CN117731817B - 一种偶联纳米多肽HD5-myr抗菌材料的制备和应用 - Google Patents
一种偶联纳米多肽HD5-myr抗菌材料的制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种偶联纳米多肽HD5‑myr抗菌材料的制备和应用，属于生物医用材料技术领域。所述制备方法包括：首先制备质量浓度16~20%的聚乙烯醇溶液，冷却后加入抗菌肽HD5‑myr制得纺丝原液；加入钛酸酯偶联剂交联后经喷丝形成纺丝细流进入温度≤50℃的甬道干燥，丝条经多段牵伸后制得PVA@HD5‑myr纤维，牵伸总倍率控制在16~17；再加工制成无纺布；灭菌处理。上述工艺制备的抗菌材料稳定性好，对革兰氏阴性和阳性细菌均有很强的杀菌效应，用作创面敷料，可以控制感染、加速伤口愈合，安全性高。基于该材料的吸附、杀菌尤其是抗耐药菌生物膜形成的作用，可用于医用呼吸机过滤层、抗菌口罩的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料及其制备方法和应用。
背景技术
医用抗菌材料通过阻隔细菌，将其吸附、抑制增殖或直接杀灭，一定程度降低机体感染的风险，已成为医院内防御细菌感染、扩散的重要辅助材料。以医用敷料产品为例，各种医用敷料的临床应用主要集中在手术后伤口护理、烧伤、外部创伤和长期不愈性溃疡等。敷料作为暂时性皮肤替代物可起到保护创面、止血、防止感染等作用，传统敷料主要包括干纱布和油纱，可给创面提供一定的保护作用，主要用于隔离伤口，对伤口愈合没有直接作用。随着“湿性创面愈合”理论获得临床上普遍认可，一些现代敷料如透明膜敷料、水胶体敷料、藻酸盐敷料、银离子敷料等，先后应用于临床。这些敷料和创面间存在着交互作用，可以及时吸收分泌物、使氧气进入创面，对创面愈合起了积极的促进作用。伴随着纳米技术的发展，在组织工程领域还出现了使用包括静电纺丝纳米纤维在内的各类生物支架作为新一代创面敷料，并取得了良好效果。
聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)是一种可生物降解的半结晶合成聚合物，已被广泛应用于生物技术领域，如组织再生、伤口敷料和药物输送系统。聚乙烯醇基创面敷料因其优良的机械性能、稳定性、生物降解性、生物相容性和低生产成本等特性而备受青睐。然而PVA本身不具备抗菌活性，仅起到物理阻隔细菌的作用，而导致伤口愈合延迟的主要原因之一是细菌感染控制困难，这限制了皮肤组织恢复过程以及功能的完整性。
通过纺丝技术可以将天然或合成生物活性化合物负载或包埋于纳米纤维皮肤创面敷料。例如专利文献CN116920157A公开将重组抗菌肽加入到PVA纺丝溶液中，通过静电纺丝技术制备得到重组鼠源抗菌肽PVA纳米纤维膜，赋予纳米材料抗菌性能。然而该工艺中抗菌肽直接与纺丝液混合使得制备得到的纤维膜中抗菌肽无法与纺丝纤维紧密结合，存在生物活性不稳定、与创面亲和性差等问题。利用交联剂的偶联作用可以实现抗菌肽共价结合在PVA上，该方法虽然能确保长期的抗菌活性，但是目前常见的交联剂例如硅烷类偶联剂，在水环境中易于水解降解，存在稳定性差的问题；而戊二醛、硼酸、草酸等存在毒性风险。另一方面，在低温条件下上述交联剂的交联效果达不到稳定结合的要求。
另外，要维持抗菌肽生物活性，基质纤维材料需要满足物理性能要求。静电纺丝形成的纤维材料机械强度较差，无法达到制备无纺布敷料的要求。湿法纺丝作为另一种纤维纺丝方法，利用多段牵伸控制总拉伸比可赋予纤维一定的机械强度，但是其工艺中纺丝需在高盐凝固浴中固化形成初生纤维，该过程会引入盐离子，对抗菌肽的结构和活性会产生影响，破坏稳定性。
目前PVA工业生产主要通过聚醋酸乙烯醇解(或水解)反应得到，该工艺制备的PVA树脂中存在副产物、残留物，其中副产物醋酸钠是导致PVA毒性的最主要原因。通过调研、测试片状PVA树脂醋酸钠含量在1.0-2.5%；絮状PVA树脂醋酸钠含量：3.9-7.0%。醋酸钠是强碱弱酸盐，若与人体创面接触时，在体液的水中发生部分水解，水解显碱性，会严重刺激伤口，不利于伤口恢复。而且，PVA树脂中存在离子杂质会影响PVA与抗菌肽的交联作用以及抗菌肽的生物活性。目前常规的水洗处理方式，仅能将固体聚乙烯醇树脂的表面醋酸钠清除，而界面仍然残留大量醋酸钠，依据GB/T12010.2中的化学滴定法测定水洗后的PVA中的乙酸钠含量大于0.5%，而且会产生大量污染废水。
因此，如何综合考量结合力、杀菌活性和安全性，是当前亟需解决的技术问题。此外，设计满足工业化生产的合成路线是敷料产品实现临床转化的关键。
发明内容
本发明的目的在于综合考量结合力、杀菌活性和安全性设计纳米多肽HD5-myr与聚乙烯醇基质材料的偶联，提供满足工业化生产的合成路线，实现抗菌多肽的临床转化。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种偶联纳米多肽HD5-myr的复合抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)聚乙烯醇树脂的预处理：
将粒径≥50目且醇解度≥90%的聚乙烯醇颗粒在室温下浸泡于水中，充分溶胀后进行电解除杂，去离子水冲洗，得到处理后的聚乙烯醇树脂，备用；
(2)含抗菌肽HD5-myr的纺丝原液的制备：
将处理后的聚乙烯醇树脂加入去离子水中，加热使温度升至90℃以上，使聚乙烯醇溶液的质量百分比浓度达到16~20%，调节溶液pH至5.5~6.5，冷却至室温后加入抗菌肽HD5-myr，混匀制得纺丝原液；
(3)偶联纳米多肽HD5-myr复合纤维的制备：
在喷丝前将钛酸酯偶联剂泵入纺丝原液中进行交联反应，然后喷丝形成纺丝细流，进入温度≤50℃的甬道进行干燥；干燥后的丝条经多段牵伸后制得PVA@HD5-myr纤维，牵伸总倍率控制在16~17；
