CN117729910A

CN117729910A - 红茶叶提取物、含有红茶叶提取物的组合物及其美容用途

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Publication number: CN117729910A
Application number: CN202280050617.7A
Authority: CN
Inventors: E·奥热; L·穆雷
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2022-07-19
Publication date: 2024-03-19
Also published as: EP4373467A1; FR3125425B1; WO2023001812A1; FR3125425A1

Abstract

本发明涉及特别富含小RNA、糖、酚类化合物、氨基酸和茶氨酸的红茶(Camellia sinensis)的提取物，以及用于制备这样的提取物的方法。本发明还涉及包含这样的提取物的化妆品组合物以及包含除了来自毛里求斯的红茶以外的来自任何来源的红茶提取物的化妆品组合物用于护理皮肤、头皮及附属物的用途，更具体地用于保护皮肤免受外部侵蚀和氧化、对抗皮肤衰老的迹象、增加光保护、美白皮肤以及提高皮肤水合能力的用途。

Description

红茶叶提取物、含有红茶叶提取物的组合物及其美容用途

技术领域

本申请涉及化妆品领域，更具体地涉及用于制备改善皮肤外观或保护皮肤的化妆品制剂的天然来源的活性剂。

本申请涉及富含小RNA、糖、酚类化合物、有机酸、氨基酸和茶氨酸的红茶(Camellia sinensis)的提取物，以及用于制备这样的提取物的方法。本申请还涉及包含这样的提取物的化妆品组合物。本申请还涉及包含除了来自毛里求斯的红茶以外的来自任何来源的红茶的提取物的组合物用于护理皮肤、头皮及附属物的美容用途，更具体地用于保护皮肤免受外部侵蚀和氧化、对抗皮肤衰老的迹象、增加光保护、美白皮肤以及提高皮肤水合能力的美容用途。

背景技术

通常被称为茶树的茶(Camellia sinensis)种包括三个植物变种：普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)、大叶茶(云南)(Camellia sinensis var.sinensis(Yunnan))和柬埔寨茶(Camellia sinensis var.Cambodiensis)。

茶树(Camellia sinensis)的叶子被用来制作不同类型的茶。正是对收获的叶子进行的处理决定了所获得的茶的类型。绿茶几乎没有氧化，白茶轻微氧化，乌龙茶中度氧化(10％至75％)，红茶被完全氧化。

植物生长的环境对其新陈代谢有影响，并影响植物分子的合成。植物对其环境的适应是精细表观遗传调控的结果，这也涉及到能够快速调节植物基因表达的小RNA的表达，从而使其能够适应压力和环境。

因此，季节、种植地点和收获的叶子类型影响红茶的化学组成。例如，芽和最幼小的叶子具有最高的多酚含量。这些叶中含有干重约15％的儿茶素，包括10％的EGCG(LiangZhang,Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,Vol.18,2019)，而在较老、较低的叶中该含量较小。

平均而言，来自印度阿萨姆邦的新鲜的山茶茶叶含有22.2％的总多酚，包括高至15％的儿茶素、17.2％的蛋白质、4.3％的咖啡因、27％的纤维、0.5％的淀粉和3.5％的还原糖(Duke,J.A.,Handbook of Energy Crops,1983,Purdue University,Unpublishedhttps://hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia_sinensis.html)。

红茶以其健康益处而闻名，这归因于其高浓度的抗氧化分子和其他减少炎症和慢性病风险的化合物。

平均而言，红茶含有约10.2mg/g的儿茶素、28.54mg/g的咖啡因、1mg/g的可可碱、10.70mg/g茶黄素和0.65mg/g茶氨酸，但量差异很大(Liang Zhang,ComprehensiveReviews in Food Science and Food Safety,Vol.18,2019)。

红茶在本申请中被定义为来自已经经历完全氧化的茶种(Camellia sinensis)的叶子的茶。红茶可以使用传统的或机械化方法来制备，这些方法通常具有预干燥或枯萎阶段，然后将叶子切碎或对其进行滚压，其目的是破坏细胞并释放负责氧化的酶，特别是多酚氧化酶。红茶的氧化发生在细胞液泡中所含的多酚与降解酶接触时。发生的化学反应将茶的儿茶素主要转化为茶黄素和茶红素。叶绿素也被转化为脱镁叶绿素，其使茶变黑。氧化发生在炎热、非常潮湿的环境中。然后通过将叶子加热到90℃来停止氧化。

文献中描述了许多茶叶提取物，特别是其富含酚类化合物，包括儿茶素。现有技术中的大多数提取方法由于有机溶剂提取儿茶素型多酚的能力而使用有机溶剂(WO2006/111666、KR2016021734A、KR2018125828A)。所获得的提取物富含多酚和类黄酮，但几乎不含或不含酚分子，如酚酸，或有机分子，如糖、氨基酸或寡核糖核苷酸。事实上，诸如糖、氨基酸或寡核糖核苷酸等分子最好用极性溶剂提取，并且理想地用水溶液提取。因此，所有这些已知对皮肤具有有益作用的植物分子都不能通过现有技术中描述的茶叶提取方法有效地提取。

用户对尽可能天然但功效与合成产品相当甚至更好的化妆品的需求正在快速增长。在本申请中，为了满足消费者的要求，所述提取物是100％天然的。

本发明试图解决的一个问题是提供一种新的红茶水提取物，其在天然度标准方面满足当今化妆品市场的要求，但具有显著的生物功效且无毒。

酚类化合物如儿茶素的浓度过高可能引起光毒性或限制提取物随时间的稳定性。例如，绿茶中存在的儿茶素的主要形式，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，在水溶液中是高度不稳定的。在诸如氧气、阳光或者温度或pH的变化等各种因素的影响下，它会降解，产生超氧化物和氧化产物。这导致了负责溶液褐变的二聚体的形成(J.Zeng etal.Molecules 2018,23,2394)。

与现有技术中描述的提取物相比，本申请中描述的提取物具有酚类化合物的原始组成。酚类化合物的浓度明显较低，主要由酚酸组成，并且几乎不含主要的茶多酚，即儿茶素。此外，本申请中描述的提取物也是随时间稳定且无毒的。

本发明试图解决的另一个问题是提供富含已知对皮肤有效的化合物如糖、有机酸、氨基酸、咖啡因和茶氨酸以及小RNA的新的红茶的水提取物。

本发明人已开发了用于美容用途的特别富含小RNA、糖、酚类化合物和有机化合物、有机酸、氨基酸和茶氨酸的新的红茶提取物，其通过不具有现有技术方法的缺点(如使用潜在毒性的清洁剂和溶剂)的方法获得。

由此获得的提取物可以用于化妆品中以护理皮肤、头皮及附属物，以获得多种益处，更具体地保护皮肤免受外部侵蚀和氧化、对抗皮肤衰老的迹象、增加光保护、美白皮肤、提高皮肤水合能力、增强屏障功能以及舒缓皮肤。

发明内容

本发明首先涉及茶(Camellia sinensis)物种的红茶叶的提取物，其包含10至350mg/kg的具有至多150个核苷酸长度的小RNA，包含至多150mg/kg的儿茶素、优选至多120mg/kg的儿茶素、甚至更优选至多30mg/kg的儿茶素。

以上提取物可以通过以下生产方法获得，本发明其次涉及该生产方法，该生产方法包括以下步骤：

a.将先前研磨的茶(Camellia sinensis)物种的红茶叶放入水中；

b.添加植酸；

c.将pH调节至10与11之间的值；

d.将混合物在40至80℃的温度下搅拌至少一小时；

e.将在c)中获得的混合物纯化以清除残留的固体植物物质并收集滤液；

f.将pH调节至6与8之间的值；

g.用粉末状活性炭处理所述混合物；

h.过滤以除去所述活性炭并收集滤液；

i.用聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)处理滤液；

j.过滤以除去所述PVPP并收集滤液；

k.检查滤液的pH，如有必要，将其重新调节至6与6.5之间的值。

l.任选地，在生理学上可接受的溶剂中稀释所述提取物，并将其pH调节至5.8与6.7之间、优选6.0与6.5之间的值，以获得干重为4至20g/kg的经稀释的提取物。

