CN117720633B - 一种蜱的镇痛蛋白及其编码基因在镇痛中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，本发明提供了一种蜱的镇痛蛋白及其编码基因在镇痛中的应用，该镇痛蛋白为青海血蜱的镇痛蛋白rHq023，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明还提供了青海血蜱镇痛蛋白rHq023的编码基因Hq023，该Hq023基因包含编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.2。将该基因在大肠杆菌中进行表达，利用镍离子亲和层析树脂纯化获得了目标蛋白。将纯化的目标蛋白腹腔注射入小鼠体内，通过热模型评价该蛋白的镇痛效果，结果显示该镇痛蛋白给药剂量为2.5μg/kg时镇痛效果与吗啡相近，具有显著的中枢镇痛作用。该镇痛蛋白适用于研制镇痛制剂。

Description

一种蜱的镇痛蛋白及其编码基因在镇痛中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从青海血蜱cDNA文库中发现的具有镇痛作用的蛋白质和其编码基因。

背景技术

疼痛是生理情况下高阈值外周感觉神经元对组织损伤或损伤风险的一种必要的保护性反应，提醒身体有害刺激的存在，并产生必要的纠正反应。对于组织损伤和感染，疼痛过敏伴随着相关的炎症，并在炎症反应期间持续存在，通过避免使用受影响的身体部位来帮助愈合。疼痛的原因包括癌症、炎症或组织损伤，以及神经系统的损伤或病变。由于中枢神经系统的异常扩增状态，可能发生多种慢性的广泛性疼痛综合征。这些可通过痛觉系统的异常活动导致在没有刺激的情况下疼痛(自发疼痛)，对有害刺激的过度反应(痛觉过敏)以及由正常无害刺激引起的疼痛(异常性痛觉)。自发性疼痛的一个驱动因素是初级感觉神经元的异位活动。几种电压门控钠离子通道(Nav1.3、Nav 1.7和Nav 1.8)、钾离子通道(KCNQ)、钙离子通道(Cav 2.2)和超极化激活的环核苷酸调节通道(HCN)与感觉神经元的异位活性和膜兴奋性的调节有关，尤其是在外周神经损伤后。外周炎症可导致感觉神经元外周末端的伤害性转导离子通道功能亢进。这些参与膜兴奋性的传感器和离子通道的外周敏化导致痛觉感受器感觉神经元的激活阈值降低和高兴奋性。

急性和慢性疼痛很常见，疼痛也是患者寻求医疗护理的主要原因，但现有治疗疼痛的方法很有限。现有镇痛药包括非甾体抗炎药、胺再摄取抑制剂、抗癫痫药和阿片类药物，这些镇痛药具有不同的镇痛作用机制，但具有典型的低水平镇痛效果且伴有许多有害副作用。阿片类药物是最常用的药物，也是最有效的一类镇痛药，阿片受体介导的镇痛具有不同的药理特征。但是阿片类药物会产生耐受性、依赖性和便秘，并存在严重的滥用风险，高剂量用药导致严重的呼吸抑制甚至死亡。有限的疼痛治疗方式反映了开发新型镇痛药的迫切需求，新的镇痛药具有比现有镇痛药更好的疗效、更少的不良反应和更低的滥用风险。新型镇痛药物开发的主要难点是临床疼痛状况的异质性以及潜在病理生理机制的复杂性和多样性。

硬蜱是一种专性吸血的体外寄生虫，吸血周期可达数天至数周。为了获取宿主的血液，蜱在吸血过程中会通过唾液向其宿主体内分泌多种生物活性分子，这些生物活性分子具有抗炎、镇痛、抗凝及抑制免疫系统的作用。这些生物活性分子的结构变化多样，对宿主体内的靶作用分子具有较高的特异性和较强的亲和力。

发明内容

本发明新发现的青海血蜱rHq023蛋白，该蛋白通过抑制痛觉神经系统的敏感性，降低宿主对局部疼痛的感知，以帮助蜱成功吸血；该具有镇痛作用的蜱源蛋白能够抑制中枢神经系统的疼痛反应，可用于制备镇痛制剂。

