CN117701719A - 肿瘤靶向cldn18.2治疗耐药标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学诊断技术领域，公开了肿瘤靶向CLDN18.2治疗耐药标志物及其应用。本发明揭示了细胞外囊泡（EV）携带的CLDN18.2、PD1、PD‑L2表达及其衍生组合评分或模型作为肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效和耐药标志物的用途，能够划分有效人群、预测治疗效果、监测耐药发生，且对细胞治疗类药物和抗体类药物都具有明确的标志物潜力，有望推动靶向CLDN18.2治疗方案的伴随诊断手段的开发，为今后CLDN18.2靶向治疗药物的临床实践积累宝贵经验。

Description

肿瘤靶向CLDN18.2治疗耐药标志物及其应用
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，具体地说，涉及肿瘤靶向CLDN18.2治疗耐药标志物及其应用。
背景技术
晚期恶性肿瘤失去手术机会，药物治疗为关键手段，但治疗靶点缺乏是长期以来困扰着抗肿瘤精准治疗药物研发的问题。CLDN18.2是消化道肿瘤近年来最临床转化潜力的精准靶点。Claudin家族跨膜蛋白通过形成紧密连接而充当胞间保护屏障，并调节细胞层之间的渗透和极性，其中CLDN18基因能够通过可变剪接产生CLDN18.1和CLDN18.2两类亚型产物，前者主要表达于正常肺组织，而后者在肿瘤组织和正常组织中都有表达。正常组织中的CLDN18.2蛋白通常被掩盖于粘膜下，抗原表位隐藏,而在肿瘤发生后对紧密连接的破坏使得肿瘤细胞外翻，表达的CLDN18.2发生暴露，能够被靶向性药物所识别，使其成为理想的治疗靶点。患者队列分析发现CLDN18.2除了在胃癌组织中具有较普遍的高表达外（阳性表达率约30-50%），在胰腺癌、胆系肿瘤、食管癌、结直肠癌等消化道肿瘤组织中也具有较高的阳性表达率。目前在国内外有大量关于靶向CLDN18.2的临床试验正在开展，涉及单抗、双抗、ADC、细胞治疗等多种药物形式、覆盖一线到三线治疗。IMAB362（Zolbetuximab）是首个针对CLDN18.2开发的靶向性单克隆抗体药物，采用该药物的FAST研究奠定了CLDN18.2疗效和安全性的基调，而SOPTLIGHT和GLOW临床研究结果提示靶向CLDN18.2联合化疗能够实现胃癌患者PFS和OS双获益。此外，更多类型CLDN18.2靶向药物的临床研究也正在进行中（如靶向CLDN18.2的CAR-T细胞治疗药物CT041取得了迄今为止实体瘤中细胞治疗最高的有效率），势必将推动CLDN18.2成为肿瘤新的获批靶点。尽管靶向CLDN18.2在肿瘤治疗中的应用具有广阔的前景，但目前尚无针对靶向CLDN18.2疗法开发的疗效和耐药标志物。
发明内容
本发明的目的是提供肿瘤靶向CLDN18.2治疗耐药标志物及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种肿瘤靶向CLDN18.2治疗耐药标志物，所述标志物为细胞外囊泡（EV）表达的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子中的至少一种。
进一步地，所述标志物为细胞外囊泡表达的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子中的至少两种。
更进一步地，所述标志物为细胞外囊泡表达的CLDN18.2、PD1和PD-L2分子。
细胞外囊泡携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子（任一种分子或几种分子）高表达对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗有效率低、无进展生存期PFS短、总生存期OS短。
第二方面，本发明提供一种肿瘤靶向CLDN18.2治疗耐药标志物，所述标志物是基于细胞外囊泡携带的CLDN18.2、PD1和PD-L2三种分子中的任意一种、两种或全部的表达水平而建立的评分模型。
以一种代表性模型（CPP-score，评分包括-1/0/1/2）为例，CPP-score评分高对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗有效率低、无进展生存期PFS短、总生存期OS短。
第三方面，本发明提供用于检测细胞外囊泡表达的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子的生物制品在制备肿瘤靶向CLDN18.2治疗的疗效、敏感性和/或预后评价试剂中的应用。
