CN117736138A - 一种哈茨木霉源天然产物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于木霉次级代谢物领域，公开了一种哈茨木霉源天然产物及制备方法和应用。该天然产物具有式I所示结构。本发明从哈茨木霉次级代谢产物中分离提纯得到哈茨木霉源天然产物LU‑11，可应用于抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌PH‑1的生长，诱导并提高小麦的抗病性，为生物农药的开发提供了一定的理论依据。
Description
技术领域
本发明属于木霉次级代谢物领域，更具体地，涉及一种哈茨木霉源天然产物及制备方法和应用。
背景技术
木霉(Trichoderma spp.)作为一类重要的生防因子，对多种植物致病性真菌如黄瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum cucumis)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、小麦禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等都具有明显的抑制作用，并且可以提高植物的抗病性。据了解，木霉菌主要通过竞争、抗生、拮抗等方面的作用对病原菌进行抑制，其中抗生作用在近几年得到了许多研究者的关注。在木霉生长代谢的过程中，会产生一系列的次级代谢产物如多肽类、萜类、木霉菌素、甾体类、生物碱类和聚酮类等，这些产物中含有大量抗生性物质。
从绿色木霉LTR-2的次级代谢产物中经分离纯化得到的吡喃酮类物质5,6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌等11种植物病原菌都具有一定的抑制作用。6PP是木霉分泌的一种具有椰子香气的常见活性代谢物，对马铃薯炭疽病菌(Macrophomina phaseolina)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒疫霉(Phytophthora capsica)、黄瓜疫霉(Phytophthora melonis)等病原菌的菌丝生长具有良好的抑制作用。
木霉的次级代谢产物不仅可以拮抗植物病原菌，还可以诱导并提高植物抗病性并促进植物生长。
对于拮抗植物病原菌方面：ElHasan等人发现6-PAP能够控制玉米体内串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)引起的幼苗枯萎病，并提高玉米植株中的抗性酶POD、PPO和β-1,3-葡聚糖酶的活性，诱导玉米植株的防御反应。Marra等人发现哈茨酸(harzianic acid，HA)、6-PP(6-pentyl-a-pyrone)与木霉活菌组联合使用能显著促进植物生长，增加植物体内矿物质。Luo等从拟康氏木霉(T.pseudokoningii)分离得Trichokonins，这是一种抗菌肽，烟草在烟草花叶病毒(TMV)的胁迫下，它可以提高烟草中的抗氧化酶PAL和POD的活性，上调多种植物防御基因的表达，提高烟草的抗病性。Malmierca等发现苇状木霉(T.arundinaceum)分泌的trichodiene(TD)可以诱导番茄水杨酸(SA)防御基因的表达，并降低侧根的发育。Pascale等人发现哈茨酸(harzianic acid，HA)和6-PP(6-pentyl-a-pyrone)可以抑制葡萄白粉病的发病率，并且6-PP可以提高葡萄中的多酚总含量和抗氧化活性以及葡萄产量和品质。
但目前，研究木霉次级代谢物对植物的抗病诱导还较少。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种哈茨木霉源天然产物和制备方法及应用。本发明从哈茨木霉次级代谢产物中分离提纯得到哈茨木霉源天然产物LU-11，可应用于抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌PH-1的生长，诱导并提高小麦的抗病性，为生物农药的开发提供了一定的理论依据。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种哈茨木霉源天然产物，该天然产物具有式I所示结构：
本发明第二方面提供了一种哈茨木霉源天然产物的制备方法，该制备方法包括将哈茨木霉依次进行大米发酵培养和萃取分离纯化，得到权利要求1所述的哈茨木霉源天然产物。
根据本发明，优选地，所述大米发酵培养的温度为25-30℃，时间为30-40d。