第三，本发明涉及包含作为活性剂的有效量的本文所述的红茶叶的稀释水性提取物和生理学上可接受的介质的组合物。

第四，本发明涉及包含作为活性剂的有效量的本申请所述的除了来自毛里求斯的红茶以外的红茶叶的稀释水性提取物和生理学上可接受的介质的组合物用于护理皮肤、头皮及附属物的美容用途，更具体地用于保护皮肤免受外部侵蚀和氧化、对抗皮肤衰老的迹象、增加光保护、美白皮肤或提高皮肤水合能力的美容用途。

附图说明

通过阅读以下参考附图示出的描述和非限制性实施方案，将更好地理解本发明及其产生的优点，在附图中：

[图1]示出了通过测量浊度对根据实施例1和2获得的来自印度的各种茶提取物的透明质酸酶抑制活性的评估。

具体实施方式

本发明人已开发了在化妆品中的富含小RNA、糖、酚类化合物和有机化合物、有机酸、氨基酸和茶氨酸的新的红茶(Camellia sinensis)的提取物，其通过不具有现有技术方法的缺点(如使用潜在毒性的清洁剂和溶剂)的方法获得。

本发明人还开发了用小RNA富集提取物的方法，这些小RNA是已知参与表观遗传调控并因其对皮肤的有益活性而被描述的分子。该提取物不含DNA，DNA对皮肤的有益生物特性并不为人所知，并且可能导致提取物的某种不稳定性。

定义

本申请中使用的所有术语具有最广为人知的含义或以下所示的含义：

术语“红茶”意指来自任何地理来源的茶种(Camellia sinensis)物种的完整、干燥、完全氧化的叶子。

术语“来自毛里求斯的红茶”或“来自毛里求斯的红茶”是指在毛里求斯种植园种植、收获和加工的茶。

术语“来自印度的茶”或“来自印度的红茶”是指在印度种植园种植、收获和加工的茶。

术语“红茶提取物”或“红茶叶提取物”意指茶种(Camellia sinensis)物种的红茶叶的水性提取物，其包含10至350mg/kg的不超过150个核苷酸长的小RNA，不含DNA，包含不超过150mg/kg的儿茶素、优选不超过120mg/kg的儿茶素、甚至更优选不超过30mg/kg的儿茶素。

术语“粗红茶提取物”意指通过本申请所述方法获得的提取物未被稀释。

术语“小RNA”或“小分子量的RNA”、或“不超过150个核苷酸长的小RNA”意指小分子量、不超过150个核苷酸长的非编码RNA(核糖核酸)，如所有类型的小单链和/或双链非信使RNA，例如微小RNA、干扰RNA、内含子、小的核RNA或来源于植物并通过本申请中描述的方法提取的任何RNA片段。因此，纯化的、已知序列的或合成的RNA片段不落入该定义。

术语“有机酸”我们意指α-羟酸(或AHA)，即源自茶叶中所含糖的羧酸，如乳酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸和糖醛酸。

术语“酚类化合物”意指具有至少一个带有一个或多个羟基的酚类型芳族环的植物来源的分子，如酚酸、多酚和类黄酮，如儿茶素。众所周知，酚类化合物在植物和美容用途中都是强大的抗氧化分子。这些次生植物代谢产物也是植物在生物或非生物胁迫期间作为防御机制产生的。

术语“无DNA的”意指红茶提取物不含DNA。脱氧核糖核酸酶测试已经证明了这一点，这种酶专门降解DNA而不是RNA。脱氧核糖核酸酶作用后的电泳图谱没有改变，这表明提取物中存在的核酸对脱氧核糖核酸酶不敏感，因此不是DNA。

术语“糖”意指植物中存在的所有类型的糖，如单糖，比如葡萄糖或果糖等，还有寡糖和多糖。一般而言，多糖含有超过十个的单糖单元，而寡糖含有三至十个单糖单元。

术语“感兴趣的植物分子”意指本发明的茶提取物中存在的所有分子，特别是最大长度为150个核苷酸的小RNA、糖、酚类化合物、有机酸、氨基酸、咖啡因和茶氨酸。

儿茶素是属于儿茶素家族的类黄酮多酚，如儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、没食子儿茶精(CG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)。

当描述值的范围时，必须将该范围的极限理解为明确包括该范围的所有中间值。例如，在1％与10％之间的值的范围应理解为包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％，以及在1％与10％之间的所有十进制值。

除非另有规定，否则数值百分比值为重量百分比，即化合物的重量相对于预期混合物的总重量。

本文所述的组合物可以“包含”必需化合物或任选成分、“由必需化合物或任选成分组成”或“基本上由必需化合物或任选成分组成”。

术语“基本上由...组成”意指组合物或组分可以包含另外的成分，但前提是另外的成分不改变本申请中描述的组合物或用途的基本或新颖的特性。

术语“局部应用”意指将根据本发明的提取物或含有该提取物的组合物施用或铺展在皮肤或粘膜的表面上。

术语“皮肤”是指面部(特别是眼睛和嘴巴周围)、鼻子、前额、脖子和手的健康皮肤，以及全身的皮肤。

术语“头皮”意指覆盖头骨的健康皮肤，包括毛囊和毛囊间皮肤空间。

术语“附属物”是指毛囊(头发、睫毛和体毛)和指甲的产物，即皮肤的富含角蛋白的附属物。

术语“美白皮肤”意指通过对老年斑或衰老性着色斑(senile lentigos)等色素紊乱起作用，均匀或局部地降低与表皮黑色素含量相关的肤色强度。

术语“有效量”意指获得以下中的至少一种所需的根据本发明的提取物的最低量：期望的生物活性或保护皮肤免受外部侵蚀和氧化、对抗皮肤衰老的迹象、增加光保护、美白皮肤和提高皮肤水合作用，而该量没有毒性。

术语“皮肤水合作用”是指表皮上层中的水含量和分布。

术语“改善的皮肤水合作用”是指由于脱水导致皮肤外观变化(如干燥、紧绷和不适)的任何改善，无论是由于内部因素还是外部因素，如不利的环境条件。

术语“皮肤衰老的迹象”是指由于衰老而导致的皮肤外观的所有变化，如皱纹和细纹、裂纹、眼袋、黑眼圈、枯槁、失去皮肤的弹性、紧致和/或张力(toning)，但也指皮肤的任何内部变化，这些变化不系统地导致外观的改变，例如，皮肤变薄或由环境胁迫如污染和包括UV射线在内的太阳辐射引起的对皮肤的任何内部损伤。

术语“皮肤衰老的迹象”还包括色素沉着紊乱，如衰老性着色斑或日光性着色斑。

术语“外部胁迫”意指太阳辐射，包括可见光、UV和红外辐射、污染，其可以来自家庭内外的环境大气并且包括各种尺寸的颗粒(对于PM10为10μm，对于PM2.5为2.5μm，或者对于超细颗粒为小于100nm)以及许多化学元素(挥发性有机化合物、多环芳烃、重金属等)。

术语“改善皮肤外观”意指皮肤纹理看起来更细，亮度更强，肤色更均匀。

术语“生理学上可接受的”意指由至少一种赋形剂、溶剂或溶剂混合物组成的介质，适合与皮肤外层或粘膜接触，没有毒性、刺激性、过度过敏反应等或类似或不耐受反应，并与合理的收益/风险比成比例。

