CN117700517A - 具有更强液-液相分离能力及活性的p53变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有更强液‑液相分离能力及活性的p53变体及其用途。与野生型p53相比,此新型p53变体具有以下优点:1)更强的液‑液相分离能力;2)在肿瘤细胞中对p53靶基因CDKN1A等具有更强的转录激活能力;3)对多种肿瘤细胞有更为显著的杀伤效果。并且此新型p53变体可通过调控FGFR3实现肿瘤杀伤功能,本发明证明了提高液‑液相分离能力能够增强p53转录激活活性以及诱导肿瘤细胞凋亡的功能,对于改进基于p53的基因/蛋白疗法具有重要意义,而且此发明公开的新型p53变体基因及蛋白是具有临床应用前景的肿瘤杀伤药物,同时LLPSE‑p53重组蛋白与FGFR抑制剂TAS‑120以及Wnt信号通路抑制剂IWR‑1联合使用能够增强其肿瘤杀伤效果,对于癌症治疗具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种液-液相分离能力增强的p53变体及其杀伤肿瘤细胞的应用。
背景技术
转录因子p53是细胞内最为重要的肿瘤抑制因子,它在50%以上的癌细胞中发生突变失去活性,在其余的癌细胞中p53的活性或下游信号通路被抑制。p53作为“基因组保镖”通过响应细胞内外应激条件,进而转录激活其下游靶基因CDKN1A、PUMA、BAX等诱导DNA损伤修复、细胞周期停滞或细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞增殖。所以在癌细胞中恢复/提高p53活性是目前抑制癌细胞增殖的一种策略。
在癌细胞中恢复/提高p53活性的方法包括:1)抑制野生型p53降解;2)抑制突变型p53蛋白活性;3)转入p53 cDNA 的基因疗法。其中唯一一种已经获得临床批准的疗法是基因疗法。一项利用重组缺陷型腺病毒递送野生型p53用于治疗头颈癌的基因疗法(Gendicine)已经在中国得到临床批准。其它递送野生型p53的基因疗法如ONYX-015仍在临床实验中。p53基因疗法联合免疫检查点抑制剂(PD-1/PD-L1抗体)治疗实体瘤的方法已进入临床二期实验。虽然基因疗法直接递送野生型p53被证明是能够杀死癌细胞的,但是由于野生型p53的不稳定性以及癌细胞中已经存在的具有获得性功能(Gain-of-function)的突变体p53会导致野生型p53不能够有效地发挥功能,从而使得治疗效果有限。因此,亟需开发具有更强肿瘤抑制效果的p53变体来提高p53基因疗法的有效性。
发明内容
针对上述现存的问题,本发明的目的是提供具有更强液-液相分离能力及活性的p53变体及其用途。
具有更强液-液相分离能力的p53变体,在p53序列的一端添加富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列,在细胞水平和体外比野生型p53具有更强的液-液相分离能力,具有更强的转录激活活性;所述的富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列的通式为Hx(G/S/P/A/T)y(R/K)z,其中H:为组氨酸;(G/S/P/A/T):为由甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸之一或多个组成的序列;(R/K)为精氨酸或赖氨酸,其中x,y,z 是相应氨基酸的个数, x,z=0-20,y=0-100, x+z>5。
所述的富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列与野生型p53序列的一端之间进一步具有间隔(linker)序列。
所述的p53具有转录激活活性,DNA序列如SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2所示。
所述的p53具有转录激活活性,包括人和非人的物种。
所述的p53变体DNA序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
所述的p53变体,能够激活CDKN1A靶基因的转录,提高CDKN1A、MDM2、PUMA、NOXA以及RRM2B中的一个或者多个的下游靶基因的转录水平。
所述p53变体在制备肿瘤治疗药物中的用途,适用的肿瘤种类包括非小细胞肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤以及人脑瘤;所述的药物包括核酸水平和蛋白水平起到活性作用的药物。
所述的p53变体的重组蛋白表达体系包括大肠杆菌表达宿主、动物细胞以及酵母蛋白表达系统;原核表达载体包括pET24A,pET28A(+);真核生物表达载体包括:1)pEGFP、pEYFP、pmcherry、pRFP、pECFP、pLenti、pLX、pCMV6、pCMV3、pcDNA3以及pcDNA6B动物细胞表达载体;2)昆虫细胞表达载体包括pAc5.1-EGFP等;3)酵母表达载体包括pPIC3以及pPIC9。