(4)偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备：
将PVA@HD5-myr纤维经过无纺布加工工艺制成PVA@HD5-myr无纺布，对PVA@HD5-myr无纺布进行辐照灭菌处理，即得所述偶联纳米多肽HD5-myr的复合抗菌材料。
本发明利用在水溶液中的电解工艺对基质原料聚乙烯醇树脂进行除杂处理，醋酸钠的质量百分比含量可控制在≤0.02%，获得高纯度医用聚乙烯醇。进一步的，本发明提供的纺丝工艺采用湿喷干纺方式，纺丝液经纺丝泵连续、定量而均匀地从喷丝头或喷丝板的毛细孔中挤出而成液态细流，随后纺丝细流进行甬道，在温度控制在45~50℃的热气流的作用下干燥固化。该工艺利用甬道干燥，避免了湿法纺丝中凝固浴工序中盐离子对抗菌肽活性的影响；且甬道中热空气的温度控制在45~50℃，能够有效保持抗菌肽的活性。同时本发明利用钛酸酯偶联剂对抗菌肽HD5-myr和聚乙烯醇在弱酸性条件下进行低温交联，实现抗菌肽通过Ti-O键共价结合在PVA表面，提升复合材料抗菌性能。研究表明利用上述方法获得的纤维材料稳定性好，储存三年以上抗菌肽仍旧稳定结合在聚乙烯醇基质上，且保持抗菌肽生物活性。
步骤(1)中，利用电解工艺对基质原料聚乙烯醇树脂进行去除杂质的处理。完全醇解的聚乙烯醇在常温水中溶胀不溶解，运用在水溶液中的电解处理可以加速树脂界面处的杂质如醋酸钠、醋酸甲酯、丁烯醛、氢氧化钠等向水溶液中迁移，大大降低杂质的含量，获得高纯度医用聚乙烯醇。
所述电解工艺以去离子水作为电解液，充分溶胀的PVA树脂置于电解槽阳极电极和阴极电极之间，通入直流电，通电过程中，PVA溶胀体系中的阴离子如醋酸根、氢氧根离子向阳极迁移，阳离子如钠离子、氢离子向阴极迁移，当杂质离子越过质子交换膜即可与PVA溶胀体系隔绝，无需换水可实现连续除杂。
进一步的，直流电电流为500A，电压为24V；电解持续时间为4-24 h。所述阳极电极可以采用但不限于钌铱电极，阴性电极可以采用但不限于石墨电极。
电解结束后，再用去离子水冲洗。研究表明，充分除杂后的PVA树脂与抗菌肽的共价偶联效率显著提升，而且制备的复合材料抗菌稳定性好。
步骤(2)中，将处理后的聚乙烯醇树脂投入溶解釜中，加入去离子水，加热至溶解温度，完全醇解的PVA的溶解温度≥90℃，保温搅拌使其完全溶解，保温结束后自然冷却至25±5℃，脱泡，再加入抗菌肽HD5-myr，在室温条件下添加抗菌肽以维持其活性，混匀制得纺丝原液。
本发明采用经济安全的水作为溶剂，PVA与水形成氢键相互作用，形成水溶性聚合物，便于后续更好地结合抗菌HD5-myr，提高材料制备过程中的稳定性。本发明制备质量浓度达到16~20%的聚乙烯醇溶液。研究表明，该浓度条件下的纺丝原液可以在本发明的甬道工艺条件下有效干燥并在本发明的牵伸条件下牵拉成丝。
进一步的，利用柠檬酸调节聚乙烯醇水溶液至pH为5.5~6.5。弱酸性能保护多肽生物学活性，同时弱酸性利于后续钛酸酯偶联剂发挥交联作用。
步骤(3)中，在钛酸酯偶联剂作用下，使抗菌肽通过Ti-O键共价稳定结合在聚乙烯醇表面。
本发明研究表明，钛酸酯类偶联剂可以作为纳米多肽和聚乙烯醇基高分子材料之间的接枝“桥梁”，其引入不会造成毒副作用，生物安全性好，且易于在PVA表面形成单分子层，性质稳定，水溶液中不易水解。
进一步的，所述钛酸酯偶联剂可以为但不限于二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛(分子式为C6H18N2O8Ti，分子量为294.08)，该偶联剂性质稳定，在水溶液中不易水解。
本发明采用的纳米多肽HD5-myr为公众可获知生物材料，参见申请号为201610561665.9的中国专利文献。
进一步的，抗菌肽HD5-myr与聚乙烯醇的质量比为10~50 ppm；钛酸酯偶联剂与聚乙烯醇的质量比为50~100 ppm。研究表明，在上述配比条件下制备的复合抗菌材料既能保证纤维强度又具有符合要求的抑菌率。
更进一步的，抗菌肽HD5-myr与聚乙烯醇的质量比为14 ppm；钛酸酯偶联剂与聚乙烯醇的质量比为60 ppm。
本发明在纺丝干燥与保持抗菌肽活性之间取得平衡，设置甬道干燥温度为45~50℃。研究表明，当干燥温度在60℃时，抗菌肽活性显著下降；当干燥温度在40℃时，无法实现纺丝的干燥固化。
进一步的，设置甬道中热空气的温度控制在45~50℃，纺丝经甬道干燥的时间为≤90 s。研究表明，在本发明设置的纺丝原液浓度以及牵伸工艺条件下，纺丝在45℃、≤90 s条件下可实现纺丝的干燥固化且保持抗菌肽活性。
纤维的强度与纺丝牵伸的倍率相关，具备一定机械强度的纤维提供强度支持，有利于保护与之共价结合的抗菌肽的生物活性。本发明设置牵伸总倍率控制在16~17。研究表明，在上述牵伸倍率条件下可保障其纤维强度同时纺丝经过45~50℃甬道可有效实现干燥。当牵伸倍率超过该范围，纺丝的拉断率显著上升，而低于该范围难以有效干燥。
进一步的，所述牵伸由三段牵伸组成，第一段牵伸的牵伸比为2，第二段牵伸的牵伸比为3，第三段牵伸的牵伸比为2.8。具体的，①喷丝板到甬道外出口，2.0倍，1×2＝2；②第一三辊(曳引机)到第二三辊(曳引机)，3倍，2×3＝6；③第二三辊(曳引机)切断机，2.8倍，2.8×6＝16.8，牵伸倍率约等于17。
本发明中，纺丝液经纺丝形成纤维后，再经过无纺布加工工艺包括切断、开松、精梳、重叠、定型、卷取分切，制成无纺布。
步骤(3)中，对无纺布进行灭菌处理制得无菌产品。
进一步的，采用60Co辐照灭菌技术进行灭菌处理。本发明采用辐射灭菌可有效保持抗菌肽的结构和活性，安全可靠，操作简单。具体的，60Co辐照剂量为15±1千戈瑞(kGy)。本发明研究表明，目前常规的高温、环氧乙烷等灭菌工艺均会破坏抗菌肽结构造成失活，不适合所述复合抗菌材料的灭菌。上述60Co辐照灭菌方式以及辐照剂量能够有效保持复合抗菌材料的抗菌性能。
