CN117700491A - 一种靶向肿瘤微环境的多肽分子探针 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及核医学分子探针设计方面，具体涉及一种靶向肿瘤微环境的多肽分子探针。YJL‑4是通过模板辅助法得到的一条新型多肽序列，并首次对其进行⁶⁸Ga标记并用于肿瘤微环境的显像。YJL‑4属于稳定型多肽(不稳定指数为37.33)，其稳定性要高于低pH插入肽家族多肽。高稳定性使YJL‑4在⁶⁸Ga标记的高温条件下保持结构稳定，能适用于95℃高温的标记条件；能够弥补pHLIP家族肽稳定性较差的缺陷。

Description

一种靶向肿瘤微环境的多肽分子探针

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及核医学分子探针设计方面，具体涉及一种靶向肿瘤微环境的多肽分子探针。

背景技术

病变组织及受损细胞的新陈代谢往往导致细胞外酸化，如果能够找到一种可以靶向细胞外酸性环境的载体，对于改善细胞外酸性环境相关的癌症、缺血性中风、神经外伤和感染等病理状态具有积极的意义。但是这种方法的应用具有一定的难度，因为病变组织胞外pH值与正常组织pH值相差甚微(约低0.5～0.8个pH单位)。这种差别在生物学上可使细胞功能改变，但从化学角度而言差别非常小，调节靶向因子的化学性质非常困难。

低pH插入肽(pH low insertionpeptides,pHLIPs)的发现为胞外微酸环境敏感靶向给药系统的发展提供了新的契机。pHLIP由侧翼序列和跨膜(transmembrane,TM)序列组成，其中侧翼序列由质子化氨基酸残基构成，TM序列由疏水残基构成。TM序列影响pHLIP与膜相互作用，侧翼-1(氨基端)与pHLIP的水溶性相关，通常含有极性带电残基。膜插入侧翼-2(羧基端)不仅与pHLIP的水溶性有关而且影响pHLIP进出细胞膜的比率。随着对pHLIP生物物理学性质的不断了解，基于pHLIP具有低pH靶向行为这一特点，考虑将其作为诊断或治疗药物的载体。

与18F、11C等非金属核素标记多肽等生物小分子相比，⁶⁸Ga标记具有方法简便、条件温和、快速等优点，适用于小分子药物的药代动力学研究以及标记多肽示踪剂。目前⁶⁸Ga标记显像剂中应用最成功的是⁶⁸Ga标记的SSTR显像剂，其对神经内分泌肿瘤的诊断灵敏度和特异性都在90％以上，并且改变了50％～60％的神经内分泌肿瘤患者的诊治策略，优于常规影像学检查及传统的SSTR SPECT显像。除上述诊断优势外，⁶⁸Ga与90Y、177Lu配位化学性质相似，可标记同样的化合物分别进行显像和多肽受体放射性核素治疗(peptidereceptor radionuclide therapy，PRRT)，能够更加精准地筛选患者、制定治疗策略、计算核素治疗剂量以及评价疗效，实现个体化诊断及治疗。此外，⁶⁸GaPET/CT SSTR显像在检查成本、人力成本、所需其他辅助检查成本方面也优于SSTR SPECT显像。

低pH插入肽(pHLIP)家族肽能够靶向酸性肿瘤微环境，有望成为一种新型靶向肿瘤的载体。而前期研究通过⁶⁸Ga标记pHLIP家族肽，在标记的高温条件下pHLIP家族肽不稳定，标记结果不理想。限制了⁶⁸Ga标记与pHLIP的结合使用。

发明内容

本发明的目的在于提高多肽的稳定性，使得多肽在⁶⁸Ga标记的高温条件下保持结构稳定，从而将⁶⁸Ga标记结合到多肽结构上，对多肽的使用进行显像示踪，为多肽在临床研究和应用进行验证，具有良好的前景。

为了实现上述目的，本发明对pHLIP家族肽插入区氨基酸序列进行分析，通过模板辅助法每个位置选取出现频率最高的氨基酸，得到新的多肽序列YJL-4，YJL-4在⁶⁸Ga标记的高温条件下保持结构稳定。能够弥补pHLIP家族肽稳定性较差的缺陷。

本发明第一个方面公开了一种靶向肿瘤微环境的多肽分子探针，命名为YJL-4，所述多肽分子探针YJL-4的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：NOTA-ACDDQNPWARYADLLFPTDLLLLDL-NH₂。

