CN117730141A - 细胞外囊泡的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于分离纯化细胞外囊泡的分离纯化方法。中空纤维膜是内径为0.2mm～1.4mm、截留分子量为10万～100万的中空纤维膜，过滤方法具有：第一过滤工序，将所述间充质干细胞的培养上清液从所述中空纤维膜的一端侧的第一开口部压入并过滤，分离为透过液和第一浓缩液；以及第二过滤工序，将所述第一浓缩液从所述中空纤维膜的另一端侧的第二开口部压入并过滤，分离为透过液和第二浓缩液，所述过滤方法是通过交替实施多次第一过滤工序和第二过滤工序的交替切向流过滤，得到细胞外囊泡的浓度提高的浓缩液的方法，第一过滤工序和第二过滤工序中的膜面速度为0.3～2m/sec。

Description

细胞外囊泡的分离纯化方法
技术领域
本公开涉及用于分离纯化细胞外囊泡的分离纯化方法。
背景技术
作为从培养液中分离纯化有用物的方法，已知使用了分离膜的方法。
在日本特开平3-39084号公报中，记载了通过使用截留分子量10000～1000000的中空纤维型超滤膜(UF膜)组件对单细胞藻类的培养液进行错流过滤来进行浓缩时，进行定期的伏流清洗的单细胞藻类培养液的浓缩方法的发明。
当通过错流过滤将培养液浓缩时，在UF膜的外侧存在浓缩液，透过液进入UF膜的内侧。当进行伏流清洗时，清洗水进入UF膜的内侧后，流出到UF膜的外侧，由此清洗UF膜。
在日本特开2018-76291号公报中记载了一种回收有用物质的方法的发明，其包括：渗出工序，从细胞的培养槽排出培养液，将与排出的培养液等量的新鲜培养基加入到上述培养槽中；以及过滤工序，使用实质上不具有致密层的多孔膜对从上述培养槽提取的培养液进行过滤，上述过滤工序中的过滤为切向流过滤，所述过滤工序中的透过液的速度为1.0LMH以下。
记载了上述有用物质选自由蛋白质、病毒、外泌体以及核酸构成的组中。作为上述切向流过滤，还记载了可以实施交替切向流过滤。细胞外囊泡是指被释放到细胞外的、由脂双层覆盖的、不具有核的颗粒的总称，包括核酸、蛋白质、脂质、各种代谢产物等，相当于外泌体、微泡以及凋亡囊泡等。
在Cytometry Research 26(1)：1～6，2016“基于Exosome的液体活检的新展开”(日文：“Exosomeによるリキッドバイオプシーの新展開”)，吉冈佑亮，落谷孝广中，作为外泌体的新的检测法，记载了ExoScreen法。
发明内容
本公开的技术问题在于提供一种用于分离纯化细胞外囊泡的分离纯化方法。
本公开提供一种细胞外囊泡的分离纯化方法，其利用中空纤维膜对包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液进行过滤，
所述中空纤维膜是内径为0.2mm～1.4mm、截留分子量为10万～100万的中空纤维膜，
所述过滤方法具有：第一过滤工序，将所述间充质干细胞的培养上清液从所述中空纤维膜的一端侧的第一开口部压入并过滤，分离为透过液和第一浓缩液；以及
第二过滤工序，将所述第一浓缩液从所述中空纤维膜的另一端侧的第二开口部压入并过滤，分离为透过液和第二浓缩液，
所述过滤方法是通过交替实施多次所述第一过滤工序和所述第二过滤工序的交替切向流过滤，得到所述细胞外囊泡的浓度提高的浓缩液的方法，
所述第一过滤工序和所述第二过滤工序中的膜面速度为0.3m/sec～2m/sec。需要说明的是，膜面速度是指膜面上的线速度。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，所述过滤方法为如下工序：将所述间充质干细胞的培养上清液利用孔径0.1μm～0.5μm的微滤膜过滤后，使用所述微滤膜的滤液，交替实施多次所述第一过滤工序和所述第二过滤工序的工序。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，在实施所述第一过滤工序时，对间充质干细胞的培养上清液或在所述第二过滤工序中得到的第二浓缩液加入缓冲液进行稀释后，实施所述第一过滤工序。