CN117729974A - 用于组合的核酸纯化和扩增的组件和方法 - Google Patents

用于组合的核酸纯化和扩增的组件和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于从生物样品中进行核酸纯化和扩增的组合测试的组件和相应的方法，特别是关于制备用于下一代测序的文库。所述组件中的一个或多个流体卡盒的独特旋转设计能够使生物样品和试剂基于离心力在流体卡盒各处移动，所述离心力由旋转移动提供并与分度转位机构联结。通过将流体卡盒适当地定向，可以引导流体流进流体卡盒上的不同室和从流体卡盒上的不同室流出以进行不同的测试步骤，而不需要在样品处理期间分批。

Description

用于组合的核酸纯化和扩增的组件和方法
技术领域
本发明涉及用于从生物样品中进行核酸纯化和扩增的组合测试的组件和相应的方法，特别是用于制备下一代测序的文库的组件和相应的方法。
背景技术
下一代测序(NGS)已发展为用于对核酸进行高通量测序的强大工具，从而使得在如基因组鉴定、基因检测、药物发现和疾病诊断的各种应用中取得快速进展(例如在以下的文献中所评述的：Goodwin，S.等人(2016)Nat.Rev.Genet.17，333-351；Slatko，B.E.等人(2018)Curr.Protoc.Mol.Biol.122，e59；Hess，J.F.等人(2020)Biotechnol.Adv.41，107537)。
随着NGS技术不断进步，可一次测序的核酸量逐渐增加。这使得不仅能够处理更大且更复杂的样品，还能够增加每个样品的读段(reads)的数量，从而检测该样品内甚至非常小的序列变化。
在当前用于诊断应用的NGS设置中，自动化通过减少操作时间并降低由所需复杂程序引起的样品混淆风险而在加速样品处理方面发挥着重要作用。
NGS文库制备过程在很大程度上仍然是手动的，需要大量的实验工作和熟练的操作员，周转时间长达数天。事实上，大型自动化液体处理仪可用于促进制备，但这些仪器通常分批处理样品，并且需要昂贵的塑料耗材，例如样品吸头和板。因此，NGS分析通常在专业实验室进行。
为了使NGS技术作为常规检测得到更广泛的应用，工作流程需要以简单且分散方式进行，以便于可能进行就近患者检测的临床环境。特别地，需要能够在不需要样品分批的情况下制备NGS文库的仪器，即尤其能够进行组合的核酸纯化和扩增的仪器。同时，该方法应易于处理且具有成本效益。
因此，本发明的目的是提供用于组合的核酸纯化和扩增(特别是在下一代测序应用的背景下)的这类仪器以及相应的方法。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种用于从生物样品中进行核酸纯化和扩增的组合测试的组件，所述组件包括：(i)一个或多个盘形的流体卡盒(card)，其布置在旋转平台上；(ii)磁性混合装置，其布置在一个或多个流体卡盒下方；以及(iii)用于对旋转平台上的一个或多个流体卡盒进行分度转位(indexing)的装置，该装置包括电子控制的步进电机，所述步进电机与旋转平台接合，以便以预定角度产生旋转平台的间歇性旋转运动；其中，一个或多个盘形的流体卡盒包括：(x.i)一个或多个接收室，其用于接收生物样品和一种或多种用于核酸纯化的试剂；(x.ii)纯化室，其用于纯化核酸，所述纯化室具有凹形底表面，位于流体卡盒的中央，并且通过从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度与一个或多个接收室流体连通；(x.iii)一个或多个反应室，其用于扩增核酸，所述一个或多个反应室具有凹形底表面，位于流体卡盒的纯化室一侧的外部，并且每个反应室通过从反应室到纯化室的下降坡度与纯化室流体连通；以及(x.iv)废料室，其用于收集测试废料，所述废料室包括吸收性材料，位于流体卡盒的与一个或多个接收室基本上相反的外部，并且与一个或多个反应室中的每个反应室以及纯化室流体连通；并且其中，磁性混合装置布置在一个或多个流体卡盒的纯化室下方，从而能够通过使用磁性固体载体来纯化核酸。
在优选的实施方案中，一个或多个盘形的流体卡盒进一步包括以下室中的一种或多种：(x.v)一个或多个接收室，其用于接收一种或多种用于核酸扩增的试剂，所述一个或多个接收室通过从所述一个或多个接收室到一个或多个反应室的下降坡度与一个或多个反应室流体连通；(x.vi)一个或多个洗脱室，其用于稀释纯化的核酸，所述一个或多个洗脱室位于与纯化室相邻的位置并且与纯化室和一个或多个反应室流体连通；(x.vii)一个或多个混样和/或收集室，其用于混样和收集在一个或多个反应室中产生的扩增的核酸，所述一个或多个混样和/或收集室位于流体卡盒的与一个或多个反应室相邻的外部并且与一个或多个反应室流体连通；(x.viii)一个或多个通风室，其与一个或多个反应室和/或废料室流体连通。
在具体的实施方案中，一个或多个接收室(x.i)包括样品接收室和试剂接收室，并且在特定的实施方案中，从样品接收室到纯化室的流体连通部与从试剂接收室到纯化室的流体连通部合并。
在进一步特定的实施方案中，(i)从一个或多个接收室(x.i)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到废料室的流体连通部；和/或(ii)从一个或多个接收室(x.i)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部；和/或(iii)从一个或多个混样和/或收集室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部；和/或(iv)从一个或多个反应室到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到废料室的流体连通部；和/或(v)在存在一个或多个洗脱室的情况下，从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个洗脱室的流体连通部，从一个或多个接收室(x.i)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个洗脱室的流体连通部，并且从一个或多个混样和/或收集室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的流体连通部。
在进一步特定的实施方案中，一个或多个反应室设置有：(i)一个或多个加热和/或冷却元件，其能够控制一个或多个反应室中的温度，具体地，其中，所述一个或多个加热和/或冷却元件通过磁感应工作；和/或(ii)能够密封一个或多个反应室的装置，其配置为能够控制通向一个或多个反应室以及源自一个或多个反应室的流体连通，具体地，其中，用于密封的装置选自旋转盖、球形盖和油覆盖层。
在优选的实施方案中，所述组件进一步包括用于将测试试剂分配至一个或多个接收室和/或一个或多个反应室的一个或多个装置，其中，所述一个或多个装置布置在一个或多个流体卡盒上方，并且具体地，其中，所述一个或多个装置为用于分配多种试剂的一个或多个转盘(carousel)。
在进一步优选的实施方案中，所述组件为用于进行下一代测序的集成平台的一部分。
在另一个方面，本发明涉及一种用于从生物样品中进行核酸纯化和扩增的组合测试的方法，所述方法包括：(i)提供如上文所限定的组件；(ii)使得向一个或多个接收室(x.i)提供的生物样品和一种或多种用于核酸纯化的试剂经由从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度行进至纯化室；(iii)在纯化室中通过将纯化的核酸固定至磁性固体载体来从生物样品中纯化核酸；(iv)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得废料室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使测试废料通过离心流动从纯化室行进至废料室；(v)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个反应室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至一个或多个反应室；或者在存在一个或多个洗脱室的情况下，将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个洗脱室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至一个或多个洗脱室，并且在稀释纯化的核酸之后，将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个反应室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从一个或多个洗脱室行进至一个或多个反应室；(vi)在一个或多个反应室中扩增核酸；以及(vii)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个混样和/或收集室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使扩增的核酸通过离心流动从一个或多个反应室行进至一个或多个混样和/或收集室。