应当理解，本发明涉及哺乳动物，并且更具体地涉及人类。

红茶提取物

本发明首先涉及茶(Camellia sinensis)物种的红茶的提取物，其包含10至350mg/kg的具有至多150个核苷酸长度的小RNA，至多150mg/kg的儿茶素、优选至多120mg/kg的儿茶素、甚至更优选至多30mg/kg的儿茶素。

有利地，红茶提取物，特别是来自印度的红茶提取物，含有微量儿茶素，即相对于提取物的干重最大0.001％的儿茶素，或者甚至更有利地不含有儿茶素。

有利地，红茶提取物包含0.030至5g/kg的酚类化合物。

红茶提取物优选具有4至30g/kg的干重并且包含0.2至10g/kg的糖、0.010至3g/kg的总氨基酸、0.010至2g/kg的咖啡因和0.010至2g/kg的茶氨酸。甚至更优选地，红茶提取物是水性的、琥珀色至深琥珀色的，具有4至30g/kg的干重，并且包含提取物总重量的按重量计0.2至10g/kg的糖、0.030至2g/kg的有机酸、0.010至3g/kg的总氨基酸、0.030至5g/kg的酚类化合物(包含最多150mg/kg的儿茶素、0.010至2g/kg的咖啡因和0.010至2g/kg的茶氨酸)以及10至350mg/kg的最大长度为150个核苷酸的小RNA。

此外，红茶提取物不含DNA(脱氧核糖核酸)。

在一个特定的实施方案中，红茶提取物来自毛里求斯并且具有5至30g/kg的干重，包含0.5至10g/kg的总糖、0.050至2g/kg的总有机酸、0.050至2g/kg的氨基酸、0.100至5g/kg的总酚类化合物(包含最多50mg/kg的儿茶素、0.010至2g/kg的咖啡因和0.010至2g/kg的茶氨酸)以及50至350mg/kg的最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。

在一个有利的实施方案中，将红茶提取物在生理学上可接受的溶剂中稀释用于美容用途。进行稀释以将提取物的干重调节至4与20g/kg之间的值。

生理学上可接受的溶剂选自甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇以及其天然形式、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。

有利地，生理学上可接受的溶剂选自从植物获得的丁二醇、丙二醇或甘油(天然形式)。

优选地，将红茶提取物在30至50％的丁二醇、或30至50％的丙二醇或30至70％的甘油中稀释。当溶剂是甘油时，优选将红茶提取物在70％甘油中稀释。

优选地，将红茶提取物在从植物获得的丙二醇中稀释，使得稀释的提取物具有30％或50％的最终丙二醇浓度。

优选地，红茶叶提取物已在生理学上可接受的溶剂中稀释，具有在4与20g/kg之间的干重并且包含稀释提取物总重量的按重量计10至250mg/kg的具有至多150个核苷酸长度的小分子量RNA、0.2至5g/kg的糖、0.010至2g/kg的氨基酸、0.030至3g/kg的酚类化合物(包含至多120mg/kg的儿茶素、0.010至1g/kg的咖啡因和0.010至1g/kg的茶氨酸)。

更优选地，如此稀释的红茶叶提取物具有在4与20g/kg之间的干重并且包含稀释的提取物的总重量的按重量计10至250mg/kg的最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA、0.2至5g/kg的糖、0.030至1g/kg的有机酸、0.010至2g/kg的氨基酸、0.030至3g/kg的酚类化合物(包含最多120mg/kg的儿茶素、0.010至1g/kg的咖啡因、0.010至1g/kg的茶氨酸)，并且是不含DNA的。

当其来自毛里求斯并且稀释的提取物含有30％的最终丙二醇浓度时，如此稀释的红茶提取物具有在6与20g/kg之间的干重，并且含有50至250mg/kg的最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA、0.8至5g/kg的糖、0.2至1g/kg的有机酸、0.2至1g/kg的氨基酸、和0.5至3g/kg的酚类化合物(包含最多30mg/kg的儿茶素、0.10至100mg/Kg的咖啡因、0.010至300mg/Kg的茶氨酸)，并且是不含DNA的。

优选地，来自毛里求斯的红茶提取物不含儿茶素。

当其来自印度并且稀释的提取物含有30％的最终丙二醇浓度时，如此稀释的红茶提取物具有在4与12g/kg之间的干重，并且含有10至100mg/kg的最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA、0.2至3g/kg的糖、0.030至0.5g/kg的有机酸、0.030至0.3g/kg的氨基酸、和0.050至2g/kg的酚类化合物(包含最多30mg/kg的儿茶素、0.050至500mg/kg的咖啡因、0.010至300mg/kg的茶氨酸)，并且是不含DNA的。

因此，本申请中描述的红茶提取物包含对皮肤具有有益作用的广泛的植物分子，而不存在任何皮肤刺激或其他健康损害的风险。

例如，糖在湿润表皮上层方面发挥着积极作用，从而有助于抵抗外部侵蚀，而不产生任何不良影响。本发明的茶提取物更特别地含有单糖和多糖。

茶(Camellia sinensis)是山茶科的一员，山茶科产生咖啡因，其为强效的天然杀虫剂。咖啡因也被称为咖啡因(caffeine)、1,3,7-三甲基黄嘌呤或甲基可可碱。除了其公认的对神经系统和心血管系统的影响外，咖啡因对皮肤，特别是对下垂的皮肤也具有有益的影响。

这种植物还产生茶氨酸，其为非蛋白质氨基酸，占茶中存在的氨基酸总量的50％。

本申请中描述的红茶提取物也含有酚类化合物，如多酚、酚酸和类黄酮，如儿茶素，但这类分子已通过用碳和PVPP处理而被部分除去。酚类化合物中的这种相对消耗意味着产物随着时间的推移更加稳定，并且获得了非光毒性提取物。

红茶提取物也含有有机酸。有机酸是参与三羧酸循环的分子，三羧酸循环是对细胞呼吸至关重要的代谢过程。某些有机酸，如苹果酸和乳酸，被称为α-羟酸(AHA)，以其对皮肤的抗衰老作用、改善皮肤外观和纹理而闻名。

在一个特定的实施方案中，稀释的红茶提取物含有最多1.5g/kg的酚类化合物(包含最多120mg/kg的儿茶素)。

在另一个特定的实施方案中，稀释的红茶提取物含有最多1.2g/kg的酚类化合物(包含最多30mg/kg的儿茶素)。

在一个特定的实施方案中，稀释的红茶提取物含有最多3g/kg的酚类化合物并且基于来自印度的红茶提取物的干重含有最多0.001％儿茶素的微量儿茶素，或者对于来自印度或毛里求斯的红茶提取物甚至不含儿茶素。

在另一个特定的实施方案中，稀释的红茶提取物含有最多100mg/kg的酚类化合物并且相对于来自印度的红茶提取物的干重含有最多0.001％儿茶素的微量儿茶素，或者对于来自印度或毛里求斯的红茶提取物甚至不含儿茶素。

在又一个特定的实施方案中，稀释的红茶提取物含有最多50mg/kg的酚类化合物并且相对于来自印度的红茶提取物的干重含有最多0.001％儿茶素的微量儿茶素，或者在来自印度或毛里求斯的红茶提取物的情况下甚至不含儿茶素。

在本申请的这一部分中描述的所有红茶提取物都可以通过下面描述的提取过程获得。

提取过程

经典描述的核糖核酸(RNA)提取方案使用不适合美容用途的溶剂(例如，Brown,R.A.M.,Epis,M.R.,Horsham,J.L.et al.Total RNA extraction from tissues formicroRNA and target gene expression analysis:not all kits are createdequal.BMC Biotechnol 18,16(2018))。这些方法旨在获得完全纯化的核酸(RNA或DNA)，即不含任何其他感兴趣的分子，如美容感兴趣的次级代谢产物、维生素、糖或者甚至肽。

