CN117695312A - 一种外泌体脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及外泌体技术领域，具体涉及一种外泌体脂质体及其制备方法和应用，本发明采用分阶段这种温和的冷冻干燥方式，并加入合适的冻干保护剂单螺旋交联透明质酸钠和麦角硫因以很好的保护外泌体稳定性，经冻干后的外泌体不仅保留了原有的生物活性，其稳定性对保存介质、温度和时间不再敏感。本发明通过先制备冻干外泌体后，再采用纳米制剂技术，把冻干外泌体包裹进脂质体里，制成的脂质体不仅能很好的保护包载活性成分不被生理环境降解、延长药物半衰期、控制药物分子释放，还能提高生物相容性和安全性。将本发明的外泌体脂质体应用于头皮修复护理产品，可以解决传统活性物质易于失效且难以透皮吸收的问题。

Description

一种外泌体脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及外泌体技术领域，具体涉及一种外泌体脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着我国社会经济的发展，人们对美的追求已不止于衣着、妆容和体型，头发护理日益受到重视。一头健康秀发，可以充分彰显个人魅力与性格，业已成为爱美人士的头等大事。而头皮是头发赖以生存的“土壤”，健康的头皮才能生长和培养秀发。

头皮属于皮肤，头部皮肤与身体上其他部位的皮肤具有相同的生理结构，但与面部皮肤相比又有着许多特点。其一：头部皮肤的皮脂腺、汗腺、毛囊数量要比面部皮肤多得多， 且较面部皮肤代谢周期时间短，有着油脂分泌速度更快、环境更潮湿，并且由于发丝的阻碍更难清洁的特点。因此头皮潮湿、油脂丰富的环境更容易滋生微生物，引起头皮肩等头皮问题。其二：头部皮肤的厚度要比面部皮肤更薄（仅次于眼部皮肤），因此较敏感，其衰老速度更快。也就是说对于外界刺激，头皮可能比面部更加敏感，更容易出现瘙痒等 皮 肤问题。此外头皮的衰老严重影响毛囊及毛发的生长。其三：头皮皮肤皮下组织中富含血 管神经，头皮状态更容易受到情绪、压力等影响 ，容易受内分泌影响产生脱发、白发等问题。

据不完全统计，进入青春期后，一半以上的人群被头皮问题所困扰。目前对于头皮问题的具体发病机制及其生化改变尚不完全清楚，但多数研究表明，微生物学因素及局部免疫反应在头皮问题的发病过程中起到了主要作用。目前普遍认为以马拉色菌和葡萄球菌为主的微生物的过度增殖、头皮油脂分泌和个体易感性是最重要的3个因素。

目前市售的头皮护理产品以化妆品为主，主要通过添加各种抗真菌药物如酮康唑、氯咪巴唑、吡啶硫酮锌（ZPT）等，减少头皮微生物的生长，抑制头皮角质化细胞的分裂，阻止将要脱落的细胞积聚成肉眼可见的块状鳞片，从而达到去屑的目的。然而长期使用该类药物容易产生耐药性且对头皮刺激性较大。

随着人们生活水平的提高，化妆品的功效、安全、品质越来越受关注。因此，研发一种纯天然、安全性高、疗效显著的头皮护理产品成为医药领域技术人员亟待解决的问题。

近年来随着有关再生医学研究的逐步深入，人们发现无论在动物实验还是临床研究中，外泌体在组织再生和损伤修复方面具有与其来源细胞相同的功效。因此合理利用外泌体是现代科学的一个重要方向。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种生物相容性好、安全性高的外泌体，当将本发明的外泌体脂质体应用于头皮修复护理产品，可有效解决传统活性物质易于失效且难以透皮吸收的问题。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种外泌体脂质体，它由宫内膜干细胞外泌体、单螺旋交联透明质酸钠、麦角硫因、卵磷脂和胆固醇组成。

一种如权利要求1所述的外泌体脂质体的制备方法，它包括以下制备步骤：

步骤A:在50-60ml pH 7.4 磷酸缓冲液中加入4.5-6.5g单螺旋交联透明质酸钠、4-5g麦角硫因，搅拌至完全溶解，再加入9-10g宫内膜干细胞外泌体，搅拌5-10min后，转移到冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干外泌体；