在具体的实施方案中，生物样品选自血液、血浆、血清、唾液、尿液、鼻咽拭子、口咽拭子和组织样本。
在优选的实施方案中，用于纯化核酸的磁性固体载体为顺磁珠。在该方面特别优选地，所述方法进一步包括以下步骤中的一个或多个步骤：(i)通过将用于细胞裂解的试剂提供至一个或多个接收室(x.i)并使其行进至纯化室，从生物样品中释放核酸；和/或(ii)通过将洗涤试剂提供至一个或多个接收室(x.i)并使其行进至纯化室，对固定的核酸的一个或多个洗涤步骤；和/或(iii)通过将洗脱试剂提供至一个或多个接收室(x.i)并使其行进至纯化室，从磁性固体载体洗脱固定的核酸。
在进一步优选的实施方案中，在一个或多个反应室中通过进行聚合酶链式反应来扩增核酸，具体地，其中，聚合酶链式反应期间的热循环通过磁感应来实现。
在特定的实施方案中，在进行步骤(vi)之前向一个或多个反应室提供用于核酸扩增的试剂，其中，将一种或多种用于核酸扩增的试剂提供至一个或多个接收室(x.v)并使其经由从一个或多个接收室到一个或多个反应室的下降坡度行进至一个或多个反应室。
在进一步特定的实施方案中，所述方法进一步包括：通过将稀释试剂提供至一个或多个接收室(x.v)并使其行进至一个或多个反应室，稀释扩增的核酸。
在优选的实施方案中，以多重形式进行核酸纯化和扩增的组合测试；和/或其中，扩增的核酸代表用于下一代测序的核酸文库。
附图说明
图1：(A)根据本发明的示例性流体卡盒的示意图。流体卡盒包括两个接收室，所述两个接收室例如分别用于引入生物样品和测试试剂，所述两个接收室经由通道与用于核酸纯化的中央纯化室流体连通。纯化室又经由相应的通道与用于核酸扩增的三个反应室以及用于处理测试废料的废料室流体连通。反应室和废料室各自与通风室流体连通。流体流动主要分别发生在接收室到纯化室、纯化室到废料室以及纯化室与反应室之间，如箭头所示。(B)根据本发明的另一示例性流体卡盒的示意图。流体卡盒包括与纯化室流体连通的两个接收室。纯化室又与洗脱室流体连通，所述洗脱室用于对纯化的核酸在转移至一个或多个反应室之前进行稀释。纯化室还与废料室流体连通。一个或多个反应室与洗脱室和用于混样(pooling)扩增的核酸的混样室流体连通。多个通风室与上述其他室流体连通。主要的流体流动由箭头指示。
图2：根据本发明的示例性流体卡盒的图。(A)俯视图；(B)仰视图。(A)和(B)表示分别用于引入生物样品和测试试剂的接收室。(C)表示纯化室，(D)表示废料室，(E)表示三个反应室。此外，室之间的各种通道被示出用于实现流体流动，并且与反应室流体连通的附加试剂端口用于引入用于核酸扩增的试剂。收集室(显示在纯化室上方)用于对扩增的核酸进行混样和收集。
图3：(A)根据本发明的示例性旋转平台的图。为了同时处理多个生物样品，可以在旋转平台上布置多达六个流体卡盒。如图2所示的三个流体卡盒布置在旋转平台上。在该实施方案中，流体卡盒的反应室和收集室分别由旋转盖密封。(B)示例性流体卡盒与两个试剂转盘组合的图，所述两个试剂转盘用于将测试试剂分别分配至用于核酸纯化的接收室和反应室。例如，向接收室供应用于核酸纯化的通用试剂(例如提取和洗涤缓冲液)，而向反应室供应用于核酸扩增的特定试剂(例如引物)。可以通过使试剂转盘本身旋转来分配不同的试剂。可以通过将每个流体卡盒旋转到试剂转盘下方的特定位置来对多个流体卡盒进行供应。
图4：根据本发明的示例性组件的图。(A)立体图；(B)侧视图。布置有两个流体盘(C)的旋转平台(B)安装在用于使平台旋转的步进电机(A)上，所述步进电机还采用针对旋转平台的分度转位机构。在每个流体盘的下方布置有磁性混合装置(D)，其能够使生物样品和试剂混合。每个磁性混合装置与电机(E)非接触地接合。
图5：如图2所示的根据本发明的示例性流体卡盒的图，其中每个反应室(E)设置有加热和/或冷却元件(显示为反应容器状结构)，能够在核酸扩增期间控制反应室中的温度。此外，每个反应室配备有旋转盖(H)，所述旋转盖(H)用于密封反应室并配置为能够控制通向反应室以及源自反应室的流体连通。(A)示出加热和/或冷却元件的立体图；(B)示出旋转盖的立体图；(C)截面图。
图6：(A)如图2所示的根据本发明的示例性流体卡盒的图(仰视图)。(I)表示与相应的反应室流体连通的试剂端口，其用于引入用于核酸扩增的试剂。(K)表示用于对各个反应室中产生的扩增产物进行混样的混样室，并且(K)表示用于收集最终产物的收集室。(B)旋转盖(H)对流体通道的打开(open)和关闭(close)产生相应效果的三个不同旋转位置的图。旋转盖H1处于所有三个流体通道(分别通向纯化室(C)、试剂端口(I)和混样室(J))均打开的位置。旋转盖H2处于仅通向试剂端口(I)和混样室(J)的流体通道打开的位置。旋转盖H3处于所有三个流体通道均关闭的位置。
图7：如图1B所示的根据本发明的示例性流体卡盒的图。(A)立体图；(B)截面图。示出了纯化室(C)和反应室(F)。不同室之间的流体连通由“球形盖”控制，所述球形盖示为红色球体并且在示出纯化/洗脱室与反应室之间的流体连通的截面图中示为(H)。球形盖(实际上是一种滚珠)用作单向流动的阀门，并且在核酸扩增期间用于密封一个或多个反应室。类似地控制其他室之间的流体连通。
图8：根据本发明的用于进行核酸纯化和扩增的组合测试的方法的三个示例性步骤的图。将生物样品和用于核酸纯化的试剂引入到布置在旋转平台(G)上的如图2所示的示例性流体卡盒的接收室(A)和(B)中，并且从生物样品中纯化核酸并固定在纯化室(C)中。(A)将流体卡盒分度转位，使得废料室径向向外定向，并且向旋转平台(G)施加旋转运动，从而使测试废料通过离心流动从纯化室行进至废料室(D)。可以以类似的方式通过以下进行洗涤步骤：将洗涤缓冲液添加至接收室(B)，在纯化室中洗涤固定的核酸，并在废料室中丢弃废料。(B)通过将洗脱缓冲液添加至接收室(B)来洗脱固定的核酸。将流体卡盒分度转位，使得反应室(E)(其可以预填充有用于核酸扩增的试剂)径向向外定向，并且向旋转平台(G)施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至反应室。(C)在核酸扩增完成之后，将扩增的产物稀释至合适的浓度。将流体卡盒分度转位，使得混样室(J)然后是收集室径向向外定向，并且向旋转平台(G)施加旋转运动，从而使扩增的核酸通过离心流动从反应室行进至混样室和收集室。
图9：根据本发明的示例性流体卡盒的图。在左图示出了俯视图，在右图示出了仰视图。指示出相应的室。纯化室包括作为搅拌器或搅拌装置的滚珠，所述滚珠示为红色球体。不同室之间的流体连通由“球形盖”控制，所述球形盖也示为红色球体(还如图7所示)。
图10：如图2所示的根据本发明的示例性流体卡盒的图。示出了具有反应室(用于核酸扩增)的流体卡盒的一部分的截面，所述反应室能够在扩增期间通过磁感应进行温度控制。反应室至少部分地由诸如铁磁性材料的导电和/或感应磁性材料制成或涂覆有所述导电和/或感应磁性材料。反应室由感应线圈围绕。感应线圈由单个驱动电路控制。靠近反应室的温度传感器能够监测反应温度。通过施加磁感应，反应的导电和/或感应磁性材料产生热量。反应室的冷却通过反应室周围的气流来实现。
图11：分别用作为对照的Bio-Rad PCR Thermal Cycler(Bio-Rad LaboratoriesPte.Ltd.，新加坡)(A)和如图2所示的根据本发明的示例性流体卡盒(B)进行的示例性核酸纯化和扩增反应的图。样品是来自人类受试者的溶解在病毒运输培养基(磷酸盐缓冲盐水、胎牛血清)中的鼻咽拭子。用于核酸纯化的试剂与用于来自临床样品的病毒和细菌RNA/DNA的NucleoMag Pathogen试剂盒(Macherey-Nagel GmbH&Co.KG，迪伦，德国)一致。所使用的引物是在标准PCR条件下的β-肌动蛋白DNA内部对照引物。在两个反应中检测到的DNA扩增子的相应大小是相同的(绘制的是相对信号强度vs.迁移时间)。
