CN117701573A - 核酸突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及基因工程技术领域，具体地，涉及核酸突变体及其应用。该核酸突变体与野生型相比，所述核酸具有选自下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A。通过检测这些突变体在生物样品中是否存在，可以有效检测生物样本是否患有常染色体隐性非综合征型耳聋。

Description

核酸突变体及其应用

技术领域

本申请涉及基因工程技术领域，具体地，涉及核酸突变体及其应用。更具体地，涉及一种核酸、蛋白质及其在制备试剂盒中的用途、用于筛选患患耳聋的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞、生物模型在筛选药物中的用途、用于治疗耳聋的药物。

背景技术

在现代医学领域，耳聋(Hearing Loss,HL)是一种十分常见且严重的感官功能障碍，其发病原因多种多样，其中相当一部分患者的耳聋与遗传因素密切相关。通过基因检测手段深入研究耳聋的分子机制，努力寻求降低耳聋发病率的方法，这不仅为产前基因诊断和干预措施提供了有效依据，也为耳聋的预防和治疗提供了根本途径。

遗传性耳聋可以根据患者是否伴有其他临床症状分为综合征型耳聋(SyndromicHearing Loss,SHL)和非综合征型耳聋(Non-Syndromic Hearing Loss,NSHL)。其中，非综合征型耳聋占据了先天性遗传性耳聋的绝大多数，其中又有相当比例的病例为常染色体隐性遗传(Autosomal Recessive,AR)。PTPRQ基因位于染色体12的q21.31区域，包含着47个外显子。PTPRQ基因的突变与常染色体隐性遗传非综合型耳聋(Autosomal Recessive Non-Syndromic Hearing Loss,ARNSHL)有关，患者的临床症状主要表现为耳聋、前庭异常以及语言发育滞后。

然而，不同的致病基因导致的非综合征型耳聋在发病年龄、听力损失程度、病情进展等方面表现出显著差异。因此，准确确定导致耳聋的致病基因对于为患者选择合适的听力干预手段至关重要，这不仅能够提高治疗的有效性，还能够显著提升患者的生活质量。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选患有耳聋的生物样品的手段。

在基因组学领域，全外显子测序(Whole-Exome Sequencing，WES)被广泛应用于基因变异的鉴定。外显子是人类基因组中蛋白质编码的区域，尽管它只占据整个基因组的约1％，但却包含了约85％的致病突变。通过序列捕获技术，外显子DNA能够被有效捕获和富集。与全基因组测序相比，全外显子测序更加经济高效，被广泛用于研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的突变。

基于上述技术发展，发明人针对自行收集的一例耳聋Trio家系(包括父母和患者)，运用全外显子测序、家系分析以及Sanger测序验证的方法进行了致病变异检测。同时，利用公共数据库提供的外显子数据，更好地解释所得突变与疾病的关系。

在研究中，发明人成功确定了一个新的致病突变位点——PTPRQ基因的c.1069delC突变。此外，该突变与患者另一条染色体上同一基因的c.5942+1G>A突变构成了复合杂合(in trans)，共同导致了常染色体隐性非综合征型耳聋的发病。

需要说明的是，本申请中所涉及的c.1069delC是指野生型PTPRQ基因编码区8号外显子第1069位C碱基发生缺失；c.5942+1G>A是指野生型PTPRQ基因编码区36号外显子第5942位后第一个碱基G突变为A。

在本申请的第一方面，本申请提出了一种核酸。根据本申请的实施例，与野生型相比，所述核酸具有选自下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A。发明人意外发现，一条染色体PTPRQ基因的c.1069delC突变与另一条染色体上PTPRQ基因的c.5942+1G>A突变导致了常染色体隐性非综合征型耳聋的发生。根据本申请的实施例，可通过检测这些突变体在生物样品中是否存在，可以有效检测生物样本是否患有常染色体隐性非综合征型耳聋。

在本申请的第二方面，本申请提出了一种蛋白质。根据本申请的实施例，所述蛋白质由本申请第一方面所述的核酸编码。发明人意外发现，一个位于染色体上的PTPRQ基因的c.1069delC突变与另一染色体上PTPRQ基因的c.5942+1G>A突变共同引起了一种常染色体隐性非综合征型耳聋。通过检测生物样本中PTPRQ基因蛋白的表达情况，可以有效判定该生物样本是否患有耳聋。