本发明第二个方面公开了上述多肽分子探针YJL-4的制备方法：通过模板辅助法对pHLIP家族肽氨基酸序列进行分析，每个位置选取出现频率最高的氨基酸，组成得到多肽分子探针YJL-4，YJL-4通过固相多肽合成法合成。

本发明第三个方面公开了一种⁶⁸Ga标记多肽，将⁶⁸Ga淋洗液和NOTA-YJL-4混合均匀，再加入已活化的C-18柱，淋洗后获得纯化后的⁶⁸Ga标记多肽。

本发明第四个方面公开了所述的多肽分子探针或权利要求3所述的⁶⁸Ga标记多肽在给药系统中的应用。以及所述的多肽分子探针或权利要求3所述的⁶⁸Ga标记多肽在细胞跨膜转运中的应用。其中所述多肽分子探针或⁶⁸Ga标记多肽用于制备靶向肿瘤细胞的载体。优选地，所述多肽分子探针或⁶⁸Ga标记多肽用于负载药物。

本发明取得如下有益技术效果：

YJL-4是通过模板辅助法得到的一条新型多肽序列，并首次对其进行⁶⁸Ga标记并用于肿瘤微环境的显像。YJL-4属于稳定型多肽(不稳定指数为37.33)，其稳定性要高于低pH插入肽家族多肽。高稳定性使YJL-4在⁶⁸Ga标记的高温条件下保持结构稳定，能适用于95℃高温的标记条件；能够弥补pHLIP家族肽稳定性较差的缺陷。

附图说明

图1A处展示了YJL-4分子结构图；B处展示了螺旋轮图标示出YJL-4插入区极性氨基酸和非极性性氨基酸的准确空间位置及排列顺序；C处DNASTAR分析显示YJL-4具有α-螺旋结构及两亲性。

图2为⁶⁸Ga-YJL-4(A2h，B 4h)及⁶⁸Ga-对照肽(C 2h，D 4h)在三阴性乳腺癌肿瘤模型的小动物PET显像。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。

实施例1YJL-4多肽的设计及表征

对pHLIP家族肽能够形成α螺旋的插入区氨基酸进行分析，各个位置氨基酸具有一定保守性，选取pHLIP家族肽插入区的优势氨基酸得到新型多肽YJL-4序列。

使用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和

HeliQuest(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/)在线工具分析多肽的净电荷,不稳定指数,平均疏水性,细胞膜插入区疏水性,细胞膜插入区疏水力矩.使用HeliQuest、DNASTAR、pymol等工具分析及预测多肽二级结构。分析发现YJL-4属于稳定型多肽(不稳定指数为37.33)，其稳定性要高于低pH插入肽家族多肽。(pHLIP家族中靶向肿瘤效果比较好的短序列变体pHLIP(Var3)的不稳定指数是41.24，Var7的不稳定指数是50.92。该指数越高多肽越不稳定，一般40以上认为不稳定多肽)

YJL-4是由固相多肽合成法合成(上海科肽生物科技有限公司)，多肽序列如下：YJL-4NOTA-ACDDQNPWARYADLLFPTDLLLLDL-NH₂。

YJL-4通过岛津LC-20AT高效液相色谱仪(岛津公司，日本)纯化。色谱条件如下：色谱柱：Agela C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：溶剂A(0.05％三氟乙酸+2％乙腈)，溶剂B(0.05％三氟乙酸+90％乙腈)；梯度洗脱(0～22min，45-67％B)；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm。通过岛津LCMS-2020(岛津公司，日本)对多肽进行鉴定，确定所合成多肽分子的分子特征。(YJL-4的HPLC分析显示有一个主峰(97.47％，9.48min)和2个较小的杂质峰；产物的质谱分析显示1个质谱峰，m/z为3177.57([M+H]+)。实测分子量(3176.57)与理论分子量(3176.82)基本相符。)

实施例2圆二色光谱测定

0.1mg/ml的多肽及2mmol/L 2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱(直径≤50nm)溶于10mmol/L、pH＝8的磷酸缓冲液中，然后在室温下平衡至少10小时。通过0.1mol/L的HCL调节溶液pH值至4.0。