步骤B:将9-10g卵磷脂和26-29g胆固醇溶于10-15mL无水乙醇中，将2-3g冻干外泌体溶于5-10mL pH 7.4 磷酸缓冲液中，室温下将上述两种溶液在功率为60-65W超声下混合15-20 min；然后将混合液旋蒸至凝胶状，加20-25mL pH 7.4 磷酸盐缓冲液水化20-25min，再使用超声细胞破碎仪进行超声破碎，最后用0.22μm滤膜过滤，即得到外泌体脂质体。

优选的，步骤A中，冷冻干燥的具体步骤为：

以降温速度为0.3-0.5℃/min的速率将冷冻干燥机的搁板温度降至-40至-55℃，当制品温度降至-45℃以下时，保持2-3小时；开始抽真空，当真空度达到21±2pa时，开始升温；将搁板温度以升温速率为0.1-0.3℃/min，升至不高于-33℃，待视镜处样品水线消失后，结束一次干燥；

将搁板温度以升温速率为0.5-3℃/分钟，升至10℃，真空设定为0.01pa，保温3-5小时；将搁板温度升至18℃，真空不变，保温2-5小时;将搁板温度升至27℃，真空不变，保温2-3小时，结束后即得冻干后的外泌体。

优选的，所述单向螺旋交联透明质酸钠的制备方法为：

将质量比为（5-8）：（3-5）:1的透明质酸钠与交联剂1,4-丁二醇二环氧甘油醚、注射用水混合均匀，制得透明质酸钠交联反应体系；

将透明质酸钠交联反应体系置于离心管17000r/min离心40-50min；高速离心完成后转入3100r/min低速离心140-160min，同时将透明质酸钠交联反应体系升到51℃后保持该温度不变50-60min，65-75℃烘干，得到单向螺旋交联透明质酸钠。

优选的，宫内膜干细胞外泌体的制备方法如下：

将第4-5代脐带间充质干细胞培养至60％-70％融合时，更换为无血清培养基，继续培养48-72 h后，收集细胞培养基上清液；

在4℃，300g的条件下离心上清液10min，去除间充质干细胞，得到细胞上清液；将细胞上清液在4℃，2000g下离心20min进一步去除死细胞和杂质，收集上清液；在4℃，10000g下离心30min去除细胞碎片，收集上清液；

最后将上清液使用0.22μm的滤膜过滤，使用100KD超滤管进行超滤浓缩，再使用3KD超滤管进一步浓缩，得到宫内膜干细胞外泌体。

将该外泌体脂质体用于头皮护理，外泌体是经血来源干细胞发挥旁分泌作用的主要物质，属于胞外囊泡的一种，直径大小为 30-150 nm，其中含有脂质、核糖核酸和蛋白质。虽然外泌体并不具备经血来源干细胞的分化再生能力，但也降低了经血来源干细胞治疗发生免疫排斥、栓塞或肿瘤形成的风险。本发明运用现代技术对宫内膜干细胞外泌体进行有效处理，制备了一种外泌体脂质体，为开发安全性高的头皮修复护理产品提供基础依据。

本发明步骤A中，经冻干后的外泌体不仅保留了原有的生物活性，其稳定性对保存介质、温度和时间不再敏感。未经冻干的外泌体是具有双层脂膜的囊泡结构,提取后的外泌体的完整性和生物活性受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响。目前, 最常用的储存方法为冷冻保存, 但是冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变, 同时导致多层囊泡的形成和聚集, 反复冻融还会导致外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化。外泌体虽然建议保存于−80℃环境下, 但在储存、运输和使用过程中是很难维持这种低温条件，限制了其应用。冻干后的外泌体可以提供更好的保质期，方便储藏和运输。

但是在冻干过程中存在许多应力，包括低温应力、冻结应力(枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等)、干燥应力(失去蛋白质表面水分子)等，这些应力常常直接或间接导致外泌体失去天然构象从而变性或失活。所以本发明采用了分阶段这种温和的冷冻干燥方式，还需要加入合适的冻干保护剂单螺旋交联透明质酸钠和麦角硫因以很好的保护外泌体稳定性。