FR2831168描述了用于获得富含核酸(DNA和RNA)的植物提取物的方法。该方法使用纤维素分解酶。

从现有技术中还已知专利文献EP1723958和WO03101376，其描述了用于局部施用的组合物，所述组合物包含具有已知序列并具有siRNA(短干扰)功能的12至40个核苷酸长的合成双链RNA寡核苷酸。

文献FR 1502361(也以编号WO2017084958公开)描述了用于获得用于制备化妆品组合物的富含低分子量核糖核酸(RNA)的植物水提取物的方法。该方法使用浓度为2至15mM的EDTA。

该申请中描述的方法具有低环境影响，因为它使用水溶液和植酸(一种天然存在的分子)作为提取溶剂。

这里所述的方法使得可以获得100％天然来源的红茶提取物，同时保持植物中所含植物分子的良好提取效率。

该说明书第一部分中描述的红茶提取物有利地通过下面描述的提取方法获得。

在该方法中使用的红茶叶是干燥的、完整的或分解成粉末的。

当它们是完整的时候，事先将它们磨成粉末。

在该方法的第一步骤a)中，将粉末状红茶叶与水混合。所使用的水是蒸馏水或脱矿质水或富含矿物盐和/或微量元素的水。优选的水是蒸馏水。

在步骤a)中，植物物质/水比率有利地为1％至20％、优选2％至10％、甚至更优选2％至5％。

优选搅拌该混合物。

在步骤b)中，将植酸添加到来自步骤a)的茶-水混合物中。

植酸是螯合剂，天然存在于诸如谷类和豆类等种子的壳中。它通过络合使诸如钙离子等二价离子螯合(这在纤维素微纤维周围的果胶分子之间形成离子桥)来削弱和破坏植物细胞的果胶-纤维素膜。这具有在提取期间促进细胞内容物释放的效果。在碱性介质中的植酸处理步骤对于富集小分子量RNA的提取物以及也对于确保其他感兴趣的植物分子(即糖、氨基酸、酚类化合物、有机酸以及咖啡因和茶氨酸)更好提取产率至关重要。

该方法中使用的植酸是呈钠盐、钙盐或有时镁盐的形式。

优选地，所使用的植酸是呈钠盐形式的植酸粉末。优选地，其以1至10mM、优选1至5mM的浓度、甚至更优选地以3mM的浓度使用。

特别有利的是使用浓度为3mM的呈钠盐形式的植酸。

在步骤c)中，通过添加氢氧化钠(NaOH)将pH调节至在10与11之间的碱性值。在步骤c)期间，必要的是pH是碱性的，在10与11之间。优选地，将pH调节至10.3与10.8之间的值。实际上，这种pH水平与植酸的作用相组合，导致细胞膜(包括核膜)的破坏、植物细胞的裂解和DNA的变性(双螺旋的两条链被分离)。

步骤d)，在植酸存在下通过碱性裂解进行提取，优选在40至80℃的温度下持续至少1小时。优选地，该步骤持续1小时。有利地，该步骤在60℃至80℃的温度下进行。甚至更优选地，该步骤在80℃下进行。在该步骤中，有利地适度搅拌混合物。

检查pH表明在步骤d)结束时它保持碱性并稳定在9至11。

在步骤e)中，对在d)中获得的混合物进行纯化，以除去残留固体并回收构成根据本发明的水性粗提取物的可溶性部分。

本领域技术人员已知的任何方法都可以用于进行该纯化步骤。优选地，将混合物在孔隙率大于或等于30μm的过滤器上直接过滤，以收集滤液。在d)中获得的混合物也可以以低速离心，例如以4000g离心至少10分钟，以使残留植物物质在沉淀物中沉淀的并回收上清液中的水性粗提取物。

在步骤f)中，将pH调节到6与8之间。这个酸化步骤导致DNA发生突然的复性(双螺旋链的重新配对)。然而，染色体DNA很长，无法完成完全重新配对并形成稍后会被消除的不溶的缠结。另一方面，更小、更短的RNA保留在溶液中。

在步骤g)中，将粉末状活性炭添加到混合物中。优选地，使用两种不同类型的碳的混合物以增加脱色，两种类型的活性炭中每种活性炭的比例为0.1至1％(重量/重量)、优选地比例为0.25％(重量/重量)。选择活性炭是因为它们消耗多酚提取物的能力，而多酚主要决定提取物的颜色。该阶段在40至50℃的温度下在搅拌下持续15分钟至1小时、优选30分钟，以获得最佳结果。

在步骤h)中，使用孔隙率大于或等于30μm的过滤器将在步骤g)中获得的混合物过滤以除去碳颗粒。获得澄清的滤液。

在步骤i)中，使在步骤h)中获得的滤液与粉末状PVPP接触，以继续除去未被活性炭保留的酚类化合物，如高分子量多酚，如单宁。优选地，PVPP以0.5％至3％(重量/重量)的比例，并且优选地以1％至10％的比例使用。

该步骤可以在室温至50℃的温度下，在搅拌下持续10至30分钟，优选10分钟。

在步骤j)中，通过在孔隙率大于25μm的过滤器上过滤，然后使用孔隙率为0.8μm的过滤器过滤来使在步骤i)中获得的混合物澄清。此步骤可消除PVPP颗粒。收集滤液。

本文所述的方法，特别是步骤g)至j)，使得可以获得含有微量(即相对于提取物的干重，最多0.001％)儿茶素的提取物，或者甚至不含有儿茶素、表儿茶素或表没食子儿茶素的提取物。这通过使用薄层色谱法对提取物进行分析来证明。

在步骤k)中，然后将步骤j)中获得的混合物的pH调节到6至6.5的值。然后获得粗红茶提取物。

通过添加盐酸(HCl)溶液或与美容用途相容的任何其他等效酸(如柠檬酸)来调节pH。将pH调节到6至6.5是本申请所述方法中的必不可少的步骤，以保持低分子量RNA悬浮并防止感兴趣的植物化学化合物如糖、酚类化合物、有机酸、氨基酸、咖啡因和茶氨酸的沉淀。

因此，上述提取方法使得可以获得物种茶(Camellia sinensis)的红茶叶的水性提取物，其具有5至30g/kg的干重并且包含提取物总重量的按重量计0.5至10g/kg糖、0.050至2g/kg的有机酸、0,030至3g/kg的氨基酸、0.050至5g/kg的酚类化合物(包含最多150mg/kg的儿茶素、0.020至2g/kg的咖啡因、0.020至2g/kg的茶氨酸)和50至350mg/kg的具有最大150个核苷酸的长度的小分子量RNA，并且不含DNA。

因此，本发明还涉及通过上述方法可获得的物种茶(Camellia sinensis)的红茶叶的水性粗提取物。

在步骤k)中获得的提取物可以任选地用生理学上可接受的溶剂稀释，以便随着时间的推移增加其稳定性和保存性。然后获得稀释的提取物。

将提取物稀释以获得4至20g/kg的干重，并将其pH调节至5.8至6.5、优选6.0至6.5。该步骤随着时间的推移提高了产品的稳定性。

生理学上可接受的溶剂可以选自以下溶剂：水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇以及其天然形式、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。

优选地，乙醇、丁二醇、丙二醇和甘油是植物来源的溶剂(天然形式)。

有利地，生理学上可接受的溶剂选自从植物获得的丁二醇、丙二醇或甘油。

丁二醇或丙二醇在长期内使提取物稳定并防止植物化合物沉淀。甘油，当以至少70％的浓度使用时，具有相同的性质。这些溶剂还因其抑菌甚至杀菌或杀真菌特性而被公认，这也有助于提取物的长期保存和稳定性。以这种方式稀释的提取物可以保存至少12个月。这一方面通过这样的研究得到了验证，该研究在用不同类型的微生物接种提取物后，测量了其阻断微生物生长的能力。稀释后的提取物可以保存至少12个月。