根据本发明，优选地，所述萃取分离纯化包括依次进行的乙酸乙酯萃取、正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析和液相色谱分离。
根据本发明，优选地，所述乙酸乙酯萃取进行的次数为3-4次。
根据本发明，优选地，所述正相硅胶柱层析采用的减压梯度洗脱体系为石油醚-二氯甲烷-甲醇体系。
根据本发明，优选地，所述反相硅胶柱层析采用的减压梯度洗脱体系为甲醇-水体系。
在本发明中，作为优选方案，哈茨木霉源天然产物即哈茨木霉源LU-11的制备方法包括如下步骤：
1)将哈茨木霉的孢子液依次进行大米发酵培养，获得发酵物；
2)将发酵物与乙酸乙酯混合并进行超声处理3-4次，然后将含有发酵物的乙酸乙酯进行45℃减压旋蒸处理，得到乙酸乙酯总提取物；
3)将乙酸乙酯总提取物进行正相硅胶柱层析，得到含有哈茨木霉源LU-11的正相柱层析组分；
4)将含有哈茨木霉源LU-11的正相柱层析组分进行反相硅胶柱层析，得到含有哈茨木霉源LU-11的反相柱层析组分；
5)将含有哈茨木霉源LU-11的反相柱层析组分进行液相色谱分离和液相色谱检测分析，在馏分中检测到哈茨木霉源LU-11。
在本发明中，哈茨木霉的孢子液的制备方法包括：在含有哈茨木霉T-aloe菌落的PDA平板上，用9mm打孔器截取菌饼，接入含有150mLPDB培养基的锥形瓶中，将锥形瓶放入25℃、180r/min的恒温摇床中培养4d。将培养4d的哈茨木霉T-aloe发酵液，用4层无菌纱布过滤，吸取1mL已过滤的孢子液，放置在光学显微镜下观察孢子数并记录，最后将孢子液放置4℃冰箱备用。
本发明第三方面提供了所述的哈茨木霉源天然产物在以下方面的应用：
1)抑制小麦赤霉病病原禾谷镰刀菌的生长；
2)诱导植物抗病性；
3)防治植物幼苗赤霉病。
根据本发明，优选地，所述哈茨木霉源天然产物在抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌的生长的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为5-100mg/L。在本发明中，作为优选方案，应用于抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌的生长的哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为5、10、20、40、60、80和100mg/L。
根据本发明，优选地，哈茨木霉源天然产物诱导植物抗病性的方式包括提高植物抗氧化酶、降低植物细胞膜脂过氧化和降低植物细胞损伤；
根据本发明，优选地，所述哈茨木霉源天然产物在诱导植物抗病性的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1-100mg/L。在本发明中，作为优选方案，应用于诱导植物抗病性的哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1、1、10和100mg/L。
根据本发明，优选地，所述哈茨木霉源天然产物在防治植物幼苗赤霉病的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1-100mg/L。在本发明中，作为优选方案，应用于防治植物幼苗赤霉病的哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1、1、10和100mg/L。
本发明的技术方案的有益效果如下：
本发明从哈茨木霉次级代谢产物中分离提纯得到的哈茨木霉源天然产物LU-11是一种新发现的哈茨木霉源新天然产物，可应用于抑制小麦赤霉病病原禾谷镰刀菌PH-1的生长，诱导并提高小麦的抗病性，为生物农药的开发提供了一定的理论依据。
本发明的哈茨木霉源天然产物可实现大规模生产，而且天然安全。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本发明示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。
图1示出了本发明实施例1得到的哈茨木霉源LU-11的1H-NMR谱图。
图2示出了本发明实施例1得到的哈茨木霉源LU-11的13C-NMR谱图。
图3示出了本发明测试例1对实施例1得到的哈茨木霉源LU-11对抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌(PH-1)的生长的情况进行检测的结果(其中a、b、c、d、e表示p<0.05水平下差异显著)。
图4(A)-(D)示出了本发明测试例2对实施例1得到的哈茨木霉源LU-11对诱导小麦抗病性的情况进行检测的结果(其中“MDA”表示丙二醛、“POD”表示过氧化物酶、“CAT”表示过氧化氢酶、“SOD”表示超氧化物歧化酶、“activity”表示活性、“content”表示含量、a、b、c、d表示p<0.05水平下差异显著)。