研究表明，利用上述工艺制备的复合抗菌材料既保留了纳米多肽HD5-myr的广谱杀菌作用，控制感染和加速伤口愈合，同时具有更好的热敏性，并对延缓细菌耐药性表现出巨大潜力，而且具有良好的生物安全性。
本发明的另一个目的是提供一种由上述制备方法制得的偶联纳米多肽HD5-myr的复合抗菌材料。
本发明提供的复合抗菌材料以聚乙烯醇为基质材料，纳米多肽HD5-myr通过化学偶联共价结合于基质材料上，结构稳定性好，具有良好的溶胀特性。通过体外杀菌试验验证，所述复合抗菌材料对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均表现出很强的杀菌活性，且耐湿热能力强，适合长期储存。杀菌机理研究显示所述复合抗菌材料通过“接触式”杀菌(contact-killing)以及抗细菌生物膜的机制来发挥作用。通过动物模型试验验证，所述复合抗菌材料通过杀菌和吸附中和内毒素来发挥保护皮肤创面的作用，具体包括保护皮肤创面免受细菌侵袭，控制感染和加速伤口愈合。并通过体内、体外实验验证所述复合抗菌材料的生物安全性。
本发明还提供了所述的复合抗菌材料在制备创面敷料中的应用。
进一步的，所述创面敷料通过接触式杀菌和吸附中和内毒素起到保护皮肤创面的作用。传统细菌感染过程中形成细菌生物膜帮助细菌定位聚集，而所述敷料极大程度减少了细菌的黏附和定植，具有持续性杀菌作用。并且本发明采用的HD5-myr不易诱导细菌耐药性产生。
本发明提供的复合抗菌材料还可以应用于制备一次性卫生用品或过滤材料，比如医用呼吸机过滤层、抗菌口罩等。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明基于纳米多肽HD5-myr的结构特点，提供了满足工业化生产的合成路线，具体的，以纳米多肽HD5-myr为生物活性成分，利用钛酸酯偶联剂对聚乙烯醇进行材料改性，合成化学偶联、“非浸出(non leaching)型”复合无纺布抗菌材料。整个制备工艺温度控制在20~50℃之间，有效维持HD5-myr的生物活性，利用钛酸酯偶联实现纳米多肽稳定结合于基质材料上，延长抗菌活性，且不会增加毒性风险。
(2)本发明利用电解工艺对基质材料聚乙烯醇进行去除杂质的处理，研究表明，聚乙烯醇树脂中醋酸钠等离子杂质的存在会影响聚乙烯醇与抗菌肽的交联反应以及抗菌肽的生物活性。相较于常规的水洗方式，电解工艺对聚乙烯醇树脂的除杂效果显著，避免对后续交联反应以及抗菌肽活性维持造成影响，而且有效节省用水量。
(3)本发明提供的复合抗菌材料具有良好的溶胀特性，化学偶联稳定性，耐受湿热的稳定性；对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均有杀菌效应。用作创面敷料，可以预防皮肤创面细菌和内毒素侵袭，控制感染和加速伤口愈合，生物安全性高。
附图说明
图1为PVA@HD5-myr 无纺布的合成路线及作用机制示意图。
图2为PVA@HD5-myr和PVA无纺布敷料的形态(A)及纤维直径(B)。
图3为PVA和PVA@HD5-myr的SEM-EDS图像以及 C、O、N 等各元素百分比，其中A为SEM-EDS图像，B为PVA的元素百分比，C为PVA@HD5-myr的元素百分比。
图4为PVA、HD5-myr和PVA@HD5-myr的XPS图像，其中A为PVA、B为HD5-myr，C为PVA@HD5-myr的元素组成分析，D为HD5-myr和PVA@HD5-myr的N 1s谱，E为PVA@HD5-myr的Ti 2p谱。
图5为PVA@HD5-myr体外杀菌作用，其中A为大肠杆菌，B为肺炎克雷伯杆菌，C为金黄色葡萄球菌，D为鲍曼不动杆菌，E为铜绿假单胞菌，F为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，G为耐舒普深®鲍曼不动杆菌，H为耐碳青霉烯铜绿假单胞菌。
图6为PVA@HD5-myr在37℃下浸提的浸提液成分分析。
图7为PVA@HD5-myr对细菌形态的破坏作用，图中三角形指示细菌膜完整性受到破坏；图中标尺为0.5μm。
图8为PVA@HD5-myr抗细菌生物膜的机制作用，其中A为耐泰能®鲍曼不动杆菌，B为耐碳青霉烯铜绿假单胞菌，C为耐万古霉素金黄色葡萄球菌，左中右图放大倍数分别为350×、2500×和 5000×，左、中、右图中标尺分别为50 μm、10 μm和5 μm。
图9为HD5-myr和抗生素诱导细菌耐药的情况，其中A为鲍曼不动杆菌，B为金黄色葡萄球菌。
图10为PVA@HD5-myr浸提液成分质谱分析，其中A为50℃下浸提24 h，B为50℃下浸提48 h。
图11为湿热环境对PVA@HD5-myr杀菌活性的影响，其中A为大肠杆菌，B为肺炎克雷伯杆菌，C为金黄色葡萄球菌，D为鲍曼不动杆菌，E为铜绿假单胞菌，F为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，G为耐舒普深®鲍曼不动杆菌，H为耐碳青霉烯铜绿假单胞菌。
图12为PVA@HD5-myr在长期储存三年后应用杀菌活性稳定性测试，其中A为大肠杆菌，B为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
图13为PVA@HD5-myr和PVA的溶胀率。
图14为PVA@HD5-myr对小鼠皮肤创面抗感染促愈合的作用，其中A为创面照片，B为皮肤组织的H&E染色(第一、二行)和 Masson 三色染色(第三、四行)。