在本申请的第三方面，本申请提出了一种检测第一方面所述核酸或第二方面所述蛋白质的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本申请的实施例，所述试剂用于诊断耳聋。根据本申请的实施例，所述试剂能有有效的筛选患有耳聋的生物样品，进而用于制备筛选患有耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品的试剂盒。

在本申请的第四方面，本申请提出了一种用于筛选患耳聋的生物样品的试剂盒。根据本申请的实施例，所述试剂盒包括：适于检测PTPRQ基因突变体的至少一种的试剂。其中，与野生型PTPRQ基因相比，所述突变体具有下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A。根据本申请的实施例，所述试剂盒用于筛选患有耳聋的生物样品，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋。

在本申请的第五方面，本申请提出了一种构建体。根据本申请的实施例，所述构建体包含本申请第一方面所述的核酸。根据本申请的实施例，本申请的构建体与野生型PTPRQ基因相比，该核酸具有下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A或同时包含上述任意基因突变体的核酸序列。由此，本申请的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作耳聋性疾病，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋相关研究的模型。

在本申请的第六方面，本申请提出了一种重组细胞。根据本申请的实施例，所述重组细胞是通过本申请第五方面所述的构建体转化受体细胞获得的。根据本申请的实施例，该重组细胞能够有效的用作耳聋性疾病，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋相关研究的模型。

在本申请的第七方面，本申请提出了一种生物模型在筛选药物中的用途。根据本申请的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)第一方面所述的核酸；(2)表达第二方面所述的蛋白质；(3)第五方面所述的构建体；(4)第六方面所述的重组细胞。

需要说明的是，“生物模型携带第一方面所述的核酸”表示，本申请明的生物模型携带与野生型PTPRQ基因相比具有具有下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A或同时包含上述任意基因突变体的核酸序列；“生物模型携带第二方面所述的蛋白质”表示，本申请的生物模型携带与野生型PTPRQ基因相比具有具有下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A的突变体所表达的蛋白质或者同时包含上述各种基因突变的基因所表达的蛋白质。根据本申请的实施例，该生物模型能够有效的用作耳聋性疾病，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋相关研究的模型。

在本申请的第八方面，本申请提出了一种用于治疗耳聋的药物。根据本申请的实施例，所述药物包括：特异性改变本申请第一方面所述的核酸的试剂。

需要说明的是，所称的“特异性改变”是指能使得突变的核酸或突变的蛋白质恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。根据本申请实施例的药物能特异性预防或治疗耳聋性疾病，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋性疾病。

需要说明的是，在本文中针对不同方面所描述的特征和技术效果是可以互相借鉴的，在此不再赘述。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本申请的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本申请实施例的隐性遗传非综合型耳聋Trio家系示意图；其中，该家系包含3名成员，女儿为耳聋患者(即家系图中的II-1)，父母为正常人(即家系图中的I-1、I-2)，实心图标为患者，箭头所指为先证者；

图2为根据本申请实施例的患者家系中患者的听力检测结果示意图；其中，横坐标表示听力的频率，纵坐标表示听力级别；

图3和图4为根据本申请实施例的患者家系中所有家系成员的PTPRQ基因的c.1069delC突变和c.5942+1G>A突变代表性Sanger测序验证峰示意图；其中，患者为PTPRQc.1069delC突变和c.5942+1G>A突变的复合杂合携带者，患者的父亲携带c.1069delC突变，患者的母亲携带c.5942+1G>A突变。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本申请中，除非另有说明，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本申请中，所称的参考序列(reference，ref)，也即染色体参考序列，为已确定的序列，可以是自己预先测定组装的DNA和/或RNA序列，也可以是他人测定公开的DNA和/或RNA序列，可以是预先获得的样本来源个体/目标个体所属生物类别中的任意的参考模板，例如，同一生物类别的已公开的基因组组装序列的全部或者至少一部分。若样本来源个体或者目标个体是人类，其基因组参考序列(也称为参考基因组或者参考染色体组)可选择UCSC、NCBI或ENSEMBL数据库提供的人类参考基因组，例如HG19、HG38、GRCh36、GRCh37、GRCh38等，本领域技术人员可以通过数据库的说明了解上述各参考基因组版本的对应关系，选择使用的版本。进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如在进行比对前，先依据目标个体的性别、人种、地域等因素选择或测定组装出更接近或更具某方面特性的序列来作为参考序列，有助于后续获得更准确的序列分析结果。在本申请的实施例中，待测样本来自于人体，参考序列为人参考基因组或者为人常染色体组。