所述的p53变体的蛋白质形式包括全长形式,和保留功能的突变形式。
所述的p53变体介导肿瘤细胞凋亡的靶标分子包括FGFR3,用于治疗FGFR3表达量高的肿瘤。
所述的肿瘤治疗药物为p53变体与FGFR抑制剂TAS-120以及Wnt信号通路抑制剂IWR-1联合使用的药物,或者制备的复合药物,用于提高在较低蛋白浓度时增强其杀伤肿瘤细胞的能力。
所述的药物的形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、口服液体剂型、颗粒剂、软膏剂。
本发明具有的技术效果为:
(1)本申请创新性设计的LLPSE-p53(p53变体)在细胞内和细胞外的液-液相分离效果更强。
(2)本申请明确了液-液相分离能力更强的p53变体促进了p53靶基因CDKN1A等的转录激活。
(3)本申请证明了LLPSE-p53对多种肿瘤细胞均有显著杀伤效果,说明其有很好的肿瘤治疗的临床应用潜力,创新性的从相分离角度揭示了p53抑制肿瘤细胞增殖的机理。
(4)本申请证明了低浓度LLPSE-p53蛋白与药物联合使用能够提高其肿瘤杀伤效果,为其应用于肿瘤临床治疗提供了新的思路和基础。
附图说明
图1是WT-p53和p53 C末端加EGFP标签之后(EGFP-p53)的重组蛋白在体外相分离能力对比显微镜图像。
图2是WT-p53和p53 C末端加EYFP标签之后(YFP-p53)的质粒转染人非小细胞肺癌细胞系H1299后,对CDKN1A转录的检测结果。
图3是WT-p53和LLPSE-p53在人肾上皮细胞系HEK293T中的形态共聚焦图像。
图4是WT-p53和LLPSE-p53在人非小细胞肺癌细胞系H1299中的形态共聚焦图像。
图5是WT-p53(NMR)和LLPSE-p53(NMR)在人非小细胞肺癌细胞系H1299中的形态共聚焦图像。
图6是WT-p53和LLPSE-p53在人肾上皮细胞系HEK293T对p53下游靶基因mRNA水平调控的qRT-PCR检测结果图。
图7是WT-p53和LLPSE-p53在人非小细胞肺癌细胞系H1299对p53下游靶基因mRNA水平调控的qRT-PCR检测结果图。
图8是WT-p53和LLPSE-p53质粒转染人非小细胞肺癌细胞系H1299后,对CDKN1A转录激活的检测结果。
图9是WT-p53和LLPSE-p53质粒转染人非小细胞肺癌细胞系H1299后,ATP法检测细胞活力结果图。
图10是WT-p53和LLPSE-p53质粒转染人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y后,ATP法检测细胞活力结果图。
图11是WT-p53及LLPSE-p53质粒转染人骨肉瘤细胞系U-2OS后,ATP法检测细胞活力结果图。
图12是WT-p53与LLPSE-p53重组蛋白体在体外相分离显微镜图像。
图13是WT-p53与LLPSE-p53重组蛋白体转导人非小细胞肺癌细胞系H1299 72 h后,ATP法检测细胞活力结果图。
图14是WT-p53与LLPSE-p53重组蛋白体转导人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y 72 h后,ATP法检测细胞活力结果图。
图15是WT-p53与LLPSE-p53重组蛋白体转导人乳腺癌细胞系SKBR3 72 h后,ATP法检测细胞活力结果图。
图16是WT-p53与LLPSE-p53重组蛋白体转导人骨肉瘤细胞系U-2OS 72 h后,CCK8法检测细胞活力结果图。
图17是WT-p53与LLPSE-p53重组蛋白体转导人脑瘤细胞系SF126 72 h后,CCK8法检测细胞活力结果图。
图18是分别敲低对照组(Vector)和FGFR3之后分别过表达WT-p53以及LLPSE-p53,72h后,ATP法检测细胞活力结果图。
图19是人骨肉瘤细胞系U-2OS分别递送WT-p53和LLPSE-p53蛋白之后,加入DMSO(对照)、TAS-120以及IWR-1继续培养24 后,CCK8法检测细胞活力结果图。
具体实施方式
以下将结合具体的实施例对本发明的设计、方法以及产生的技术效果进行阐明。本发明包括但不限于以下所公开的代表性实施例,还可通过多种方式进行阐述。说明书旨在帮助本领域技术人员综合理解本发明实施细节。
在DNA序列方面,SEQ ID NO.1是人源具有正常功能的突变p53,SEQ ID NO.2是人源野生型p53;SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的p53是人源p53,SEQ ID NO.6中的p53是银白长臂猿中p53,SEQ ID NO.7中的p53是大鼠中的p53,SEQ ID NO.8中的p53是裸鼹鼠中的p53。
本发明中,SEQ ID NO.3添加的氨基酸序列(包括linker)是:
GTGGGGSGGGGSGGGGSHHHHHHGGRRRRRRRRR
SEQ ID NO.4添加的氨基酸序列(包括linker)是:
GGGGSHHHHHGGTGGRRRRRRR
SEQ ID NO.5添加的氨基酸序列(包括linker)是:GTGGGGSGGGGSGGGGSHHHHHHHGSGGRRRRRRRRRR
SEQ ID NO.6添加的氨基酸序列(包括linker)是:
GGGGGHHHHHHHGGSPGGTGGKKKKKK
SEQ ID NO7添加的氨基酸序列(包括linker)是:GGASGHHHHHHHHGGAGGGGRRRRRRKK
SEQ ID NO.8添加的氨基酸序列(包括linker)是:GGGSGGGSGGGSHHHHGGGDPRRRRRRRRRRRR。
实施例1 WT-p53与EGFP-p53重组蛋白体外相分离能力对比
由于标签蛋白能够影响蛋白质的结构,为检测是否只要加入标签就可以促进液-液相分离,我们将EGFP作为标签加在p53的C末端,然后对比了不带荧光标签蛋白的WT-p53和EGFP-p53重组蛋白在体外液-液相分离能力。实验结果显示,在相同条件下,与不带荧光标签的WT-p53相比,当WT-p53已经发生液-液相分离时,EGFP-p53还未形成明显的液滴状结构,说明EGFP标签对p53蛋白的液-液相分离有明显的抑制作用(图1)。
实施步骤:
1. 将两种目的基因克隆至pET-24a(+)原核表达载体中,转化至C41表达菌株,37℃恒温培养箱培养过夜。
2. 挑取单克隆,37 ℃,220 rpm,培养至OD600=0.6;
3. 加入200-500 μM IPTG,100 µM ZnCl2,25 ℃,220 rpm培养过夜;
4. 4500 rpm,4 ℃离心30 min;
5. 加入细胞裂解液,高压破碎,17000 rpm,4 ℃离心30 min;
6. 取上清液进行HisTrap HP介质纯化;
7. 将洗脱液进行HiTrap Heparin HP介质纯化;
8. 最后进行Gel filtration进一步纯化;
9. 配制相分离体系,在荧光倒置显微镜拍照,对比两者相分离能力。
结果显示,在相同条件下,WT-p53已经形成明显的液滴状结构,而EGFP-p53没有形成明显液滴结构,说明标签蛋白EGFP不但不会促进反而会抑制p53蛋白液-液相分离。
实施例2 YFP-p53与WT-p53转录激活活性对比
为了考察是否在p53末端添加任何标签都会改变p53的转录激活活性,我们在野生型p53的C末端添加了YFP标签,构建pCMV3-YFP-p53真核表达载体,将pCMV3-YFP-p53与pCMV3-p53转入细胞中,并检测两者对CDKN1A转录激活能力的影响。实验结果表明,与WT-p53相比,YFP-p53对CDKN1A的转录激活能力有降低趋势(图2)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种适量细胞,细胞密度达60-70%时将上述质粒与CDKN1A荧光素报告基因质粒共转,放入培养箱继续培养24h;
2. 按照Promega生产的双荧光素酶报告系统检测试剂盒与M5酶标仪进行化学发光检测;
3. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,与WT-p53相比,YFP-p53对CDKN1A转录激活活性偏弱,说明加入YFP标签不但不会促进,反而会抑制野生型p53的转录激活活性。
实施例3 在人肾上皮细胞系HEK293T细胞中WT-p53、LLPSE-p53(SEQ ID NO.3)液-液相分离能力细胞水平对比
为验证本发明设计的p53变体LLPSE-p53相分离能力优于WT-p53,我们构建了pEGFP-p53和pEGFP-LLPSE-p53真核表达载体,通过向真核细胞人胚胎肾细胞HEK293T转染以及免疫荧光技术检测两者在细胞中形成液滴的数量和大小。
实施步骤:
1. 转染前一天,在35 mm共聚焦皿中接种6-8×10^5个HEK293T细胞,加入2 ml完全培养基;
2. 细胞密度到达60-70%后,每孔转染2-2.5 µg质粒,37 ℃,5% CO2恒温培养箱继续培养24h;
3. 吸弃1 ml完全培养基,加入1 ml的4%多聚甲醛,室温固定10 min;
4. 吸弃全部上清液,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
5. 加入0.2%的TritonX-100室温通透15 min;
6. 吸弃全部上清液,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
7. 加入1 ml的5% BSA室温封闭1 h;
8. 加入稀释后的p53(DO-1)一抗(稀释比例1:1000),置于水平摇床上,4 ℃孵育过夜;
9. 回收一抗,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
10. 加入稀释后的免疫荧光二抗(稀释比例1:1000),室温避光孵育1 h;
11. 吸弃二抗,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