其中，所述疗效包括治疗有效率、无进展生存期PFS、总生存期OS。
本发明所述细胞外囊泡为细胞释放的各种具有膜结构的微小囊泡结构统称（其中40-100nm粒径的成分称为外泌体，本发明的细胞外囊泡范围包括但不限于外泌体）。
本发明所述细胞外囊泡可以来自肿瘤患者体液及衍生物，包括全血、血浆、血清、腹水、胸水、尿液、粪便等。细胞外囊泡检测的定义包括直接对样本进行检测，或经过细胞外囊泡纯化分离后再进行检测。
本发明所述生物制品是能够从RNA（转录）或蛋白（翻译）水平上检测上述三种分子的物质，包括但不限于抗体、蛋白表达芯片、RNA表达芯片，以及借助于RNA测序、单细胞测序、质谱蛋白测序、qPCR、western blot、ELISA等手段来实现RNA和蛋白检测所使用的试剂和/或芯片。
进一步地，细胞外囊泡携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2表达水平可利用蛋白表达芯片（如EV expression array）、蛋白质谱、ELISA、Western Blot等手段检测上述三种分子的蛋白表达水平，或经RNA表达芯片、转录组RNA-sequencing、qPCR等手段检测上述三种分子的RNA表达水平。
进一步地，对细胞外囊泡携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2进行蛋白表达检测时使用的抗体包括以该三种分子为检测目标的任何类型及品牌的抗体。
本发明用于肿瘤靶向CLDN18.2治疗的药物包括但不限于靶向CLDN18.2的细胞治疗药物和/或靶向CLDN18.2的抗体类药物。例如，以CAR-T为代表的靶向CLDN18.2的细胞治疗药物，以单抗、双抗、抗体偶联药物（ADC）为代表的具有CLDN18.2靶向性的抗体类药物，以及涉及上述治疗药物的各种联合用药方案。
本发明所述肿瘤为适用于接受靶向CLDN18.2治疗的肿瘤，包括但不限于胃癌、胰腺癌、胆系肿瘤、食管癌、结直肠癌等），及其下细分的各个组织、病理、基因分子亚型。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明揭示了细胞外囊泡（EV）携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2表达及其衍生组合评分或模型作为肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效和耐药标志物的用途，能够划分有效人群、预测治疗效果、监测耐药发生，且对细胞治疗类药物和抗体类药物都具有明确的标志物潜力，有望推动靶向CLDN18.2治疗方案的伴随诊断手段的开发，为今后CLDN18.2靶向治疗药物的临床实践积累宝贵经验。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中应用免疫胶体金电镜技术对血来源细胞外囊泡膜蛋白表达特异性进行的鉴定。
图2为本发明较佳实施例中从细胞外囊泡（EV）携带的多种分子中筛选出EV-CLDN18.2、EV-PD1、EV-PD-L2的原理和结果示意图。
图3为本发明较佳实施例中细胞外囊泡（EV）携带的CLDN18.2分子表达作为肿瘤靶向CLDN18.2的细胞治疗或抗体治疗方案标志物的鉴定。
图4为本发明较佳实施例中细胞外囊泡（EV）携带的PD1分子表达作为肿瘤靶向CLDN18.2的细胞治疗或抗体治疗方案标志物的鉴定。
图5为本发明较佳实施例中细胞外囊泡（EV）携带的PD-L2分子表达作为肿瘤靶向CLDN18.2的细胞治疗或抗体治疗方案标志物的鉴定。
图6为本发明较佳实施例中基于细胞外囊泡（EV）携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子表达而建立的模型CPP-score作为肿瘤靶向CLDN18.2的细胞治疗或抗体治疗方案标志物的鉴定。
图7为本发明较佳实施例中基于细胞外囊泡（EV）携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子表达，将EV-CLDN18.2、EV-PD1、EV-PD-L2、CPP-score和组织水平CLDN18.2表达对靶向CLDN18.2治疗疗效相关的response、PFS、OS等各个指标的预测能力进行比较。
具体实施方式
本发明提供细胞外囊泡（EV）携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2表达及其衍生组合评分或模型作为肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案标志物的用途。