在一个特别优选的实施方案中，粗红茶提取物可以与30至50％的丁二醇、或30至50％的丙二醇或30至70％的甘油混合。

当使用甘油时，其优选以70％使用。

如此稀释的红茶叶的水性提取物具有在4与20g/kg之间的干重并且包含稀释的提取物的总重量的按重量计10至250mg/kg的最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA、0.2至5g/kg的糖、0.030至1g/kg的有机酸、0.010至2g/kg的氨基酸、0.030至3g/kg的酚类化合物(包含最多120mg/kg的儿茶素、0.010至1g/kg的咖啡因、0.010至1g/kg的茶氨酸)，并且是不含DNA的。

在优选实施方案中，红茶来自毛里求斯或印度。

上面段落中描述的红茶叶的水性提取物可以直接用于制备本发明的化妆品组合物。

或者，也可以使在步骤k)中获得的粗红茶提取物脱水以获得呈粉末形式的干提取物。可以使用本领域技术人员已知的用于使提取物脱水的任何方法，例如冷冻干燥。

第三，本发明涉及包含作为活性剂的有效量的根据上述方法获得的红茶的稀释提取物和生理学上可接受的介质的化妆品组合物。

有利地，红茶提取物以相对于组合物的总重量按重量计0.05至5％的浓度、优选地以相对于组合物的总重量按重量计0.1至2.5％的浓度添加到生理学上可接受的介质中。

本申请的组合物被配制成通过任何合适的途径施用，特别是经口施用或局部外部施用，并且组合物的配制将由本领域技术人员进行调整。

优选地，本申请的组合物呈适合局部施用的形式。因此，该组合物必须含有生理学上可接受的介质，即与皮肤和附属物相容，在施用过程中没有任何不适的风险。

组合物特别可以呈水溶液、水醇溶液或油状溶液或凝胶、水包油、油包水乳液或多种乳液的形式；它们也可以呈悬浮液或粉末的形式，适合施用于皮肤、粘膜、嘴唇和/或头发。

该组合物可以或多或少是粘性的，并且还具有乳膏、乳液、流体、乳、浆液、软膏、凝胶、糊剂、香膏(balm)或泡沫的外观。它也可以呈固体形式，如棒，或作为气溶胶施用至皮肤。

在所考虑的应用领域中通常使用的生理学上可接受的介质的实例是制剂所需的佐剂，如溶剂、增稠剂、胶凝剂、稀释剂、乳化剂、抗氧化剂、着色剂、防晒剂、美黑剂、颜料、填料、防腐剂、香料、气味吸收剂、精油、维生素、必需脂肪酸，表面活性剂、成膜聚合物、酯类、植物油或黄油等。

在所有情况下，本领域技术人员将确保这些佐剂及其比例是以不损害根据本发明的组合物所寻求的有利特性的方式进行选择的。例如，这些佐剂可以各自对应于组合物总重量的0.01至20％。当根据本发明的组合物是乳液时，相对于组合物的总重量，脂肪相可以占按重量计2至90％、优选按重量计5至30％。组合物中使用的乳化剂和共乳化剂选自所讨论的领域中常规使用的那些。例如，相对于组合物的总重量，它们可以以按重量计0.3至30％的比例使用。

根据另一个有利的实施方案，红茶提取物可以被封入或包含在化妆品载剂中，如脂质体或化妆品领域中使用的任何其他纳米胶囊或微胶囊，或者吸附到粉末状有机聚合物或矿物载体上，如滑石和膨润土。

有利地，除了所述活性剂(即红茶提取物)之外，组合物还可以包含至少一种具有与本发明的化妆品效果相似和/或互补的化妆品效果的其他活性剂。

例如，另外的活性剂可以选自：抗衰老剂、紧致剂、美白剂、保湿剂、疏干剂(draining agent)、微循环促进剂、去角质剂、脱皮剂、细胞外基质刺激剂、能量代谢活化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、舒缓剂、抗自由基剂、抗UV剂、抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、引起温热感的试剂、引起凉爽感的试剂和瘦身剂。

这样的另外的活性剂可以选自包括以下的组：

-维生素A，特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯和视黄醇棕榈酸酯；

-维生素B3，更特别是烟酰胺和生育酚烟酸盐；

-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇；

-维生素C，特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁和钠；

-维生素E、F、H、K、PP、辅酶Q10；

-金属蛋白酶抑制剂或TIMP激活剂；

-DHEA、其前体及衍生物；

-氨基酸如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰基化氨基酸化合物；

-天然或合成肽，包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂性衍生物，其为同分异构的并且与其他物质如金属离子(例如铜、锌、锰、镁等)络合。实例包括商业上已知为：CHRONOGEN^TM、LAMINIXYL IS^TM、PEPTIDE Q10^TM、COLLAXYL^TM(专利FR2827170，)、PEPTIDE VINCI 01^TM(专利FR2837098，)、PEPTIDE VINCI 02^TM(专利FR2841781，)、ATPeptide^TM(专利FR2846883，)的肽，或以ATPeptide^TM的名称由销售的具有序列Arg-Gly-Ser-NH2的合成肽；

-以GP4G^TM(FR2817748，)的名称销售的卤虫(artemia salina)提取物；

-植物肽提取物，如亚麻提取物(Lipigenin^TM，专利FR2956818，)、大豆提取物、斯佩耳特小麦(spelt)提取物、葡萄提取物、油菜籽提取物、亚麻提取物、大米提取物、玉米提取物、豌豆提取物；

-酵母提取物，例如Dynagen^TM(专利FR2951946，)或Actopontine^TM(专利FR2944526，)；

-脱氢乙酸(DHA)；

-合成或天然来源的植物甾醇；

-水杨酸及其衍生物，α-和β-羟酸，硅烷醇；

-氨基糖：葡糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺；

-多酚、异黄酮和类黄酮的提取物，如葡萄提取物、松树提取物和橄榄提取物；

-脂质如神经酰胺或磷脂、动物来源的油如角鲨烯或角鲨烷；植物油，如甜杏仁油、椰子核油、蓖麻油、荷荷巴油、橄榄油、菜籽油、花生油、向日葵油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油棉、苜蓿、南瓜、月见草、小米、大麦、黑麦、红花、西番莲、榛子、棕榈、杏仁、鳄梨、金盏花；乙氧基化植物油、乳木果油、可可脂、巴巴苏脂；

-所有UV屏蔽剂和防晒剂；

-环状AMP及其衍生物、腺苷酸环化酶激活剂和磷酸二酯酶抑制剂、积雪草(Centella asiatica)提取物、积雪草皂苷和亚洲积雪草酸、甲基黄嘌呤、茶碱、可可碱、佛司可林(forskolin)、七叶灵和七叶苷、ACE抑制剂、Val-Trp肽、神经肽Y抑制剂、脑啡肽、银杏叶提取物、薯蓣提取物、芦丁、马黛茶提取物、瓜拉那提取物、寡糖、多糖、肉毒碱、常青藤提取物、墨角藻提取物、水解夏枯草提取物、水解鸡冠花提取物、光滑果榆绿木(Anogeissusleiocarpus)提取物、木薯(Manihot utilissima)叶提取物、棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine)、肌肽、牛磺酸、接骨木提取物、海藻提取物如掌裙藻(PalmariaPalmata)提取物；

-透明质酸或透明质酸钠及其所有部分和促进剂；

-薄荷醇和乳酸薄荷醇酯以及其他具有清爽作用的活性剂；

-芦荟、红没药醇、尿囊素等具有舒缓作用的活性剂；

-香草基丁基醚和其他具有加热作用的活性剂；

-过氧化苯甲酰和其他抗痤疮活性剂。

在本发明的一个特定实施方案中，化妆品组合物包含作为活性剂的有效量的根据上述方法获得的除了来自毛里求斯的红茶以外的来自任何来源的红茶的提取物和生理学上可接受的介质。