图15为PVA@HD5-myr对内毒素介导小鼠皮肤创面急性炎症反应的保护作用，其中A为创面冲洗液中内毒素含量，B为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)含量，C为白介素(interleukin, IL)-1β含量，D为IL-6的含量。
图16为PVA@HD5-myr浸提液细胞毒性，其中A为PVA，B为PVA@HD5-myr。
图17为PVA@HD5-myr浸提液溶血毒性，其中A为PVA，B为PVA@HD5-myr。
图18为PVA@HD5-myr对小鼠皮肤的影响，其中第一行为皮肤组织的H&E染色，第二行为Masson三色染色，第三、四、五行分别为免疫组化分析了皮肤组织中血管内皮细胞(CD31+)、巨噬细胞(F4/80+)、中性粒细胞(Ly6G+)的分布。
图19为PVA@HD5-myr连续应用于小鼠创面后，对其内脏组织形态的影响。
图20为PVA@HD5-myr 处理后小鼠肝肾生化指标的变化，其中A为谷丙转氨酶(ALT)、B为谷草转氨酶(AST)、C为肌酐(CREA)、D为尿素氮(BUN)含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
HD5-myr的氨基酸序列：Ala1-Thr2-Cys3-Tyr4-Cys5-Arg6-Thr7-Gly8-Arg9-Cys10-Ala11-Thr12-Arg13-Glu14-Ser15-Leu16-Ser17-Gly18-Val19-Cys20-Glu21-Ile22-Ser23-Gly24-Arg25-Leu26-Tyr27-Arg28-Leu29-Cys30-Cys31-Arg32-Gly33-Lys34-NH2，其中， Cys3和Cys31 、Cys5 和Cys20 、Cys10 和Cys30之间分别形成分子内二硫键。第34位为一个Lys，其ε氨基上连接一个肉豆蔻酰基。参见申请号为201610561665.9的中国专利文献。
Tyzor®LA，中文名称为：二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛、二羟基双(乳酸铵)钛(IV)，分子式为C6H18N2O8Ti，分子量：294.08，CAS号：65104-06-5。结构式如下：
聚乙烯醇(PVA)颗粒，例如购自安徽皖维高新材料股份有限公司(型号PVA 2699，粒径≥50目，醇解度99%)。
下述实施例中采用的菌株，来自ATCC的标准株包括：大肠杆菌(E. coli)ATCC25922、肺炎克雷伯杆菌(K. pneumoniae)ATCC 13883、金黄色葡萄球菌(S. aureus)ATCC25923、鲍曼不动杆菌(A. baumannii)ATCC 17978、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)ATCC 27853 、 MRSA ATCC 43300；耐舒普深®鲍曼不动杆菌 (cefoperazone/sulbactam-resistantA. baumannii)、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(carbapenems-resistantP. aeruginosa)为临床分离株。耐泰能®鲍曼不动杆菌(imipenem/cilastatin sodium-resistantA. baumannii)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistantS. aureus)分别由标准菌株ATCC 17978和 ATCC 25923诱导得到。
实施例1：PVA@HD5-myr复合抗菌材料的制备
1、PVA@HD5-myr复合抗菌材料的合成路线如图1所示，具体步骤如下：
(1) 将PVA颗粒加入水中，室温下浸泡2 h，充分溶胀，转移至电解槽中进行电解，水为电解液，以钌铱电极为阳性，石墨电极为阴极，连接直流稳压稳流电源，电压24 V，电流500A，时间4-24 h。电解结束后，清水冲洗，得到预处理的PVA。
(2)将预处理后的PVA投入溶解釜中，加超纯水配置浓度为16 wt%，加热至90℃溶解PVA，充分搅拌均匀；用柠檬酸调节溶液pH为5.5~6.5，制成PVA水溶液。
(3) 将溶液静置降温脱泡，当上述溶液冷却至室温(25±2°C)后，加入HD5-myr(14ppm，与PVA质量比)配置纺丝原液。
(4) 将上述纺丝原液搅拌均匀，室温下静置0.5~1 h。
(5) 纺丝原液经输送、计量泵、交联、喷丝、甬道干燥、牵伸、卷曲、切断打包等工序制成PVA@HD5-myr纤维。其中通过计量泵在管道中加入Tyzor®LA(60 ppm，与PVA质量比)。
具体的，喷丝条件为：喷丝头毛细孔直径为0.07~0.08毫米；甬道干燥温度为45℃；初生纤维生成速率为12米/分钟；牵伸条件为：①喷丝板到甬道外出口，2.0倍，1×2＝2；②第一三辊(曳引机)到第二三辊(曳引机)，3倍，2×3＝6；③第二三辊(曳引机)切断机，2.8倍，2.8×6＝16.8≈17，即牵伸倍率约为17。
上述过程中，从喷丝头毛细孔中挤出的纺丝细流进入甬道，通过甬道中热空气流作用，使原液细流中的溶剂挥发，原液细流在逐渐脱去溶剂的同时发生浓缩和固化而成为初生纤维；丝条经多道曳引机的牵伸制得具有一定机械强度的纤维。
(6) 将上述PVA@HD5-myr 纤维经过切断、开松、精梳、重叠、定型、卷取分切，制成无纺布。
(7) 无纺布合成后，采用60Co辐照灭菌，辐照剂量为15±1千戈瑞(kGy)。获得PVA@HD5-myr无纺布敷料(下文称之PVA@HD5-myr)，PVA无纺布敷料作为对照组(下文称之PVA)。
2、电解工艺对PVA的除杂效果