具体实施方式
本发明基于如下意外的发现：可以通过布置在旋转平台上的特别设计的盘形流体卡盒以组合测试从生物样品中纯化和扩增核酸，其中在流体卡盒各处的流体运动仅通过离心流动来实现，而不需要复杂的注射器或流体泵。样品处理通过与旋转运动联结的分度转位机构进行协调，从而能够按时间顺序执行核酸纯化和随后分析的各个步骤。流体卡盒的特定构造(例如不同室之间的流体连通部的坡度、某些室的凹形底表面、流体连通部与室之间的阶状部等)允许在流体卡盒内进行定向且旋转驱动的流体输送，而不会在样品处理期间出现回流的风险。由于可以在流体卡盒上进行多个测试，所以不需要将样品分批。将测试试剂加入系统中，并且通过使流体卡盒旋转至通用分配装置下方的所需位置，经由该分配装置供应所述测试试剂。因此，进行测试不需要塑料耗材。根据本发明的方法提供了一种明显省力、简化并具有成本效益的过程，其中将样品装载到流体卡盒上并将流体卡盒布置到旋转平台上的操作时间仅为几分钟。
本发明的方法特别适用于制备用于各种应用的核酸文库，特别是用于下一代测序的核酸文库。下一代测序(也称为大规模平行测序)总体上涉及高通量DNA测序方法(例如在以下的文献中所评述的：Goodwin，S.等人(2016)Nat.Rev.Genet.17，333-351；Hu，T.等人(2021)Hum.Immunol.82，801-811)。文库制备可以在六小时内完成，这尤其在诊断领域具有重大意义，在诊断领域中尽快获得结果可能至关重要。由于不需要专门的实验室来进行测试，所以本发明提供了一种用于就近患者检测的解决方案，其进一步帮助缩短了时间。
在下文将结合特定的实施方案并参考某些附图来描述本发明，但本发明应理解为不限于此，而仅由所附权利要求来限定。可以在本文未具体公开的任何元件或限制不存在的情况下适当地实施本发明。
在本文使用术语“包括”的情况下，该术语不排除其他元件或步骤。出于本发明的目的，术语“由......组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果在下文中将群组定义为包括至少一定数量的实施方案，则这也应理解为公开了优选地仅由这些实施方案组成的群组。
在引用单数名词时使用如“一个”、“一种”或“该”的不定冠词或定冠词的情况下，其包括该名词的复数，除非另有特别说明。
在本发明的上下文中指出数值的情况下，本领域技术人员将理解，所讨论的特征的技术效果是在精度区间内确保的，所述精度区间通常包括给定的数值的±10％的偏差，优选±5％的偏差。
此外，在说明书和权利要求书中，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等用于在相似元件之间进行区分，而非一定用于描述顺序或时间顺序。应理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文所描述的本发明的实施方案能够以除本文所描述或所示出的顺序之外的其他顺序操作。
在下文，将根据使用术语的上下文给出术语的进一步定义。提供以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明。这些定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
在一个方面，本发明涉及一种用于从生物样品中进行核酸纯化和扩增的组合测试的组件，所述组件包括：
(i)一个或多个盘形流体卡盒，其布置在旋转平台上；
(ii)磁性混合装置，其布置在一个或多个流体卡盒下方；以及
(iii)用于对旋转平台上的一个或多个流体卡盒进行分度转位的装置，该装置包括电子控制的步进电机，所述步进电机与旋转平台接合，以便以预定角度产生旋转平台的间歇性旋转运动；
其中，一个或多个流体卡盒包括：
(x.i)一个或多个接收室，其用于接收生物样品和一种或多种用于核酸纯化的试剂；
(x.ii)纯化室，其用于纯化核酸，所述纯化室具有凹形底表面，位于流体卡盒的中央，并且通过从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度与一个或多个接收室流体连通；
(x.iii)一个或多个反应室，其用于扩增核酸，所述一个或多个反应室具有凹形底表面，位于流体卡盒的纯化室的一侧的外部，并且每个反应室通过从反应室到纯化室的下降坡度与纯化室流体连通；以及
(x.iv)废料室，其用于收集测试废料，所述废料室包括吸收性材料，位于流体卡盒的与一个或多个接收室基本上相反的外部，并且与一个或多个反应室中的每个反应室以及纯化室流体连通；
并且其中，磁性混合装置布置在一个或多个流体卡盒的纯化室的下方，从而能够通过使用磁性固体载体来纯化核酸。
本发明中使用的流体卡盒具有盘状形状，优选圆形或近似圆形形状。图1A和图1B分别示出了本文中采用的两个示例性流体卡盒的示意图。图2和图9示出了这样的流体卡盒的两种示例性设计。流体卡盒布置在旋转平台上。旋转平台可以保持单个流体卡盒，或者可以配置为保持多个流体卡盒，优选地，偶数个流体卡盒(例如两个、四个、六个、八个、十个或十二个流体卡盒)。一个或多个流体卡盒以旋转平台旋转时流体卡盒本身能够旋转的方式布置在旋转平台上。例如，流体卡盒可以安装在位于旋转平台的相应位置处的保持装置(例如销或插头)上，流体卡盒与旋转平台旋转地接合。图3A示出了布置有流体卡盒的示例性旋转平台。
本文中使用的流体卡盒包括下文详细描述的各种室。不同的室可以彼此流体连通，其中流体连通优选地通过室之间的通道来实现。
流体卡盒包括一个或多个接收室，所述一个或多个接收室用于接收生物样品和一种或多种用于核酸纯化的试剂。一个或多个接收室可以配置为端口或入口，生物样品和测试试剂被分配到所述端口或入口。在具体的实施方案中，一个或多个接收室包括单独的样品接收室和单独的试剂接收室，这样避免了污染的风险并且使得能够在样品处理期间的某些时间点供应用于核酸纯化的不同测试试剂(例如提取试剂、洗涤缓冲液和洗脱试剂)。
一个或多个接收室与进行核酸纯化的纯化室流体连通。对于一个或多个接收室中的每一个，通向纯化室的流体连通可以是单独的，例如通过流入纯化室的单独通道。在其他实施方案中，源自两个或更多个接收室的相应流体连通部在到达纯化部之前合并。在具有单独的样品接收室和单独的试剂接收室的特定实施方案中，从样品接收室到纯化室的流体连通部与从试剂接收室到纯化室的流体连通部在到达纯化室之前合并。
一个或多个接收室与纯化室之间的流体连通部具有从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度，从而使生物样品和测试试剂能够被动地流动至纯化室，并且还降低了在纯化室中进行样品处理期间出现任何回流的风险。为此，在一些实施方案中，在流体连通部与纯化室汇合处设置有阶状部或陡降部(drop)，使得存在针对液体回流的另一屏障。此外，可以设置“球形盖”作为阀门，以确保单向流动。这种球形盖是一种功能类似于滚珠的球状结构。从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度可以在1％至20％之间，例如1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、18％和20％。
流体卡盒还包括用于纯化核酸的纯化室。纯化室位于流体卡盒的中央，并且具有凹形底表面，即底表面朝向中央向内弯曲或凹陷。这种配置能够将液体容纳在室中并处理较小的液体体积。通常，纯化室具有圆形的表面区域或形状。
所述组件进一步包括磁性混合装置，所述磁性混合装置布置在一个或多个流体卡盒的纯化室下方，从而能够通过使用固体磁性载体来纯化核酸。纯化室可以配备有用于使室中的液体混合的搅拌器或搅拌装置。搅拌器或搅拌装置可以是布置在纯化室中的一个或多个滚珠。搅拌器或搅拌装置是磁性的，例如磁性搅拌棒，其由磁性混合器(例如旋转磁体或电磁体组件)驱动。替选地，搅拌器或搅拌装置也可以是铁氧体，例如一个或多个铁氧体球体，其由磁性混合器驱动。搅拌器或搅拌装置可以布置或安装在纯化室的底部。
流体卡盒进一步设置有用于扩增核酸的一个或多个反应室，所述一个或多个反应室具有凹形底表面，即底表面朝向中央向内弯曲或凹陷。这种配置能够容纳和处理较小的液体体积。通常，流体卡盒设置有多于一个的方向室，例如两个、三个或四个反应室，这有助于促进核酸扩增。通常，一个或多个反应室具有圆形的表面区域或形状。一个或多个反应室可以具有锥形的端部逐渐变细的整体形式。一个或多个反应室可以由导电和/或感应材料制成或涂覆有导电和/或感应材料。导电和/或感应材料是磁性的。典型的导电和/或感应材料为金属，例如铁、铜和铝或其组合。一个或多个反应室位于流体卡盒的纯化室一侧的外部(其与废料室基本上相反，参见下文)，并且每个反应室与纯化室流体连通。流体连通可以通过源自纯化室的单独通道或通过源自纯化室的共用通道来实现，所述共用通道分叉或分支以建立与每个反应室的连接。