第四，本发明还涉及前述包含除了来自毛里求斯的红茶以外的来自任何来源的红茶的提取物的组合物用于护理皮肤、头皮及附属物的美容用途，更具体地用于保护皮肤免受外部侵蚀和氧化、对抗皮肤衰老的迹象、增加光保护、美白皮肤以及提高皮肤水合能力的美容用途。

术语“美容用途”意指该产品旨在用于具有健康皮肤、头皮或附属物的个人。

皮肤是由数个层(真皮、表皮和角质层)组成的器官，覆盖身体的整个表面，提供保护，免受外部攻击、感觉、免疫、代谢和体温调节功能，以及充当限制脱水的屏障。

皮肤的外观可以通过内部变化(内在衰老、疾病和激素变化，如怀孕)或外部变化(环境因素，如污染、阳光、病原体、温度变化等)来改变。所有这些变化不仅影响皮肤，还影响角质附属物，或诸如毛发、睫毛、眉毛、指甲和头发等附属物。

实施例

作为说明，下面描述如何进行根据本发明的方法的实施例。

实施例1：根据本发明的方法制备富含小RNA的来自印度和毛里求斯的红茶(Camellia sinensis))的提取物：

为了考虑到植物适应其环境的巨大能力，使用来自不同地理来源的红茶提取物(均来自物种茶(Camellia sinensis))来实施本发明的方法，如本实施例中所述。

制备了来自毛里求斯的红茶和来自印度的红茶的提取物。

毛里求斯被山脉环绕，海拔高度从300米到800米不等。这片土地从沿海平原上升到达到670m高度的中央高原。岛上的气候使其成为种植茶叶的理想场所。来自毛里求斯的红茶是在毛里求斯的种植园种植、收获和加工的茶。

印度茶是在印度海拔1200至2200米的茶园种植、收获和加工的茶。

在第一步骤a)中，将预先研磨成粗粉末的红茶叶称重至占该方法中使用的原材料的3％，即每1kg为30g。添加的蒸馏水的量为968g。

搅拌茶叶和水混合物以改善感兴趣的植物分子的提取，这得益于固体物质、茶和提取水溶液之间更好的交换。

在步骤b)中，将2g/l(即最终3mM)的植酸添加到水和磨碎的茶叶的混合物中。

在步骤c)中，将pH调节至10.5以优化提取并用小分子量RNA和各种植物分子富集提取物。

在步骤d)中，将混合物在80℃下加热1小时，同时适度搅拌。

在步骤e)中，使用孔隙率为30μm的过滤器过滤混合物，以从滤液中分离固体物质。然后使用孔隙率降低的过滤器进行三次顺序过滤，以使植物提取物澄清，直到以3μm的孔隙率过滤。

步骤f)将在步骤e)中收集的滤液的pH(平均大于9)调节到6至8，以获得用于随后的活性炭处理的最佳pH。

步骤g)用两种SX+和CA1活性炭进行处理以使提取物脱色，特别是通过除去多酚而使提取物脱色。每升提取物添加2.5克每种类型的碳。该处理在40至50℃的温度下持续30分钟。

步骤h)：通过使提取物通过孔隙率为30μm的过滤器来除去碳。

在步骤i)中，通过添加(PVPP)粉末对g)中获得的滤液进行第二次脱色处理。每升提取物添加10g PVPP以除去提取物中所含的一些单宁。该处理在40至50℃的温度下进行10分钟。

在步骤j)中，然后在孔隙率减小的过滤器上进行顺序过滤，以从植物提取物中除去PVPP。最初的30μm过滤可以保留PVPP，然后顺序过滤直至0.8μm的孔隙率，以使提取物澄清。

在步骤k)中，检查pH，然后使用柠檬酸或盐酸溶液将pH调节到6至6.5的值。

由此从来自毛里求斯的红茶中获得的水性粗红茶提取物的干重为10.8g/kg。理化分析表明，所获得的提取物具有这样的浓度：3.3g/kg的总糖、550mg/kg的总有机酸、340mg/kg的氨基酸、1.2g/kg的总酚类化合物和260mg/kg的最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。

从来自印度的红茶中获得的水性粗红茶提取物的干重为7.8g/kg。理化分析表明，所获得的提取物具有这样的浓度：1.2g/kg总糖、280g/kg总有机酸、230mg/kg氨基酸、0.51g/kg总酚类化合物和160mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。

用植物来源的丙二醇稀释在步骤k)中获得的提取物，以获得30％丙二醇和70％茶提取物的最终浓度。对于美容用途是生理学上可接受的这种溶剂可以使产品稳定并随着时间的推移增加其保存。结果是pH调节到6.0至6.5的稀释的提取物。

添加30％丙二醇后的粗水性提取物的组成在下表1中给出。

[表1]

使用本实例中描述的方法获得的稀释的茶提取物在本申请中提供的表或图中被称为PSR(植物小RNA)茶。

实施例2：使用常规提取方法制备红茶(Camellia sinensis)的对比提取物：

实施例2中所用方法的目的是制备对照提取物，以获得与通过本发明的方法(实施例1)获得的茶提取物相关的对比分析数据。

所选择的所谓常规提取方法对于提取不同类型的酚类化合物和其他极性分子如糖和氨基酸是最佳的，这使其成为与实施例1中应用的本发明方法进行比较的良好参考方法。

在第一阶段中，为了生产1kg提取物，使用与实施例1中相同的来自毛里求斯和印度的茶(来自茶(Camellia sinensis)物种)。

将预先研磨成粗粉末的干红茶叶称重，使其占该过程中使用的原材料的3％，即每1kg为30g，将其与970g蒸馏水混合。

不对提取pH进行调节，并且其在5至7之间。

然后将混合物在45℃下在搅拌下加热1小时。

然后使用孔隙率为30μm的过滤器过滤混合物，以将固体物质从滤液中分离出来。然后在孔隙率减小的过滤器上进行顺序过滤以使植物提取物澄清，直到以1μm的孔隙率过滤。

在这一阶段结束时，用碳处理提取物以使其脱色，特别是通过去除多酚使其脱色。每升提取物添加2.5克每种碳。该处理在40至50℃的温度和6至8的pH下持续30分钟。进行30μm过滤以从提取物中除去碳。

然后通过添加PVPP粉末进行第二次脱色处理。向提取物中添加10gPVPP以除去提取物中所含的一些单宁。使该处理在40至50℃的温度下持续了10分钟。然后在孔隙减小的过滤器上进行顺序过滤以使植物提取物澄清直至0.2μm过滤。

检查pH，然后使用柠檬酸、盐酸或氢氧化钠溶液将pH调节到6至6.5。

来自毛里求斯的生红茶的提取物的干重为7g/kg。理化分析表明，所获得的提取物具有这样的浓度：0.9g/kg的总糖、310mg/kg的总有机酸、190mg/kg的氨基酸、和270mg/kg的总酚类化合物。

获得的来自印度的水性粗红茶提取物的干重为4g/kg。理化分析表明，所获得的提取物具有这样的浓度：0.8g/kg的总糖、190mg/kg的总有机酸、140mg/kg的氨基酸、和170mg/kg的总酚类化合物。

然后用植物来源的丙二醇(一种生理学上可接受的化妆品溶剂)稀释提取物，以获得30％丙二醇和70％茶提取物的最终浓度。通过常规方法获得的提取物的组成在下表2中给出。

[表2]