本发明以细胞外囊泡（Extracellular Vesicle，EV）携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2表达及其衍生组合的评分或模型作为疗效和耐药标志物用于指导治疗肿瘤疾病的靶向CLDN18.2药物（包括细胞治疗类和抗体治疗类药物）相关的临床和科研决策的用途。具体涉及：1. 细胞外囊泡携带的CLDN18.2表达作为肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效和耐药标志物的用途。2. 细胞外囊泡携带的PD1表达作为肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效和耐药标志物的用途。3. 细胞外囊泡携带的PD-L2表达作为肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效和耐药标志物的用途。4. 基于细胞外囊泡携带的CLDN18.2/PD1/PD-L2三者表达水平而建立的任意评分或模型作为肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效和耐药标志物的用途。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供细胞外囊泡携带的CLDN18.2表达作为伴随诊断指标，用于判断肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效（包括有效率、无进展生存期PFS、总生存期OS）、以便指导临床和科研决策的用途，如图2所示，EV-CLDN18.2高表达对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗有效率低、无进展生存期PFS短、总生存期OS短。
本发明提供细胞外囊泡携带的PD1表达作为伴随诊断指标，用于判断肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效（包括有效率、无进展生存期PFS、总生存期OS）、以便指导临床和科研的用途，如图3所示，EV-PD1高表达对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗有效率低、无进展生存期PFS短、总生存期OS短。
本发明提供细胞外囊泡携带的PD-L2表达水平作为伴随诊断指标，用于判断肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效（包括有效率、无进展生存期PFS、总生存期OS）, 以便指导临床和科研决策的用途，如图4所示，EV-PD-L2高表达对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗有效率高、无进展生存期PFS长、总生存期OS长。
本发明提供基于细胞外囊泡携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2其中一个或多个的表达水平作为参数而建立的任意评分或模型作为伴随诊断指标，用于判断肿瘤靶向CLDN18.2治疗方案疗效（包括有效率、无进展生存期PFS、总生存期OS），以便指导临床和科研决策的用途，如图5所示。以一种代表性模型（CPP-score，评分包括-1/0/1/2）为例，CPP-score评分高对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗有效率低、无进展生存期PFS短、总生存期OS短。
进一步地，细胞外囊泡的定义为细胞释放的各种具有膜结构的微小囊泡结构统称（其中40-100nm粒径的成分俗称外泌体，本发明申请的细胞外囊泡范围包括但不限于外泌体）。
进一步地，细胞外囊泡来源的定义为患者体液及衍生物，包括全血、血浆、血清、腹水、胸水、尿液、粪便等。细胞外囊泡检测的定义包括直接对样本进行检测，或经过细胞外囊泡纯化分离后再进行检测。
进一步地，细胞外囊泡携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2表达的定义指经过蛋白表达芯片（如EV expression array）、蛋白质谱、ELISA、Western Blot等手段所检测到的上述三种分子的蛋白表达水平，或经RNA表达芯片、转录组RNA-sequencing、qPCR等手段所检测到的上述三种分子的RNA表达水平。
进一步地，对细胞外囊泡携带的CLDN18.2、PD1、PD-L2进行蛋白表达检测时使用的抗体包括以该三种分子为检测目标的任何类型及品牌的抗体。
进一步地，肿瘤疾病的定义为适用于接受靶向CLDN18.2治疗的肿瘤类型（包括但不限于胃癌、胰腺癌、胆系肿瘤、食管癌、结直肠癌等），及其下细分的各个组织、病理、基因分子亚型。