依据GB/T12010.2中聚乙烯醇材料性能测定方法，测定上述步骤(1)预处理后PVA中的乙酸钠含量为0.014%，醋酸甲酯含量小于0.1%，丁烯醛含量小于0.2%，氢氧化钠含量小于0.0005%。
3、PVA@HD5-myr复合抗菌材料的形态和纤维直径
图2的A显示的是PVA@HD5-myr和PVA无纺布敷料的大体形态及 SEM图像(放大100倍和500 倍拍摄的图像，图中标尺为20 μm)。
图2的B显示的是PVA@HD5-myr和PVA纤维直径，实验数据(n=20)以均数±标准差(mean±SD)表示。采用非配对t 检验的方法进行统计分析，ns 表示差异无显著性统计学意义。
4、SEM-EDS技术分析PVA@HD5-myr复合抗菌材料的元素分布
如图3所示，PVA含有C、O元素，而在PVA@HD5-myr表面另检测到N元素，占比1.88%，提示多肽HD5-myr偶联到PVA材料的表面，因为 N元素只存在于HD5-myr。而且，N元素在纤维表面的分布状态，证实HD5-myr在PVA材料的表面均匀分布，也证实了钛酸酯Tyzor®LA良好的界面结合和均匀分布的特性。
5、X 射线光电子能谱技术分析PVA@HD5-myr复合抗菌材料
如图4所示，PVA@HD5-myr的 Ti 谱上显示出两个结合能分别为463.98 eV和458.38 eV的能带，与Ti4+化学态上的Ti 2p1/2和Ti 2p3/2自旋-轨道分裂光电子相关，提示有Ti-O-C键的形成。
本实施例基于HD5-myr的结构特点，设计了满足工业化生产的复合材料PVA@HD5-myr合成路线，并通过实验明确了合成过程中温度、湿度以及辐照等因素对HD5-myr结构和功能的影响，论证了合成路线的合理性；证实钛酸酯类偶联剂可以作为多肽和高分子材料之间的接枝“桥梁”。
实施例2：PVA@HD5-myr复合抗菌材料的体外杀菌作用
1、体外杀菌测试
本实验参考GB15979-2002之“C5非溶出性抗(抑)菌产品抑菌性能试验方法”并做适当修改。测试方法如下：
1) 取冻存菌液5 μL滴于LB固体培养基上，涂菌棒涂匀，37℃过夜；
2) 挑单菌落加到含5 mL LB液体培养基的50 mL离心管中，200 rpm，37℃，6-8 h，使细菌生长至对数期；
3) 4000 rpm离心5 min后弃上清；加PBS 1 mL重悬、洗涤；
4) 4000 rpm离心5 min后弃上清；加PBS 1 mL重悬；
5) 取200 μL于96孔板中，酶标仪600 nm波长处检测OD值，测量细菌浓度；
6) 取三个250 mL三角烧瓶，分为三个组：Control组、PVA组、PVA@HD5-myr组；
7) 每个烧瓶中加50 mL PBS；
8) 分别取上述菌液5 mL加至三个烧瓶中，调整烧瓶中的细菌浓度为 1×106CFU/mL；
9) 三个烧瓶混匀后，取原液、1:10 稀释液、1:100 稀释液、1:1000 稀释液各10 μL滴于LB固体培养基上，记为0 h点；
10) PVA组、PVA@HD5-myr组分别加入6 cm × 6 cm的PVA无纺布、PVA@HD5-myr无纺布各三片；
11) 三个烧瓶于摇床上，37℃、200 rpm振荡1 h；
12) 1 h后，取烧瓶中的原液并按1:10、1:100、1:1000稀释；
13) 取原液、1:10稀释液、1:100稀释液、1:1000稀释液各10 μL滴于 LB 固体培养基上，记为1 h点；
14) 将0 h点和1 h点的LB固体培养基置于37℃培养箱中，过夜；
15) 计数菌落数目，并对比不同组别菌落差异；
16) 本实验检测PVA以及PVA@HD5-myr无纺布对如下菌株的抑菌作用：E. coli ATCC 25922、K. pneumoniae ATCC 13883、S. aureusATCC 25923、A. baumannii ATCC17978、P. aeruginosa ATCC 27853、MRSA ATCC 43300、cefoperazone/sulbactam-resistantA. baumannii、carbapenems-resistantP. aeruginosa；
17) 检测下限为100CFU。实验数据(n=3)以均数±标准差(mean±SD)表示。多组比较采用Bonferroni校正的单因素方差分析计算统计学意义，**P<0.01，***P<0.001，ns表示差异无显著性统计学意义。
测试结果：如图5所示，与PVA相比，PVA@HD5-myr对大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、MRSA、耐舒普深®鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌等均表现出很强的杀菌作用。
上述结果证实HD5-myr固化到 PVA 材料上之后，仍保持良好的杀菌活性。
2、PVA@HD5-myr振荡条件下浸提液成分分析
为了排除上述“振荡法”杀菌实验过程(实施例2的“1、体外杀菌测试”)中HD5-myr脱落，进一步明确PVA@HD5-myr通过“接触式”杀菌(contact-killing)而非“释放式”(release-killing)杀菌，我们于200 rpm，37℃浸提PVA@HD5-myr 1 h，利用MS检测浸提液的成分。
测试结果：如图6所示，浸提液中没有HD5-myr，从而证明了PVA@HD5-myr发挥抗菌作用是通过其与细菌接触，而非将HD5-myr释放至溶液中。
3、PVA@HD5-myr对细菌形态的破坏作用
测试方法：PVA和PVA@HD5-myr分别与大肠杆菌、铜绿假单胞菌、MRSA处理后，通过SEM 观察并拍摄细菌形态图像。