实施例3：实施例1和2中获得的稀释的红茶提取物的各种成分的定量以及来自实施例1的提取物的微生物稳定性的评估。

在105℃下蒸12小时后测量根据实施例1(本发明的方法)或根据实施例2(常规方法)获得的每种提取物的干重。

通过实施例1的方法(本发明的方法)获得的PSR提取物具有比通过常规方法获得的茶提取物更高的干重，这意味着在实施例1的方法中的提取产率更高(见表3)。

[表3]

来自实施例1和2的茶提取物的总糖含量通过分光光度测定法测定，该测定法基于Dubois等人(1956)(Dubois et al.,"Méthode colorimétrique pour la déterminationdes sucres et des substances apparentées",Anal.Chem,1956,28(3),350-356)所述测定法的改编。将来自实施例1和2的红茶提取物溶解在浓硫酸中，然后使其与苯酚反应以形成有色络合物。在分光光度计上在490nm处读取了络合物的吸光度。使用标准葡萄糖曲线来测定糖含量。

分析显示，与通过实施例2中的常规方法获得的提取物中的糖浓度相比，通过实施例1中的方法获得的来自所有来源的红茶提取物中的糖浓度更高。结果在表4中示出。

[表4]

实施例1和2中红茶提取物的总氨基酸含量使用Moore S.和Stein WH(1948)公布的方案(Moore,S.and Stein,W.H.(1948)Photometris Ninhydrin Method for Use inthe Chromatography of Amino Acids.The Journal of Biological Chemistry,176,367-388)用分光光度法测定.

提取物的游离氨基酸含量通过在胺和羧基官能被试剂茚三酮破坏后形成有色络合物来评估。在570nm处读取了络合物的吸光度。使用基于氨基酸库的标准曲线测定总氨基酸含量。

该分析显示，与在实施例2中通过常规方法获得的提取物中的氨基酸浓度相比，在实施例1中通过本发明的方法获得的红茶PSR提取物中的氨基酸浓度更高。

[表5]

实施例1和2中的红茶提取物的总酚含量通过Folin-Ciocalteu分光光度法测定(Singleton et al.,Analysis of total phenols and other oxidativeandantioxidant substrates using the Folin-Ciocalteu reagent,1999,299:152)。样品中存在的多酚化合物与Folin-Ciocalteu试剂反应以产生蓝色。在分光光度计上在760nm处读取了样品的吸光度。总多酚浓度使用标准没食子酸曲线以没食子酸当量表示。

分析显示，与表6中所述的常规提取方法相比，对于所有红茶来源，使用本发明所述方法获得的提取物中的酚类化合物浓度更高。

[表6]

使用高效液相色谱法，结合ACQUITY Qda质量检测器(WATERS)，对来自实施例1和2的红茶提取物中所含的有机酸进行表征和定量。将样品在EC 150/4.6Nucleoshell RP18plus-5μm柱(150x4.6 mm)(Macherey Nagel:763236.46)上通过Agilent 1260HPLC系统(Agilent Technologies)分离。流速为0.3ml/min。流动相由0.01％甲酸(HCOOH)溶液(A)和乙腈组成。

通过将样品的保留时间和质谱峰与标准品进行比较来鉴定有机酸。有机酸的定量估计基于色谱峰的面积与标准品的面积的比较。

因此，HPLC-MS分析显示，使用本发明的方法获得的来自毛里求斯或印度的红茶提取物具有比实施例2中所述的常规提取物更高的总有机酸浓度，如表7中所述。

分析还表明，根据实施例1和2获得的红茶提取物含有不同类型的有机酸，如表7所示。在根据实施例1获得的PSR红茶提取物中或在实施例2的常规提取物中未检测到酒石酸和糖醛酸，或检测到的量非常低。

[表7]

通过高效液相色谱法，结合UV(紫外光)检测器，对来自实施例1和2的红茶提取物的茶氨酸含量进行评估。将样品在250mm x 4.6mm x 5um Uptisphère C18-2柱(Interchim)上通过Agilent 1200HPLC系统(Agilent Technologies)分离。流速为0.4ml/min。流动相由0.1％磷酸(H3PO4)水溶液(A)和乙腈(ACN)(B)组成。

通过将样品的保留时间和UV光谱峰与标准品进行比较来鉴定茶氨酸。根据色谱峰面积与标准品面积的比较，对茶氨酸进行了定量估算。

HPLC-UV分析显示，根据实施例1获得的红茶提取物含有等量的茶氨酸，并且比常规提取物含有得更多。结果在表8中示出。

[表8]

通过高效液相色谱法，结合UV检测器，对来自实施例1和2的红茶提取物中的咖啡因(或咖啡因)含量进行评估。将样品在100mm x 4.6mm x 2.6pm Uptisphere CSevolution C18-AQ柱(Interchim)上通过Agilent 1100HPLC系统(Agilent Technologies)分离。流速为0.8ml/min。流动相由0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液(A)和甲醇(B)组成。

温度为25℃。注射体积为5μL，使用UV检测器将检测波长设置为272nm。咖啡因标准品购自Sigma-Aldrich。通过将样品的保留时间和UV光谱峰与可靠的标准品进行比较来进行咖啡因鉴定。根据色谱峰面积与标准品面积的比较，对咖啡因进行了定量估算。

HPLC-UV分析表明，所有类型的茶提取物都含有咖啡因。通过实施例2中提及的常规提取获得的红茶提取物具有比使用本文所述方法获得的提取物更高的咖啡因浓度。结果如表9所示。

[表9]

还对总儿茶素进行了定量。由于存在两个不对称碳，儿茶素以几种立体异构体的形式存在。在自然界中，最常见的异构体是(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素。另外两种对映体要少得多，它们的存在似乎与酶促反应或热处理有关。将所有样品在100mm x 4.6mm x 2.6pmUptisphere CS evolution C18-AQ柱(Interchim)上使用Agilent 1100HPLC系统(AgilentTechnologies)分离。流速为0.8ml/min。流动相由0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液(A)和甲醇(B)组成。

允许对根据实施例1和2(本发明的方法和所谓的常规方法)获得的各种红茶提取物中所含的儿茶素进行量化和鉴定的HPLC-UV分析，表明通过本发明的方法或通过常规提取获得的红茶提取物含有微量即相对于提取物的干重最大0.001％的儿茶素型多酚，或者甚至不含如表10所示的儿茶素型多酚(n.d.意指不可测定的)。这些分子在提取物中的这种缺失或低量可以通过碳和PVPP处理阶段去除了这种类型的化合物的事实来解释。这证实了碳处理与PVPP结合在去除这类分子方面的有效性。

[表10]

此外，薄层色谱分析显示，本发明的茶提取物中没有一种含有表儿茶素或表没食子儿茶素。

使用专门为核酸分析如小分子量RNA的核酸分析设计的微流控芯片上的微型电泳技术(BioanalyzerAgilent)对低分子量RNA的尺寸进行定量和测量。该方法用于测定提取物中所含核酸的尺寸和浓度。

本发明的茶提取物中存在的小RNA是RNA的复杂混合物的形式，其中大多数的尺寸在25与150个核苷酸之间。

生物分析仪的定量结果显示，通过实施例1的方法获得的红茶提取物使得能够从不同类型的茶中提取小分子量RNA，如表11所示。相反，在常规红茶提取物中检测不到小分子量RNA(n.d.意指不可测定的)。

[表11]

根据实施例1的红茶提取物的微生物稳定性的评估

根据实施例1获得的印度原产红茶提取物的稳定性根据以下方案进行：

在第0天和第21天进行接种。在接种后48小时、7天、14天、21天和28天进行测试。细菌培养基为胰蛋白胨-大豆琼脂，真菌培养基为右旋糖-马铃薯琼脂。

使用了适用于测试微生物类型的标准温度和时间条件。

结果

来自印度的生(未稀释)红茶提取物在几天后显示出超过100CFU的污染率。

用丙二醇稀释的来自印度的红茶提取物获得30％丙二醇和70％茶提取物的最终浓度，给出的结果在表12中示出。

[表12]

