CN117736971A - 腮腺上皮细胞培养物及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开腮腺上皮细胞培养物及其培养方法和应用。本发明的方法包括使腮腺组织在分离培养基中培养得到腮腺原代上皮细胞；使腮腺原代上皮细胞在条件培养基中进行培养；并将得到的细胞进行传代继续培养；其中，条件培养基以不含血清的DMEMF12为基础培养基，添加包含EGF、FGF2、胰岛素、BPE、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子。本发明能够培养人腮腺原代上皮细胞，所用的培养基配方可以稳定的对人腮腺原代上皮细胞扩增培养、传代，而其他类型细胞受抑制，从而成功建立行之有效的人腮腺原代上皮细胞培养体系，为唾液腺相关疾病研究提供细胞模型。
Description
技术领域
本发明涉及原代上皮细胞培养领域，具体地涉及腮腺上皮细胞培养物及其培养方法和应用。
背景技术
腮腺是人体三大唾液分泌器官之一，其主要功能是分泌唾液。腮腺疾病种类较多，涵盖炎症、损伤、肿瘤、舍格伦综合征和放射损伤等，其中放射损伤和舍格伦综合征对腮腺功能破坏最为严重，患者口干明显，极大地影响了生活质量，需要深入研究解决唾液腺放射损伤以及舍格伦综合征这类严重的临床问题。
腮腺是上皮器官，主要有浆液性上皮细胞和导管上皮细胞两种细胞类型，其上皮细胞在体内基本不分裂，处于静息状态，浆液性腺泡上皮细胞和导管上皮细胞均为高度分化的细胞，细胞平均寿命周期超过三个月，其自我更新有丝分裂速率较低。因此，在体外培养腮腺组织来源的原代上皮细胞十分困难。关于腮腺的研究主要用动物模型进行实验，包括小型猪、小鼠和大鼠，这些动物与人类存在物种差别，只能模拟人的腮腺研究。已有的成品上皮培养基无法满足腮腺细胞培养需求。腮腺细胞研究常用的唾液腺上皮细胞系是日本科学家Miyazaki从人颌下腺导管上皮分离培养建系的，但是该细胞系可能存在Hela污染，严重影响研究结果的准确性。综上，目前没有理想的腮腺原代上皮细胞培养体系，限制了与腮腺相关的在机制方面上的深入研究。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供腮腺上皮细胞培养物及其培养方法和应用。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)使腮腺组织在分离培养基中培养得到腮腺原代上皮细胞；
(2)使腮腺原代上皮细胞在条件培养基中进行培养；和
(3)将步骤(2)的得到的细胞进行传代继续培养；
其中，所述分离培养基为含血清的DMEMF12培养基，所述条件培养基以不含血清的DMEMF12为基础培养基，同时添加包含EGF、FGF2、胰岛素、BPE、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，基于所述条件培养基，所述EGF的含量为0.01-0.05μg/ml，所述FGF2的含量为0.01-0.05μg/ml，所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，所述BPE的含量为10-90μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，所述腮腺组织为来源于人的腮腺组织。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，所述方法包括：取正常腮腺组织用PBS去除血污后，剪碎得到组织块，随后用I型胶原酶和中性金属蛋白水解酶消化，弃掉消化酶后，先用含血清的DMEMF12培养基培养，待上皮细胞爬出后，换条件培养基进行上皮细胞的培养，常规换液，细胞融合至80％-90％时胰蛋白酶消化传代。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，进一步包括对步骤(3)继续培养后的细胞进行形态分析和类型鉴定的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，所述类型鉴定包括检测作为标志物的角蛋白5、钠钾氯协同转运蛋白和/或激肽释放酶血管舒缓素的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，所述步骤(1)得到的腮腺原代上皮细胞包括腺泡上皮细胞和导管上皮细胞，且不包含成纤维细胞。