冻干过程中外泌体的稳定基于两种主要机制：玻璃化和水置换理论。玻璃化定义了外泌体分子在由无定形稳定剂形成的基质中的固定化，从而降低外泌体分子之间的相互作用，从而防止其结构的变化。水置换机制是基于稳定剂单螺旋透明质酸钠的羟基和外泌体的极性基团之间氢键的形成，在干燥过程中取代了水和外泌体之间的氢键，从而允许保留外泌体分子的天然形式。玻璃化理论代表动力学稳定，而水替代理论代表稳定的热力学方面，动力学稳定与临界温度（Tg）密切相关。Tg的测定对于选择适当的储存和运输条件至关重要。在冻结态下，无定形辅料和外泌体形成玻璃状基质温度低于该温度Tg。但即使在低于Tg的温度下，外泌体迁移也可以加速降解反应。外泌体会增加制剂处方的Tg，需要添加Tg值相对较高的辅料以保持外泌体稳定性。本发明用单螺旋交联透明质酸钠作为稳定剂，可以在较高的产品温度Tp（高于Tg'，甚至高于Tc）下进行初级干燥，从而缩短初级干燥时间而不会发生塌陷。

经检测稳定剂的Tg’约为-33℃，加入具有较高临界温度的单螺旋透明质酸钠可以在较高的产品温度Tp（高于Tg'，甚至高于Tc）下进行初级干燥，从而缩短初级干燥时间而不会发生塌陷。主要是因为单螺旋透明质酸钠在冻干的过程中不易结晶，从而不会使外泌体分离，同时通过防止外泌体在界面处展开和聚集，使在冷冻、干燥和复溶过程中增加外泌体稳定性；它还降低了表面张力，防止空气/水、冰/水和固体/空气界面的不稳定。

本发明步骤B中，把冻干外泌体包裹进脂质体里，脂质体中的磷脂能够增强皮肤的水合作用，从而使角质细胞膨胀，间隙增大，使水溶性活性物更易透过角质层，脂溶性活性物则通过扩散和毛细吸力进入细胞间隙。同时脂质体的磷脂与角质层中的脂质融合，其屏障作用发生逆转，角质层形成扁平的颗粒状结构，包封有外泌体的脂质体顺利通过脂质颗粒的间隙，促进药物透皮吸收。

本发明采用的宫内膜干细胞外泌体，可以促进成纤维细胞的迁移, 促进成纤维细胞分泌bFGF和VEGF；调节缺损愈合的炎症反应。

本发明采用的单螺旋交联透明质酸钠，冻干填充剂和（或）冻干保护剂，通过防止外泌体在界面处展开和聚集，使在冷冻、干燥和复溶过程中增加外泌体稳定性；它还降低了表面张力，防止空气/水、冰/水和固体/空气界面的不稳定。保证得到良好结构的冻干品，同时增加产品的溶解性。传统的透明质酸钠是长链（单链）分子，在稀溶液状态下，呈自然伸展状态，当分散体系浓度较高时，分子互相缠绕或呈现自由状态，呈杂乱结构，熵值较高，呈现各向同性，排列无序，不利于冻干形成孔隙结构和刚性不足，无法维持体系的机械支撑。针对上述问题，本发明采用单螺旋交联透明质酸钠，在透明质酸钠交联时通过沿着一个方向施加外部应力，使长链分子空间取向呈螺旋趋于一致，在长时间应力作用下，长链分子集结成为螺旋束状，熵值降低，结构趋于一致性和均一性，总体上呈现各向异性。

本发明采用的麦角硫因，在无定形状态时作为缓冲液和冷冻/冻干保护剂，以及作为抗氧化剂。

本发明采用的卵磷脂，保护活性成分不被降解，提高稳定性；改善浅表创面的水合作用，增加了分子间的间距，使水溶性活性物更易透过角质层，脂溶性活性物则通过扩散和毛细吸力进入细胞间隙。