实施例4：在体外测试中，来自实施例1和2的红茶提取物在抑制酶--透明质酸酶方面的活性的评估：

概念：

该测试的目的是使用浊度测试证明来自印度的来自实施例1和2的提取物对透明质酸酶的酶活性的抑制能力。透明质酸是存在于真皮中的糖胺聚糖，能够在真皮细胞外基质中保留大量水分并因此是皮肤水合能力的主要参与者。透明质酸酶是存在于皮肤中的酶，其催化透明质酸分解为单糖或双糖和较小的透明质酸片段。在酸性白蛋白的存在下，透明质酸能够反应形成可以使用分光光度法在600nm下测量的云雾状浑浊。因此，通过分析样品与酶及其底物接触后的浊度水平来测量酶活性的抑制。

方案：

将该酶与来自印度的根据实施例1和2获得的提取物(使得提取物在反应混合物中的最终浓度为1％)在37℃的温度下、在pH7的缓冲液中一起温育20分钟(酶平衡的理想条件)。将酶底物透明质酸以0.3mg/ml的浓度添加到混合物中。将混合物缓慢均化，然后在37℃下温育45分钟。然后使混合物中残留的透明质酸与酸性白蛋白溶液接触并均化。反应时间为10分钟，之后使用分光光度计读取在600nm处的透光度。将数据与用阴性抑制对照获得的数据进行比较，所述阴性抑制对照对应于酶已使底物降解至100％的条件，对应于100％的酶活性。

结果：

根据实施例1制备并以1％测试的来自印度的红茶提取物显示出45.1％的透明质酸酶的抑制百分比。根据实施例2常规制备的来自印度的茶提取物显示出22.1％的抑制百分比。结果在图1中示出。

结论：

评估以1％测试的提取物在体外对透明质酸酶活性的抑制作用的测试表明，根据实施例1(本发明的方法)制备的来自印度的红茶提取物对酶的抑制能力显著强于根据常规方法(实施例2)制备的提取物。

实施例5：抗衰老面膜的配方

[表13]

制备过程：

1.在25℃下，使主容器中的相A均化；

2.在25℃下，撒入到相B中，充分混合直至均匀；

3.在25℃下，添加相C，充分混合直至均匀；

4.在单独的烧杯中预混合相D，并在25℃下添加到主容器；

5.在25℃下，向主容器中添加相E并充分混合；

6.预混合相F并缓慢添加。充分混合直至均匀；

7.在单独的烧杯中预混合相G，并添加到主容器中直至均匀；

8.在25℃下停止。

因此，该组合物呈具有闪烁的绿色效果、具有5.30至5.80的pH值和70,000-100,000cps的粘度(D0)(Brookfield RVT/主轴C/5RPM/1分钟/25℃)的乳膏状凝胶的形式。

实施例6：血清配方

[表14]

制备过程：

1.向主容器中添加水，开始用高低螺旋桨叶片搅拌；

2.添加剩余的成分，一次一种，在每次添加之间进行搅拌。

因此，该组合物呈具有5.75至6.25的pH值和1,100-1,400cps的粘度(D0)(Brookfield RVT/主轴3/20rpm/25℃/1分钟)的光滑、半透明浆液的形式。

Claims

1.一种茶(Camellia sinensis)物种的红茶叶的提取物，其包含10至350mg/kg的具有至多150个核苷酸长度的小RNA，至多150mg/kg的儿茶素、优选至多120mg/kg的儿茶素、甚至更优选至多30mg/kg的儿茶素，其特征在于红茶(Camelia sinensis)的提取物通过包括以下步骤的生产方法获得：

a)将先前研磨的茶叶放入水中；

b)添加植酸；

c)将pH调节至10与11之间的值；

d)将混合物在40至80℃的温度下搅拌至少一小时；

e)将在c)中获得的混合物纯化以清除残留的固体植物物质并收集滤液；

f)将pH调节至6与8之间的值；

g)用粉末状活性炭处理所述混合物；

h)过滤以除去所述活性炭并收集滤液；

i)用聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)处理滤液；

j)过滤以除去所述PVPP并收集滤液；

k)检查滤液的pH，如有必要，将其重新调节至6与6.5之间的值；

l)任选地，在生理学上可接受的溶剂中稀释所述提取物，并将其pH调节至5.8与6.5之间、优选6.0与6.5之间的值，以获得干重为4至20g/kg的经稀释的提取物。

2.根据权利要求1所述的红茶叶提取物，其特征在于所述红茶叶提取物含有相对于所述提取物干重最多0.001％儿茶素的微量儿茶素，优选不含儿茶素。

3.根据前述权利要求中的一项所述的红茶叶提取物，其特征在于所述红茶叶提取物包含0.030至5g/kg的酚类化合物。

4.根据前述权利要求中的一项所述的红茶叶提取物，其特征在于所述红茶叶提取物具有4至30g/kg的干重并且包含0.2至10g/kg的糖、0.010至3g/kg的总氨基酸、0.010至2g/kg的咖啡因和0.010至2g/kg的茶氨酸。

5.根据前述权利要求中的一项所述的红茶叶提取物，其特征在于所述红茶叶提取物已在生理学上可接受的溶剂中稀释，具有在4与20g/kg之间的干重并且按重量计包含稀释的提取物总重量的10至250mg/kg的具有至多150个核苷酸长度的小分子量RNA、0.2至5g/kg的糖、0.010至2g/kg的氨基酸、0.030至3g/kg的酚类化合物，所述酚类化合物包含至多120mg/kg的儿茶素、0.010至1g/kg的咖啡因和0.010至1g/kg的茶氨酸。

6.一种用于从根据权利要求1至5中任一项所述的红茶(Camellia sinensis)的叶中获得提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将先前研磨的茶叶放入水中；

b)添加植酸；

c)将pH调节至10与11之间的值；

d)将混合物在40至80℃的温度下搅拌至少一小时；

f)将pH调节至6与8之间的值；

g)用粉末状活性炭处理所述混合物；

h)过滤以除去所述活性炭并收集滤液；

i)用聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)处理滤液；

j)过滤以除去所述PVPP并收集滤液；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当在步骤l)中稀释所述提取物时，所述生理学上可接受的溶剂选自水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，将红茶叶以1％至20％、优选2％至10％、甚至更优选2％至5％的植物物质/水比率放置在水中。

9.根据权利要求6至8中的一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，用浓度为1至10mM且优选1至5mM的植酸进行处理。

10.根据权利要求6至9中的一项所述的方法，其特征在于，在步骤e)中，在孔隙率大于或等于30μm的过滤器上进行至少一次过滤。

11.根据权利要求6至10中的一项所述的方法，其特征在于，在步骤j)中，用孔隙率大于25μm的过滤器、然后用孔隙为0.8μm的过滤器进行顺序过滤。

12.一种组合物，其包含作为活性剂的有效量的根据权利要求5所述的稀释的红茶提取物和生理学上可接受的介质。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述活性剂按重量计以所述组合物的总重量的0.05％至5％、优选按重量计以所述组合物和生理学上可接受的介质的总重量的0.1％至2.5％的浓度存在。

14.根据权利要求12或13中的一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物被配制成局部施用至皮肤、附属物和头皮。

15.根据权利要求12至14中的一项所述的组合物，其特征在于，所述活性剂是来自任何来源的红茶的提取物，不包括来自毛里求斯的红茶。

16.权利要求15所述的组合物用于护理皮肤、头皮及附属物的美容用途。

17.权利要求16所述的组合物用于获得美容益处的美容用途，所述美容益处选自：保护皮肤免受外部侵蚀和氧化、对抗皮肤衰老的迹象、增加光保护、美白皮肤、或提高皮肤水合能力。