本发明的第二方面，提供用于培养腮腺原代上皮细胞的培养基，其以不含血清的DMEMF12为基础培养基，同时添加包含EGF、FGF2、胰岛素、BPE、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子，其中：
所述EGF的含量为0.01-0.05μg/ml，所述FGF2的含量为0.01-0.05μg/ml，所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，所述BPE的含量为10-90μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml。
本发明的第三方面，提供腮腺上皮细胞培养物，其包含通过第一方面所述的方法培养得到的混合细胞。
本发明的第四方面，提供第三方面所述的腮腺上皮细胞培养物在唾液腺及相关疾病研究中的应用。
本发明所用的方法能成功培养人腮腺原代上皮细胞，并能有效传代多达15以上，所用的培养基配方可以稳定的对人腮腺原代上皮细胞扩增培养、传代，从而成功建立行之有效的人腮腺原代上皮细胞培养体系，可为唾液腺相关疾病研究提供细胞模型，从而可进行深入机制的研究探索，为腮腺发育、再生、类器官培养、干细胞鉴定以及腮腺相关疾病等的研究提供良好的基础。
附图说明
图1hPGECs细胞在不同传代次数后的细胞形态。
图2示例性hPGECs细胞鉴定图。
图3流式细胞技术分选结果，Q1为腺泡上皮细胞区域，Q3为导管上皮细胞区域。
图4对比例1细胞在传代5次后细胞培养结果图。
图5对比例2细胞及增殖情况。A：不添加BPE，细胞状态不好，表现为细胞摊平，以及失去上皮细胞典型的铺路石样改变；B：不添加BPE后用CCK8连续检测7天细胞增殖，与实施例1对比，细胞增殖速率显著变慢。
图6对比例3细胞增殖情况。不添加FGF2后用CCK8连续检测7天细胞增殖，与实施例1对比，细胞增殖速率显著变慢。
图7由本发明传代得到的hPGECs细胞所形成的类器官图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本文中，术语“腮腺原代上皮细胞”是指直接来源于腮腺的未经培养的上皮细胞，本文有时简称为“本发明的上皮细胞”。腮腺的结构以腺上皮为主，同时还包括其他组织，其由上皮细胞、成纤维细胞等多种不同类型的细胞组成。上皮细胞是腮腺中的一种细胞类型，本发明的腮腺上皮细胞主要为浆液性腺泡上皮细胞和导管上皮细胞，此类细胞均为高度分化的细胞，自我更新有丝分裂速率较低，在体外培养腮腺组织来源的原代上皮细胞十分困难。
[用于培养腮腺原代上皮细胞的方法]
本发明的第一方面，提供用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)使腮腺组织在分离培养基中培养得到腮腺原代上皮细胞；
(2)使腮腺原代上皮细胞在条件培养基中进行培养；和
(3)将步骤(2)的得到的细胞进行传代继续培养；可选地，进一步包括：
(4)对步骤(3)继续培养后的细胞进行形态分析和类型鉴定。
步骤(1)：
本发明的步骤(1)为分离步骤，具体地，包括使腮腺组织在分离培养基中培养得到腮腺原代上皮细胞。其中，腮腺组织优选为正常组织，即非病变组织。腮腺组织可以是直接从机体分离得到，也可以是预先冷冻保藏的组织。对此不特别限定。
本发明中，腮腺组织在较大的情况下，一般包括小块化处理，例如剪碎处理，由此得到组织块，组织块大小不特别限定，例如平均0.1-10mm3，0.5-8mm3，1-6mm3，2mm3，3mm3，4mm3，5mm3。组织块越大不利于上皮细胞爬出或分离。另一方面，如果组织块过小，则细胞趋向于受损，影响其活力。
本发明中，在腮腺组织小块化处理后可选地进一步包括消化处理，消化处理包括使用消化酶。消化酶优先使用复合酶，其实例包括但不限于含胶原酶和中性金属蛋白水解酶的复合酶。胶原酶的浓度不特别限定一般可控制为0.5-5mg/ml、0.6-4mg/ml、0.8-3mg/ml、1-2mg/ml等。中性金属蛋白水解酶的浓度一般可控制为0.5-5mg/ml、0.6-4mg/ml、0.8-3mg/ml、1-2mg/ml等。消化处理时的温度不限定，一般为20-45℃，优选25-40℃，如30℃、35℃、37℃等。