在本申请中，所使用的野生型PTPRQ基因序列位置是以人类基因组中野生型PTPRQ基因的序列为准，但当该野生型RAD50基因存在于其他物种中时，该序列可能会有差异，可通过将该物种的野生型PTPRQ基因与人野生型PTPRQ基因进行比对获得该物种的野生型PTPRQ基因中所对应的位置。在本申请中，发明人发现了导致常染色体隐性耳聋的新致病突变位点，即PTPRQ基因的突变。该突变位点可以用于对常染色体隐性耳聋患者进行分子诊断，也可以用于与相关疾病(如遗传性听力损失疾病或药物引起的耳聋)进行鉴别诊断。这种基因检测方法快速、准确、高效、简便，具有较高的早期诊断率。

核酸

在本申请的一方面，本申请提出了一种核酸。根据本申请的实施例，与野生型PTPRQ基因相比，所述核酸具有选自下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A。

需要说明的是，本申请的核酸编码PTPRQ突变体，也可以称为“编码PTPRQ突变体的核酸”，即该核酸可以理解为与编码PTPRQ突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与PTPRQ的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本申请的一个具体示例，前面所述的编码PTPRQ突变体的核酸为DNA。

根据本申请的实施例，发明人成功确定了一个新的致病突变位点——PTPRQ基因的c.1069delC突变。此外，该突变与患者另一条染色体上同一基因的c.5942+1G>A突变构成了复合杂合(in trans)，共同导致了常染色体隐性非综合征型耳聋的发病。通过检测这些突变在生物样品中是否存在，可以有效检测生物样本是否患有常染色体隐性非综合征型耳聋。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:1～SEQID NO:2，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

在本申请中，发明人首次发现PTPRQ基因具有c.1069delC和c.5942+1G>A突变会导致患者患常染色体隐性非综合征型耳聋。

需要说明的是，上述野生型PTPRQ基因的DNA序列(例如内含子序列、外显子序列等)、RNA序列、编码蛋白信息等有关该野生型PTPRQ基因的信息均在NCBI数据库中有收录，可以从如下网址获得：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/374462。

根据本申请的具体实施例，c.1069delC突变是指在野生型PTPRQ基因8号外显子第1069位的碱基缺失，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。其中，加粗部分为引物序列，标下划线的加粗碱基位点为缺失位点。

根据本申请的具体实施例，c.5942+1G>A突变是指在野生型PTPRQ基因36号外显子+1的位置碱基由G变为A。具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。其中，加粗部分为引物序列，标下划线的加粗碱基位点为突变位点。

aaaggcatagcacattttacattattgatttattataattttctgactttaatctacacttctttcagaattagctgtccactctgactcacaatgcatttaacacaatctctattgcagGTTACTTAGTTATAGAAAATCCATCAAgtaagtttgttaaatattttctttcttctttttgaatatcaaagttagatgcactgactcagtagaaccttaatgtgtgattcactttttgtatgtttgttggaaaaacctccaagctggatataaatcataaaagcatgactaattgcatggtaactggagaaatgctttctctctctctggggtgaagcctgcatgtctgtattttagcttgggaagtaatacggggatatttaaactccttggggtttgaaaacc(SEQ ID NO:2)。

蛋白质

在本申请的另一方面，本申请提出了一种蛋白质。根据本申请的实施例，所述蛋白质由前述核酸编码。在本申请的一些示例中，通过检测该蛋白质，也可对样品PTPRQ基因是否发生复合杂合突变。