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，所述第一过滤工序和所述第二过滤工序是通过引入选自氮气、惰性气体、二氧化碳、经HEPA过滤器过滤的空气中的气体来压入并实施的。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，使包含成为起始原料的细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液中所含的蛋白质量减少至1/5以下的量。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，经分离纯化的浓缩液中的胰岛素浓度为5mg/l以下。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，以所述间充质干细胞的培养上清液中所含的细胞外囊泡的量为基准时，就所述浓缩液中所含的细胞外囊泡的使用ExoScreen法测定的量而言，浓缩倍率为5倍以上且回收率为50％以上。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，所述中空纤维膜为在具有多个液体出入口的外壳内容纳有多根中空纤维膜的中空纤维膜组件。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，当交替实施所述第一过滤工序和所述第二过滤工序时，随着所述实施次数增加，使第一过滤工序的过滤对象的稀释倍数增加。
根据本公开的一个实施方式，也可以是，当交替实施所述第一过滤工序和所述第二过滤工序时，随着所述实施次数增加，使第一过滤工序的过滤对象的稀释倍数在2容量倍～15容量倍的范围内增加。
根据本公开的细胞外囊泡的分离纯化方法，可以将细胞外囊泡浓缩至高浓度。
附图说明
图1是表示实施细胞外囊泡的分离纯化方法的分离纯化装置的图。
图2是在图1所示的分离纯化流程中使用的与图1不同的实施方式的分离纯化装置的局部放大图。
图3是用NanoSight法测定实施例中使用的培养上清液中的细胞外囊泡(外泌体)时的曲线图。
图4是用NanoSight法测定实施例的最终浓缩液中的细胞外囊泡(外泌体)时的曲线图。
具体实施方式
通过使用了图1所示的分离纯化装置1的制造流程，对细胞外囊泡的分离纯化方法的一个实施方式进行说明。
在第一工序中，将包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液放入第一罐10内。作为包含细胞外囊泡的间充质干细胞，可以使用源自骨髓、血液、脂肪、脐带、脐带血、骨膜、软骨膜等以及其他体细胞组织等各种来源的间充质干细胞。关于其培养方法，例如记载在日本特开2011-67175号公报、日本特开2003-52360号公报中。
第一罐10在图1中为圆筒形状，但并不限定于此，形状和容积可以根据设置场所的状况、处理量来决定。
第一罐10优选具有能够以目视观察内部液面的透明性，而且为了防止液体附着并残留于第一罐10的内壁面，优选由具有防水性的材料构成。
第一罐10优选一部分或全部由例如聚丙烯腈、聚丙烯酸酯等丙烯酸系树脂、聚碳酸酯、氟树脂构成。
可以在第一罐10中设置用于从第一罐10内取出最终的浓缩液的取出管线。
如图2例示性地示出的那样，第一罐10的包含液体出入口10a的部分的与中空纤维膜30的连接部11可以具有直径从第一罐10侧向中空纤维膜30侧变小的圆锥状的倾斜面11a和筒状的垂直面11b。
在图2中，连接部11具有圆锥状的倾斜面11a和筒状的垂直面11b，但只要具有圆锥状的倾斜面11a，则也可以没有筒状的垂直面11b。
若具有图2所示的连接部11，则能够防止包含细胞外囊泡的液体或其浓缩液滞留在第一罐10的底部侧，能够提高细胞外囊泡的回收率，因此优选。