本发明中，分离培养基为含血清培养基，基础培养基不特别限定，只要适于上皮细胞生长即可，包括但不限于DMEMF12培养基。分离培养基中血清的浓度不限定，一般为5-30％，如10-25％、15％、20％、25％等。组织或组织块在分离培养基培养的时间不限定，以上皮细胞充分爬出为宜，一般而言，可培养1-8天，2-6天、3-5天等。如果培养时间过长，则培养基成分消耗过度，培养不充分，或培养基不足，或者组织块干燥。如果培养时间不足，则细胞不能充分爬出，影响分离效果。
本发明中，可选地，进一步包括在细胞爬出后收集细胞的步骤。收集细胞可通过消化酶，如胰蛋白酶消化并进一步通过离心分离。
步骤(2)：
将步骤(1)爬出的细胞或收集的细胞置于条件培养基进一步进行培养。在条件培养基培养时可进行常规一次或多次换液。条件培养基为不含血清的培养基，其以DMEMF12为基础培养基，添加特定的活性因子。本发明通过添加特定的活性因子，从而促进上皮细胞分裂增殖，但不促进其他类型细胞分裂或增殖。
本发明中，活性因子是多种成分的组合，其包含EGF、FGF2、胰岛素、BPE、氢化可的松和转铁蛋白。基于条件培养基，EGF的含量为0.01-0.05μg/ml，如0.02μg/ml、0.03μg/ml、0.04μg/ml。所述FGF2的含量为0.01-0.05μg/ml，如0.02μg/ml，0.03μg/ml，0.04μg/ml，0.05μg/ml。所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，如2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml，所述BPE的含量为10-90μg/ml，如12μg/ml，5μg/ml，16μg/ml，18μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，如0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml，如0.06μg/ml、0.08μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml。在上述配方范围内，能够促进上皮细胞的生长和分裂，同时还能够选择性抑制其他类型细胞，特别是成纤维细胞的生长，从而有利于得到高纯度腮腺上皮细胞。
步骤(3)：
本发明的步骤(3)为传代培养步骤，其包括将步骤(2)的得到的细胞进行传代继续培养。本发明的传代培养使用的培养基与步骤(2)使用的培养基相同。只要传代后继续培养的培养基不变，则其他条件不限定，可以使用本领域已知的任何条件。
步骤(4)：
本发明中，步骤(4)为可选步骤，其包括对步骤(3)继续培养后的细胞进行形态分析和类型鉴定。形态分析或类型鉴定的目的在于确认传代后培养的细胞状态是否满足所需。
本发明中，形态分析可包括目测或通过仪器放大后的观察。一般而言，如果经培养后细胞具有上皮细胞典型的铺路石样形态，则认定细胞状态好。
本发明中，类型鉴定包括确认所培养的细胞属于是否属于上皮细胞，可选地进一步包括确认是否存在杂质细胞如成纤维细胞。杂质细胞和上皮细胞的区分可通过目测观察容易地分辨，当然也可通过检测细胞标志物来区分。可选地，本发明的类型鉴定还包括确认上皮细胞的具体类型，例如确认是腺泡上皮细胞，还是导管细胞。上皮细胞具体类型的鉴定可通过细胞标志物的检测来进行。例如，使用钠钾氯协同转运蛋白(NKCC1)作为细胞标志物来鉴定腮腺腺泡上皮细胞，使用激肽释放酶血管舒缓素1(KLK1)来鉴定导管上皮细胞。本发明中细胞标志物通常为生物大分子，如蛋白质，其可通过例如特异性抗体来进行细胞标志物的检测。
[用于培养腮腺原代上皮细胞的培养基]
本发明的第二方面，提供用于培养腮腺原代上皮细胞的培养基，其以不含血清的DMEMF12为基础培养基，添加包含EGF、FGF2、胰岛素、BPE、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子。本发明中DMEMF12为本领域已知培养基，活性因子已在上文本发明第一方面中进行了详细说明，在此不再赘述。
[腮腺上皮细胞培养物]
本发明的第三方面，提供腮腺上皮细胞培养物，其包含通过第一方面所述的方法培养得到的混合细胞，本文有时简称为“本发明的培养物”。
本发明的培养物优选由混合细胞经有序排列也形成的组织或类组织、类器官，其通常可由本发明第一方面得到的上皮细胞混合物经进一步培养直接得到。
[应用]
本发明的第四方面，提供第三方面所述的腮腺上皮细胞培养物在唾液腺及相关疾病研究中的应用。