进一步地，靶向CLDN18.2治疗的定义为：以CAR-T为代表的靶向CLDN18.2的细胞治疗药物，以单抗、双抗、抗体偶联药物（ADC）为代表的具有CLDN18.2靶向性的抗体类药物，以及涉及上述治疗药物的各种联合用药方案。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 应用免疫胶体金电镜技术对血来源细胞外囊泡膜蛋白进行鉴定
从在北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科接受治疗的肿瘤患者（包括胃癌、胰腺癌、胆系肿瘤、食管癌、结直肠癌等类型）中挑选出接受靶向CLDN18.2的细胞治疗（包括CT041CAR-T细胞治疗药物）或抗体类治疗（包括单抗、双抗、ADC）的患者。对上述患者队列进行血液样本采集，进行细胞外囊泡分子表达检测，结果如图1所示。具体步骤如下：
（1）细胞外囊泡的制备
抽取患者外周血并离心分离血浆，将1mL的血浆在2500~3500g条件下离心10min后收集上清，得到初次上清液；然后将初次上清液在9500~11000g条件下离心30min，收集上清液，得到二次上清液；再将二次上清液在100000g离心条件下70min，去除上清后，得到沉淀物；向沉淀物中加入1mL PBS（磷酸盐缓冲溶液）洗涤溶解沉淀，得到处理沉淀；再将处理沉淀在100000g条件下离心70min，去除上清液后得到二次沉淀物；最后向二次沉淀物中加入50-100μL的磷酸盐缓冲溶液使其溶解，得到细胞外囊泡溶液。
（2）免疫胶体金电镜实验
将细胞外囊泡溶液与4%（w/v）多聚甲醛（PFA）按1:1体积比混合，得到混合液；取20μL混合液滴在干净的塑料膜上，将电镜碳网的正面扣在混合液上，放置20min；将电镜碳网放置于100μL PBS液滴上，洗两次，每次3 min，得到初处理碳网；将初处理碳网放置于100μL浓度为50 mM的甘氨酸液滴上，3 min，重复3次后得到二次处理碳网；封闭，将二次处理碳网放置于100μL浓度为5% BSA封闭液上，封闭10 min，得到封闭碳网；一抗用稀释液（浓度为1%的BSA）进行稀释，稀释比例为1:20（体积比），封闭碳网放置于20μL一抗液滴上孵育2h后得到一抗碳网；将一抗碳网置于100μL浓度为0.1%的BSA液滴上，洗6次，每次3 min，得到洗涤碳网；将标记有胶体金颗粒的二抗用稀释液进行稀释，稀释液为浓度为1%的BSA，稀释比例为1:20（体积比），将洗涤碳网置于20μL二抗液滴上孵育1h后得到二抗碳网；将二抗碳网置于100μL浓度为0.5%的BSA液滴上，洗6次，每次3min得到二次洗涤碳网；将二次洗涤碳网置于100μL PBS液滴上，洗6次，每次2 min，得到三次洗涤碳网；将三次洗涤碳网置于100μL浓度为1%的戊二醛液滴上，放置2 min，后得到三次处理碳网；将三次处理碳网置于100μL去离子水液滴上，洗6次，每次2 min，得到四次处理碳网；将四次处理碳网置于10μL醋酸双氧铀负染90s，得到五次处理碳网；五次处理碳网室温干燥30min后得到检测碳网，利用透射电子显微镜对检测碳网进行上机检测。
免疫胶体金电镜实验使用的抗体厂家和货号如表1所示，结果如图1所示。透射电镜结果可见细胞外囊泡呈现典型的椭球状特征，粒径大小分布在100nm左右，典型的细胞外囊泡标志物蛋白CD81和CD9定位于细胞外囊泡的膜上，CLDN18.2、PD1、PDL2也定位于细胞外囊泡的膜上，而阴性对照兔IgG或鼠IgG无法与外泌体结合，提示CLDN18.2、PD1、PD-L2蛋白能够在细胞外囊泡上表达并被抗体特异性探测到。
表1
实施例2 蛋白表达抗体芯片检测患者血浆细胞外囊泡分子表达
具体步骤如下：
（1）蛋白表达抗体芯片的制备
本发明使用多种分子的抗体制作芯片，具体列表和抗体货号见表2。将特异性的细胞外囊泡捕获抗体分别溶解在含有5%甘油的PBS中，最终浓度为200-400μg/ml，得到不同种类的抗体溶剂。阴性对照为PBS溶液。使用自动点样仪按照一定排列方式将不同种类的上述抗体溶剂点制到包被玻片上，该包被玻片为德国SCHOTT公司NEXTERION环氧基包被玻片，每个抗体溶剂点设置3个重复，得到蛋白表达抗体芯片，每张芯片可点制16个阵列。将抗体芯片置于2-8℃环境中保存备用。
（2）蛋白表达抗体芯片检测血浆细胞外囊泡分子表达的工作原理和cutoff值
