CN117723515A - 基于单光子雪崩二极管的单像素荧光多维显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种基于单光子雪崩二极管的单像素荧光多维显微成像方法。其特征是：聚焦在待测样品中的激光光束激发待测样品中的荧光团产生荧光信号，经数字微镜阵列调制后，通过一个工作在反向击穿电压下的单光子雪崩二极管接收，经时间相关单光子计数器记录荧光光子的数量与荧光寿命信息，通过不同偏置电压下的光谱响应曲线与解调算法求解荧光光谱，通过激发光束的快速扫描获取待测样品的三维结构荧光层析图像。本发明提出的方法利用一个单像素探测器实现光谱、寿命和三维结构的多维信息的快速检测与成像，具有灵敏度高、结构简单、成本低廉、操作简便等特点，可应用于生物学、医学、药学和生命科学等众多研究领域。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种基于单光子雪崩二极管的单像素荧光多维显微成像方法，可对微纳尺度内的生物体进行快速的激光扫描三维显微成像，同时还可以获取荧光光谱和荧光寿命，是一种将单像素成像和荧光寿命成像相结合的技术，具有成像速度快、分辨率高、结构简单等优点，属于生物医学成像领域。
背景技术
荧光显微成像技术是细胞生物学最常用的研究工具之一，利用细胞的自体荧光或外源性荧光标记提供化学特异性和成像对比度，从而获取细胞内部结构，并进而研究细胞生命过程中的许多生物现象，如细胞的有丝分裂、代谢过程等。相较于其他成像技术，荧光显微成像技术具有成像速度快，分辨率高，对生物体损伤小，适合于活体细胞动态检测等优势，是一种先进的显微成像技术。
目前，荧光光谱已广泛应用于分析物质组成成分的场合，可作为定性检测和定量测量的一个特定参数。然而，生物体的荧光特征不仅包括发射光谱及其强度信息，还包括荧光寿命信息。当荧光分子与微环境相互作用时，荧光会发生淬灭，而荧光寿命可以直接反应荧光淬灭的速率。因此，荧光寿命作为附加的特征参量，可以用来探测监测细胞及微环境中许多动态过程，例如PH值变化、离子浓度、氧饱和度等。通过检测荧光光谱与荧光寿命来表征生物分子在性质和状态上的变化，获取细胞的荧光光谱和荧光寿命多维信息有助于在获取细胞内部结构的同时，分析细胞内部生物分子间相互作用过程，及其所处微环境变化等多方面信息。
传统的荧光成像系统中，荧光光谱和荧光寿命信息通常是分开检测的。荧光光谱检测模块中通常使用棱镜、光栅等分光元件进行光谱分离，从而实现荧光光谱信号的检测，系统通常体积庞大，复杂度高，限制了荧光光谱检测系统的小型化。在荧光光谱检测系统中，最常用的探测器为光电倍增管(Photomultiplier Tubes,PMT)，其缺点是量子效率较低，造成大量光子的浪费，且造价昂贵，对使用环境要求苛刻。
本发明将单像素成像(Single-pixel Imaging,SPI)技术与时间相关单光子计数(Time-Correlated Single Photon Counting,TCSPC)技术结合在一起应用于荧光显微成像领域，实现了基于单光子雪崩二极管的荧光光谱和荧光寿命的同时探测的荧光显微成像技术。通过激发光束的快速扫描，在获取生物待测样品的荧光光谱和荧光寿命信息的同时，获取其三维结构荧光显微图像，有利于实时观察荧光分子相互作用的过程，便于对细胞进行全方面的实时分析。