处理方法：1×106CFU/mL的上述细菌加入到含有三片PVA或PVA@HD5-myr(每片6cm × 6 cm)的锥形瓶中，于37℃，200 rpm 孵育1 h，孵育完毕后，离心收集细菌，通过 SEM观察并拍摄细菌形态图像。
测试结果：如图7所示，PVA和PVA@HD5-myr分别与大肠杆菌(左)、铜绿假单胞菌(中)、MRSA(右)处理后，通过SEM观察并拍摄细菌形态图像。图中三角形指示细菌膜完整性受到破坏；图中标尺为0.5 μm。
4、PVA@HD5-myr抗细菌生物膜的机制作用
测试方法：PVA和PVA@HD5-myr分别与耐泰能®鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐万古霉素金黄色葡萄球菌孵育 48 h 以后，用 PBS 洗掉材料上的浮游细菌，通过SEM观察并拍摄细菌生物膜生长的图像。
测试结果：如图8所示，在与耐泰能®鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐万古霉素金黄色葡萄球菌孵育48 h以后，PVA敷料上有大量细菌生物膜形成，而PVA@HD5-myr敷料上几乎没有生物膜。这证实，PVA@HD5-myr 具有优异的抗细菌生物膜活性。左中右图放大倍数分别为350×、2500×和5000×，左、中、右图中标尺分别为50 μm、10 μm和5 μm。
5、PVA@HD5-myr中多肽耐药机制研究
用亚致死剂量HD5-myr连续诱导鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌 20 代以上，检测 MIC 的变化，并选择传统抗生素泰能®和万古霉素作为对照。如图9所示，连续诱导 20代以上，HD5-myr对上述两种细菌的MIC值基本没有变化，而对泰能®或万古霉素的MIC值提高了128倍。实验证实：相比于泰能®或万古霉素，HD5-myr不易诱导细菌耐药，是一款理想的外用抗菌剂。
实施例3：PVA@HD5-myr复合抗菌材料的稳定性测试
1、PVA@HD5-myr化学键偶联的稳定性(浸提液成分质谱分析)
为了证实偶联的稳定性，我们将PVA@HD5-myr置于超纯水中，在 50℃水浴中浸提24 h和48 h，浸提完毕后，用质谱分析浸提液中的成分。
如图10所示，浸提24 h，浸提液中未发现HD5-myr；浸提48 h后，浸提液中含有分子量为3972.094的物质，该物质分子量与HD5-myr的理论分子量(3976.7)接近，但有轻微减小，分析是HD5-myr脱落过程中，部分基团残留在PVA基质材料上。
上述实验证实PVA@HD5-myr上HD5-myr通过共价键较稳定地偶联至PVA材料上。
2、PVA@HD5-myr在湿热环境应用的杀菌活性稳定性
测试方法：将PVA@HD5-myr置于60%相对湿度、37℃环境中处理33 d，然后检测其对大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、MRSA、耐舒普深®鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的杀菌活性，方法详见实施例2的“1、体外杀菌测试”。
测试结果：结果如图11所示，PVA@HD5-myr经过湿热处理后，依然具有很强的杀菌效果，证实其耐湿热能力较强，具有长期的杀菌活性稳定性，PVA@HD5-myr适合长期储存。
3、PVA@HD5-myr在长期储存后的稳定性
测试方法：将PVA@HD5-myr置于4℃环境下保存3年，然后检测其对大肠杆菌、MRSA的杀菌活性，方法详见实施例2的“1、体外杀菌测试”。
测试结果：结果如图12所示，PVA@HD5-myr经过长达3年的适当保存，对于MRSA和E.coli依然具有很强的杀菌效果，证实其稳定性强，具有长期的杀菌活性稳定性，PVA@HD5-myr适合长期储存。
实施例4：PVA@HD5-myr复合抗菌材料的吸水性测试
吸水性是无纺布的重要特性，有良好溶胀性质的敷料有助于从伤口组织吸收渗液，创造一个湿润的微环境，促进伤口愈合。本实施例测试了PVA@HD5-myr和PVA的溶胀率。
测试方法：PVA@HD5-myr和PVA浸于PBS中，分别过15 min、0.5 h、1 h、3 h、6 h以及24 h以后，用滤纸拭干表面的PBS后称取重量，并计算溶胀率。实验数据(n=3)以均数±标准差(mean±SD)表示。
测试结果：如图13所示，PVA@HD5-myr和PVA在置于PBS后，15 min即达到最大溶胀率，PVA@HD5-myr的溶胀率略低于PVA。
上述实验证实PVA@HD5-myr复合抗菌材料具有良好的溶胀特性。
实施例5：PVA@HD5-myr预防小鼠皮肤创面细菌感染、促进创面愈合的作用
造模方法：将小鼠腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)/甲苯噻嗪(10 mg/kg)进行麻醉，背部皮肤剃毛，并用脱毛膏将毛发清理干净，用手术刀构建1 cm ×1 cm的全层皮肤创伤模型。
测试方法：造模后，加盖PVA或PVA@HD5-myr敷料，然后滴加1×106CFU MRSA，于第0天、第5天、第10天、第15天拍摄创面照片，并于第15天取皮肤组织进行H&E染色和Masson三色染色。
测试结果：如图14所示，PVA@HD5-myr组小鼠创面变小得更快，皮肤愈合情况明显好于PVA组；HE结果显示，相比于PVA组，PVA@HD5-myr组小鼠皮肤组织生理愈合更完整。
实施例6：PVA@HD5-myr对内毒素介导小鼠皮肤创面急性炎症反应的保护作用
测试方法：小鼠全层皮肤创伤造模(造模方法同实施例5)后，加盖PVA@HD5-myr或PVA敷料，然后滴加20 μg的LPS(溶于50 μL PBS)，6 h后，用去内毒素水反复清洗创面6次并收集起来，检测冲洗液中内毒素以及TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。