本发明第一个方面公开一种蜱的镇痛蛋白，所述镇痛蛋白为青海血蜱的镇痛蛋白rHq023，其氨基酸序列为：

MREFMQHPWIILVICVLALQFLSTSSAQKLKSTGKGTEENRTLCVDSTECPSNKCCRHGDGNDTEPYCQLLALEKEVCQERDNNTVYYHNCPCGVGLKCVFEEKSGTIPGTPVLQSRGAKEVVKCGTCEKVDECR（SEQ IDNO.1）。

本发明的镇痛蛋白获自青海血蜱，命名为镇痛蛋白rHq023。

本发明除了保护上述镇痛蛋白rHq023，进一步地，本发明还应保护在上述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

以及经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的镇痛蛋白；或来源于青海血蜱且与镇痛蛋白rHq023具有98％以上同源性且与镇痛相关的蛋白质。

本发明第二个方面公开了编码上述蛋白质的核酸分子，其中编码镇痛蛋白rHq023的核苷酸序列为：

ggcctgtgggattcttttttcacaaacaaagaccagccctcttcccttgcagctctagccgtaactcccctgcccccttgaagcagagatccaactatcgtactggacgctgttaatttcctctagccgtaactcccctgcccttttgaagcagagctccaactatcgtactggacgctgttatttcagttcccaagaattcagccgtgtttgcaagacaatgcgcgaatttatgcagcacccatggataatcctcgtgatctgtgtacttgcgctgcagttcctttccacttcatctgcccaaaaattgaagagcacaggaaagggcacagaagaaaacagaacactctgcgttgactccaccgaatgtccctcaaataagtgctgccggcatggggatggtaatgatacggaaccctattgccaactcttggcactggaaaaggaagtatgccaagaacgtgataacaatactgtgtattaccacaattgcccatgtggcgtagggctgaagtgcgtttttgaagaaaaaagcggcacgatcccaggaacacctgtactgcaatctagaggagcaaaagaagttgtgaagtgtggaacatgcgagaaagtggacgaatgccgttaatattatgaattccaataacatatattcaaatgaatcgagttggcaaaagtgcctaatccgatatgctcctacaaccttcccttctaataaaagtgctcctcctcctcctattgagcgctcgtataaactttttattagaaaaaaaaaaaaaaaagaaaaaacaaaa（SEQ ID NO.2）。

上述核酸分子为青海血蜱的镇痛蛋白编码基因Hq023。本发明所公开的核苷酸序列属于首次公开，在现有技术的检索中未发现与其有相似性的同源序列。

在本发明中，本领域技术人员公知的是，由于蛋白质遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法（如PCR方法、突变方法）或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此，该部分核苷酸序列都应该包括在本发明保护范围内。

本发明利用本领域常用的报道基因与本发明的基因相连获得开放阅读框架。优选地，所述开放阅读框还包括启动子和/或增强子。

本发明第三个方面公开了一种包含上述青海血蜱镇痛蛋白编码基因Hq023的重组表达载体。

在本发明中，所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可以为重组表达载体。优选地，所述重组载体为重组表达载体。进一步优选地，所述重组表达载体选自重组原核表达载体中的任意一种。在本发明的一种优选的实施方式中，所述重组载体为将本发明提供的基因与原核表达载体pET30a连接构建得到的重组载体。

本发明第四个方面公开了一种包含上述重组表达载体的转基因细胞系。本发明还可以利用上述核酸分子构建重组质粒，在重组菌中进行表达。

在本发明中，所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞中获得。

在本发明中，所述重组菌可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株（如大肠杆菌感受态细胞DH5α）中而获得。

在本发明中，本发明对获得所述转基因细胞系或重组菌的方法没有特别的限定，可以为本领域常规的选择，例如，可以通过氯化钙法化学转化或高压电击转化。

本发明第五个方面公开了一种镇痛重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组表达质粒或重组质粒表达的。