SPI技术是一种新型成像技术，该技术使用一个单像素探测器，如单光子雪崩二极管(Single-Photon Avalanche Diode,SPAD)、光电倍增管(Photomultiplier Tubes,PMT)替代传统成像方式中的阵列式采光器件，如CCD、CMOS等，完成荧光信号的探测。本发明中系统基于一个工作在反向击穿电压条件下具有单光子探测能力的SPAD作为探测器，具有光谱响应范围宽、光子探测效率高、暗计数低、响应速度快、造价低廉、体积小巧、功耗低等众多优势。
由于单像素探测器不具备空间分辨能力，因此系统中需要借助空间光调制器(Spatial Light Modulator,SLM)或数字微镜阵列(Digital Micromirror Device,DMD)加载一系列掩模图像，通过计算成像算法处理单像素探测器获得的不同掩模图像下的荧光信号强度，从而获取待测样品的三维结构荧光图像。
本发明在计算光谱重建的基础上，结合单光子雪崩二极管的宽响应带宽，入射光谱的信息可以被计算重建，利用了计算机的处理能力去替代光谱仪中分光元件的负荷，大大简化了系统的复杂度，而且将单光子雪崩二极管应用到荧光显微成像中，有利于促进单像素成像系统设备轻量化、便携化。最后，还可以根据需要，灵活组合不同维度的测量参量，有助于获取所需的生物体特定参量信息。因此，研究具有三维空间结构和光谱分辨的荧光寿命成像具有实用意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于工作在反向击穿电压下的SPAD作为单像素探测器的荧光多维显微成像方法，该方法可同时获取待测样品中荧光团的荧光光谱和荧光寿命，通过激发光束快速扫描的方式获取待测样品的三维结构荧光层析图像。
本发明是通过以下技术方案实现的：
该系统由三维荧光显微成像系统与荧光光谱及荧光寿命检测系统组成，其特征是：所述系统主要由激光器1；透镜2、3、12；扫描振镜4；扫描镜5、管镜6、；二向色镜7；复消色差显微物镜8；待测样品9；数字微镜阵列10；滤光片11；单光子雪崩二极管13；时间相关单光子计数器14；直流电压源15；计算机16组成。所述系统主要由激光器1；透镜2、3、12；扫描振镜4；扫描镜5、管镜6、；二向色镜7；复消色差显微物镜8；待测样品9；数字微镜阵列10；滤光片11；单光子雪崩二极管13；时间相关单光子计数器14；直流电压源15；计算机16组成。所述系统中激光器1发射激光光束经透镜2、3扩束准直后到达二维扫描振镜4，通过扫描镜5和管镜6耦合，经二向色镜7反射耦合进复消色差显微物镜8，实现聚焦激光光束在待测样品9上的高速高精度二维空间扫描。激光光束激发待测样品9内的荧光团产生的荧光信号经复消色差显微物镜8收集，经数字微镜阵列10反射，通过计算机控制数字微镜阵列10，依次写入观测矩阵图形，经数字微镜阵列10调制的荧光信号经滤光片11滤除环境杂光后由透镜12会聚在单光子雪崩二极管13上，采集对应于不同观测矩阵的光强信号。基于计算成像原理，通过对不同观测矩阵图形条件下单个探测器所记录得到的荧光信号强度进行关联运算处理，实现单像素二维成像。通过在z方向上的微位移，得到多个不同平面的二维荧光图像，将二维荧光图像叠加得到三维荧光图像。在同一观测矩阵图形条件下，通过计算机16控制直流电压源15的输出电压，实现对单光子雪崩二极管13反向偏置电压的快速调节，并记录不同电压下的荧光光子数量，通过计算的方式实现荧光光谱的重构，同时利用时间相关单光子计数的方法获取荧光寿命信息。