12. 运用共聚焦显微镜进行拍照检测,不同样品拍摄参数一致。
实验结果表明,与WT-p53相比,LLPSE-p53在HEK293T细胞中形成的液滴结构体积更大、数量更多(图3)。
实施例4在非小细胞肺癌细胞系H1299中WT-p53、LLPSE-p53(SEQ ID NO.4)液-液相分离对比
为进一步验证本发明设计的p53变体LLPSE-p53相分离能力优于WT-p53,我们构建了pCMV6-p53和pCMV6-LLPSE-p53真核表达载体,向人非小细胞肺癌细胞系H1299转染上述质粒后,利用免疫荧光技术检测两者在细胞中形成液滴的数量和大小。
实施步骤:
1. 转染前一天,在35 mm共聚焦皿中接种6-8×10^5个H1299细胞,加入2 ml完全培养基;
2. 细胞密度到达60-70%后,每个皿转染2-2.5 μg质粒,37 ℃,5% CO2恒温培养箱继续培养24h;
3. 吸弃1 ml完全培养基,加入1 ml的4%多聚甲醛,室温固定10 min;
4. 吸弃全部上清液,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
5. 加入0.2%的TritonX-100室温通透15 min;
6. 吸弃全部上清液,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
7. 加入1 ml的5% BSA室温封闭1 h;
8. 加入稀释后的p53一抗(稀释比例1:1000),置于水平摇床上,4 ℃ 孵育过夜;
9. 回收一抗,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
10. 加入稀释后的免疫荧光二抗(稀释比例1:1000),室温避光孵育1 h;
11. 吸弃二抗,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
12. 运用共聚焦显微镜进行拍照检测,不同样品拍摄参数一致。
实验结果表明,与WT-p53相比,LLPSE-p53在H1299细胞中形成的液滴更大、更多(图4)。
实施例5在非小细胞肺癌细胞系H1299中WT- p53(裸鼹鼠)与LLPSE-p53(裸鼹鼠,SEQ ID NO.8)液-液相分离能力比较
为验证我们构建的p53相分离能力增强的序列是否也能适用于其它物种的p53,我们将相分离增强的序列片段添加至裸鼹鼠的p53基因(NMR-p53)中,并构建了pCMV6- p53(NMR)和pCMV6-LLPSE- p53(NMR)真核表达载体,并转染入人非小细胞肺癌细胞系H1299中,利用共聚焦显微镜拍照对比两者在细胞中形成的液滴结构的数量和大小。
实施步骤:
1. 转染前一天,在35 mm共聚焦皿中接种6-8×10^5个H1299细胞,加入2 ml完全培养基;
2. 细胞密度到达60-70%后,每个皿转染2-2.5 μg质粒,37 ℃,5% CO2恒温培养箱继续培养24h;
3. 吸弃1 ml完全培养基,加入1 ml的4%多聚甲醛,室温固定10 min;
4. 吸弃全部上清液,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
5. 加入0.2%的TritonX-100室温通透15 min;
6. 吸弃全部上清液,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
7. 加入1 ml的5% BSA室温封闭1 h;
8. 加入稀释后的p53一抗(稀释比例1:1000),置于水平摇床上,4 ℃ 孵育过夜;
9. 回收一抗,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
10. 加入稀释后的免疫荧光二抗(稀释比例1:1000),室温避光孵育1 h;
11. 吸弃二抗,加入1 ml PBS漂洗3次,每次5 min;
12. 运用共聚焦显微镜进行拍照检测,不同样品拍摄参数一致。
实验结果表明,与WT- p53(NMR) 相比,LLPSE- p53 (NMR) 在H1299细胞中形成的液滴更大、更多(图5)。
实施例6本发明的p53变体(SEQ ID NO.5)具有更强的转录激活其下游靶基因的能力
在证明LLPSE-p53液-液相分离能力优于WT-p53后,我们构建了pEGFP -p53和pEGFP-LLPSE-p53真核表达载体,在HEK293T细胞中通过qRT-PCR的方法检测WT-p53和LLPSE-p53对其下游靶基因的转录调控能力。结果表明,与WT-p53相比,LLPSE-p53对CDKN1A、MDM2以及PUMA等的转录水平有明显提高(图6)。说明相液-液分离增强了p53的转录活性。
实施步骤:
1. 在12孔细胞培养板中接种细胞,细胞密度达到70-80%之后转染1μg质粒,继续培养24h;
2.使用Trizol法提取细胞总RNA;
3.将提取的RNA逆转录合成cDNA,按照标准化流程配制qRT-PCR体系;