实验数据(n=8)以均数±标准差(mean±SD)表示。多组比较采用 Bonferroni校正的单因素方差分析计算统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示差异无显著性统计学意义。
测试结果：如图15的A所示，相比于PVA组，PVA@HD5-myr组可以有效吸附内毒素，即LPS，减轻皮肤创面的LPS含量，如图15的B-D所示，相比于PVA组，PVA@HD5-myr 组小鼠皮肤创面的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显下降。
上述实验证实，固化到PVA上的HD5-myr能赋予PVA@HD5-myr吸附LPS的能力，从而增强该敷料对皮肤创面的保护作用。
实施例7：PVA@HD5-myr的安全性测试
1、PVA@HD5-myr浸提液细胞毒性
本实验参考《中华人民共和国国家标准•医疗器械生物学评价第 5 部分：体外细胞毒性试验》，并作适当修改。测试方法：将PVA和PVA@HD5-myr置于1640培养基(含10% FBS)中浸提24 h，浸提液倍比稀释(100%、50%、25%、12.5%、6.25%)，检测其对L929细胞的毒性，用MTT法检测细胞存活率。L929细胞是小鼠成纤维细胞系，能代表皮肤创面愈合过程中的主要细胞类别。具体测试步骤如下：
1) 样品浸提液制备：
PVA、PVA@HD5-myr按样品表面积与浸提介质体积的浸提比率为 6 cm2/mL浸提，即无纺布剪取6 cm × 6 cm共三块，加入到18 mL 1640培养基(含10%FBS)中，37℃孵育24 h；
2) 将100%浸提液用1640培养基(含10% FBS)倍比稀释，得到 50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%浓度；多肽HD5-myr配置初始浓度为4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL系列浓度；
3) L929细胞种于96孔板，1×104个/孔，含100 μL完全1640培养基(1640培养基+10% FBS+1%青/链霉素)，过夜；
4) 弃掉培养基，用PBS洗一遍；
5) 实验组细胞：①加100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%系列浓度浸提液100 μL，②加各浓度多肽5 μL至含95 μL 1640培养基(含10% FBS)的孔板内中，总体积为100 μL；
对照组细胞：加100 μL 1640培养基(含10% FBS)；
调零孔：不含细胞，加入100 μL 1640 培养基(含10% FBS)；
6) 37℃、5% CO2孵育 24 h；
7) 每孔加10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续37℃、5% CO2培养2 h；
8) 弃上清，每孔加入150 μL DMSO，置室温摇床低速振荡10 min；
9) 酶标仪测定490 nm或570 nm波长的光密度(optical density，OD)值。
测试结果：如图16所示，PVA@HD5-myr的100%浸提液刺激细胞后，细胞存活率超过70%，符合国家标准的要求。
2、PVA@HD5-myr浸提液溶血毒性
测试方法：
1) 样品浸提液制备：PVA、PVA@HD5-myr按样品表面积与浸提介质体积的浸提比率为 6 cm2/mL浸提，即无纺布剪取6 cm × 6 cm共三块，加入到18 mL PBS中，37℃孵育24h；
2) 将100%浸提液用PBS倍比稀释，得到50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%浓度；
3) 取6~8周龄、体重在20~22 g的雄性C57BL/6小鼠；
4) 小鼠麻醉完全后剪掉小鼠胡须，眼球周围酒精消毒；
5) 采用摘除眼球法取血，血液滴于EDTA抗凝管中，使血液和EDTA充分混合；
6) 4℃，350 g，离心5 min，可见血液分为三层，最下层为红细胞；
7) 弃掉上清，吸取红细胞；
8) 加入PBS适量，轻轻吹打均匀；
9) 4℃，350 g，离心5 min；
10) 弃掉上清，取一定量的红细胞液加入到PBS中，配成8%(v/v)红细胞悬液；
11) 取100 μL的8%红细胞悬液和100 μL上述系列浓度(100%、50%、25%、12.5%、6.25%)浸提液加入到1.5 mL EP管中，此为实验组；阳性对照为100 μL 8%红细胞悬液加入到100 μL含1% Triton X-100的PBS溶液；阴性对照组为100 μL 8%红细胞悬液加入到100 μL PBS溶液；
12) 37℃，1000 rpm，振荡1 h；
13) 4℃，350 g，离心5 min；
14) 取100 μL上清于96孔板内，测定576 nm波长的OD值；
15) 计算溶血率，溶血率(%)=(实验组OD值-阴性对照组OD值)/(阳性对照组OD值-阴性对照组OD值)×100；
16) 上述实验重复4次，统计分析。
测试结果：如图17所示，系列浓度浸提液均没有明显的溶血毒性。
上述结果显示PVA@HD5-myr的细胞毒性和溶血毒性符合国家标准。
3、PVA@HD5-myr 对小鼠皮肤的影响，验证其安全性。
测试方法：
1) PVA 组小鼠和PVA@HD5-myr组构建全层皮肤创面模型，假手术组不做处理；
2) PVA组小鼠和PVA@HD5-myr组小鼠背部分别覆盖两片PVA和PVA@HD5-myr(2 cm× 2 cm)敷料，并加以固定；