使用蛋白表达抗体芯片检测血浆细胞外囊泡中上述多个蛋白的表达水平。每例患者分别取10μL血浆，利用样品稀释液PBS稀释至100μL，得到反应液。取出抗体芯片，向抗体芯片上的每个孔中加入100μL封闭液，该封闭液为浓度为3%的BSA，室温孵育30 min后抽去每孔中的封闭液，得到处理芯片。取100μL准备好的反应液，将反应液加入到处理芯片上的每个孔中，室温孵育60 min后得到反应芯片。抽去反应芯片上每个孔中的液体，加入检测抗体Anti-CD9-Biotin和Anti-CD81-Biotin，室温孵育1h后得到待测芯片。抽去待测芯片上每个孔中的液体，然后向每个孔中加入100μL的Cy3-Streptavidin，避光室温孵育30min后得到检测芯片。将检测芯片干燥，利用激光扫描仪，例如Axon GenePix，采用激发频率532nm的通道扫描信号，用GenePix软件来读取抗体芯片的荧光值，从而获得每个蛋白表达的绝对定量矩阵。
随后采用细胞外囊泡经典生物标志物（例如CD9, CD63, CD81, Alix）等的表达值作为内参进行标准化，获得每个蛋白表达的相对定量矩阵，作为真实的表达值。我们采用136例消化道肿瘤患者的外周血标本，对其进行了细胞外囊泡蛋白panel的检测，随后选择每个蛋白表达值的中位数，作为确定高低的cutoff值，高于该cutoff为高表达，低于该cutoff为低表达。中位数的具体数值见表2。
实施例3 蛋白表达抗体芯片检测患者血浆细胞外囊泡CLDN18.2、PD1、PD-L2分子表达
（1）蛋白表达抗体芯片检测靶向CLDN18.2患者血浆细胞外囊泡分子表达
从在北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科接受治疗的肿瘤患者（来自实施例2中的136例消化道肿瘤患者，包括胃癌、胰腺癌、胆系肿瘤、食管癌、结直肠癌等类型）中挑选出接受靶向CLDN18.2的细胞治疗（包括CT041 CAR-T细胞治疗药物）的患者31例，或接受靶向CLDN18.2的抗体类治疗（包括单抗、双抗、ADC）的患者34例。针对31例接受靶向CLDN18.2的CAR-T细胞治疗药物的患者，以及34例接受靶向CLDN18.2的抗体类药物治疗的患者，采集治疗从基线到进展的动态血标本。靶向CLDN18.2治疗的方式包括：靶向CLDN18.2的CAR-T细胞治疗药物，靶向CLDN18.2的单抗药物，靶向CLDN18.2的双抗药物，靶向CLDN18.2的ADC药物，以及上述治疗药物与其他任意治疗方案或药物的联合。对其进行多个细胞外囊泡蛋白表达的芯片检测，获得表达矩阵，并使用前述建立的cutoff判断高低。需要说明的是，由于靶向CLDN18.2的CAR-T细胞治疗和抗体治疗是国际研究的最前沿，此处采用的31例CAR-T细胞治疗患者和34例抗体类治疗患者是目前同类靶向CLDN18.2研究中最大的队列。
（2）筛选获得细胞外囊泡水平CLDN18.2、PD1、PD-L2表达作为靶向CLDN18.2治疗的标志物
针对31例接受靶向CLDN18.2的CAR-T细胞治疗药物的患者，逐一判断各个细胞外囊泡分子表达水平与治疗应答（response）、无进展生存（PFS）和总生存（OS）的相关性。最终发现所有分子中，只有CLDN18.2、PD1表达同步满足nonresponder高表达率/responder高表达率>1.7、PFS/OS相关Hazard ratio>1.7，且PD-L2表达同步满足nonresponder高表达率/responder高表达率<0.3、PFS/OS相关Hazard ratio<0.3，提示CLDN18.2和PD1为较差疗效相关分子、PD-L2为较好疗效相关分子。因此选择这三个分子作为标志物。通过将三个分子任意一者的高表达记为1、低表达记为0，采用如下公式进行打分：CPP-score=（EV-CLDN18.2高表达）+（EV-PD1高表达）-（EV-PD-L2高表达）。建立的CPP-score相比任意EV单分子以及组织水平的CLDN18.2表达具有更好的疗效和耐药预测作用。随后，针对34例接受靶向CLDN18.2的抗体类药物治疗的患者，直接采用CLDN18.2、PD1、PD-L2和CPP-score进行检测判断。最终获得的结果如图2-图7所示。
图2是采用response、PFS、OS信息对各个细胞外囊泡分子表达水平与疗效的相关性进行鉴定，最终获得CLDN18.2、PD1、PD-L2的示意图。
图3是结合患者细胞外囊泡分子表达检测数据和临床疗效数据开展的综合分析结果，结果表明细胞外囊泡携带的CLDN18.2（EV-CLDN18.2）高表达对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗（包括细胞治疗和抗体治疗）有效率低、无进展生存期PFS短、总生存期OS短，EV-CLDN18.2是肿瘤靶向CLDN18.2治疗的不利因素。