4.用实时荧光定量PCR仪进行检测;
5.利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
实验结果表明,与WT-p53相比,LLPSE-p53具有更强的转录激活活性。
实施例7本发明的p53变体(SEQ ID NO.6)具有更强的转录激活其下游靶基因的能力
在HEK293T细胞中通过qRT-PCR的方法证明了相分离能够增强p53的转录活性。我们构建了pCMV6-p53和pCMV6-LLPSE-p53真核表达载体,并进一步在H1299细胞中进行验证。实验结果表明,与WT-p53相比,LLPSE-p53对CDKN1A、MDM2以及PUMA等的转录水平有明显提高(图7)。
实施步骤:
1. 在12孔细胞培养板中接种细胞,细胞密度达到70-80%之后转染1 μg 质粒,继续培养24h;
2. 使用Trizol法提取细胞总RNA;
3. 将提取的RNA逆转录合成cDNA,按照标准化流程配制qRT-PCR体系;
4. 用实时荧光定量PCR仪进行检测;
5. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
实验结果表明,与WT-p53相比,LLPSE-p53具有更强的转录激活活性。
实施例8本发明的p53变体(SEQ ID NO.7)具有更强的转录激活活性
为进一步考察LLPSE-p53的转录激活活性是否优于WT-p53,我们构建了pcDNA3.1-p53和pcDNA3.1-LLPSE-p53真核表达载体,在H1299细胞中通过双荧光素酶报告实验证明了LLPSE-p53能够促进CDKN1A的转录激活(图8)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种适量细胞,细胞密度达60-70%时将上述质粒与CDKN1A荧光素报告基因质粒共转,放入培养箱继续培养24h;
2. 按照Promega生产的双荧光素酶报告系统检测试剂盒与M5酶标仪进行化学发光检测;
3. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,与WT-p53相比,LLPSE-p53对CDKN1A转录激活活性显著提高。
实施例9本发明的p53变体(SEQ ID NO.3)具有更强的杀伤非小细胞肺癌细胞系H1299的能力
在证明相分离提高了p53转录激活能力,进一步验证相分离是否能够增强其对肿瘤的杀伤效果。我们构建了pEGFP-p53和pEGFP-LLPSE-p53真核表达载体,通过质粒转染和ATP法检测细胞活力,结果表明相分离增强的p53变体显著抑制了H1299细胞的增殖,与WT-p53相比,LLPSE-p53能够更显著抑制H1299肿瘤细胞增殖(图9)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,每孔加入100 μl完全培养基,置于培养箱继 续培养12-24 h;
2. 向细胞中转染100 ng-200 ng质粒,每组3个复孔,置于培养箱接续培养 72 h;
3. 取出细胞室温平衡30 min,反应报告液也平衡至室温;
4. 吸弃50 μl完全培养基,加入50 μl反应报告液,置于水平摇床室温裂解5 min;
5. 使用M5酶标仪对每个孔进行1-3 s的化学发光检测;
6. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,与WT-p53相比,LLPSE-p53对能够显著抑制H1299肿瘤细胞增殖。
实施例10本发明的p53变体(SEQ ID NO.3)具有更强的杀伤神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的能力
为探究LLPSE-p53对其它肿瘤是否也具有更强的杀伤效果,我们构建了pCMV3-p53和pCMV3-LLPSE-p53真核表达载体,将两者转染到SH-SY5Y细胞中,并检测细胞活力。结果表明相分离增强的p53变体显著抑制了SH-SY5Y细胞的增殖,效果比野生型p53更强(图10)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,每孔加入100 μl完全培养基,置于培养箱继 续培养12-24 h;
2. 向细胞中转染100-200ng质粒,每组3个复孔,置于培养箱接续培养72 h;
3. 取出细胞室温平衡30 min,反应报告液也平衡至室温;
4. 吸弃50 μl完全培养基,加入50 μl反应报告液,置于水平摇床室温裂解15min;
5. 使用M5酶标仪对每个孔进行1-3 s的化学发光检测;
6. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,与WT-p53相比,LLPSE-p53对SH-SY5Y细胞有较强的杀伤效果。
实施例11 本发明的p53变体(SEQ ID NO.3)具有更强的杀伤骨肉瘤细胞系U-2OS的能力