在pH＝8.0及4.0分别用Chirascan-plus ACD圆二色光谱仪(英国应用光物理公司，英国)测定多肽的圆二色光谱。

当pH从8.0降低到4.0时，YJL-4呈现从无结构构象到α-螺旋结构的典型pH依赖性转变；对照肽kVar7在pH＝8.0及4.0条件下均成β折叠构象。

实施例3⁶⁸Ga标记多肽的制备与纯化

用5mL 0.1M盐酸淋洗⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器，分段收集淋洗液，取其中放射性活度最高的部分用于后续标记。1.5mL离心管做反应管，依次加入500μL 0.1M醋酸钠缓冲液(PH＝5.5)，1000μL ⁶⁸Ga淋洗液和80μL 0.1mg/mL NOTA-YJL-4(或对照肽kVar7，序列如下：ACEEQNPWARYLKWLFPTKTLLLKL)，旋涡混匀10s，800转每分，95℃加热15min。待体系温度降至室温后，加至已活化的C-18柱，用3mL超纯水淋洗柱子，最后用0.7mL 80％乙醇淋洗C-18柱获得纯化后的标记产物。

用Agilent 1200Radio-HPLC(Agilent Technologies Inc.USA)对⁶⁸Ga标记多肽进行鉴定，条件如下：流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B：乙腈；洗脱梯度为：0-15min；流动相A为95％-5％，流动相B为5％-95％，流速：1mL/min；观察放射性峰保留时间。

结果显示纯化后标记化合物⁶⁸Ga-YJL-4放射化学纯度为(97.95±0.06)％(n＝3)，保留时间为10.51min；⁶⁸Ga-kVar7放射化学纯度为(95.3±0.13)(n＝3)％，保留时间为9.58min。

实施例4⁶⁸Ga标记多肽探针血清稳定性

200μl ⁶⁸Ga标记多肽(0.5mci)与1.0mL新鲜人血清混匀37度孵育，在混合后30，60，120和240分钟检测放射化学纯度。

⁶⁸Ga-YJL-4与⁶⁸Ga-kVar7稳定性良好，在37℃人血清中孵育240分钟，放射化学纯度仍高达95％。

实施例5体内生物分布

待肿瘤直径长至0.8～1.0cm时，选取18只荷瘤裸鼠进行体内生物分布实验。每只裸鼠经尾静脉注入⁶⁸Ga标记YJL-4及对照肽kVar7约1.85MBq/200μL，分别于注射后1h、2h、4h人道的处死小鼠，取脑、心、肺、肝、肾、胃、小肠、血液、肌肉、骨骼及肿瘤等组织器官，称重并测其放射性计数，结果表示为每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。

⁶⁸Ga标记多肽后2、4小时，⁶⁸Ga标记YJL-4在肿瘤中的分布分别为3.22±0.69，2.4±0.58％ID/g，均高于⁶⁸Ga标记kVar7在肿瘤中的分布(P<0.01)。

实施例6小动物PET显像

待肿瘤直径长至0.8～1.0cm时，选取6只荷瘤裸鼠用于显像。每只裸鼠通过尾静脉注射约7.4MBq/200μL⁶⁸Ga标记的YJL-4或kVar7，在注射后1h、2h、4h通过2％的异氟烷麻醉荷瘤鼠并进行显像；采集方式为静态10min PET、中分辨率全身CT。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种靶向肿瘤微环境的多肽分子探针，其特征在于，所述多肽分子探针的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述靶向肿瘤微环境的多肽分子探针的制备方法，其特征在于，通过模板辅助法对pHLIP家族肽氨基酸序列进行分析，每个位置选取出现频率最高的氨基酸，组成得到多肽分子探针。

3.一种⁶⁸Ga标记多肽，其特征在于，将⁶⁸Ga淋洗液和NOTA-YJL-4混合均匀，再加入已活化的C-18柱，淋洗后获得纯化后的⁶⁸Ga标记多肽。

4.如权利要求1所述的多肽分子探针或权利要求3所述的⁶⁸Ga标记多肽在给药系统中的应用。

5.如权利要求1所述的多肽分子探针或权利要求3所述的⁶⁸Ga标记多肽在细胞跨膜转运中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多肽分子探针或⁶⁸Ga标记多肽用于制备靶向肿瘤细胞的载体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多肽分子探针或⁶⁸Ga标记多肽用于负载药物。