试剂在制备试剂盒中的用途

在本申请的另一方面，本申请提出了一种检测前面所述核酸或前面所述基因突变或前面所述蛋白质的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本申请的实施例，所述试剂用于诊断耳聋。

根据本申请的实施例，所述试剂包括特异性针对PTPRQ基因突变体或者表达PTPRQ基因突变蛋白质的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。在本申请的一些示例中，该试剂能特异性、高灵敏性地筛选出前面所述的核酸或前面所述的蛋白质，进而特异性、高灵敏性地筛选出患耳聋的生物样品，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品的试剂盒的制备。

根据本申请的具体实施例，所述引物具有如SEQ ID NO:3～6所示的核苷酸序列。其中，PTPRQ基因c.1069delC突变上游引物序列如SEQ ID NO:3所示；PTPRQ基因c.1069delC突变下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；PTPRQ基因c.5942+1G>A突变上游引物序列如SEQID NO:5所示；PTPRQ基因c.5942+1G>A突变下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

TGATATCAGTGCACTACTAAGC(SEQ ID NO:3)；

CATTCCCTATGTTCTTACCATC(SEQ ID NO:4)；

AAAGGCATAGCACATTTTACATT(SEQ ID NO:5)；

GGTTTTCAAACCCCAAGGAG(SEQ ID NO:6)。

根据本申请的具体实施例，所述耳聋为非综合征型耳聋。

根据本申请的具体实施例，所述非综合征型耳聋包括常染色体隐性非综合征型耳聋。

根据本发明的具体实施例，所述蛋白质的编码基因，c.1069delC突变与所述野生型PTPRQ基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质具有下列类型突变：氨基酸序列357位的谷氨酰胺(Gln，缩写D)突变成精氨酸(Arg，缩写R)，且6位的缬氨酸(Val，缩写V)突变为终止密码子(Ter，缩写*号)。则可以确认生物体患常染色体隐性非综合征型耳聋。

用于筛选患耳聋的生物样品的试剂盒

在本申请的另一方面，本申请提出了一种用于筛选患耳聋的生物样品的试剂盒。根据本申请的实施例，该试剂盒包括：适于检测PTPRQ基因突变体的至少一种的试剂；其中，与野生型PTPRQ基因相比，所述突变体具有下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A。利用所述试剂盒，能够有效地筛选患耳聋的生物样品。该检测结果为常染色体隐性耳聋的早期诊断、鉴别诊断以及药物治疗提供了科学依据。

在本文中，所使用的术语“适于检测PTPRQ基因突变体的至少一种的试剂”应做广义理解，即可以是检测PTPRQ突变体编码基因的至少一种的试剂，也可以是检测PTPRQ蛋白突变体的至少一种的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。

根据本申请的一个实施例，所述试剂包括特异性针对PTPRQ基因突变体或者表达PTPRQ基因突变蛋白质的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。由此，可以高效地筛选患常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品。

根据本申请的具体实施例，所述引物具有如SEQ ID NO:3～6所示的核苷酸序列。其中，PTPRQ基因c.1069delC突变上游引物序列如SEQ ID NO:3所示；PTPRQ基因c.1069delC突变下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；PTPRQ基因c.5942+1G>A突变上游引物序列如SEQID NO:5所示；PTPRQ基因c.5942+1G>A突变下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

TGATATCAGTGCACTACTAAGC(SEQ ID NO:3)；

CATTCCCTATGTTCTTACCATC(SEQ ID NO:4)；

AAAGGCATAGCACATTTTACATT(SEQ ID NO:5)；

GGTTTTCAAACCCCAAGGAG(SEQ ID NO:6)。

根据本申请的具体实施例，所述耳聋为非综合征型耳聋。

根据本申请的具体实施例，所述非综合征型耳聋包括常染色体隐性非综合征型耳聋。

根据本申请的具体实施例，与野生型相比，所述突变体具有c.1069delC和c.5942+1G>A突变，所述耳聋为常染色体隐性非综合征型耳聋。发明人发现，PTPRQ基因发生上述突变，可以确认生物体患常染色体隐性非综合征型耳聋。