为进一步探究LLPSE-p53对肿瘤杀伤效果,我们构建了pcDNA6B-p53和pcDNA6B-LLPSE-p53真核表达载体,并在U-2OS细胞中也进行了细胞活力的检测,实验结果表明相分离增强的p53变体显著抑制了U-2OS肿瘤细胞的增殖,效果比野生型p53更强(图11)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,每孔加入100 μl完全培养基,置于培养箱继 续培养12-24 h;
2. 向细胞中转染100 -200ng质粒,每组3个复孔,置于培养箱接续培养72 h;
3. 取出细胞室温平衡30 min,反应报告液也平衡至室温;
4. 吸弃50 μl完全培养基,加入50 μl反应报告液,置于水平摇床室温裂解15min;
5. 使用M5酶标仪对每个孔进行1-3s的化学发光检测;
6. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,与WT-p53相比,LLPSE-p53对U-2OS肿瘤细胞有显著杀伤效果。
实施例12 本发明的p53变体(SEQ ID NO.3)重组蛋白与野生型WT-p53重组蛋白体外相分离能力对比
在真核细胞表达水平明确LLPSE-p53相分离能力及功能之后,通过WT-p53、LLPSE-p53重组蛋白原核表达与纯化以及体外相分离实验,发现LLPSE-p53相分离能力优于WT-p53(图12)。
实施步骤:
1.将两种目的基因克隆至pET-28a(+) 原核表达载体中,转化至BL21表达菌株,37℃恒温培养箱培养过夜。
2.挑取单克隆,37 ℃,220 rpm,培养至OD600=0.6;
3.加入200-500 μM IPTG,100 µM ZnCl2,25 ℃,220 rpm培养过夜;
4.4500 rpm,4 ℃离心30 min;
5.加入细胞裂解液,高压破碎,17000 rpm,4 ℃离心30 min;
6.取上清液进行HisTrap HP介质纯化;
7.将洗脱液进行HiTrap Heparin HP介质纯化;
8.最后进行Gel filtration进一步纯化;
9.配制相分离体系,在荧光倒置显微镜拍照,对比两者相分离能力。
结果显示,与WT-p53相比,LLPSE-p53形成数量更多和体积更大的液滴,说明LLPSE-p53液-液相分离能力比WT-p53强。
实施例13本发明的p53变体(SEQ ID NO.3)蛋白具有更强的杀伤人非小细胞肺癌细胞系H1299的能力
在体外证明LLPSE-p53重组蛋白相分离能力优于WT-p53后,我们进一步通过蛋白质细胞递送实验发现与WT-p53相比,LLPSE-p53蛋白对H1299肿瘤细胞有更强的杀伤效果(图13)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,加入100 µl完全培养基(无P/S),置于培养箱继续培养12-24 h;
2. 按照蛋白作用浓度为6.5-10 μM配制50 μl蛋白递送体系,如下:
6.5-10 μM蛋白 + 5×transduction buffer + 完全培养基(无P/S)
3. 将上述体系过0.22 μm 滤膜除菌;
4. 吸弃孔板中的完全培养基,加入上述蛋白递送体系,放至培养箱继续培养24h;
5. 吸弃蛋白递送体系,加入完全培养基,继续培养24 h;
6. 利用ATP法和M5酶标仪进行细胞活力检测;
7. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,在H1299肿瘤细胞中,与WT-p53相比,LLPSE-p53重组蛋白促进了H1299肿瘤细胞凋亡。
实施例14 本发明的p53变体(SEQ ID NO.3)蛋白具有更强的杀伤人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的能力
我们进一步在SH-SY5Y细胞上进行了蛋白水平的验证,发现LLPSE-p53重组蛋白对SH-SY5Y肿瘤细胞也有显著杀伤效果,杀伤效果比野生型p53更强(图14)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,加入100 μl完全培养基(无P/S),置于培养箱继续培养12-24 h;
2. 按照蛋白作用浓度为6.5-10 μM配制50 μl蛋白递送体系,如下:
6.5-10 μM蛋白 + 5×transduction buffer + 完全培养基(无P/S);
3. 将上述体系过0.22 μM 滤膜除菌;
4. 吸弃孔板中的完全培养基,加入上述蛋白递送体系,放至培养箱继续培养24h;
5. 吸弃蛋白递送体系,加入完全培养基,继续培养24 h;
6. 利用ATP法和M5酶标仪进行细胞活力检测;
7. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,在SH-SY5Y肿瘤细胞中,与WT-p53相比,LLPSE-p53重组蛋白促进了SH-SY5Y肿瘤细胞凋亡。