三维荧光显微成像包括两个的核心部件：数字微镜阵列10和单光子雪崩二极管13。由于单光子雪崩二极管13是一种单点探测器，不具有空间分辨能力，因此将数字微镜阵列10与单光子雪崩二极管13连接起来，通过计算机16依次写入观测矩阵图形控制数字微镜阵列10的状态，实现对荧光信号的调制，单光子雪崩光电二极管11采集一系列对应于观测矩阵图形的光强信号，基于计算成像原理，根据所采集的的光强信号与观测矩阵恢复出待测样品9的三维荧光图像。受压缩感知理论的启发，对于稀疏信号，可以使用更少的采样数据来实现重建，压缩感知的数学模型如下：
y＝Φx (1)
其中，y为采样信号，表示每次点扫描时单光子雪崩二极管13单位时间内所探测的光子数量，Φ为二维测量矩阵，对应于数字微镜阵列所编码的观测矩阵图形，x为原始图像，其中y、Φ均为已知条件，通过求解方程组(1)得到待测样品9的图像x。
单光子雪崩二极管13的光谱响应函数会随着施加在其上的反向击穿电压而改变，因此在计算光谱重构的基础上，结合宽光谱响应的单光子雪崩二极管13，可以计算重构入射光谱的信息。计算光谱重构分为三个步骤：首先，在进行光谱重构前需对单光子雪崩二极管13的光谱响应进行标定，利用一系列单色光F(λj)对单光子雪崩二极管13进行定标，通过逐点扫描偏置电压vi和波长λj获取单光子雪崩二极管13的光谱响应Ri(λj)，建立偏置电压与波长之间的映射关系，得到光谱响应矩阵；接着是荧光光谱检测过程，激发的荧光信号F(λ)照射于单像素探测器上时，记录下一系列对应于偏置电压的响应信号ci，得到测量矩阵；最后是重构过程，将测量矩阵代入光谱解算公式中，通过求解线性方程组得到荧光的光谱F(λ)：
其中，ci为测量矩阵，表示单位时间内单光子雪崩二极管所探测的荧光光子数量，F(λj)为荧光的光谱，Ri(λj)为预先标定的光谱响应矩阵。
通过激发光束的快速扫描获取来自待测样品9每一个像素点的荧光信号，由单光子雪崩二极管13采集后传输至时间相关单光子计数器14，时间相关单光子计数器14拥有很高的时间分辨率，可以捕捉很小的时间变化，通过对不同时刻到达的荧光光子进行统计并记录于相应的时间通道内，最后由计算机16对数据进行拟合处理得到待测样品9的荧光寿命曲线并输出荧光寿命图像。
附图说明
图1是基于单光子雪崩二极管的单像素荧光多维显微成像系统示意图。
附图标记说明：1-激光器；2-透镜；3-透镜；4-扫描振镜；5-扫描镜；6-管镜7-二向色镜；8-复消色差显微物镜；9-待测样品；10-数字微镜阵列；11-滤光片；12-透镜；13-单光子雪崩二极管；14-时间相关单光子计数器；15-直流电压源；16-计算机。
图2是单光子雪崩光电二极管IV特性曲线，通过组合一系列偏置电压与波长来编码光谱响应矩阵。
图3是单光子雪崩光电二极管的光谱响应标定系统示意图。
附图标记说明：1-宽谱光源；2-衰减片适配器；3-光栅单色仪；4-功率计。5-单光子雪崩二极管；6-稳压直流电源；7-时间相关单光子计数器。
图4是单光子雪崩光电二极管的光谱响应示意图。
图5是基于单光子雪崩二极管的荧光寿命成像原理示意图。
图6是基于单光子雪崩二极管的荧光多维显微成像的工作时序图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明，以令本领域的技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