在本申请的一个示例中，利用该试剂盒检测常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的具体步骤包括：提取待测样品的DNA。对前述DNA进行扩增，纯化。将获得的纯化产物上机测序。通过观察测序所得到的序列是否具有c.1069delC突变和c.5942+1G>A突变，能够有效地检测PTPRQ基因突变体在待测样品DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测样品是否患常染色体隐性非综合型耳聋。

在本申请中所述提取DNA的方法、PCR扩增反应均为实验室常用技术，本申请不作具体限定。此外，产物纯化步骤所用试剂盒为商用试剂盒，可购自OMEGA或其他公司。

根据本申请的实施例，可以用于测序的方法和设备并不受特别限制。在本申请的一些示例中，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。在一些具体示例中，可以利用选自BGIseq500、Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

构建体及重组细胞

在本申请的另一方面，本申请还提出了一种构建体。根据本申请的实施例，该构建体包含前面所述的核酸。

由本申请的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本申请的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本申请的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

在本申请的又一方面，本申请还提出了一种重组细胞。根据本申请的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。

需要说明的是，本申请的筛选患耳聋生物样品的方法及试剂盒，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。

生物模型在筛选药物中的用途

在本申请的又一方面，本申请提出了一种生物模型在筛选药物中的用途。根据本申请的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)第一方面所述的核酸；(2)表达第二方面所述的蛋白质；(3)第五方面所述的构建体；(4)第六方面所述的重组细胞。

根据本发明的具体实施例，所述生物模型为细胞模型或者动物模型。

用于治疗耳聋的药物

在本申请的再一方面，本申请提出了一种用于治疗耳聋的药物。根据本申请的实施例，所述药物包括：特异性改变前述核酸的试剂。

根据本申请的具体实施例，所述试剂为基于基因编辑或核酸合成方法的试剂。

根据本申请的具体实施例，所述药物进一步包括：药学上可接受的载体或辅料。

需要说明的是“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相溶的任何和所有溶剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐溶液、葡萄糖等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：确定常染色体隐性耳聋致病突变

1、样本收集

发明人搜集到一个中国汉族耳聋患者Trio家系(父母+先证者(女儿))，其家系图见图1。如图1所示，该家系包含3名成员，女儿为表现为耳聋(即家系图中的II-1)、父母为正常人(即家系图中的I-1、I-2)。其中，实心图标为患者，箭头所指为先证者。

该家系中患者的听力结果见图2。在图2中，横坐标表示听力的频率，纵坐标表示听力级别，如果听力正常，阈值曲线应该是在0附近浮动。如图2所示，听力图提示患者II-1双耳极重度耳聋。

发明人收集该家系内所有成员的外周血样本，加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。所有血液样本均已签属知情同意书。

2、DNA提取

取上述家系所有成员的外周血，分别利用QIAmp Blood kit(Qiagen,Hilden,Germany)抽提外周血白细胞的基因组DNA，并利用Qubit Fluorometer和琼脂糖凝胶电泳测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于50ng/μl，总量不少于3μg。

3、捕获测序

利用Agilent等液相捕获系统，结合Illumina Hiseq 2500的高通量测序技术，对所有家系成员的样本进行测序。捕获范围包括全基因组外显子区域(约占全基因组1％)，捕获区域总长可达50M，测序数据量10-12Gb，100×有效测序深度。主要步骤包括打断、文库制备和上机测序。

测序数据下机后，使用内部定制流程进行突变检测、注释以及数据库比对，根据人群频率、软件预测结果、家系分析等手段，确定候选致病位点。

结果显示，在患者的PTPRQ基因上发现2个杂合突变，分别为c.1069delC和c.5942+1G>A。家系分析显示，患者的父亲携带c.1069delC突变，患者的母亲携带c.5942+1G>A突变，提示2个突变为复合杂合。

若c.1069delC突变和c.5942+1G>A突变经Sanger验证为真阳性，则基本可确认该突变为患者的耳聋致病原因。

实施例2：Sanger法测序验证

本实施例分别对实施例1中所述的常染色体隐性非综合型耳聋患者家系中的所有家系成员(包括患者和听力正常的父母)的PTPRQ基因进行检测：针对PTPRQ基因c.1069delC和c.5942+1G>A突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，基于序列检测结果确定属于突变型还是野生型，验证PTPRQ基因的c.1069delC和c.5942+1G>A突变是否在样本中检出。