在第一工序之前，可以根据需要实施利用微滤膜(微滤膜组件)的预处理工序。微滤膜(微滤膜组件)优选孔径为0.1μm～0.5μm的微滤膜。
在预处理工序中，利用微滤膜(微滤膜组件)对包含细胞外囊泡的液体进行过滤而得到的滤液(预处理液)能够输送至第一罐10。
在第二工序中，可以在打开开闭阀(电磁阀等)46的状态下，将缓冲液罐40内的缓冲液从缓冲液送液管线45供给至第一罐10内，稀释第一罐10内的包含细胞外囊泡的液体(或预处理液)。
在第一罐10内加入包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液(或预处理液)的稀释液的状态下，在第一罐10的上部留有不存在上述稀释液的空间。
作为缓冲液罐40内的缓冲液，优选医疗用或生物化学用的缓冲液，例如可以使用磷酸缓冲液(PBS)、Tris盐酸缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液等。
在向缓冲液罐40补充缓冲液时，可以从缓冲液补充管线41补充。
需要说明的是，也可以使第一工序与第二工序的顺序颠倒，将缓冲液罐40内的缓冲液从缓冲液送液管线45供给至第一罐10内，然后，将包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液(或预处理液)加入至第一罐10内。
此外，也可以将第一工序和第二工序作为一个工序，在另外设置的混合罐内添加包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液(或预处理液)和缓冲液并混合，制备稀释液后，将上述稀释液加入至第一罐10内。
在第三工序中，实施如下的第一过滤工序：使未图示的泵等工作，从未图示的气体供给源向第一罐10内供给气体，对第一罐10内的包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液(或预处理液)进行加压，由此将包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液(或预处理液)压入中空纤维膜30的内侧进行过滤。
需要说明的是，在本公开中，将用中空纤维膜30过滤第一罐10内的液体并输送至第二罐20的工序全部称为第一过滤工序。
切换三通阀61，用于加压的气体穿过具备压力计51的气体供给管线52和第一罐气体供给管线53进行输送。此时，开闭阀46、第一排气管线55的开闭阀62预先关闭，第二排气管线56的开闭阀63预先打开。
作为用于加压的气体，可以使用选自氮气、氩气、氦气等惰性气体、二氧化碳、经HEPA过滤器等过滤的清洁空气等中的气体。
过滤后的透过液贮存在透过液罐35中，将包含细胞外囊泡的浓缩液(第一浓缩液)输送至第二罐20。
在第一浓缩液加入至第二罐20内的状态下，在第二罐20的上部留有不存在第一浓缩液的空间。
中空纤维膜30的内径优选为0.2mm～1.4mm，更优选为内径0.2mm～1.0mm，进一步优选为内径0.4mm～1.0mm。
作为中空纤维膜30，优选截留分子量为10万～100万的超滤膜，更优选截留分子量为20万～80万的超滤膜，进一步优选截留分子量为30万～60万的超滤膜。截留分子量可以通过使磷酸缓冲液中的γ球蛋白(SIGMA制牛血清γ球蛋白，分子量15万)100mg/L的溶液在中空纤维膜30以过滤压力0.1MPa下进行错流透过(膜面速度：0.2m/s)的情况下的、γ球蛋白的透过率％((透过液中的γ球蛋白浓度/溶液中的γ球蛋白浓度(100mg/L)×100)来评价。中空纤维膜30的γ球蛋白的透过率优选为5％～95％，更优选为10％～80％，进一步优选为30％～70％。
中空纤维膜30可以是聚醚砜膜等疏水性膜，也可以是纤维素系的亲水性膜，但优选纤维素系的亲水性膜。作为纤维素系的亲水性膜，可列举出乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、丙酸纤维素膜、丁酸纤维素膜、苯甲酸纤维素膜等。