3) 用移液枪吸取含1×107CFU/mL的MRSA菌液100 μL(细菌总量为 1 × 106CFU)滴到背部，模拟皮肤细菌感染；
4) 分别于第0天、第5天、第10天、第15天拍摄皮肤创面照片，并在第15天称重；
5) 第15天，小鼠背部皮肤取材后，一部分置于4%中性甲醛中固定，进行苏木精-伊红(Hemotoxylin and Eosin, H&E)染色和Masson三色染色；另一部分称重、研磨、点板，计数细菌。
测试结果：如图18所示，H&E染色和Masson三色染色显示，PVA@HD5-myr连续使用14天后，小鼠皮肤完整性良好，胶原沉积与PVA组无明显差异。
此外，通过免疫组化分析了皮肤的血管内皮细胞(CD31+)、巨噬细胞(F4/80+)、中性粒细胞(Ly6G+)等主要细胞的分布。使用PVA@HD5-myr后，小鼠皮肤血管再生良好；在皮肤愈合阶段发挥重要作用的巨噬细胞含量丰富；而反映皮肤局部炎症的中性粒细胞很少。
上述研究证实，PVA@HD5-myr使用后，皮肤愈合良好，没有表现出明显的皮肤毒性或炎症反应。
4、PVA@HD5-myr对小鼠内脏的影响
测试方法：对上述进行皮肤测试的小鼠的内脏进行取材，经过甲醛固定、石蜡包埋，H&E染色等，最后使用虚拟数字切片扫描系统拍片。
测试结果：如图19所示，通过H&E染色，分析了PVA@HD5-myr对重要脏器的影响。证明了PVA@HD5-myr在细胞水平和组织水平，均具有良好的生物安全性。
5、PVA@HD5-myr处理后小鼠肝肾生化指标的变化
测试方法：小鼠全层皮肤创伤加盖PVA或PVA@HF5-myr，每 2 天更换一次，连续14天；14天后，取小鼠血清检测ALT、AST、CREA、BUN含量。实验数据(n=5)以均数±标准差(mean±SD)表示。多组比较采用 Bonferroni校正的单因素方差分析计算统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示差异无显著性统计学意义。
测试结果：如图20所示，反映肝肾损伤的ALT、AST、CREA、BUN 等指标，PVA@HD5-myr组与PVA、Sham组没有明显差异。
Claims (10)
1.一种偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)聚乙烯醇树脂的预处理：
将粒径≥50目且醇解度≥90%的聚乙烯醇颗粒在室温下浸泡于水中，充分溶胀后进行电解除杂，去离子水冲洗，得到处理后的聚乙烯醇树脂；
(2)含抗菌肽HD5-myr的纺丝原液的制备：
将处理后的聚乙烯醇树脂加入去离子水中，加热使温度升至90℃以上，使聚乙烯醇溶液的质量百分比浓度达到16~20%，调节溶液pH至5.5~6.5，冷却至室温后加入抗菌肽HD5-myr，混匀制得纺丝原液；
(3)偶联纳米多肽HD5-myr复合纤维的制备：
在喷丝前将钛酸酯偶联剂泵入纺丝原液中进行交联反应，然后喷丝形成纺丝细流，进入温度控制在45~50℃的甬道进行干燥；干燥后的丝条经多段牵伸后制得PVA@HD5-myr纤维，牵伸总倍率控制在16~17；
(4)偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备：
将PVA@HD5-myr纤维经过无纺布加工工艺制成PVA@HD5-myr无纺布，对PVA@HD5-myr无纺布进行辐照灭菌处理，即得所述偶联纳米多肽HD5-myr的复合抗菌材料。
2.如权利要求1所述的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，处理后的聚乙烯醇树脂中醋酸钠的质量百分比含量≤0.02%。
3.如权利要求1所述的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，保温结束后自然冷却至25±5℃。
4.如权利要求1所述的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，钛酸酯偶联剂为二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛，分子式为C6H18N2O8Ti，分子量为294.08；在钛酸酯偶联剂作用下，使抗菌肽通过Ti-O键共价稳定结合在聚乙烯醇表面。
5.如权利要求1所述的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，抗菌肽HD5-myr与聚乙烯醇的质量比为10~50 ppm；钛酸酯偶联剂与聚乙烯醇的质量比为50~100 ppm。
6.如权利要求1所述的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，纺丝经甬道干燥的时间为≤90 s。
7.如权利要求1所述的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述牵伸由三段牵伸组成，第一段牵伸的牵伸比为2，第二段牵伸的牵伸比为3，第三段牵伸的牵伸比为2.8。
8.如权利要求1所述的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，采用60Co辐照灭菌技术进行灭菌处理，辐照剂量为15±1千戈瑞。
9.如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料。
10.如权利要求9所述的偶联纳米多肽HD5-myr复合抗菌材料在制备创面敷料、一次性卫生用品或过滤材料中的应用。
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