具体步骤如下所示：

1、DNA提取

按照实施例1所述的DNA提取方法，提取受试者外周静脉血中的基因组DNA备用。

2、引物设计及PCR反应

参考人类基因组参考序列GRCh37/hg19，针对PTPRQ基因的c.1069delC和c.5942+1G>A突变设计特异性引物，序列如下：

PTPRQ c.1069delC上游引物(Primer-F)：TGATATCAGTGCACTACTAAGC；

PTPRQ c.1069delC下游引物(Primer-R)：CATTCCCTATGTTCTTACCATC；

PTPRQ c.5942+1G>A上游引物(Primer-F)：AAAGGCATAGCACATTTTACATT；

PTPRQ c.5942+1G>A下游引物(Primer-R)：GGTTTTCAAACCCCAAGGAG。

然后，按照表1配制各DNA样本的PCR反应体系以及表2反应程序进行PCR反应。

表1：反应体系(20μl)

试剂名称	单个反应标准量(μL)
		ddH2O	12.8
10×Buffer	2.0
		dNTP(2.5mM)	2.0
Primer-F(10pmol)	1.0
		Primer-R(10pmol)	1.0
Taq酶(5U/q)	0.2
		DNA模板	1.0
Total	20.0

；

表2：PCR反应程序

由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、Sanger测序

将步骤2得到的PCR产物经纯化后，直接进行DNA测序，测序使用ABI3730XL型测序仪进行正反向测序。

基于测序结果，如图3～4所示，在所示的患者Trio家系中，患者携带PTPRQ基因c.1069delC突变和c.5942+1G>A突变，听力正常的父亲携带c.1069delC突变，听力正常的母亲携带c.5942+1G>A突变，提示2个突变为复合杂合。

结合以上信息，可以确认PTPRQ基因的c.1069delC突变和c.5942+1G>A突变是导致患者II-1耳聋的致病原因。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (14)

1.一种核酸，其特征在于，

与野生型PTPRQ基因相比，所述核酸具有选自下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸为DNA。

3.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质由权利要求1或2所述的核酸编码。

4.检测权利要求1或2所述的核酸或权利要求3所述的蛋白质的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于诊断耳聋。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂包括特异性针对PTPRQ基因突变体或者表达PTPRQ基因突变蛋白质的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一；

任选地，所述引物具有如SEQ ID NO:3～6所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述耳聋为非综合征型耳聋；

优选地，所述非综合征型耳聋包括常染色体隐性非综合征型耳聋。

7.一种用于筛选患耳聋的生物样品的试剂盒，其特征在于，包括：

适于检测PTPRQ基因突变体的至少一种的试剂；

其中，与野生型PTPRQ基因相比，所述突变体具有下列突变：c.1069delC和c.5942+1G>A。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括特异性针对PTPRQ基因突变体或者表达PTPRQ基因突变蛋白质的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一；

任选地，所述引物具有如SEQ ID NO:3～6所示的核苷酸序列。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述耳聋为非综合征型耳聋；

优选地，所述非综合征型耳聋包括常染色体隐性非综合征型耳聋；

任选地，与野生型相比，所述突变体具有c.1069delC和c.5942+1G>A突变，所述耳聋为常染色体隐性非综合征型耳聋。

10.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸。

11.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求10所述的构建体转化受体细胞获得的。

12.生物模型在筛选药物中的用途，所述生物模型携带下列至少之一：

(1)权利要求1或2所述的核酸；

(2)表达权利要求3所述的蛋白质；

(3)权利要求10所述的构建体；

(4)权利要求11所述的重组细胞；

任选地，所述生物模型为细胞模型或者动物模型。

13.一种用于治疗耳聋的药物，所述药物包括：

特异性改变权利要求1或2所述的核酸的试剂。

14.根据权利要求13所述的药物，其特征在于，所述试剂为基于基因编辑或核酸合成方法的试剂；

任选地，所述药物进一步包括：药学上可接受的载体或辅料。