本发明采用的胆固醇，两亲物质，与卵磷脂相互作用形成脂质体时可嵌入到卵磷脂分子之间，调节膜结构及性质，提高脂质体功能性。此外，还可调节卵磷脂双分子层膜的流动性，使膜通透性降低，减少药物渗漏；使脂膜维持一定柔韧性，增强脂质体囊泡抗击外部条件变化的能力；还能对卵磷脂的氧化有一定保护作用。

本发明的有益效果：本发明采用分阶段这种温和的冷冻干燥方式，并加入合适的冻干保护剂单螺旋交联透明质酸钠和麦角硫因以很好的保护外泌体稳定性，经冻干后的外泌体不仅保留了原有的生物活性，其稳定性对保存介质、温度和时间不再敏感。本发明通过先制备冻干外泌体后，再采用纳米制剂技术，把冻干外泌体包裹进脂质体里，制成的脂质体不仅能很好的保护包载活性成分不被生理环境降解、延长药物半衰期、控制药物分子释放，还能提高生物相容性和安全性。将本发明的外泌体脂质体应用于头皮修复护理产品，可以解决传统活性物质易于失效且难以透皮吸收的问题。

附图说明

图1 外泌体脂质体透射电镜图片；

图2外泌体脂质体的粒度分布；

图3外泌体脂质体的Zeta 电位；

图4测试区域内油脂含量在分别使用外泌体脂质体头皮护理液以及市售头皮护理液后随时间的变化图；

图5使用外泌体脂质体头皮护理液和不使用任何护理液下的测试区域内油脂含量变化图。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步描述。

实施例1。

一种外泌体脂质体，它由宫内膜干细胞外泌体、单螺旋交联透明质酸钠、麦角硫因、卵磷脂和胆固醇组成。

一种如权利要求1所述的外泌体脂质体的制备方法，它包括以下制备步骤：

步骤A:在50ml pH 7.4 磷酸缓冲液中加入4.5g单螺旋交联透明质酸钠、4g麦角硫因，搅拌至完全溶解，再加入9g宫内膜干细胞外泌体，搅拌5min后，转移到冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干外泌体；

步骤B:将9g卵磷脂和26g胆固醇溶于10mL无水乙醇中，将2g冻干外泌体溶于5mLpH 7.4 磷酸缓冲液中，室温下将上述两种溶液在功率为60W超声下混合15min；然后将混合液旋蒸至凝胶状，加20mL pH 7.4 磷酸盐缓冲液水化20min，再使用超声细胞破碎仪进行超声破碎，最后用0.22μm滤膜过滤，即得到外泌体脂质体。

步骤A中，冷冻干燥的具体步骤为：

以降温速度为0.3℃/min的速率将冷冻干燥机的搁板温度降至-45℃，当制品温度降至-45℃以下时，保持2小时；开始抽真空，当真空度达到21±2pa时，开始升温；将搁板温度以升温速率为0.1℃/min，升至不高于-33℃，待视镜处样品水线消失后，结束一次干燥；

将搁板温度以升温速率为0.5℃/分钟，升至10℃，真空设定为0.01pa，保温3小时；将搁板温度升至18℃，真空不变，保温2小时;将搁板温度升至27℃，真空不变，保温2小时，结束后即得冻干后的外泌体。

所述单向螺旋交联透明质酸钠的制备方法为：

将质量比为5：3:1的透明质酸钠与交联剂1,4-丁二醇二环氧甘油醚、注射用水混合均匀，制得透明质酸钠交联反应体系；

将透明质酸钠交联反应体系置于离心管17000r/min离心40min；高速离心完成后转入3100r/min低速离心140min，同时将透明质酸钠交联反应体系升到51℃后保持该温度不变50min，65℃烘干，得到单向螺旋交联透明质酸钠。

宫内膜干细胞外泌体的制备方法如下：

将第4代脐带间充质干细胞培养至60％融合时，更换为无血清培养基，继续培养48h后，收集细胞培养基上清液；

在4℃，300g的条件下离心上清液10min，去除间充质干细胞，得到细胞上清液；将细胞上清液在4℃，2000g下离心20min进一步去除死细胞和杂质，收集上清液；在4℃，10000g下离心30min去除细胞碎片，收集上清液；