请参阅图1，本实施例提供一种基于单光子雪崩二极管的荧光多维显微成像方法，该系统由三维荧光显微成像系统与荧光光谱及荧光寿命检测系统组成，其特征是：所述系统主要由激光器1；透镜2、3、12；扫描振镜4；扫描镜5、管镜6、；二向色镜7；复消色差显微物镜8；待测样品9；数字微镜阵列10；滤光片11；单光子雪崩二极管13；时间相关单光子计数器14；直流电压源15；计算机16组成。所述系统中激光器1发射激光光束经透镜2、3扩束准直后到达二维扫描振镜4，通过扫描镜5和管镜6耦合，经二向色镜7反射耦合进复消色差显微物镜8，实现聚焦激光光束在待测样品9上的高速高精度二维空间扫描。激光光束激发待测样品9内的荧光团产生的荧光信号经复消色差显微物镜8收集，经数字微镜阵列10反射，通过计算机控制数字微镜阵列10，依次写入观测矩阵图形，经数字微镜阵列10调制的荧光信号经滤光片11滤除环境杂光后由透镜12会聚在单光子雪崩二极管13上，采集对应于不同观测矩阵的光强信号。基于计算成像原理，通过对不同观测矩阵图形条件下单个探测器所记录得到的荧光信号强度进行关联运算处理，实现单像素二维成像。通过在z方向上的微位移，得到多个不同平面的二维荧光图像，将二维荧光图像叠加得到三维荧光图像。在同一观测矩阵图形条件下，通过计算机16控制直流电压源15的输出电压，实现对单光子雪崩二极管13反向偏置电压的快速调节，并记录不同电压下的荧光光子数量，通过计算的方式实现荧光光谱的重构，同时利用时间相关单光子计数的方法获取荧光寿命信息。
光子探测效率是单光子雪崩二极管13的一个重要参数，我们注意到，光子探测效率对偏置电压和波长表现出很强的依赖性，是因为硅材料对不同波长光的吸收存在差异，所以在不同偏置电压和入射波长调制下，单光子雪崩二极管表现出独特变化的光谱响应，使得单光子雪崩二极管13对光谱具有分辨的能力。因此，将光子探测效率作为单光子雪崩二极管13的光谱响应，通过组合不同入射波长和偏置电压可以得到大量数据来编码光谱响应矩阵R(λ)，光谱响应矩阵R(λ)反应的是波长与偏置电压的函数关系。实验中，一般来说，光子探测效率可描述为宏观上单位时间内检测的雪崩脉冲数量N1与照射于探测器单位面积的光子数量N2之比，表达式如下：
式中，N1为检测到的雪崩脉冲数量，定义为有光照时检测到雪崩脉冲数减去无光照时的暗计数，即光子激发的雪崩脉冲数量，也等效为单光子雪崩二极管13所探测到的光子数量。N2为照射单光子雪崩二极管13表面的光子总数，表示单位面积的光功率乘以探测器的感光面积再除以单个光子的能量：
其中，P为入射荧光的总功率值，S1为功率计探头的探测区面积，S2为单光子雪崩二极管感光面积，h为普朗克常数，ν为入射光频率，单个光子的能量为
将式(4)代入式(3)中，则式(3)可改写为：
由上式可知，光谱响应度与入射光波长有关，是因为硅材料对不同波长光的吸收存在差异，所以对单光子雪崩二极管13进行编码时，需要测试单光子雪崩二极管13对于不同入射波长的光谱响应度。
基于本发明所使用的单光子雪崩二极管13，光谱响应标定过程如下：首先，利用一系列单色光F(λj)对探测器进行定标，接着对偏置电压vi进行n步扫描，获得n个偏置电压上的响应信号Ri(λj)，以建立波长和电压之间的映射关系，得到光谱响应矩阵R(λ)，在标定过程中应最大限度地减少噪声的引入。
完成光谱响应矩阵R(λ)的标定后，可以进行入射光F(λ)检测时，由时间相关单光子计数器分别记录单光子雪崩二极管13产生的一系列对应于n个偏置电压下的响应信号ci，即光子数量，得到测量矩阵ci＝[c1,c2,…,cn]T。
由于入射光F(λ)与响应信号c之间存在由R决定的映射关系，因此将测量矩阵代入光谱解算公式中，通过矩阵求逆运算可从光谱响应矩阵R和测量矩阵c中近似地恢复出入射光的光谱F(λ)，光谱解算的过程描述如下：
该式子表征了单光子雪崩二极管13对一定波长范围内入射光响应的积分，其中，光子数ci为F(λj)Ri(λj)在波长范围内的积分，λ1和λ2定义了光谱测量的范围；F(λj)表示未知入射荧光的光谱；Ri(λj)为光谱响应矩阵，表示单光子雪崩二极管13在不同偏置电压下对波长的响应度，行为所设定的偏置电压数量，列为波长通道数。