本发明中的基因Hq023是从蜱的唾液腺cDNA文库中克隆得到的，基因序列长度为794bp, 基因序列含有一个长度为408bp（221位至628位）的开放阅读框架（ORF），编码的氨基酸序列长度为135aa，理论分子量为15.00kDa，等电点pI为6.12。将去掉信号肽后的编码序列与pET30a表达载体连接构建重组表达质粒，将质粒转化至大肠杆菌Rosetta（DE3），诱导表达获得重组蛋白rHq023。所表达的重组蛋白的羧基端引入了LEHHHHHH纯化标签，该重组蛋白含有117个氨基酸残基，理论分子量为13.1kDa, 等电点pI为6.51。以纯化的重组蛋白进行小鼠尾浸实验，证实蜱镇痛蛋白rHq023分子具有镇痛的生物活性，可用于制备镇痛制剂。

本发明第六个方面公开了上述镇痛蛋白的重组表达方法，包括以下步骤：

构建含青海血蜱镇痛蛋白rHq023编码基因序列的重组表达质粒；

将所述重组表达质粒转化至大肠杆菌中，经诱导表达获得rHq023镇痛重组蛋白。

本发明第七个方面公开了上述镇痛蛋白、核酸分子、重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或镇痛重组蛋白在制备镇痛药物中的应用，所述镇痛药物用于疼痛的治疗与缓解。

与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果：

本发明的青海血蜱镇痛蛋白rHq023，经重组表达后获得镇痛rHq023重组蛋白，将该蛋白腹腔注射入小鼠体内，通过热模型评价该蛋白的镇痛效果，结果显示该镇痛蛋白给药剂量为2.5 μg/kg时镇痛效果与吗啡相近。证实该重组蛋白具有显著的中枢镇痛的生物活性，非常适于制备镇痛生物制剂。

附图说明

图1为目标基因片段PCR扩增产物电泳图。

图2为重组表达质粒构建图谱。

图3为诱导表达的目标蛋白及其纯化产物SDS-PAGE电泳图，其中M.标准分子量蛋白marker；1. 重组菌裂解液；2.重组菌裂解液沉淀；3.重组菌裂解液上清；4.纯化的目标蛋白。

图4为本发明中小鼠尾浸实验柱状图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的蛋白编码基因的克隆。

（1）以从青海血蜱cDNA文库中所获阳性克隆Hq023作为PCR反应的模板，用上游引物：atcatatgcaaaaattgaagagcacagga（SEQ ID NO.3）和下游引物：tactcgagacggcattcgtccacttt（SEQ ID NO.4）扩增目的基因片段的去信号肽编码区，琼脂糖电泳显示扩增产物与理论值340bp相符，见附图1。

（2）切胶回收纯化步骤（1）的PCR扩增产物，将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T-easy载体（购于Promega公司），构建重组克隆质粒。

（3）用步骤（2）的质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α（购自上海唯地生物公司）,并提取重组克隆质粒。

实施例2

本实施例用于说明重组原核表达质粒的构建与表达。

（1）将实施例1步骤（3）获得的重组克隆质粒和原核表达载体pET30a（购于Novagen公司）分别利用限制性内切酶Nde I和Xho I进行酶切，获得目的基因插入片段和线性化载体。

（2）将步骤（1）所获插入片段和线性化载体用T4连接酶（购于Promega公司）连接，构建重组原核表达质粒pET30a-Hq023（见附图2），用所构建质粒转化感受态细胞DH5α,并提取重组表达质粒。

（3）将步骤（2）所提取的重组表达质粒送北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定，确认目的基因片段插入pET30a中。

（4）将步骤（3）经测序验证正确的重组表达质粒转化入大肠杆菌感受态细胞Rosetta（DE3）（购自上海唯地生物公司），经卡那霉素抗性筛选，挑取单克隆菌落，接种于LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中于37℃，200rpm振荡培养过夜，获得种子液。

（5）将步骤（4）所获种子液按1:100的比例接种于2×YT液体培养基中（含50μg/mL卡那霉素），在37℃，200rpm振荡培养至OD600大约为0.6-0.8。