从一个或多个反应室到纯化室的流体连通部具有下降坡度，从而使纯化的核酸能够被动地流动至反应室，并且还降低了在反应室中进行核酸处理(扩增)期间出现任何回流的风险。为此，在一些实施方案中，在流体连通部与纯化室汇合处设置有阶状部或陡降部，使得存在针对液体回流的另一屏障。此外，可以设置“球形盖”作为阀门，以确保单向流动。从纯化室到一个或多个反应室的下降坡度可以在1％至20％之间，例如1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、18％和20％。
在优选的实施方案中，流体卡盒进一步包括一个或多个洗脱室，所述一个或多个洗脱室用于对纯化的核酸在转移至一个或多个反应室之前进行稀释，从而确保提供适当量的适当的浓度的核酸用于核酸扩增。本领域技术人员非常清楚如何确定进行特定的核酸扩增测试所需的量和/或浓度。一个或多个洗脱室位于与纯化室相邻的位置并且与纯化室和一个或多个反应室流体连通。通常，流体卡盒设置有单个洗脱室。
从一个或多个反应室到一个或多个洗脱室的流体连通部具有下降坡度，从而使纯化的核酸能够被动地流动至反应室，并且还降低了在反应室中进行核酸处理(扩增)期间出现任何回流的风险。为此，在一些实施方案中，在流体连通部与一个或多个洗脱室汇合处设置有阶状部或陡降部，使得存在针对液体回流的另一屏障。此外，可以设置“球形盖”作为阀门，以确保单向流动。从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的下降坡度可以在1％至20％之间，例如1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、18％和20％。
在进一步优选的实施方案中，流体卡盒进一步包括一个或多个(附加)接收室，所述一个或多个(附加)接收室用于接收一种或多种用于核酸扩增的试剂，所述一个或多个接收室与一个或多个反应室流体连通，并且从一个或多个接收室到一个或多个反应室具有下降坡度，从而使测试试剂能够被动地流动至反应室，并且还降低了在反应室中进行核酸处理(扩增)期间出现任何回流的风险。为此，在一些实施方案中，在流体连通部与一个或多个反应室汇合处设置有阶状部或陡降部，使得存在针对液体回流的另一屏障。此外，可以设置“球形盖”作为阀门，以确保单向流动。从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的下降坡度可以在1％至20％之间，例如1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、18％和20％。
一个或多个接收室可以配置为端口或入口，测试试剂被分配到所述端口或入口。流体连通部的下降坡度使测试试剂能够被动地流动至反应室，并且还降低了液体的任何回流的风险。在一些实施方案中，为每个反应室设置一个接收室，这能够通过提供特定的试剂(例如用于核酸扩增的特定引物)而在每个反应室中进行不同的反应。在其他实施方案中，共用接收室可用于向多个反应室提供试剂。
原则上，还可以经由上述一种或多种用于核酸纯化的试剂的一个或多个接收室来引入用于核酸扩增的试剂，然后必须间接地经由纯化室将试剂转移至一个或多个反应室。然而，这种方法将需要额外的转移步骤。
在特定的实施方案中，一个或多个反应室设置有一个或多个加热和/或冷却元件，所述一个或多个加热和/或冷却元件能够控制一个或多个反应室中的温度。图5A和图5C示出了设置有加热和/或冷却元件的示例性反应室。一个或多个反应室中的每个反应室可以配备有单独的加热和/或冷却元件。替选地，可以为所有的一个或多个反应室设置共用的加热和/或冷却元件。加热和/或冷却元件可以配置为热模块，其广泛应用为用于进行聚合酶链式反应(PCR)的热循环器的一部分。这些热模块中的许多热模块利用珀耳帖元件进行热电加热和冷却，从而能够以不连续的预定步骤升高和降低热模块的温度(这也被称为热循环)。热模块可以具有梯度功能，从而在热模块的不同部分中实现不同的温度。在特定的实施方案中，设置有感应元件，其通过非接触方法加热反应室。换言之，一个或多个加热和/或冷却元件通过磁感应工作。为此，一个或多个反应室可以至少部分地由导电和/或感应磁性材料(例如铁磁性材料)制成或涂覆有所述导电和/或感应磁性材料，以产生热能。一个或多个反应室可以由共用感应线圈或用于每个反应室的单独线圈包围。冷却可以通过风扇产生的一个或多个反应室周围的气流来实现。图10示出了通过磁感应控制一个或多个反应室的温度的示例性布置。在另一些实施方案中，加热和/或冷却元件配置为具有供反应混合物移动通过的热区和冷区的通道。用于在核酸扩增期间控制温度(例如通过“经典”的热模块PCR应用、磁感应PCR应用或等温扩增方法)的多种元件已在本领域中得到广泛应用，并且可从不同的供应商处购得。
在进一步特定的实施方案中，一个或多个反应室设置有能够密封一个或多个反应室以避免在核酸扩增期间蒸发的装置。在一些实施方案中，密封通过用油(通常是矿物油)覆盖来实现。在其他实施方案中，一个或多个反应室由加热的盖子覆盖，所述加热的盖子还防止水从反应室内的反应混合物中冷凝。在另一些实施方案中，一个或多个反应室设置有盖，优选地设置有旋转盖。图5B和图5C示出了设置有旋转盖的示例性反应室。特别地，诸如旋转盖的装置配置为能够控制通向一个或多个反应室以及源自一个或多个反应室的流体连通。在旋转盖的情况下，这可以通过盖中的开口或空腔来实现，当处于一定的旋转位置时，所述开口或空腔使得一个或多个反应室能够与第一其他室(例如纯化室或用于核酸扩增的试剂的接收室)流体连通。在旋转盖的另一个旋转位置，关闭与第一其他室的流体连通，而能够与第二其他室流体连通。在旋转盖的又一个旋转位置，关闭与第一其他室和第二其他室的流体连通。在旋转盖的又一个旋转位置，能够与第一其他室和第二其他室均流体连通，等等。图6B示出了本文中用于控制通向一个或多个反应室以及源自一个或多个反应室的流体连通的旋转盖的示例性配置。旋转盖的旋转可以通过与旋转盖接合的装置来实现。该接合可以与分度转位机构联结，所述分度转位机构与组件的旋转平台接合。在另一些实施方案中，对一个或多个反应室的密封和对通向一个或多个反应室以及源自一个或多个反应室的流体连通的控制通过如上所述的位于流体连通部中的滚珠状“球形盖”来实现。图7示出了由球形盖控制的示例性反应室。
流体卡盒还包括废料室，所述废料室用于收集来自核酸纯化和核酸扩增两者的测试废料。废料室包括吸收性材料(或者两种或更多种不同吸收性材料的混合物)，所述吸收性材料用于吸收和结合液态测试废料以避免从废料室回流。适合使用的吸收性材料的示例包括棉花、纤维素纤维、海绵以及超吸收聚合物(例如聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺共聚物、乙烯马来酸酐共聚物、聚乙烯醇共聚物、交联聚氧化乙烯、交联羧甲基纤维素，以及淀粉接枝的聚丙烯腈共聚物)或其组合。吸收性材料可以涂覆至废料室的一个或多个内表面，例如通过适当的化学试剂(例如交联剂)或通过UV交联。吸收性材料(没有吸收或结合液体废料的情况下)可以覆盖废料室体积的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。
废料室位于流体卡盒的与一个或多个接收室基本上相反的外部。在这方面，术语“基本上相反”通常理解为(i)一个或多个接收室和纯化室与(ii)纯化室和废料室之间的相应流体连通部基本上彼此相反，即通常以在160°至200°之间、优选在170°至190°之间或在175°至185°之间的范围内或具有180°的值的相对于彼此的角度布置。替选地，该布置通常是相对于彼此的角度在120°至180°之间，优选在120°至150°之间或在150°至180°之间的范围内，或具有135°的值。废料室是包括在流体盘上的具有最大尺寸(就体积和表面积而言)的室。废料室的尺寸可以覆盖流体卡盒的表面积的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。关于废料室本身的定位，废料室位于流体卡盒的大扇区的外部，而一个或多个反应室基本上相反地位于流体卡盒的外部的剩余较小扇区(在某些实施方案中，与混样室和/或收集室一起，参见下文)。