最后将上清液使用0.22μm的滤膜过滤，使用100KD超滤管进行超滤浓缩，再使用3KD超滤管进一步浓缩，得到宫内膜干细胞外泌体。

将该外泌体脂质体用于头皮护理。

实施例2。

一种外泌体脂质体，它由宫内膜干细胞外泌体、单螺旋交联透明质酸钠、麦角硫因、卵磷脂和胆固醇组成。

一种外泌体脂质体的制备方法，它包括以下制备步骤：

步骤A:在52.8ml pH 7.4 磷酸缓冲液中加入5.3g单螺旋交联透明质酸钠、4.28g麦角硫因，搅拌至完全溶解，再加入9.36g宫内膜干细胞外泌体，搅拌8min后，转移到冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干外泌体；

步骤B:将9.36g卵磷脂和27.64g胆固醇溶于13mL无水乙醇中，将2.6g冻干外泌体溶于7mL pH 7.4 磷酸缓冲液中，室温下将上述两种溶液在功率为63W超声下混合18min；然后将混合液旋蒸至凝胶状，加21mL pH 7.4 磷酸盐缓冲液水化23min，再使用超声细胞破碎仪进行超声破碎，最后用0.22μm滤膜过滤，即得到外泌体脂质体。

步骤A中，冷冻干燥的具体步骤为：

以降温速度为0.4℃/min的速率将冷冻干燥机的搁板温度降至-45℃，当制品温度降至-45℃以下时，保持3小时；开始抽真空，当真空度达到21±2pa时，开始升温；将搁板温度以升温速率为0.2℃/min，升至不高于-33℃，待视镜处样品水线消失后，结束一次干燥；

将搁板温度以升温速率为2℃/分钟，升至10℃，真空设定为0.01pa，保温4小时；将搁板温度升至18℃，真空不变，保温3小时;将搁板温度升至27℃，真空不变，保温3小时，结束后即得冻干后的外泌体。

所述单向螺旋交联透明质酸钠的制备方法为：

将质量比为7：4:1的透明质酸钠与交联剂1,4-丁二醇二环氧甘油醚、注射用水混合均匀，制得透明质酸钠交联反应体系；

将透明质酸钠交联反应体系置于离心管17000r/min离心45min；高速离心完成后转入3100r/min低速离心150min，同时将透明质酸钠交联反应体系升到51℃后保持该温度不变55min，70℃烘干，得到单向螺旋交联透明质酸钠。

宫内膜干细胞外泌体的制备方法如下：

将第4代脐带间充质干细胞培养至65％融合时，更换为无血清培养基，继续培养60h后，收集细胞培养基上清液；

在4℃，300g的条件下离心上清液10min，去除间充质干细胞，得到细胞上清液；将细胞上清液在4℃，2000g下离心20min进一步去除死细胞和杂质，收集上清液；在4℃，10000g下离心30min去除细胞碎片，收集上清液；

最后将上清液使用0.22μm的滤膜过滤，使用100KD超滤管进行超滤浓缩，再使用3KD超滤管进一步浓缩，得到宫内膜干细胞外泌体。

将该外泌体脂质体用于头皮护理。

实施例3。

一种外泌体脂质体，它由宫内膜干细胞外泌体、单螺旋交联透明质酸钠、麦角硫因、卵磷脂和胆固醇组成。

一种如权利要求1所述的外泌体脂质体的制备方法，它包括以下制备步骤：

步骤A:在 60ml pH 7.4 磷酸缓冲液中加入 6.5g单螺旋交联透明质酸钠、5g麦角硫因，搅拌至完全溶解，再加入10g宫内膜干细胞外泌体，搅拌10min后，转移到冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干外泌体；

步骤B:将10g卵磷脂和29g胆固醇溶于15mL无水乙醇中，将3g冻干外泌体溶于10mLpH 7.4 磷酸缓冲液中，室温下将上述两种溶液在功率为65W超声下混合20 min；然后将混合液旋蒸至凝胶状，加25mL pH 7.4 磷酸盐缓冲液水化25min，再使用超声细胞破碎仪进行超声破碎，最后用0.22μm滤膜过滤，即得到外泌体脂质体。