本发明的应用具体包括以腮腺上皮细胞培养物为细胞模型，基于腮腺上皮细胞进行各种实验，从而促进腮腺发育、再生、类器官培养、干细胞鉴定、唾液腺上皮诱导分化以及腮腺相关疾病等的研究。本发明中，腮腺相关疾病包括放射损伤、舍格伦综合征等等。
实施例1
一、细胞分离
罹患腮腺良性肿瘤患者在接受肿瘤及腮腺浅叶切除术时，从远离肿瘤部位取一块约1cm3大小的正常腮腺组织，该做法对患者没有任何额外伤害，对预后也没有任何影响。PBS去除血污后，剪刀剪碎为1mm3大小的组织块，随后用I型胶原酶(1mg/ml)和dispase酶II(1mg/ml)在37℃水浴锅中消化30分钟，弃掉消化酶后，先用含20％血清的DMEMF12培养基培养4天左右，待上皮细胞爬出后，换条件培养基(DMEMF12)进行上皮细胞的培养，常规2天换液。细胞融合至80％左右时用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。其中，条件培养基不含血清，以DMEMF12为基础培养基，添加0.02μg/ml EGF、0.02μg/ml FGF2、10μg/ml Insulin、50μg/ml BPE、0.5μg/ml hydrocortision、0.1μg/ml transferrin、1X三抗和1X Gluta MAX。上述原代上皮细胞在连续传代15次以上后，细胞状态仍然较好，且均表现为铺路石样的上皮细胞形态。
二、hPGECs细胞形态
如图1所示，hPGECs上皮细胞排列紧密，呈多边形，具有典型的铺路石样上皮细胞形态。本发明的方法可保证原代上皮细胞可连续传代至少15次以上，细胞状态较好，且均表现为铺路石样的上皮细胞形态。
三、hPGECs细胞鉴定
角蛋白5(keratin 5，KRT5)是上皮来源细胞的通用标志物，可用其判断细胞是否为上皮来源。经免疫荧光验证，所培养的hPGECs细胞为上皮细胞(CK5，图2A)，且成纤维细胞标志物(fibroblast-specific protein 1，FSP1)免疫荧光染色镜下基本没有阳性细胞，说明所培养的hPGECs细胞为纯度很高的上皮细胞。
钠钾氯协同转运蛋白(Na-K-Cl cotransporter 1，NKCC1)和激肽释放酶血管舒缓素1(Kallikrein1，KLK1)分别为腮腺腺泡上皮细胞和导管上皮细胞的标志物。经免疫荧光检测，共聚焦拍照结果显示，hPGECs为腺泡上皮细胞(NKCC1，图2B)和导管上皮细胞(KalliLK1，图2C)的混合细胞。为明确hPGECs中腺泡上皮细胞和导管上皮细胞的占比，用这两种细胞的标志物分别示踪标记，经流式细胞技术检测分选，培养的hPGECs细胞中，腺泡上皮细胞比例较多，约为70％；导管细胞的比例为总细胞的30％(图3)。
实施例2
罹患腮腺良性肿瘤患者在接受肿瘤及腮腺浅叶切除术时，从远离肿瘤部位取一块约1cm3大小的正常腮腺组织，该做法对患者没有任何额外伤害，对预后也没有任何影响。PBS去除血污后，剪刀剪碎为1mm3大小的组织块，随后用I型胶原酶(1mg/ml)和dispase酶II(1mg/ml)在37℃水浴锅中消化30分钟，弃掉消化酶后，先用含20％血清的DMEMF12培养基培养4天左右，待上皮细胞爬出后，换条件培养基(DMEMF12)进行上皮细胞的培养，常规2天换液。细胞融合至80％左右时用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。其中，条件培养基不含血清，以DMEMF12为基础培养基，添加0.01μg/ml EGF、0.01μg/ml FGF2、15μg/ml Insulin、80μg/ml BPE、0.6μg/ml hydrocortision、0.2μg/ml transferrin、1X三抗和1X Gluta MAX。上述原代上皮细胞在连续传代15次以上后，细胞状态仍然较好，且均表现为铺路石样的上皮细胞形态。
对比例1-3
除了如表1所示改变条件培养基的配方外，以与实施例1相同的方法进行细胞分离、培养和传代。
表1
实验例
细胞经培养融合至80％左右后，用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。以传代培养细胞的状态评价细胞传代次数。其中，当细胞显现典型的铺路石样形态时评价为有效传代，当细胞表现为摊平或失去铺路石样形态或该形态改变后认定为无效传代。经分析，本申请实施例1和实施例2的细胞在传代15次后仍然具有典型的铺路石样形态，传代达15次以上。而对比例1的细胞在传代5次时出现大量成纤维杂质细胞的生长(见图4)。对比例2的细胞状态差，4代后即失去典型的铺路石样形态(见图5)，且细胞增殖速率显著变慢。对比例3的细胞增殖速率缓慢(见图6)，特别在传代5次后，以105个细胞/ml密度培养时在长达10天时间内甚至不能达到80％融合度。