废料室与一个或多个反应室中的每个反应室以及纯化室流体连通。废料室与纯化室直接流体连通，通常通过通道来实现，而废料室与一个或多个反应室的流体连通经由纯化室实现。在一些实施方案中，废料室与纯化室之间的流体连通部具有从废料室到纯化室的下降坡度，从而降低了样品处理期间废料的任何回流的风险。为此，在一些实施方案中，在流体连通部与废料室汇合处设置有阶状部或陡降部，使得存在针对液体回流的另一屏障。此外，可以设置“球形盖”作为阀门，以确保单向流动。从废料室到纯化室的下降坡度可以在1％至20％之间，例如1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、18％和20％。
在进一步优选的实施方案中，流体卡盒进一步包括一个或多个混样和/或收集室，所述一个或多个混样和/或收集室用于混样和/或收集在一个或多个反应室中产生的扩增的核酸。流体卡盒可以包括发挥核酸的混样和收集两种功能的单个室。替选地，流体卡盒可以包括单独的混样室和单独的收集室。在又一些替代实施方案中，流体卡盒包括一个或多个混样室和一个或多个收集室。通常，设置一个混样室和一个收集室。
在不同的反应室中进行不同的反应(例如，采用不同的扩增方案或使用不同的扩增引物)以例如制备核酸文库的情况下，用于将一个或多个反应室中产生的扩增的核酸混样的一个或多个混样室可能是特别相关的。因此，一个或多个混样室与一个或多个反应室流体连通。一个或多个混样室位于流体卡盒的外部，靠近一个或多个反应室。
一个或多个收集室用于收集扩增的核酸产物并用于将其从流体卡盒去除。为了后一个目的，一个或多个收集室具有用于去除扩增的核酸(例如，通过移液装置)的开口。如果同时设置混样室和收集室，则收集室可以位于中央纯化室与混样室之间。混样室、收集室以及一个或多个反应室在流体盘上的布置可以是三角形的形式，特别是直角三角形或基本直角三角形(角度在80°至100°之间，优选在85°至95°之间的范围内)的形式。如果存在混样室，则收集室与混样室流体连通。如果不存在单独的混样室，则收集室与一个或多个反应室流体连通。图6A示出了包括混样室和收集室的根据本发明的流体卡盒的示例性配置。
在特定的实施方案中，从一个或多个接收室(用于生物样品和一种或多种用于核酸纯化的测试试剂)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到废料室的流体连通部。亦即，根据本发明，相应的流体连通部通常以在70°至110°之间的范围内、优选在80°至100°之间或在85°至95°之间的范围内或具有90°的值的相对于彼此的角度布置。替选地，该布置通常是相对于彼此的角度在120°至180°之间的范围内，优选在120°至150°之间或在150°至180°之间的范围内，或具有135°的值。
在替代的特定实施方案中，从一个或多个接收室(用于生物样品和一种或多种用于核酸纯化的测试试剂)到纯化室的流体连通部与从纯化室到废料室的流体连通部基本上相反。亦即，根据本发明，相应的流体连通部通常以在160°至200°之间、优选在170°至190°之间或在175°至185°之间的范围内或具有180°的值的相对于彼此的角度布置。
在进一步特定的实施方案中，从一个或多个接收室(用于生物样品和一种或多种用于核酸纯化的测试试剂)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部。亦即，根据本发明，相应的流体连通部通常以在70°至110°之间的范围内、优选在80°至100°之间或在85°至95°之间的范围内或具有90°的值的相对于彼此的角度布置。
在又一些进一步特定的实施方案中，从一个或多个混样和/或收集室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部。
更特别地，在单个收集室(任选地，还发挥作为混样室的功能)的情况下，从收集室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部。亦即，根据本发明，相应的流体连通部通常以在70°至110°之间的范围内、优选在80°至100°之间或在85°至95°之间的范围内或具有90°的值的角度布置。
在替代的特定实施方案中，在单独的混样室和单独的收集室的情况下，从混样室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部。亦即，根据本发明，相应的流体连通部通常以在70°至110°之间的范围内、优选在80°至100°之间或在85°至95°之间的范围内或具有90°的值的角度布置。在进一步特定的实施方案中，从混样室到一个或多个反应室的流体连通部与从混样室到收集室的流体连通部通常以在25°至65°之间的范围内、优选在35°至55°之间或在40°至50°之间的范围内或具有45°的值的角度布置。
在又一些进一步特定的实施方案中，从一个或多个反应室到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到废料室的流体连通部。亦即，相应的流体连通部通常以在70°至110°之间的范围内、优选在80°至100°之间或在85°至95°之间的范围内或具有90°的值的相对于彼此的角度布置。
在又一些进一步特定的实施方案中，在存在一个或多个洗脱室的情况下，从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个洗脱室的流体连通部，从一个或多个接收室(用于生物样品和一种或多种用于核酸纯化的测试试剂)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个洗脱室的流体连通部，并且从一个或多个混样和/或收集室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的流体连通部。因此：(i)从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的流体连通部可以相对于从纯化室到一个或多个洗脱室的流体连通部以在70°至110°之间的范围内、优选在80°至100°之间或在85°至95°之间的范围内、或具有90°的值的角度布置。(ii)从一个或多个接收室(用于生物样品和一种或多种用于核酸纯化的测试试剂)到纯化室的流体连通部可以相对于从纯化室到一个或多个洗脱室的流体连通部以在160°至200°之间、优选在170°至190°之间或在175°至185°之间的范围内、或具有180°的值，或者替换地，在120°至180°之间的范围内、优选在120°至150°之间或在150°至180度之间的范围内、或具有135°的值的角度布置。(iii)从一个或多个混样和/或收集室到一个或多个反应室的流体连通部可以相对于从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的流体连通部以在70°至110°之间的范围内、优选在80°至100°之间或在85°至95°之间的范围内、或具有90°的值的角度布置。
在进一步优选的实施方案中，所述流体卡盒进一步包括一个或多个通风室，所述一个或多个通风室与一个或多个反应室和/或废料室和/或与一个或多个洗脱室(如果存在的话)流体连通。通常，设置有两个通风室，其中第一通风室与一个或多个反应室流体连通，第二通风室与废料室流体连通。替选地，在存在一个或多个洗脱室的情况下，两个通风室设置为分别与一个或多个洗脱室流体连通并且与废料室流体连通。一个或多个通风室具有用于调节气流的开口。以最简单的方式，这种气流调节可以是从流体卡盒中排出空气。替选地，代替通风室，流体卡盒可以包括一个或多个通风孔，即一个或多个室和/或一个或多个流体连通部中(例如，在顶表面中)的开口，以确保空气流动。还可以具有一个或多个通风室和一个或多个通风孔的组合。然而，也可以使用泵(优选地，小型泵)来调节气流。泵可以经由管、管道等连接至一个或多个通风室。正压气流和负压气流可以分别通过利用加压空气和真空而产生。这可以通过例如交替改变泵的直流电源极性来实现。调节流体卡盒内的气流，以引导或促进液体流经内部流体连通部(例如通道)，或促进任何蒸汽的去除。
在进一步优选的实施方案中，本发明的组件进一步包括用于将测试试剂分配至一个或多个接收室和/或一个或多个反应室的一个或多个装置，其中术语“接收室”包括用于(生物样品和)用于核酸纯化的试剂的一个或多个接收室以及用于核酸扩增的试剂的一个或多个(附加)接收室。一个或多个分配装置在组件中布置在一个或多个流体卡盒上方。通常，这种分配装置包括用于试剂供应的容器和用于分配试剂的吸头或喷嘴。优选地，设置有自动化或可编程的分配装置，当分配装置到达靠近某个室的预定位置时，该分配装置将预定量的给定试剂分配至所述室。各种自动化或可编程的分配装置已在本领域中得到广泛应用，并且可从不同的供应商处购得。