图5示出了本发明测试例3对实施例1得到的哈茨木霉源LU-11对防治小麦幼苗赤霉病的情况图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
以下各个实施例中，
所用试剂或仪器未标明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
哈茨木霉菌株的Gene Bank登记号：KC753766，分离保存自周口师范学院微生物实验室。
实施例1
本实施例提供一种哈茨木霉源天然产物的制备方法，该制备方法包括：
S1：哈茨木霉的孢子液的制备
在含有哈茨木霉T-aloe菌落的PDA平板上，用9mm打孔器截取菌饼，接入含有150mLPDB培养基的锥形瓶中，将锥形瓶放入25℃、180r/min的恒温摇床中培养4d。将培养4d的哈茨木霉T-aloe发酵液，用4层无菌纱布过滤，吸取1mL已过滤的孢子液，放置在光学显微镜下观察孢子数并记录，最后将孢子液放置4℃冰箱备用；
S2：大米发酵培养
在含有大米培养基的广口瓶中加入孢子数为1×107cfu/mL的哈茨木霉孢子液，放置在28℃恒温培养箱中35d，获得发酵物；
S3：乙酸乙酯萃取
将发酵物和乙酸乙酯等体积放入广口瓶中，用超声波超声30min，此操作反复进行3-4次，然后将含有发酵物的乙酸乙酯进行45℃减压旋蒸处理，得到粗提物92g，放置4℃冰箱备用；
S4：正相硅胶柱层析
将92g粗提物先用二氯甲烷和甲醇(1:1)的混合溶液溶解，加入硅胶粉，进行拌样，45℃减压蒸干后，加入预装的硅胶柱中，用石油醚-二氯甲烷-甲醇体系进行减压梯度洗脱，洗脱得到22组馏分，将22组馏分45℃减压旋蒸后，放入4℃冰箱备用；
S5：反相硅胶柱层析
将正相分离的22组馏分中的第11组馏分用二氯甲烷和甲醇(1:1)的混合溶液溶解，加入ODS反相硅胶粉，进行拌样，45℃减压蒸干后，加入预装的反相硅胶柱中，用甲醇-水体系进行减压梯度洗脱得到10组馏分，将10组馏分45℃减压旋蒸后，放入4℃冰箱备用；
S6：液相色谱分离和检测分析
将反相分离得到的10组馏分用高效液相色谱分析仪检测分析，其中在4号和5号馏分中发现哈茨木霉源LU-11，洗脱体系为80％MeOH，流动相为MeOH-H2O，洗脱时间为20min，流速为10mL/min。
所述哈茨木霉源LU-11具有式I所示结构：
所述哈茨木霉源LU-11波普数据为：正离子HR-ESI-MS实测值m/z[M+H]+314.1400，理论值[M+H]+(C18H20NO4)为314.1392，给出该化合物其分子式为C18H19NO4。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ7.47(1H,s,H-6),7.27(2H,d,J＝8.5Hz,H-15,19),6.81(2H,d,J＝8.6Hz,H-16,18),5.51–5.39(2H,m,H-10,11),4.22(1H,h,J＝6.7Hz,H-8),2.49–2.42(1H,m,Ha-9),2.03(1H,m,Hb-9),1.62(3H,d,J＝5.1Hz,H-12),1.12(3H,d,J＝6.8Hz,H-13).13CNMR(MeOD,126MHz):δ16.6(C-13),18.1(C-12),37.4(C-9),44.5(C-8),107.2(C-3),115.9(C-5),116.1(2C,C-16,18),125.2(C-14),127.9(C-11),130.0(C-10),131.4(2C,C-15,19),140.6(C-6),158.3(C-17),163.9(C-4),177.4(C-2),213.3(C-7)。
测试例1
本测试例对实施例1得到的哈茨木霉源LU-11对抑制小麦赤霉病病原禾谷镰刀菌(PH-1)的生长的情况进行检测。
采用96孔板酶标仪法，将哈茨木霉源LU-11加入孢子数为1×105cfu/mLPH-1孢子悬液中，其中哈茨木霉源LU-11的浓度设置为5、10、20、40、60、80和100mg/L。
设置：阳性对照250mg/L恶霉灵、阴性对照PH-1孢子液、空白对照清水。
在28℃恒温培养箱中培养36h，并用酶标仪测定其OD值，每组设置3组重复。
由图3可以看出，哈茨木霉源LU-11浓度为5～100mg/L均对PH-1有抑制作用。当哈茨木霉源LU-11浓度为80和100mg/L时，其抑菌率达86.74％和90.50％，且比阳性对照恶霉灵高55.96％和62.72％，具有显著差异性，(p<0.05)。但是80mg/L和100mg/L之间无显著差异性，因此，哈茨木霉源LU-11抑制禾谷镰刀菌PH-1的最佳抑菌浓度为80mg/L。