作为中空纤维膜30，可以使用Daicen Membrane-Systems(株)的FUS5082(聚醚砜膜；截留分子量50万，γ球蛋白透过率70％)，Daicen Membrane-Systems(株)的FUC1582(乙酸纤维素膜；截留分子量15万，γ球蛋白透过率10％)等。
在图1所示的例子中，中空纤维膜30被配置为连接第一罐10的液体出入口10a和位于第二罐20的连接部21的液体出入口20a。
中空纤维膜30与第一罐10的液体出入口10a的连接例如可以通过将中空纤维膜30的开口端部嵌入至固定在第一罐10的液体出入口10a侧的、如注射针那样的细管中来进行。中空纤维膜30与第二罐20的液体出入口20a的连接也可以同样地实施。
透过液罐35用于储存在中空纤维膜30中过滤得到的透过液。在图1中，透过液罐35示出得小，但也可以制成中空纤维膜30的大部分进入其中那样的较大的罐。
在图1中，中空纤维膜30示出了一根，但也可以是多根，例如可以作为由2～150根构成的中空纤维膜束使用。
此外，也可以使用多根中空纤维膜(中空纤维膜束)30容纳在具有多个液体出入口的外壳中的中空纤维膜组件。在用作所述中空纤维膜束时，可以用粘接剂将一端部或两端部一体化。
在使用所述中空纤维膜组件的情况下，可以将中空纤维膜组件的多个液体出入口、第一罐10的液体出入口10a以及第二罐20的液体出入口20a连接，进而将中空纤维膜组件的液体透过出口与透过液罐35连接。
第三工序的过滤优选在膜面速度为0.3m/sec～2m/sec的范围内过滤，更优选在膜面速度为0.5m/sec～1.5m/sec的范围内过滤。若膜面速度低于0.3m/sec，则纯化效率降低，相反，若膜面速度高于2m/sec，则用于提高膜面速度的压力水平变得过高，在过滤时对细胞外囊泡施加的剪切力也变得过高，结果有可能使细胞外囊泡变质。
将上述膜面速度维持在上述范围内的方法优选将中空纤维膜30的入口压力(第一罐10的液体出入口10a侧)的压力调整为0.01MPa～0.2MPa，更优选调整为0.02MPa～0.15MPa，进一步优选调整为0.03MPa～0.12MPa。
将上述膜面速度维持在上述范围内的方法优选将中空纤维膜30的出口压力(第二罐20的液体出入口20a侧)的压力调整为0.03MPa以下，更优选调整为0.01MPa以下，进一步优选调整为0MPa。
在第四工序中，实施如下的第二过滤工序：使未图示的泵等工作，从未图示的气体供给源向第二罐20内供给气体，对第二罐20内的包含细胞外囊泡的液体(第一浓缩液)进行加压，使包含细胞外囊泡的液体穿过中空纤维膜30的内侧进行过滤。
需要说明的是，在本公开中，将用中空纤维膜30过滤第二罐20内的液体并输送至第一罐10的工序全部称为第二过滤工序。
过滤后的透过液贮存在透过液罐35中，将包含细胞外囊泡的浓缩液(第二浓缩液)输送至第一罐10。
第二罐20在图1中为圆筒形状，但并不限定于此，形状和容积可以根据设置场所的状况、处理量来决定。
第二罐20优选具有能够以目视观察内部液面的透明性，而且为了防止液体附着并残留于第二罐20的内壁面，优选由具有防水性的材料构成。
第二罐20优选一部分或全部由例如聚丙烯腈、聚丙烯酸酯等丙烯酸系树脂、聚碳酸酯、氟树脂构成。
第一罐10和第二罐20优选为相同形状、相同容积。第一罐10和第二罐20可以分别隔开间隔地被配置于相同高度位置。
切换三通阀61，用于加压的气体穿过气体供给管线52和第二罐气体供给管线54进行输送。此时，第二排气管线56的开闭阀63、开闭阀46预先关闭，第一排气管线55的开闭阀62预先打开。
作为用于加压的气体，可以使用选自氮气、氩气、氦气等惰性气体、二氧化碳、经HEPA过滤器等过滤的清洁空气等中的气体。
第四工序中的膜面速度优选设为与第三工序的情况下的膜面速度相同的范围内。