分配装置可以配置为分配单种试剂，或者优选地，分配装置包括用于分配不同试剂的多个容器。在特别优选的实施方案中，分配装置是用于分配不同试剂的转盘，其可以旋转，使得某种试剂可以被专门分配至流体卡盒中的某个室。一个或多个分配装置布置在一个或多个流体卡盒上方，使得它们的吸头或喷嘴可以容易且精确地定位，并且将试剂从顶部引入到相应的室中。这样的布置能够使用相同供应的一种或多种试剂，在不同的流体卡盒上同时处理不同的样品，或者在一个流体卡盒上连续地处理不同的样品，或者在一个或多个流体卡盒中进行不同的测试。不同的分配装置(例如转盘)可以分别用于供应通用试剂(例如洗涤缓冲液或用于稀释样品的缓冲液)以及供应特定试剂(例如扩增引物)。分配装置的定位(例如试剂转盘的旋转位置)可以通过用于产生间歇性旋转运动的分度转位机构来确定和调节。用于对分配装置进行定位的分度转位机构可以与接合至旋转平台的分度转位机构相同或者联接至与旋转平台接合的分度转位机构，以产生旋转平台的间歇性旋转运动(参见下文)。图3B示出了与两个试剂转盘组合的示例性流体卡盒，所述两个试剂转盘用于将测试试剂分别分配至接收室和反应室。
根据本发明的组件包括用于对旋转平台上的一个或多个流体卡盒进行分度转位的装置，该装置包括电子控制的步进电机，所述步进电机与旋转平台接合以产生使旋转平台以预定角度进行的间歇性旋转运动。换言之，旋转平台不是连续地旋转，而是以移动和静止的交替周期间歇性地旋转，任选地，不反转方向，以便使一个或多个流体卡盒旋转到执行特定方法步骤的期望位置。通常，旋转角度是以规则的方式预先确定的，亦即，角度总是相同的。例如，角度可以为180°，使得旋转平台每一次完整的旋转具有两个止动点(在180°和360°处)，或者角度可以为90°，使得旋转平台每一次完整的旋转具有四个止动点(在90°、180°、270°和360°处)，或者角度可以为60°，使得旋转平台每一次完整的旋转具有六个止动点(在60°、120°、180°、240°、300°和360°处)，等等。原则上也可以使用不同的预定角度。
在本发明中，分度转位机构为电子控制的步进电机(通常是无刷直流电机)，其将一次完整的旋转分为多个等同的步骤。步进电机在本领域中是公知的。步进电机具有多个“齿形”的电磁体，这些电磁体作为定子围绕中央转子(通常是齿轮形的铁轮)布置。电磁体由外部驱动电路或微控制器供电。为了使电机轴旋转，一个电磁体通电，其以磁力吸引齿轮的齿，从而导致啮合。当齿轮的齿与第一电磁体对准时，它们会与下一个电磁体稍微偏移。因此，当下一个电磁体通电并且第一电磁体断电时，齿轮轻微旋转，以与下一个电磁体对准。以这样的方式，电机可以转动精确的角度。
图4示出了根据本发明的示例性组件。布置有两个流体盘(C)的旋转平台(B)安装在用于使平台旋转的步进电机(A)上，所述步进电机还采用针对旋转平台的分度转位机构。在每个流体盘的下方布置有磁性混合装置(D)，所述磁性混合装置能够使生物样品和试剂混合。每个磁性混合装置与步进电机(E)非接触地接合。步进电机(A)使旋转平台(B)间歇性旋转与步进电机(E)使混合装置(D)间歇性旋转的相应的预定角度是彼此同步或对准的，以使得能够精确且有效地进行样品处理。
在优选的实施方案中，将上文所述的组件用于制备核酸文库，特别是用于核酸测序的文库。
在另一个优选的实施方案中，组件是用于进行下一代测序(即用于高通量DNA测序方法，例如在全基因组范围内)的集成平台的一部分。因此，将本文提供的组件用于与测序测试相组合的核酸纯化和扩增。
在另一个方面，本发明涉及一种用于从生物样品中进行核酸纯化和扩增的组合测试的方法，所述方法包括：
(i)提供如上文所限定的组件；
(ii)使得向一个或多个接收室(x.i)提供的生物样品和一种或多种用于核酸纯化的试剂经由从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度行进至纯化室；
(iii)在纯化室中通过将核酸固定至磁性固体载体来从生物样品中纯化核酸；
(iv)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得废料室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使测试废料通过离心流动从纯化室行进至废料室；
(v)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个反应室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至一个或多个反应室；或者
在存在一个或多个洗脱室的情况下，将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个洗脱室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至一个或多个洗脱室，并且在稀释纯化的核酸之后，将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个反应室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从一个或多个洗脱室行进至一个或多个反应室；
(vi)在一个或多个反应室中扩增核酸；以及
(vii)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个混样和/或收集室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使扩增的核酸通过离心流动从一个或多个反应室行进至一个或多个混样和/或收集室。
结合本发明用于核酸纯化和核酸扩增的相应方案遵循本领域已知的既定标准程序(参见，例如，Sambrook，J.等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology.Wiley&Sons，Hoboken，NJ)。
本文中分析的生物样品为源自哺乳动物的样品，所述哺乳动物例如为小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、猪、牛、马或猴子，优选为人。这样的样品可以包括身体组织(例如，活检或切除、组织样本，例如经福尔马林固定并经石蜡包埋的组织)、拭子(例如，鼻咽或口咽拭子、伤口拭子、皮肤拭子)、粪便样品和体液(包括液体活检)，例如血液(全血、血浆、血清)、唾液、痰液、尿液和脑脊液。样品可以含有单个细胞、细胞群体(即两个或更多个细胞)或者源自身体组织或拭子的细胞提取物或混悬液，并且可以以未纯化的形式使用或者在使用前经过任何富集或纯化步骤。本领域技术人员非常了解各种这样的纯化方法(参见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，supra；Ausubel，F.M.等人(2001)supra)。术语“全血”是指具有所有成分(即血细胞和血浆)的血液。术语“血浆”表示血液的液体介质。术语“血清”是指从中已去除凝血蛋白的血浆。在特定的实施方案中，生物样品选自血液、血浆、血清、唾液、尿液、鼻咽拭子、口咽拭子和组织样本。
将样品引入根据本发明的流体卡盒的用于生物样品和一种或多种用于核酸纯化的试剂的一个或多个相应接收室中，并使其经由从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度行进至纯化室。优选地，仅将生物样品引入至用于生物样品的特定接收室，以降低任何污染的风险。可以将一种或多种用于核酸纯化的试剂经由一个或多个分配装置引入至与生物样品相同的接收室，并使其经由从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度行进至纯化室。优选地，将一种或多种用于核酸纯化的试剂引入至单独的接收室。可以将试剂与生物样品同时或在样品被引入之后引入至流体卡盒。也可以在引入生物样品之前将一些试剂引入至相应的接收室(例如用于细胞裂解的试剂)。通常，不需要离心流动来使生物样品和测试试剂从一个或多个接收室行进至纯化室。
然后在纯化室中纯化核酸并将其固定(或通过固定来纯化)至磁性固体载体。本领域技术人员非常清楚选择用于进行纯化测试的合适方案。例如，要采用的方案将特别取决于需要纯化的核酸的类型(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))、核酸的长度(例如，基因组DNA或编码DNA，mRNA或小RNA，例如微RNA)等。核酸可以是天然存在的或重组产生的。