测试例2
本测试例对实施例1得到的哈茨木霉源LU-11对诱导小麦抗病性的情况进行检测。
播种：将小麦种子在45℃温水中浸泡3h，然后将小麦种子播种在方形小盒中，每盒20粒种子，待小麦幼苗长至10cm后，用浓度为0.1mg/L、1mg/L、10mg/L和100mg/L的哈茨木霉源LU-11喷洒在小麦叶片上，每3盒喷10mL，共3组重复。
接病：上述播种处理24h后对幼苗进行病麦粒接种。
设置：阴性对照清水、阳性对照恶霉灵。
最后在病麦粒接种的第6d，对小麦幼苗的MDA、CAT、POD和SOD进行测定。
由图4(A)-(D)可知：
不同浓度的哈茨木霉源LU-11处理小面幼苗时，MDA含量会随着浓度的升高而降低，且均比恶霉灵组和CK组的低，并具有显著差异性。
在不同浓度的哈茨木霉源LU-11处理下，SOD和CAT的活性随着浓度的升高而增强，且均比恶霉灵组和CK组的高，并具有显著差异性。说明不同浓度的哈茨木霉源LU-11均可以提高小麦的抗病性，且在10-100mg/L范围内，抗病效果最为显著。由此说明，哈茨木霉源LU-11可提高小麦幼苗的抗氧化酶活力，并降低细胞的损伤程度。
测试例3
本测试例对实施例1得到的哈茨木霉源LU-11对防治小麦幼苗赤霉病的情况进行检测。
采用与测试例2相同的播种和接病方法。
设置：阴性对照清水、阳性对照恶霉灵。
在接病6d后，如图5所示，对小麦的发病情况进行观察并根据表1对小麦幼苗赤霉病病情指数进行分级，计算防效和病情指数(病情指数与防效的计算公式如公式1)，计算结果如表2所示。
由表2可知：
随着哈茨木霉源LU-11浓度的升高，其防治小麦赤霉病的能力增强。当哈茨木霉源LU-11浓度为0.1、1、10、100mg/L时，其防效分别为53.06％、65.31％、75.51％和81.63％，其防效均比阳性对照恶霉灵(34.69％)高，分别高34.62％、48.37％、54.06％和57.50％。因此，哈茨木霉源LU-11可以防治小麦幼苗赤霉病的发生。
表1
表2
注：a、b、c、d、e、f表示p<0.05水平下差异显著
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种哈茨木霉源天然产物，其特征在于，该天然产物具有式I所示结构：
2.一种哈茨木霉源天然产物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括将哈茨木霉依次进行大米发酵培养和萃取分离纯化，得到权利要求1所述的哈茨木霉源天然产物。
3.根据权利要求2所述的哈茨木霉源天然产物的制备方法，其中，所述大米发酵培养的温度为25-30℃，时间为30-40d。
4.根据权利要求2所述的哈茨木霉源天然产物的制备方法，其中，所述萃取分离纯化包括依次进行的乙酸乙酯萃取、正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析和液相色谱分离。
5.根据权利要求4所述的哈茨木霉源天然产物的制备方法，其中，
所述乙酸乙酯萃取进行的次数为3-4次；
所述正相硅胶柱层析采用的减压梯度洗脱体系为石油醚-二氯甲烷-甲醇体系；
所述反相硅胶柱层析采用的减压梯度洗脱体系为甲醇-水体系。
6.权利要求1所述的哈茨木霉源天然产物在以下方面的应用：
1)抑制小麦赤霉病病原禾谷镰刀菌的生长；
2)诱导植物抗病性；
3)防治植物幼苗赤霉病。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述哈茨木霉源天然产物在抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌的生长的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为5-100mg/L。
8.根据权利要求6所述的应用，其中，
哈茨木霉源天然产物诱导植物抗病性的方式包括提高植物抗氧化酶、降低植物细胞膜脂过氧化和降低植物细胞损伤。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述哈茨木霉源天然产物在诱导植物抗病性的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1-100mg/L。
10.根据权利要求6所述的应用，其中，所述哈茨木霉源天然产物在防治植物幼苗赤霉病的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1-100mg/L。
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