积分形式可离散化表示为：
将式(7)简化为下式，通过矩阵求逆得到光谱F：
F＝c·R-1 (8)
式中，F为入射荧光的光谱，c为测量矩阵，每个元素对应不同偏置电压下单位时间内的光子计数率，R为光谱响应函数。若设置的偏置电压有n种情况，则有n组方程，等于未知数的数量，满足方程组有解的条件。一般来说，对光谱响应矩阵求逆再与测量矩阵相乘即可计算出入射荧光的光谱。
重构入射荧光的光谱F(λ)最常用的方法是将其分解成高斯基函数和常系数的线性组合，可表示为：
其中，F(λ)表示未知入射荧光的光谱，φj(λ)表示高斯基函数，αj表示常系数。高斯基函数表示如下：
其中，σ为高斯函数宽度的控制参数在这里，δd为高斯函数的半高全宽，λj为高斯函数的中心位置。
将公式(9)带入公式(6)中：
将式(11)简写为下式：
Aα＝b (12)
其中，Aij＝∫Ri(λ)φidλ，为n×m矩阵，b＝[c1,c2,…,cn]T为已知的测量矩阵，α＝[α1,α2,…,αm]T为对应于高斯基函数的常系数向量。
则问题转换为找到常系数向量α中每个元素的值，使得残差范数最小。然而在标定单光子雪崩二极管13的光谱响应时，探测器本身以及背景噪声的影响，都会给光谱响应矩阵R和测量矩阵c带来误差，因为R和c的测量误差使得方程组变得不适定，使用一般的非迭代方法求解这些方程组很容易崩溃，从而影响光谱重建的准确性，因此引入Tikhonov正则化算法来减少重构过程中噪声扰动的影响：
其中，αγ是使重建误差最小化的最优高斯基函数的系数，A为光谱响应矩阵，b为测量矩阵，L为单位矩阵，α为常系数向量，λ为正则化系数，可选择性地阻尼噪声信号。
在这里，可以使用广义交叉验证(Generalized Cross Validation,GCV)的方法自适应选择正则化系数λ：
其中，n是测量单位的总数，I是单位矩阵，Trace表示矩阵主对角线上所有元素之和。
荧光寿命检测系统中，来自待测样品9的荧光信号经透镜12聚焦后由单光子雪崩二极管13接收，单光子雪崩二极管13的外围淬灭电路将微弱的荧光信号转换成离散的电脉冲信号传输至时间相关单光子计数器14，时间相关单光子计数器14对离散的电脉冲信号进行上升沿检测并计数，同时记录下激光器1输出的定时参考信号，对不同时刻到达的荧光子数进行统计并记录于相应的时间通道内，最后由计算机16对采集的数据进行处理，对待测样品9的每一个像素点以时间-光子数作图，拟合获取荧光寿命曲线，形成荧光寿命图像。
综上所述，本发明利用单光子雪崩二极管、扫描振镜、数字微镜阵列、复消色差显微物镜实现了荧光多维显微成像，即三维空间、一维时间、一维光谱。该系统可以实现生物体三维显微成像，同时获取生物体的荧光光谱和荧光寿命，解决了目前荧光寿命显微成像系统中缺少光谱分辨的问题。
提供以上实例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改均应涵盖在本发明的范围内。
Claims (4)