优选地，核酸纯化包括提取或细胞裂解步骤(例如，使用碱性裂解缓冲液或某些酶，例如碱性蛋白酶)以破坏细胞壁并从细胞中释放核酸。在固定核酸之后，进行一个或多个洗涤步骤以去除细胞碎片和其他污染物。最后，将纯化的核酸从载体上洗脱(参见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，supra；Ausubel，F.M.等人(2001)supra)。为此目的，在特定的实施方案中，所述方法进一步包括：(i)通过将用于细胞裂解的试剂提供至一个或多个接收室并使其行进至纯化室，从生物样品中释放核酸；和/或(ii)通过将洗涤试剂提供至一个或多个接收室并使其行进至纯化室，对固定的核酸的一个或多个洗涤步骤；和/或(iii)通过将洗脱试剂提供至一个或多个接收室并使其行进至纯化室，从磁性固体载体洗脱固定的核酸。
在添加用于核酸纯化的每种试剂之后，在纯化室中可以通过布置在纯化室下方的磁性混合装置来混合反应混合物。
此外，在完成这些反应步骤中的每个步骤之后(以及在每个洗涤步骤之后)，通过以下方式从纯化室去除测试废料：将一个或多个流体卡盒分度转位，使得废料室(特别是从纯化室到废料室的流体连通部)径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使测试废料通过离心流动从纯化室行进至废料室。图8A示出了该步骤。
在进一步优选的实施方案中，通过将核酸固定至顺磁珠来进行核酸的纯化。磁分离技术已在核酸纯化方面得到广泛应用。顺磁珠可从不同供应商处购得。顺磁珠具有官能化的表面以促进核酸结合。例如，顺磁珠可以用羧基改性的聚合物或二氧化硅官能化。在待纯化的核酸为mRNA的情况下，顺磁珠也可以用寡聚脱氧胸苷酸官能化。结合至顺磁珠的核酸的固定可以通过优选布置在纯化室下方的磁性混合装置来实现。
随后，通过以下方式将纯化的核酸转移至一个或多个反应室：将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个反应室(特别是从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部)径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至一个或多个反应室。图8B示出了该步骤。
替选地，在存在一个或多个洗脱室的情况下，通过以下方式将纯化的核酸转移至一个或多个洗脱室：将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个洗脱室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至一个或多个洗脱室。在稀释纯化的核酸之后，通过以下方式将纯化的核酸转移至一个或多个反应室：将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个反应室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从一个或多个洗脱室行进至一个或多个反应室。
在一个或多个反应室中，扩增核酸。特别地，核酸扩增是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的。在进一步优选的实施方案中，在PCR期间的热循环通过磁感应来实现。然而，诸如等温扩增的其他扩增方案也是可行的。核酸扩增方法已在本领域中得到广泛应用(参见例如Sambrook，J.和Russel，D.W.(2001)，supra；Ausubel，F.M.等人(2001)supra)。采用加热和/或冷却系统来调节一个或多个反应室中的温度。
可以在所有的一个或多个反应室中进行相同的扩增反应，亦即使用相同的试剂(例如扩增引物)和相同的温度分布(等温或热循环)。替选地，可以在不同的反应室中进行不同的反应。在从生物样品中纯化RNA的情况下，可以在扩增之前通过逆转录酶(RT)将RNA逆转录成cDNA。该反应也可以通过PCR应用RT-PCR来进行。
可以通过一个或多个分配装置将进行核酸扩增反应所需的试剂直接引入一个或多个反应室中。优选地，将试剂引入到与一个或多个反应室流体连通的(附加的)一个或多个接收室中，并使试剂经由从一个或多个接收室到一个或多个反应室的下降坡度行进至纯化室。可以从一个分配装置(例如试剂转盘)供应通用试剂(例如脱氧核糖核苷酸)，而可以从另一个分配装置供应特定试剂(例如引物)。在将纯化的核酸从纯化室转移到一个或多个反应室之后，可以将试剂引入流体卡盒。在特定的实施方案中，在转移核酸并且开始扩增反应之前，将用于核酸扩增的一些试剂引入到一个或多个(附加)接收室。通常，不需要离心流动来使测试试剂从一个或多个接收室行进至一个或多个反应室。
在特定的实施方案中，在扩增反应完成之后，通过将水或合适的其他缓冲液直接添加到一个或多个反应室中、或者优选地添加到一个或多个(附加)接收室中，将扩增的核酸稀释至合适的浓度以供进一步处理。
在一个或多个流体卡盒包括(一个或多个)混样室的情况下，将一个或多个流体卡盒分度转位，使得混样室(特别是从一个或多个反应室到混样室的流体连通部)径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使扩增的核酸通过离心流动从一个或多个反应室行进至混样室。随后，通过以下方式将扩增的核酸转移至(一个或多个)收集室：将一个或多个流体卡盒分度转位，使得收集室(特别是从混样室到收集室的流体连通部)径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使扩增的核酸通过离心流动从混样室行进至收集室。然后收集扩增的核酸，将其从一个或多个流体卡盒中移出，并在适用的情况下进行进一步处理。图8C示出了该步骤。
替选地，在没有特定的混样室的情况下，将一个或多个流体卡盒分度转位，使得(一个或多个)收集室(特别是从一个或多个反应室到收集室的流体连通部)径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使扩增的核酸通过离心流动从一个或多个反应室行进至收集室。然后收集扩增的核酸，将其从一个或多个流体卡盒中移出，并在适用的情况下进行进一步处理。
图11示出了使用根据本发明的流体卡盒和常规的热循环装置的示例性比较核酸纯化和扩增反应的结果。
在优选的实施方案中，以多重形式进行核酸纯化和扩增的组合测试。
在进一步优选的实施方案中，扩增的核酸代表核酸文库，特别是用于下一代测序的核酸文库。
可以在本文未具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制不存在的情况下，适当地实施在本文说明性地描述的本发明。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应理解为可扩展且不受限制。此外，本文所使用的术语和表述已被用作说明性而非限制性的术语，并且在使用这些术语和表述时无意排除所示和所描述的特征或其部分的任何等效形式，而应认识到，在所要求保护的发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过实施方案和任选的特征具体地公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用其中所体现的发明的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。
本文对本发明进行了广泛的一般性描述。落入一般性公开内容的较窄物种和亚属群组中的每一个也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，以及附带条件或从类属中去除任何主题的否定性限制，无论本文中是否具体列举了离体的材料。
其他实施方案在所附权利要求范围内。此外，在本发明的特征或方面是根据马库什群组来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明由此也根据马库什群组的任何单个的成员或子群组的成员来描述。

Claims (15)

1.一种用于从生物样品中进行核酸纯化和扩增的组合测试的组件，所述组件包括：
(i)一个或多个盘形的流体卡盒，其布置在旋转平台上；
(ii)磁性混合装置，其布置在一个或多个流体卡盒下方；以及
(iii)用于对旋转平台上的一个或多个流体卡盒进行分度转位的装置，所述装置包括电子控制的步进电机，所述步进电机与旋转平台接合，以便以预定角度产生旋转平台的间歇性旋转运动；