图4是结合患者细胞外囊泡分子表达检测数据和临床疗效数据开展的综合分析结果，结果表明细胞外囊泡携带的PD1（EV-PD1）高表达对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗（包括细胞治疗和抗体治疗）有效率低、无进展生存期PFS短、总生存期OS短，EV-PD1是肿瘤靶向CLDN18.2治疗的不利因素。
图5是结合患者细胞外囊泡分子表达检测数据和临床疗效数据开展的综合分析结果，结果表明细胞外囊泡携带的PD-L2（EV-PD-L2）高表达对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗（包括细胞治疗和抗体治疗）有效率高、无进展生存期PFS长、总生存期OS长，EV-PD-L2是肿瘤靶向CLDN18.2治疗的不利因素。
图6是将EV-CLDN18.2、EV-PD1、EV-PD-L2三种细胞外囊泡分子表达拟合成为模型开展的综合分析结果。为提高细胞外囊泡分子表达作为靶向CLDN18.2治疗疗效标志物的效价，将EV-CLDN18.2、EV-PD1、EV-PD-L2三种细胞外囊泡分子表达拟合成为模型。通过将三个分子任意一者的高表达记为1、低表达记为0，采用如下公式进行打分：
CPP-score=（EV-CLDN18.2高表达）+（EV-PD1高表达）-（EV-PD-L2高表达）
为每一例获得细胞外囊泡来源的CPP-score（评分包括-1/0/1/2）。CPP-score评分高对应肿瘤靶向CLDN18.2治疗（包括细胞治疗和抗体治疗）有效率低、无进展生存期PFS短、总生存期OS短，CPP-score是肿瘤靶向CLDN18.2治疗的不利因素，且作为标志物的效果优于EV-CLDN18.2、EV-PD1和EV-PD-L2。
图7是将EV-CLDN18.2、EV-PD1、EV-PD-L2、CPP-score和组织水平CLDN18.2表达对靶向CLDN18.2治疗疗效相关的response、PFS、OS各个指标区分后进行的ROC分析（包括敏感度（Sensitivity）、特异性（Specificity）、曲线下面积（AUC）），建立的CPP-score相比任意EV单分子以及组织水平的CLDN18.2表达具有更好的疗效和耐药预测作用。
表2
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.肿瘤靶向CLDN18.2治疗耐药标志物，其特征在于，所述标志物为细胞外囊泡表达的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物为细胞外囊泡表达的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子中的至少两种。
3.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物为细胞外囊泡表达的CLDN18.2、PD1和PD-L2分子。
4.肿瘤靶向CLDN18.2治疗耐药标志物，其特征在于，所述标志物是基于细胞外囊泡携带的CLDN18.2、PD1和PD-L2三种分子中的任意一种、两种或全部的表达水平而建立的评分模型。
5.用于检测细胞外囊泡表达的CLDN18.2、PD1、PD-L2分子的生物制品在制备肿瘤靶向CLDN18.2治疗的疗效、敏感性和/或预后评价试剂中的应用；
其中，所述疗效包括治疗有效率、无进展生存期、总生存期。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡为细胞释放的所有具有膜结构的微小囊泡，包括外泌体。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡来自肿瘤患者体液及衍生物，包括全血、血浆、血清、腹水、胸水、尿液、粪便。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物制品是能够从RNA或蛋白水平上检测上述三种分子的物质，包括抗体、蛋白表达芯片、RNA表达芯片，以及借助于RNA测序、单细胞测序、质谱蛋白测序、qPCR、western blot、ELISA来实现RNA和蛋白检测所使用的试剂和/或芯片。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，用于肿瘤靶向CLDN18.2治疗的药物包括靶向CLDN18.2的细胞治疗药物和/或靶向CLDN18.2的抗体类药物。
10.根据权利要求5-9任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为适用于接受靶向CLDN18.2治疗的肿瘤，包括胃癌、胰腺癌、胆系肿瘤、食管癌、结直肠癌。
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