步骤A中，冷冻干燥的具体步骤为：

以降温速度为0.5℃/min的速率将冷冻干燥机的搁板温度降至-45℃，当制品温度降至-45℃以下时，保持3小时；开始抽真空，当真空度达到21±2pa时，开始升温；将搁板温度以升温速率为0.3℃/min，升至不高于-33℃，待视镜处样品水线消失后，结束一次干燥；

将搁板温度以升温速率为3℃/分钟，升至10℃，真空设定为0.01pa，保温5小时；将搁板温度升至18℃，真空不变，保温5小时;将搁板温度升至27℃，真空不变，保温3小时，结束后即得冻干后的外泌体。

所述单向螺旋交联透明质酸钠的制备方法为：

将质量比为8：5:1的透明质酸钠与交联剂1,4-丁二醇二环氧甘油醚、注射用水混合均匀，制得透明质酸钠交联反应体系；

将透明质酸钠交联反应体系置于离心管17000r/min离心50min；高速离心完成后转入3100r/min低速离心160min，同时将透明质酸钠交联反应体系升到51℃后保持该温度不变60min，75℃烘干，得到单向螺旋交联透明质酸钠。

宫内膜干细胞外泌体的制备方法如下：

将第5代脐带间充质干细胞培养至70％融合时，更换为无血清培养基，继续培养72h后，收集细胞培养基上清液；

在4℃，300g的条件下离心上清液10min，去除间充质干细胞，得到细胞上清液；将细胞上清液在4℃，2000g下离心20min进一步去除死细胞和杂质，收集上清液；在4℃，10000g下离心30min去除细胞碎片，收集上清液；

最后将上清液使用0.22μm的滤膜过滤，使用100KD超滤管进行超滤浓缩，再使用3KD超滤管进一步浓缩，得到宫内膜干细胞外泌体。

将该外泌体脂质体用于头皮护理。

实验部分

1、外泌体脂质体的包封率

1.1 标准曲线

按ExoELISA试剂盒方法操作，将试剂盒中外泌体的标准品（2.31ng/mL）稀释成浓度分别为 1.8、1.2、0.6、0.3、0.15 ng/ml 的标准品溶液，酶联免疫反应后，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度（OD值）。以标准品的浓度为横坐标（Y），OD 值为纵坐标（X），绘出标准曲线，得方程为：Y =1.7749X-0.0738，R2=0.9901。 测定结果显示，本发明实施例的外泌体浓度在0.15-1.8 ng/ml 范围内线性良好。

1.2 外泌体的通透率

精密配制浓度为 50.0 ng/mL 外泌体溶液，分别吸取 0.15、0.50、1.0 mL溶液置于超滤离心管，PBS 稀释至 3.0 mL，离心，转速：3500 r/min，离心时间：20 min。取滤液，ExoELISA方法测定外泌体含量，计算通透率。本发明实施例不同浓度外泌体溶液对超滤膜的平均通透率为 93.1±3.0 %（n=3）。

1.3 加样回收率

精密量取空白脂质体混悬液 0.3 mL，再分别精密加入浓度为 50.0 ng/mL外泌体溶液 0.15、0.50、1.0 mL，用 PBS 稀释至 3.0 mL，混匀后转入超滤离心管离心，转速：3500r/min，时间 20 min。取滤液，ExoELISA方法测定外泌体含量，计算平均回收率为 91.7±2.2 %（n=3）。

1.4 包封率的测定

本发明实施例外泌体脂质体样品的包封率测定 3 次，计算脂质体包封率，得包封率为 57.9 ±1.1 %。

2、外泌体脂质体理化性质

2.1外泌体脂质体的形态

由图 1 外泌体脂质体透射电镜图片可知，本发明实施例外泌体脂质体形状较为规则，呈完整圆球形或椭圆形的单室囊泡；粒子大小较均匀，粒径范围在几十纳米到一百多纳米之间。