其中，一个或多个流体卡盒包括：
(x.i)一个或多个接收室，其用于接收生物样品和一种或多种用于核酸纯化的试剂；
(x.ii)纯化室，其用于纯化核酸，所述纯化室具有凹形底表面，位于流体卡盒的中央，并且通过从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度与一个或多个接收室流体连通；
(x.iii)一个或多个反应室，其用于扩增核酸，所述一个或多个反应室具有凹形底表面，位于流体卡盒的纯化室的一侧的外部，并且每个反应室通过从反应室到纯化室的下降坡度与纯化室流体连通；以及
(x.iv)废料室，其用于收集测试废料，所述废料室包括吸收性材料，位于流体卡盒的与一个或多个接收室基本上相反的外部，并且与一个或多个反应室中的每个反应室以及纯化室流体连通；并且
其中，所述磁性混合装置布置在一个或多个流体卡盒的纯化室下方，从而能够通过使用磁性固体载体来纯化核酸。
2.根据权利要求1所述的组件，其中，所述一个或多个盘形的流体卡盒进一步包括以下室中的一种或多种：
(x.v)一个或多个接收室，其用于接收一种或多种用于核酸扩增的试剂，所述一个或多个接收室通过从所述一个或多个接收室到一个或多个反应室的下降坡度与一个或多个反应室流体连通；
(x.vi)一个或多个洗脱室，其用于稀释纯化的核酸，所述一个或多个洗脱室位于与纯化室相邻的位置并且与纯化室和一个或多个反应室流体连通；
(x.vii)一个或多个混样和/或收集室，其用于混样和收集在一个或多个反应室中产生的扩增的核酸，所述一个或多个混样和/或收集室位于流体卡盒的与一个或多个反应室相邻的外部并且与一个或多个反应室流体连通；
(x.viii)一个或多个通风室，其与一个或多个反应室和/或废料室流体连通。
3.根据权利要求1或2所述的组件，其中，所述一个或多个接收室(x.i)包括样品接收室和试剂接收室，并且具体地，其中，从所述样品接收室到纯化室的流体连通部与从所述试剂接收室到纯化室的流体连通部合并。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组件，其中：
(i)从一个或多个接收室(x.i)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到废料室的流体连通部；和/或
(ii)从一个或多个接收室(x.i)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部；和/或
(iii)从一个或多个混样和/或收集室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个反应室的流体连通部；和/或
(iv)从一个或多个反应室到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到废料室的流体连通部；和/或
(v)在存在一个或多个洗脱室的情况下，从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个洗脱室的流体连通部，从一个或多个接收室(x.i)到纯化室的流体连通部基本上垂直于从纯化室到一个或多个洗脱室的流体连通部，并且从一个或多个混样和/或收集室到一个或多个反应室的流体连通部基本上垂直于从一个或多个洗脱室到一个或多个反应室的流体连通部。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组件，其中，所述一个或多个反应室设置有：
(i)一个或多个加热和/或冷却元件，其能够控制一个或多个反应室中的温度，具体地，其中，所述一个或多个加热和/或冷却元件通过磁感应工作；和/或
(ii)能够密封一个或多个反应室的装置，其配置为能够控制通向一个或多个反应室以及源自一个或多个反应室的流体连通，具体地，其中，用于密封的装置选自旋转盖、球形盖和油覆盖层。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组件，其进一步包括：
用于将测试试剂分配至一个或多个接收室和/或一个或多个反应室的一个或多个装置，其中，所述一个或多个装置布置在一个或多个流体卡盒上方，并且具体地，其中，所述一个或多个装置为用于分配多种试剂的一个或多个转盘。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组件，其为用于进行下一代测序的集成平台的一部分。
8.一种用于从生物样品中进行核酸纯化和扩增的组合测试的方法，所述方法包括：
(i)提供如权利要求1至7中任一项所限定的组件；
(ii)使得向一个或多个接收室(x.i)提供的生物样品和一种或多种用于核酸纯化的试剂经由从一个或多个接收室到纯化室的下降坡度行进至纯化室；
(iii)在纯化室中通过将核酸固定至磁性载体来从生物样品中纯化核酸；
(iv)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得废料室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使测试废料通过离心流动从纯化室行进至废料室；
(v)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个反应室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至一个或多个反应室；或者
在存在一个或多个洗脱室的情况下，将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个洗脱室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从纯化室行进至一个或多个洗脱室，并且在稀释纯化的核酸之后，将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个反应室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使纯化的核酸通过离心流动从一个或多个洗脱室行进至一个或多个反应室；
(vi)在一个或多个反应室中扩增核酸；以及
(vii)将一个或多个流体卡盒分度转位，使得一个或多个混样和/或收集室径向向外定向，并且向旋转平台施加旋转运动，从而使扩增的核酸通过离心流动从一个或多个反应室行进至一个或多个混样和/或收集室。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述生物样品选自血液、血浆、血清、唾液、尿液、鼻咽拭子、口咽拭子和组织样本。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述磁性固体载体为顺磁珠。
11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括以下步骤中的一个或多个步骤：
(i)通过将用于细胞裂解的试剂提供至一个或多个接收室(x.i)并使其行进至纯化室，从生物样品中释放核酸；和/或
(ii)通过将洗涤试剂提供至一个或多个接收室(x.i)并使其行进至纯化室，对固定的核酸的一个或多个洗涤步骤；和/或
(iii)通过将洗脱试剂提供至一个或多个接收室(x.i)并使其行进至纯化室，从磁性固体载体洗脱固定的核酸。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中，通过进行聚合酶链式反应来扩增核酸，具体地，其中，聚合酶链式反应期间的热循环通过磁感应来实现。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，在进行步骤(vi)之前向一个或多个反应室提供用于核酸扩增的试剂，其中，将一种或多种用于核酸扩增的试剂提供至一个或多个接收室(x.v)并使其经由从一个或多个接收室到一个或多个反应室的下降坡度行进至一个或多个反应室。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，进一步包括：通过将稀释试剂提供至一个或多个接收室(x.v)并使其行进至一个或多个反应室，稀释扩增的核酸。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中，以多重形式进行核酸纯化和扩增的组合测试；和/或其中，扩增的核酸代表用于下一代测序的核酸文库。
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