心管2)加入质粒DNA溶液(离心管1)中，立刻充分混匀。注意加入顺序非常重要。

8)室温孵育转染混合液15-20分钟。

9)将铺好293T细胞的培养瓶中的旧培养基弃去，加入9ml新的DMEM培养基，接着加入孵育完成的1ml转染混合液，轻轻吹吸培养基混匀。

10)将细胞于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养6小时后，弃去瓶中培养基，加入15ml新培养基。

11)转染后48小时收集细胞培养上清，并再加入15m l的新培养基，转染后72小时收集，共得30ml细胞培养上清，1000g离心8min，再用0.45nm孔径的滤膜过滤去除细胞碎片，并转移至超速离心管中。

12)使用超速离心机4℃，22000rpm离心1.5h，用移液枪吸取上清并丢弃，用200μl的X-VIVO培养基重悬病毒沉淀，转移至EP管中，置于4℃冰箱过夜保存。

13)从培养箱中取出1×106个前一天分离的T细胞，加入100μl病毒重悬液后，置于37℃培养箱中培养24h，24h后吸取全部细胞，换液继续培养，培养出来的细胞即所需的CAR-T细胞。

14)配制电转液:补充液全部加入到溶解液中，溶解液与补充液的比例为4.5:1。

15)准备适量培养基放置在孔板中并在培养箱中预温。

16)将TRAC-sgRNA溶解为100pmo l/μl的溶液。

17)分别以75pmo l的量将TRAC-sgRNA与60pmo l的cas9蛋白混合，孵育10min。

18)离心计数细胞后，取用1×107个细胞再次离心，使用200μl电转液进行重悬。

19)分别向RNP中加入20μl重悬细胞液。

20)将细胞液转移进条板中。

21)打开电转仪器并选择板条选项，使用T细胞编辑程序EN113进行电转敲除。

22)选择已经加入细胞液的孔洞，并选择T cell editing选项。

23)点开始按钮，在电转结束后，将混合液转移进事先备好的培养基中，并在培养箱中培养。培养出来的细胞即所需的通用型CAR-T细胞。

24)培养过程中，使用所配制的不同类型的培养基进行培养，每3天测一次细胞数，在培养第10天，通过流式细胞仪分析细胞的表型和耗竭情况。

具体实验结果参见图1-3，可见，本发明培养基即添加了血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、IL7和IL15的培养基获得的通用型CAR-T细胞与其他实验例相比获得更高的增殖能力、更低的耗竭指标以及更多的幼稚型表型，增强了抗肿瘤能力。

实验例2

测试上述各不同实验例得到的通用型CAR-T细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用。

具体包括以下步骤：

(1)将X-VIVO无血清细胞培养基放置37℃水浴孵育；

(2)准备状态良好的7860-luc细胞；

(3)铺板杀伤前，将在培养的7860-luc细胞中的培养基转入15ml离心管，并用PBS润洗一下培养瓶底部，加入适量的0.25％胰酶消化，见细胞悬浮，用移液管吸取原细胞培养上清加入培养瓶停止消化，吹散细胞后转入15ml离心管，离心(400g，5min)去上清；

(4)在96孔细胞培养板中选择所需孔数(根据样本量计算所需孔数：10(N＝1)；10*(N-1)，N>＝2；N为样本量)加入60μl浓度为3.33*10⁵个/ml的7860-luc细胞，这样每孔加入的靶细胞为20000个细胞；

(5)将铺好靶细胞的细胞培养板放置在37℃，5％二氧化碳培养箱孵育3-5h或者过夜；

(6)待测试的anti-CD70 CAR-T细胞根据不同的阳性率和效靶比E:T调节细胞的悬浮浓度，靶细胞为20000个细胞，效靶比E:T为8:1时，由于加入培养基的量也为60μl，所以，该细胞需要调节到(160000/0.06/阳性率)cells/ml，同时1:1、1:2、1:4效靶比为依次对半稀释(150μl细胞悬液+150μl含10％FBS的X-VIVO无血清细胞培养基)；

(7)将铺好细胞的细胞培养板放置在37℃，5％二氧化碳培养箱孵育一段时间；

(8)在孵育结束之前将ONE-Glo Luciferase Assay System试剂盒中的试剂从-20℃冰箱取出，放置室温待试剂融化，按照说明书用E605A试剂溶解E606A粉末，完全溶解后用EP管进行分装，存储在-20℃冰箱，以后实验可以直接取出恢复室温使用；

(9)打开多功能酶标仪和软件，选择Luminescence模式，进行读板布局；

(10)每孔细胞中加入配置好的试剂100μl，吹打混匀几下，在室温避光放置10min，用移液枪吸取180μl细胞培养板中的溶液平移转入96孔白色平底板中，避免产生气泡；将96孔白色平底板放置酶标仪读取数据，并导出数据保存，用于计算细胞杀伤率，细胞杀伤率＝(背景发光值-样本发光值)/背景发光值*100％；

实验结果详见图4，CD70 CAR-T对肾癌细胞(786-0)在相同时间下所造成的杀伤效果随着效靶比的升高而升高。

实验例3

NCG小鼠(购自百奥赛图基因生物技术有限公司)背部皮下依次接种CD70高表达的786-0肿瘤细胞，构建皮下移植瘤模型。肿瘤注射后第20、25天后分组(每组5只)进行AntiCD70 CAR-T细胞组、mock T细胞和PBS尾静脉输注治疗，每3-5天观察并记录小鼠存活情况并测量肿瘤大小，实验结果参见图5，结合四种肿瘤模型可以看出，注射使用本发明含有血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、IL7和IL15的培养基培养的细胞实验组肿瘤消退地最快。

综上所述，本发明提供的包含血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、IL7、I L15的T细胞活化/CAR-T细胞持续培养/通用型CAR-T细胞培养后期基较不含血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、IL7、IL15对应的培养基培养得到的CAR-T细胞或CAR-T细胞制品中，幼稚性CAR-T细胞的占比均有所提高，抗肿瘤效果显著增强。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种CAR-T细胞培养基，其特征在于：包括以下组分：血小板裂解物、L-谷氨酰胺、烟酰胺、IL7和IL15。

2.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养基，其特征在于：所述血小板裂解物的浓度为2～5％。

3.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养基，其特征在于：所述L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM。

4.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养基，其特征在于：所述烟酰胺浓度为1～5mM。

5.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养基，其特征在于：所述IL7浓度为5～10μM。

6.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养基，其特征在于：所述IL15浓度为5～10μM。

7.一种CAR-T细胞培养方法，基于权利要求1～6中任意一项所述的CAR-T细胞培养基，其特征在于：所述方法包括在T细胞活化阶段，使用CAR-T细胞培养基进行活化，活化时间为24～48小时。

8.一种CAR-T细胞培养方法，基于权利要求1～6中任意一项所述的CAR-T细胞培养基，其特征在于：所述方法包括在CAR-T细胞持续培养阶段，使用CAR-T细胞培养基进行培养，培养时间为1～14天。

9.一种CAR-T细胞培养方法，基于权利要求1～6中任意一项所述的CAR-T细胞培养基，其特征在于：所述方法包括在通用型CAR-T细胞培养后期阶段，使用CAR-T细胞培养基进行培养，培养时间为36～48小时。

10.根据权利要求1～6中任一项所述的一种CAR-T细胞培养基的应用，其特征在于：在制备抗肿瘤药物中的应用。