2.2 粒径和 Zeta 电位测定

外泌体脂质体的粒度分布见图2，本发明实施例外泌体脂质体的平均粒径为 63.7nm。主要分布在 43.8-141.8 nm之间。整体反映，外泌体脂质体粒径小，粒度分布均匀，分散性好，粒径呈正态分布。

外泌体脂质体的 Zeta 电位见图3，结果表明：外泌体脂质体的 Zeta 电位为 +9.2 mV，带正电。

3、外泌体脂质体在头皮护理方面的应用案例

3.1、控油效果评价

招募48名志愿者，年龄 20- 45岁，男女各24人。随机分成2组，各组24人（男女各占一半）。在温度20 ℃、相对湿度 50%的环境中进行半头测试，其中一组左右两边分别使用市售某品牌含化学去屑成分的去屑头皮护理液（以下简称市售头皮护理液）和外泌体脂质体头皮护理液，另一组左边使用外泌体脂质体头皮护理液，右边不使用，于试验开始 0、1和 4h时测量头皮油脂含量，测量三次并取平均值。

油脂值越大，说明油脂含量越高。而其变化率越小，说明调节皮肤油脂分泌效果越明显。图4列出了测试区域内油脂含量在分别使用外泌体脂质体头皮护理液以及市售头皮护理液后随时间的变化，图5则列出了使用外泌体脂质体头皮护理液和不使用任何护理液下的测试区域内油脂含量变化情况。

由图4可以看出，在测试周期内，试验区域使用测试样品后，油脂含量在1 h和4h均有升高，较0 h基准值而言，使用市售头皮护理液的组别油脂变化率均高于外泌体脂质体头皮护理液组，说明外泌体脂质体头皮护理液调节皮肤油脂分泌效果优于市售头皮护理液。

由图5可以看出，在测试周期内，试验区域使用外泌体脂质体头皮护理液后，较0 h基准值而言，油脂变化率远低于不使用任何护理液的空白对照，说明外泌体脂质体头皮护理液具有明显控油效果。

3.2、去屑效果评价

选取48名头屑多、易头痒的志愿者，年龄 20- 45岁，男女各24人。随机分成2组，各组24人（男女各占一半）。将外泌体脂质体头皮护理液和市售头皮护理液分别在两组志愿者的头皮上进行梳头式涂抹，待涂满整个头皮后用手按摩均匀即可。每天用一次，连续使用一个月，对头屑、头痒的症状进行使用前后的对比。

采用人体试用评价，并对连续使用产品一个月后的试用情况进行回访比较，评价结果见表1。由表1可以看出，外泌体脂质体头皮护理液较市售头皮护理液对头皮屑和头痒均有更显著的效果，使用外泌体脂质体头皮护理液一个月后，高达93% 的受试者感到头屑症状明显减轻或消失，高达87%的受试者认为产品止痒效果突出。

表1 测试样品去屑止痒效果评价

3.3、体外皮肤刺激性试验

皮肤刺激性的测定是基于人体皮肤表面的脂类和蛋白与红细胞的细胞膜相似的原理，通过测定从红细胞中释放的血红蛋白量及其变性程度来评价受试物对细胞膜和蛋白的损伤程度，从而反映皮肤刺激性的大小。将外泌体脂质体头皮护理液和市售头皮护理液进行皮肤刺激性对比试验。

具体试验方法：在离心管中分别加入500μL不同含量（用生理盐水进行稀释）的样品溶液和500μL（等体积）质量分数为2%的绵羊红细胞悬液，充分混匀。每个含量梯度均设置3个平行，以完全不溶血的生理盐水为阴性对照，以完全溶血的100mg/LSDS溶液为阳性对照。置于37℃恒温培养箱孵育3 h后，以2000r/min离心3min，取上清液稀释并于酶标仪410、540和575 nm下测定吸光度值。

计算410nm下引起50% 红细胞发生溶血时的待测样质量浓度（L50，mg/L）和样品质量分数为1%时在540和575nm 波长下的吸光度比值得到的蛋白质变性指数DI，计算出2个变量的比值L/D（L50/DI）。依据欧洲替代方法验证中心（ECVAM）的Red Blood Cell（RBC）测试方法及分级标准，对待测样品的刺激性程度进行分级，分级标准如表2所示。