为了将上述膜面速度维持在上述范围内，第四工序中的中空纤维膜30的入口压力(第二罐20的液体出入口20a侧)优选调整为0.01MPa～0.2MPa，更优选调整为0.02MPa～0.15MPa，进一步优选调整为0.03MPa～0.12MPa。
为了将上述膜面速度维持在上述范围内，第四工序中的中空纤维膜30的出口压力(第一罐10的液体出入口10a侧)的压力优选调整为0.03MPa以下，更优选调整为0.01MPa以下，进一步优选调整为0MPa。
第三工序和第四工序可以通过在从气体供给源穿过气体供给管线52连续地供给气体的同时切换三通阀61来连续地实施。
然后，可以通过多次反复进行第一过滤工序(第三工序)和第二过滤工序(第四工序)来分离纯化包含细胞外囊泡的液体中的细胞外囊泡。
在多次反复第一过滤工序和第二过滤工序时，优选随着反复次数增加，使第一过滤工序的第一罐10中的过滤对象的缓冲液的稀释倍数(即第一过滤工序的过滤对象的稀释倍数)增加，例如可以使其在2容量倍～15容量倍的范围内增加，优选使其在2容量倍～10容量倍的范围内增加。
通过如此交替实施第一过滤工序和第二过滤工序的交替切向流过滤，可以得到细胞外囊泡的浓度提高的浓缩液。
本公开的细胞外囊泡的分离纯化方法优选以使包含成为起始原料的细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液中所含的蛋白质量减少至1/5以下的量的方式实施，优选以减少至1/10以下的量的方式实施。此外，优选的是，经分离纯化的浓缩液中的胰岛素浓度减少至5mg/l以下，优选减少至2mg/l以下，进一步优选减少至1mg/l以下。
就本公开的细胞外囊泡的分离纯化方法而言，优选在以成为起始原料的间充质干细胞的培养上清液中所含的细胞外囊泡的量为基准时，以通过交替反复实施第一过滤工序和第二过滤工序而得到的浓缩液中所含的细胞外囊泡的量(使用非专利文献1中记载的ExoScreen法测定出的量)的浓缩倍率为5倍以上且回收率为50％以上的方式实施。
本说明书所公开的各种方案可以与本说明书所公开的其他任何特征组合。
各实施方式中各构成及其组合等为一个示例，可以在不脱离本发明的公开主旨的范围内适当地进行构成的追加、省略、替换及其他变更。本公开不受实施方式限定，而仅受权利要求书限定。
实施例
根据以下规格使用图1所示的分离纯化装置1。
·第一罐10和第二罐20
材质：聚丙烯腈。
尺寸：长度25cm，内径0.25cm，容量120cm3。
·缓冲液罐40
容量：1.6L。
·中空纤维膜30
内径0.8mm，外径1.3mm，长度50cm，膜面积12.6cm2，截留分子量50万的聚醚砜(PES)制中空纤维膜(品名FUS5081，Daicen Membrane-Systems株式会社制)。
(培养上清液的制备)
间充质干细胞使用源自人脂肪的间充质干细胞，作为培养基，使用Ultra ExoMCulture Medium for Extracellular Vesicles(商品编号FK-K0204024，(株)Santeja公司制)。
将间充质干细胞用加入培养基的15cm皿进行培养，在间充质干细胞覆盖培养容器的粘接面的约80％的状态下，替换为不含酚红的Ultra ExoM Culture Medium进行48小时培养。
然后，将培养上清液以离心力2000×g在4℃下离心10分钟，除去细胞碎片，制备培养上清液。
(培养上清液的定量评价)
在通过ExoScreen法对所述培养上清液中的细胞外囊泡进行定量评价时，其信号强度为30914。
此外，通过NanoSight法(制品名NanoSight NS300，马尔文(Malvern)公司制)，用405nm波长的激光模块对上述培养上清液中的细胞外囊泡进行定量评价，结果具有粒径在50nm～600nm的范围具有多个峰的粒径分布(图3)。
此外，通过NanoSight法测定的细胞外囊泡颗粒数为0.3×109个/ml。