（6）向步骤（5）经培养的培养液中加入IPTG，使IPTG的终浓度达到0.1mmol/L，于26℃，200rpm，诱导表达10小时。将菌液于4℃，6000g离心10min，弃上清，收集沉淀。

实施例3

本实施例用于说明重组蛋白的纯化。

（1）将实施例2步骤（6）所获重组菌沉淀充分重悬于结合缓冲液中（50 mmol/LTris，500mmol/L NaCl，20mmol/L 咪唑），用高压均质机裂解重组菌3轮至裂解液透亮。

（2）将步骤（1）所获重组菌裂解液于4℃，9400g离心30min，收集上清液，用0.45μm滤器过滤除去细胞碎片，滤液可直接上柱纯化。

（3）利用结合缓冲液平衡Ni-NTA Agarose蛋白纯化柱（购于Invitrogen公司），将步骤（2）经过过滤的细菌裂解液加到蛋白纯化柱上。

（4）用约10倍柱床体积的冲洗缓冲液（50mmol/L Tris，500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑）冲洗柱子至吸光值近本底且不再降低。

（5）用洗脱液（50mmol/L Tris，500mmol/L NaCl，200mmol/L 咪唑）洗脱柱子，收集目的蛋白。

（6）使用12%的SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测目的蛋白。结果如附图3所示。从附图3可以看出，重组菌株能够很好地表达目的蛋白，经纯化获得了高纯度的目的蛋白。

实施例4

本实施例用于说明本发明重组蛋白的镇痛功能验证。

（1）取C57BL/6J雄鼠置于圆柱形保持器中，其尾部自由悬挂在保持器外。将其尾部远端3 cm浸泡在55±0.5℃的水浴中，测量其缩尾时间即为延迟时间（Latency）。鼠能够在1- 3秒内将尾部从温水中提起被认为对热敏感，并被选择用于测试。尾浸时间不超过15s以避免对尾部的损伤。在给药前测量基础缩尾延迟时间。每只小鼠重复2次，以30 min间隔进行两次测量，计算的平均值为给药前延迟时间。基础缩尾延迟时间在1- 3秒内提起被认为对热敏感，并被选择用于入组实验。

（2）将体重为20g-30g的C57BL/6J小鼠32只随机分为4组，每组5只。将实施例3步骤（6）所获重组蛋白rHq023分别按1.5 μg/kg、2.5 μg/kg腹腔注射入第1组和第2组小鼠体内，将等体积蛋白保存缓冲溶液（50 mM Tris pH 7.5、500 mM NaCl）经腹腔注入第3组小鼠体内作为空白对照（CONTROL），向第4组小鼠腹腔内按2mg/kg注入吗啡（Marphine）作为阳性对照。

（3）在给药后的60分钟通过尾浸实验评价rHq023的镇痛作用。将小鼠尾巴浸泡在55±0.5℃的水浴中，缩尾时间（秒）即为延迟时间。任何小鼠被热刺激超过15秒仍无反应，则停止刺激，其延迟时间记录为15秒。从附图4可以看出，给药剂量为2.5 μg/kg 的重组蛋白可显著延长鼠尾在55±0.5℃水中的延迟时间，且其镇痛效果与给药量2 mg/kg的吗啡相似。

实施例1-4的结果表明，本发明提供的重组蛋白在镇痛方面具有良好的应用前景。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种蜱的镇痛蛋白，其特征在于，所述镇痛蛋白为青海血蜱的镇痛蛋白rHq023，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述镇痛蛋白rHq023的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸分子。

4.一种转基因细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的重组表达载体。

5.一种镇痛重组蛋白的表达方法，其特征在于，包含以下步骤：

构建含青海血蜱镇痛蛋白rHq023编码基因序列的重组表达质粒，所述青海血蜱镇痛蛋白rHq023编码基因序列是编码SEQ ID NO .1所示氨基酸序列的核苷酸序列；

将所述重组表达质粒转化至大肠杆菌中，经诱导表达获得rHq023镇痛重组蛋白。

6.如权利要求1所述镇痛蛋白、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述转基因细胞在制备镇痛制剂中的应用。