表2化妆品产品刺激性分级标准

以样品质量浓度为横坐标，红细胞溶血率为纵坐标作曲线。根据回归方程确定样品引起红细胞50%溶血时的质量浓度L50，同时计算出当质量分数1%时样品的蛋白质变性指数DI，得出L/D，根据表2分级标准，确定样品的皮肤刺激程度，试验 结果如表3所示。由L/D值可以看出，外泌体脂质体头皮护理液的皮肤刺激性明显低于市售头皮护理液，说明外泌体脂质体头皮护理液更加温和。

表3 体外皮肤刺激性试验结果

Claims (6)

1.一种外泌体脂质体，其特征在于：它由宫内膜干细胞外泌体、单螺旋交联透明质酸钠、麦角硫因、卵磷脂和胆固醇组成。

2.一种如权利要求1所述的外泌体脂质体的制备方法，其特征在于：它包括以下制备步骤：

步骤A:在50-60ml pH 7.4 磷酸缓冲液中加入4.5-6.5g单螺旋交联透明质酸钠、4-5g麦角硫因，搅拌至完全溶解，再加入9-10g宫内膜干细胞外泌体，搅拌5-10min后，转移到冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干外泌体；

步骤B:将9-10g卵磷脂和26-29g胆固醇溶于10-15mL无水乙醇中，将2-3g冻干外泌体溶于5-10mL pH 7.4 磷酸缓冲液中，室温下将上述两种溶液在功率为60-65W超声下混合15-20 min；然后将混合液旋蒸至凝胶状，加20-25mL pH 7.4 磷酸盐缓冲液水化20-25min，再使用超声细胞破碎仪进行超声破碎，最后用0.22μm滤膜过滤，即得到外泌体脂质体。

3.根据权利要求2所述的一种外泌体脂质体的制备方法，其特征在于：步骤A中，冷冻干燥的具体步骤为：

以降温速度为0.3-0.5℃/min的速率将冷冻干燥机的搁板温度降至-40至-55℃，当制品温度降至-45℃以下时，保持2-3小时；开始抽真空，当真空度达到21±2pa时，开始升温；将搁板温度以升温速率为0.1-0.3℃/min，升至不高于-33℃，待视镜处样品水线消失后，结束一次干燥；

将搁板温度以升温速率为0.5-3℃/分钟，升至10℃，真空设定为0.01pa，保温3-5小时；将搁板温度升至18℃，真空不变，保温2-5小时;将搁板温度升至27℃，真空不变，保温2-3小时，结束后即得冻干后的外泌体。

4.根据权利要求2所述的一种外泌体脂质体的制备方法，其特征在于：步骤A中，所述单向螺旋交联透明质酸钠的制备方法为：

将质量比为（5-8）：（3-5）:1的透明质酸钠与交联剂1,4-丁二醇二环氧甘油醚、注射用水混合均匀，制得透明质酸钠交联反应体系；

将透明质酸钠交联反应体系置于离心管17000r/min离心40-50min；高速离心完成后转入3100r/min低速离心140-160min，同时将透明质酸钠交联反应体系升到51℃后保持该温度不变50-60min，65-75℃烘干，得到单向螺旋交联透明质酸钠。

5.根据权利要求2所述的一种外泌体脂质体的制备方法，其特征在于：步骤A中，宫内膜干细胞外泌体的制备方法如下：

将第4-5代脐带间充质干细胞培养至60％-70％融合时，更换为无血清培养基，继续培养48-72 h后，收集细胞培养基上清液；

在4℃，300g的条件下离心上清液10min，去除间充质干细胞，得到细胞上清液；将细胞上清液在4℃，2000g下离心20min进一步去除死细胞和杂质，收集上清液；在4℃，10000g下离心30min去除细胞碎片，收集上清液；

最后将上清液使用0.22μm的滤膜过滤，使用100KD超滤管进行超滤浓缩，再使用3KD超滤管进一步浓缩，得到宫内膜干细胞外泌体。

6.一种如权利要求1或2所述的外泌体脂质体的用途，其特征在于：将该外泌体脂质体用于头皮护理。