通过SDS-PAGE(CBB染色)法分析上述培养上清液中所含的蛋白质，结果主要包含分子量约7万的蛋白质。通过Bradford法进行的定量分析的结果是，培养上清液25.0ml中的蛋白质总量为29.2mg(蛋白质浓度：1.2mg/ml)。此外，通过ELISA法对所述培养上清液中所含的胰岛素进行定量，结果为375μg。
<从包含细胞外囊泡的培养上清液中分离纯化细胞外囊泡的方法的实施>
使用上述表示规格的图1所示的分离纯化装置，从包含细胞外囊泡的培养上清液中分离纯化细胞外囊泡。分离纯化在室温(约20℃)下实施。
(1)用安装于注射器圆筒的类型的孔径0.22μm(Millex-GP材质PES Millipore公司制)的微滤膜，对上述培养上清液进行全量过滤，得到滤液(预处理液)。
(2)在图1中未示出的混合容器中，将上述滤液25ml和磷酸缓冲液(PBS)50ml混合，制作培养上清稀释液75ml。
(3)将所述混合容器中的培养上清稀释液75ml加入至第一罐10内。
(4)向第一罐10的上部空间以0.1MPa的压力供给氮气，使上述培养上清稀释液穿过中空纤维膜30的内侧，并且进行切向流过滤。
此时，第二罐20打开开闭阀56而向大气开放，压力为零。此外，在中空纤维膜30的内侧流动的膜面流速即膜面速度为1.0m/s。膜面速度根据第二罐20中的浓缩液量的增加速度计算出。
透过液贮存在透过液罐35中，使浓缩液(第一浓缩液)转移至第二罐20内(第一过滤工序)。
(5)当第一罐10的培养上清稀释液穿过中空纤维膜30的内侧而被过滤，大部分转移至第二罐20时，通过三通阀61的切换，向第二罐20供给氮气，同时通过开闭阀62的开放而将第一罐10的压力开放。
(6)通过该操作，一边使第一浓缩液从第二罐20转移至第一罐10一边进行过滤，透过液贮存在透过液罐35中，使浓缩液(第二浓缩液)转移至第一罐10内(第二过滤工序)。
当第二罐20内的第一浓缩液的大部分转移至第一罐10时，通过三通阀61的切换，再次利用中空纤维膜30过滤第一罐10内的第二浓缩液，使浓缩液转移至第二罐20内(第一过滤工序)。
进行反复多次同样的第一过滤工序和第二过滤工序的交替切向流过滤。
在反复进行上述(4)～(6)的第一过滤工序和第二过滤工序(交替切向流过滤)期间，当第一罐10内的浓缩液的液量成为约25ml时，向第一罐10中添加缓冲液罐40的磷酸缓冲液(不含钙、镁的磷酸缓冲食盐水)50ml(株式会社NIPPON GENE制10×PBS缓冲液)。
需要说明的是，在缓冲液罐40的气相部(没有加入缓冲液的空间部)封入缓冲液减少的量的氮气。
上述的(4)～(6)的分离纯化工序(交替切向流过滤)合计反复四次，最终相对于最初的培养上清液25ml以总量计加入250ml的磷酸缓冲液。
在添加第四次的磷酸缓冲液后(浓缩液量75ml)，在不进行稀释的情况下通过交替切向流过滤进行过滤至2.1ml，得到外泌体浓度提高的浓缩液(最终浓缩液)。
通过ExoScreen法对最终浓缩液的外泌体进行定量评价，结果是其信号强度为233323。
初始的培养上清液25.0ml中的外泌体的信号强度为30914，因此通过使用截留分子量50万(相当膜孔径20nm)的中空纤维膜进行分离纯化，最终浓缩液2.1ml中的外泌体的浓缩倍率约为7.5倍。
此外，该外泌体的回收率为约65％((233323×2.1/30914×25.0)×100)。
此外，通过NanoSight法测定最终浓缩液中的外泌体的粒径分布，结果如图4所示，是在粒径100nm附近具有峰的分布。而且，其颗粒数为4.7×109个/ml。
另一方面，最终浓缩液2.1ml中的蛋白质总量为1.9mg，胰岛素量为1.8μg(胰岛素浓度0.9mg/l)，相对于包含外泌体的初始的培养上清液25ml(蛋白质总量为29.2mg，胰岛素量375μg(胰岛素浓度15mgl))，可以将蛋白质总量降低至6.5％，将胰岛素量降低至0.5％。