实施例15 LLPSE-p53(SEQ ID NO.3)重组蛋白增强了p53对人乳腺癌细胞系SKBR3的杀伤效果
我们进一步在SKBR3细胞上进行了蛋白水平的验证,发现相比于野生型p53重组蛋白,LLPSE-p53重组蛋白对SKBR3肿瘤细胞也有更强的杀伤效果(图15)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,加入100 μl完全培养基(无P/S),置于培养箱继续培养12-24 h;
2. 按照蛋白作用浓度为6.5-10 μM配制50 μl蛋白递送体系,如下:
6.5-10 μM蛋白 + 5×transduction buffer + 完全培养基(无P/S);
3. 将上述体系过0.22 μm 滤膜除菌;
4. 吸弃孔板中的完全培养基,加入上述蛋白递送体系,放至培养箱继续培养24h;
5. 吸弃蛋白递送体系,加入完全培养基,继续培养24 h;
6. 利用ATP法和M5酶标仪进行细胞活力检测;
7. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,在SKBR3肿瘤细胞中,与WT-p53相比,LLPSE-p53重组蛋白促进了SKBR3肿瘤细胞凋亡。
实施例16 LLPSE-p53(SEQ ID NO.3)重组蛋白增强了p53对人骨肉瘤细胞系U-2OS的杀伤效果
我们进一步在U-2OS细胞上进行了蛋白水平的验证,发现与野生型p53相比LLPSE-p53重组蛋白对U-2OS肿瘤细胞也有更强的杀伤效果(图16)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,加入100 μl完全培养基(无P/S),置于培养箱继续培养12-24 h;
2. 按照蛋白作用浓度为6.5-10 μM配制50 μl蛋白递送体系,如下:
6.5-10 μM蛋白 + 5×transduction buffer + 完全培养基(无P/S);
3. 将上述体系过0.22 μm滤膜除菌;
4. 吸弃孔板中的完全培养基,加入上述蛋白递送体系,放至培养箱继续培养24h;
5. 吸弃蛋白递送体系,加入完全培养基,继续培养24 h,
6. 利用CCK8法和M5酶标仪进行细胞活力检测;
8. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,在U-2OS肿瘤细胞中,与WT-p53相比,LLPSE-p53重组蛋白促进了U-2OS肿瘤细胞凋亡。
实施例17 LLPSE-p53(SEQ ID NO.3)重组蛋白增强了p53对人脑瘤细胞系SF126的杀伤效果
我们进一步在SF126细胞上进行了蛋白水平的验证,发现与野生型p53相比,LLPSE-p53重组蛋白对SF126肿瘤细胞也有更强的杀伤效果(图17)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,加入100 μl完全培养基(无P/S),置于培养箱继续培养12-24 h;
2. 按照蛋白作用浓度为6.5-10 μM配制50 μl蛋白递送体系,如下:
6.5-10 μM蛋白 + 5×transduction buffer + 完全培养基(无P/S);
3. 将上述体系过0.22 μm 滤膜除菌;
4. 吸弃孔板中的完全培养基,加入上述蛋白递送体系,放至培养箱继续培养24h;
5. 吸弃蛋白递送体系,加入完全培养基,继续培养24 h;
6. 利用CCK8法和M5酶标仪进行细胞活力检测;
7. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,在SF126肿瘤细胞中,与WT-p53相比,LLPSE-p53重组蛋白具有更强的抑制SF126肿瘤细胞增殖的能力。
实施例18 LLPSE-p53(SEQ ID NO.3)通过调控FGFR3发挥其肿瘤杀伤功能
为进一步探究LLPSE-p53促进肿瘤细胞凋亡的机制,我们通过RNA-seq方法进行筛选,发现与WT-p53相比,过表达LLPSE-p53能够引起FGFR3等的转录水平降低,敲低FGFR3后,发现LLPSE-p53抑制肿瘤能力丧失,说明LLPSE-p53通过FGFR3抑制肿瘤细胞增殖(图18),提示LLPSE-p53在FGFR3基因表达量高的肿瘤中治疗效果会更显著。
实施步骤:
1.在12孔细胞培养板中接种5-6×10^5个细胞,加入1ml完全培养基继续培养12-24 h;
2.向细胞中分别转染shVector和shFGFR3质粒各1μg,放至培养箱继续培养48 h;
3.将上述两组细胞消化计数,按照每孔5000个细胞接种至96孔板,继续培养24 h;
4.向每孔转染100-200 ng质粒,放至培养箱继续培养72 h;
5.利用ATP法和M5酶标仪检测细胞活力;
6.利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