类器官是目前研究热点，其能最大限度地模拟体内组织结构和功能，模拟人类发育和器官疾病，被称为是临床前研究模型。本发明培养得到人腮腺原代上皮细胞，可用于人腮腺类器官培养中。具体地：将上皮细胞(P10)消化成单细胞后，接种于类器官基质胶中，并用类器官专用培养基培养，细胞能在三维空间上生长，且迅速增大，在接种后第9天，类器官能形成至少100μm，形成目前公认的典型的类器官形态(图7)。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (10)
1.用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使腮腺组织在分离培养基中培养得到腮腺原代上皮细胞；
(2)使腮腺原代上皮细胞在条件培养基中进行培养；和
(3)将步骤(2)的得到的细胞进行传代继续培养；
其中，所述分离培养基为含血清的DMEMF12培养基，所述条件培养基以不含血清的DMEMF12为基础培养基，同时添加包含EGF、FGF2、胰岛素、BPE、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子。
2.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，基于所述条件培养基，所述EGF的含量为0.01-0.05μg/ml，所述FGF2的含量为0.01-0.05μg/ml，所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，所述BPE的含量为10-90μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml。
3.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述腮腺组织为来源于人的腮腺组织。
4.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：取正常腮腺组织用PBS去除血污后，剪碎得到组织块，随后用I型胶原酶和中性金属蛋白水解酶消化，弃掉消化酶后，用含血清的DMEMF12培养基培养，待上皮细胞爬出后，换条件培养基进行上皮细胞的培养，常规换液，细胞融合至80％-90％时胰蛋白酶消化传代。
5.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，进一步包括对步骤(3)继续培养后的细胞进行形态分析和类型鉴定。
6.根据权利要求5所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述类型鉴定包括检测作为标志物的角蛋白5、钠钾氯协同转运蛋白和/或激肽释放酶血管舒缓素的步骤。
7.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)得到的腮腺原代上皮细胞包括腺泡上皮细胞和导管上皮细胞，且不包含成纤维细胞。
8.用于培养腮腺原代上皮细胞的培养基，其特征在于，以不含血清的DMEMF12为基础培养基，同时添加包含EGF、FGF2、胰岛素、BPE、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子，其中：
所述EGF的含量为0.01-0.05μg/ml，所述FGF2的含量为0.01-0.05μg/ml，所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，所述BPE的含量为10-90μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml。
9.腮腺上皮细胞培养物，其特征在于，其包含通过权利要求1-7任一项所述的方法培养得到的混合细胞。
10.根据权利要求9所述的腮腺上皮细胞培养物在唾液腺及相关疾病研究中的应用。
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