在上述的交替切向流过滤过程中，经时地对滤液量进行取样，根据其质量变化计算过滤速度。每1小时、膜面积1m2、压力0.1MPa的换算过滤速度在初期显著降低，但从过滤开始20分钟左右起，大致恒定在270～300(平均280)L/m2h，在过滤开始约65分钟后结束分离纯化。
工业上的可利用性
本公开的分离纯化方法可以在从培养液中分离纯化细胞外囊泡时利用。
附图标记说明
1：分离纯化装置
10：第一罐
20：第二罐
30：中空纤维膜
35：透过液罐
40：缓冲液罐

Claims (10)

1.一种细胞外囊泡的分离纯化方法，其利用中空纤维膜对包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液进行过滤，
所述中空纤维膜是内径为0.2mm～1.4mm、截留分子量为10万～100万的中空纤维膜，
所述过滤方法具有：第一过滤工序，将所述间充质干细胞的培养上清液从所述中空纤维膜的一端侧的第一开口部压入并过滤，分离为透过液和第一浓缩液；以及
第二过滤工序，将所述第一浓缩液从所述中空纤维膜的另一端侧的第二开口部压入并过滤，分离为透过液和第二浓缩液，
所述过滤方法是通过交替实施多次所述第一过滤工序和所述第二过滤工序的交替切向流过滤，得到所述细胞外囊泡的浓度提高的浓缩液的方法，
所述第一过滤工序和所述第二过滤工序中的膜面速度为0.3m/sec～2m/sec。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
所述过滤方法为如下工序：将所述间充质干细胞的培养上清液利用孔径0.1μm～0.5μm的微滤膜过滤后，使用所述微滤膜的滤液，交替实施多次所述第一过滤工序和所述第二过滤工序的工序。
3.根据权利要求1或2所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
在实施所述第一过滤工序时，对间充质干细胞的培养上清液或在所述第二过滤工序中得到的第二浓缩液加入缓冲液进行稀释后，实施所述第一过滤工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
所述第一过滤工序和所述第二过滤工序是通过引入选自氮气、惰性气体、二氧化碳、经HEPA过滤器过滤的空气中的气体来压入并实施的。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
使包含成为起始原料的细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液中所含的蛋白质量减少至1/5以下的量。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
经分离纯化的浓缩液中的胰岛素浓度为5mg/l以下。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
以所述间充质干细胞的培养上清液中所含的细胞外囊泡的量为基准时，就所述浓缩液中所含的细胞外囊泡的使用ExoScreen法测定的量而言，浓缩倍率为5倍以上且回收率为50％以上。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
所述中空纤维膜为在具有多个液体出入口的外壳内容纳有多根中空纤维膜的中空纤维膜组件。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
当交替实施所述第一过滤工序和所述第二过滤工序时，随着所述实施次数增加，使第一过滤工序的过滤对象的稀释倍数增加。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
当交替实施所述第一过滤工序和所述第二过滤工序时，随着所述实施次数增加，使第一过滤工序的过滤对象的稀释倍数在2容量倍～15容量倍的范围内增加。
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