结果显示,在不敲低FGFR3基因情况下,与野生型p53相比,LLPSE-p53抑制细胞活性能力更强,当敲低FGFR3后, LLPSE-p53抑制细胞活性能力丧失,说明LLPSE-p53通过FGFR3发挥其肿瘤杀伤功能。
实施例19 LLPSE-p53(SEQ ID NO.3)蛋白与TAS-120和IWR-1联合使用可增强其杀伤肿瘤细胞的能力
为进一步提高LLPSE-p53肿瘤杀伤效果,探索LLPSE-p53临床应用的可行性,我们将LLPSE-p53重组蛋白与FGFR抑制剂TAS-120以及Wnt信号通路抑制剂IWR-1进行联合使用,检测U-2OS细胞增殖情况。结果表明,与非联用相比,LLPSE-p53与TAS-120联用后,其抑制肿瘤增殖的效果相对WT-p53提高了近14.5%;LLPSE-p53与IWR-1联用后,其肿瘤杀伤效果相对WT-p53提高了6.4%左右,表明TAS-120以及IWR-1能够增强LLPSE-p53杀伤肿瘤细胞的能力(图19)。
实施步骤:
1. 在96孔细胞培养板接种5000个细胞/孔,加入100 μl完全培养基(无P/S),置于培养箱继续培养12-24 h;
2. 按照蛋白作用浓度为0.5-2 μM配制50 μl蛋白递送体系,如下:
0.5-2 μM蛋白 + 5×transduction buffer + 完全培养基(无P/S);
3. 将上述体系过0.22 μm滤膜除菌;
4. 吸弃孔板中的完全培养基,加入上述蛋白递送体系,放至培养箱继续培养24h;
5. 吸弃蛋白递送体系,分别加入含终浓度为5-20 μM的TAS-120和IWR-1的完全培养基,并加入相同体积的DMSO作为对照,继续培养24 h;
6. 利用CCK8法和M5酶标仪进行细胞活力检测;
7. 利用Graphpad5软件进行数据处理与分析。
实验结果表明,与FGFR抑制剂TAS-120以及Wnt信号通路抑制剂IWR-1联合使用能够在较低蛋白浓度的情况下提高LLPSE-p53杀伤U-2OS细胞的能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.具有更强液-液相分离能力的p53变体,其特征在于,在p53序列的一端添加富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列,在细胞水平和体外比野生型p53具有更强的液-液相分离能力,具有更强的转录激活活性;
所述的富含正电荷和组氨酸的氨基酸序列的通式为Hx(G/S/P/A/T)y(R/K)z,其中H:为组氨酸;(G/S/P/A/T):为由甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸之一或多个组成的序列;(R/K)为精氨酸或赖氨酸,其中x,y,z 是相应氨基酸的个数, x,z=0-20,y=0-100, x+z>5;所述的p53变体DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的p53变体,其特征在于,能够激活CDKN1A靶基因的转录,提高CDKN1A、MDM2、PUMA、NOXA以及RRM2B中的一个或者多个的下游靶基因的转录水平。
3.一种根据权利要求1所述p53变体在制备肿瘤治疗药物中的用途,其特征在于,适用的肿瘤种类包括非小细胞肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤以及人脑瘤;
所述的药物包括核酸水平和蛋白水平起到活性作用的药物。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述的p53变体的重组蛋白表达体系包括大肠杆菌表达宿主、动物细胞以及酵母蛋白表达系统;原核表达载体包括pET24A,pET28A(+);真核生物表达载体包括:1)pEGFP、pEYFP、pmcherry、pRFP、pECFP、pLenti、pLX、pCMV6、pCMV3、pcDNA3以及pcDNA6B动物细胞表达载体;2)昆虫细胞表达载体包括pAc5.1-EGFP;3)酵母表达载体包括pPIC3以及pPIC9。
5.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述的p53变体介导肿瘤细胞凋亡的靶标分子包括FGFR3,用于治疗FGFR3表达量高的肿瘤。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述的肿瘤治疗药物为p53变体与FGFR抑制剂TAS-120以及Wnt信号通路抑制剂IWR-1联合使用的药物,或者制备的复合药物,用于提高在较低蛋白浓度时增强其杀伤肿瘤细胞的能力。
7.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述的药物的形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、口服液体剂型、颗粒剂、软膏剂。
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