1.本发明提供的是一种基于单光子雪崩二极管的单像素荧光多维显微成像方法。该系统由三维荧光显微成像系统与荧光光谱及荧光寿命检测系统组成，其特征是：所述系统主要由激光器1；透镜2、3、12；扫描振镜4；扫描镜5、管镜6、；二向色镜7；复消色差显微物镜8；待测样品9；数字微镜阵列10；滤光片11；单光子雪崩二极管13；时间相关单光子计数器14；直流电压源15；计算机16组成。所述系统中激光器1发射激光光束经透镜2、3扩束准直后到达二维扫描振镜4，通过扫描镜5和管镜6耦合，经二向色镜7反射耦合进复消色差显微物镜8，实现聚焦激光光束在待测样品9上的高速高精度二维空间扫描。激光光束激发待测样品9内的荧光团产生的荧光信号经复消色差显微物镜8收集，经数字微镜阵列10反射，通过计算机控制数字微镜阵列10，依次写入观测矩阵图形，经数字微镜阵列10调制的荧光信号经滤光片11滤除环境杂光后由透镜12会聚在单光子雪崩二极管13上，采集对应于不同观测矩阵的光强信号。基于计算成像原理，通过对不同观测矩阵图形条件下单个探测器所记录得到的荧光信号强度进行关联运算处理，实现单像素二维成像。通过在z方向上的微位移，得到多个不同平面的二维荧光图像，将二维荧光图像叠加得到三维荧光图像。在同一观测矩阵图形条件下，通过计算机16控制直流电压源15的输出电压，实现对单光子雪崩二极管13反向偏置电压的快速调节，并记录不同电压下的荧光光子数量，通过计算的方式实现荧光光谱的重构，同时利用时间相关单光子计数的方法获取荧光寿命信息。
2.根据权利要求书1所述的三维荧光显微成像系统，其特征是：扫描振镜2的x、y反射镜分别操控光束的偏转，光束经扫描镜5和管镜6耦合后，由二向色镜7反射耦合进入复消色差显微物镜8，聚焦激发待测样品9中的荧光团产生荧光信号，这些荧光信号经复消色差显微物镜8收集后到达数字微镜阵列10，由计算机16写入不断变化的观测矩阵图形来改变数字微镜阵列10的状态，实现对荧光信号的调制，透镜12将荧光汇聚后由单光子雪崩二极管13接收，实现点对点扫描的单像素荧光显微成像；通过在z方向进行层析扫描，获取不同位置的二维荧光图像，将多个不同平面的二维荧光图像叠加得到待测样品9的三维荧光图像。
3.根据权利要求书1所述的荧光光谱检测系统，其特征是：在进行光谱检测前，需对单光子雪崩二极管13的光谱响应进行定标，在完成光谱响应标定后，接下来即可进行光谱检测；在同一观测矩阵图形下，通过快速调节单光子雪崩二极管13的反向偏置电压并记录不同电压下的响应信号，由于荧光光谱与探测器的响应信号之间存在着由光谱响应决定的映射关系，因此可以通过求解逆向问题得到入射荧光光谱的信息。
4.根据权利要求书1所述的荧光寿命检测系统，其特征是：在同一观测图形下，来自待测样品9的荧光信号被后续的单光子雪崩二极管13接收，单光子雪崩二极管11的外围淬灭电路将微弱的荧光信号转换为离散脉冲电信号传输至时间相关单光子计数器14，时间相关单光子计数器14可以实现很高的时间分辨率，通过对离散脉冲电
信号进行上升沿检测并计数，记录下荧光光子数量与时间的分布信息，
获取荧光寿命信息。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310798494.1A CN117723515A (zh) | 2023-06-30 | 2023-06-30 | 基于单光子雪崩二极管的单像素荧光多维显微成像方法 |
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| CN117723515A true CN117723515A (zh) | 2024-03-19 |
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-
2023
- 2023-06-30 CN CN202310798494.1A patent/CN117723515A/zh active Pending
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