CN117683814A - 一种雷帕霉素诱导cd9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法和应用 - Google Patents
一种雷帕霉素诱导cd9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及外泌体主动装载与基因递送技术领域。本发明提供了一种雷帕霉素诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法和应用。本发明利用雷帕霉素诱导FKBP/FRB蛋白二聚体形成的原理，设计了一种化学分子诱导的类病毒装载系统。将目标蛋白与FKBP进行融合，同时将FRB蛋白结构域插入外泌体表面蛋白CD9的两端，这样可以在高浓度的化学分子雷帕霉素诱导下，外泌体可以主动包装目标蛋白。在外泌体侵染靶向细胞后，FKBP/FRB二聚体会自然解离，自由释放目标蛋白POI。目标蛋白可以是GFP等荧光蛋白，也可以是基因编辑器Cas9，Cas12/Cas13等任何蛋白编码序列，在靶向细胞当中行使相应的功能。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体主动装载与基因递送技术领域，尤其涉及一种雷帕霉素诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法和应用。
背景技术
细胞外囊泡(EVs)，或者外泌体，是细胞在生理条件下或在生物线索下分泌的脂质双层封闭的膜性结构。EV由不同大小和细胞膜亚细胞来源的异质群体组成。由于关于EV亚型的特异性标记尚未达成共识，一般定义“外泌体”是尺寸范围为40-160nm的小EV，假定其膜来源于内吞体途径。通过外泌体，供体细胞可以将外源性物质，如蛋白质、mRNA、microRNAs(miRNAs)和脂质，转移到受体细胞。因此，这些天然装备的纳米载体已被用于药物传递。外泌体也可以穿透组织，扩散到血液中，甚至穿过血脑屏障(BBB)。快速发展的外泌体技术为整合诊断和疾病治疗提供了强大的工具。外泌体治疗的未来包括将靶向外泌体与抗癌药物和高精度癌症诊断探针相结合，以构建用于体内跟踪、预后监测和治疗的多功能平台。
外泌体的基因工程是赋予外泌体主动包装能力的一种方便的方法。首先，配体与在外泌体表面表达的跨膜蛋白融合。随后，转染了编码融合蛋白的质粒的供体细胞分泌在其表面带有靶向配体的工程外泌体。四酯蛋白超家族CD63/CD9/CD81，及其两个细胞外环，是经常被用来进行工程化改造的外泌体跨膜蛋白。例如，荧光蛋白蛋白被插入到CD63小的细胞外环中，以探测外泌体的分泌和摄取。在CD63蛋白一侧胞内段，融合MCP蛋白，可以主动装载含有MS2颈环结构的mRNA。但是，通过CD63介导，主动装载蛋白的策略还很缺乏。有部分研究，是利用GFP1-10/GFP11二聚体的亲和力，通过CD63-GFP11等融合蛋白，装载融合GFP1-10的靶向蛋白。
通过化学小分子，如雷帕霉素，可以用来诱导FRB/FKBP12蛋白二聚体的形成。在CD81蛋白的C端融合FKBP12，可以装载融合FRB的靶向蛋白。研究表明，CD9，CD81，CD63涵盖不同的EV分泌亚群，有不同的来源。带有CD81表面标记的外泌体群体来源于细胞膜，CD63标记的外泌体群体可能来源于内吞体。现有的研究证据表明，CD63标记的外泌体群体可能相对产量比较大，在实际的工程化改造和应用也比较多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雷帕霉素诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法和应用，诱导外泌体主动包装目标蛋白，在外泌体侵染靶向细胞后，FKBP/FRB二聚体会自然解离，自由释放目标蛋白POI。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了雷帕霉素在诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白中的应用。
本发明还提供了一种雷帕霉素诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将细胞培养至细胞融和度为70～80％时利用含有外泌体的转染体系进行质粒转染；
(2)转染后继续培养至细胞融和度为88～92％，去除培养基，洗涤1～3次，更换为含有雷帕霉素的无血清培养基；
(3)更换培养基44～52h后收集细胞上清；
(4)将细胞上清离心后过滤上清液，将上清液超速离心，得到外泌体主动包装蛋白。
作为优选，步骤(1)和步骤(2)中所述的培养条件独立的为：35～39℃、4～6％CO2；培养时所用的培养基为含有8～12％胎牛血清、青霉素80～120U/ml、链霉素80～120μg/ml的DMEM完全培养基，所述培养时每2～3天更换一次培养基。
作为优选，步骤(1)中所述细胞的种类为293T细胞、鼠卵巢细胞CHO或人Hela细胞等细胞系，所述质粒转染时所用的含有外泌体的转染体系包括如下重量份的组分：DMEM培养基730～770份、待包装质粒8～12份、外泌体包装质粒2～3份、外膜糖蛋白表达质粒2～3份、转染试剂20～28份，所述外膜糖蛋白表达质粒为pMD2.G，所述转染试剂为Lipo8000，所述质粒转染时细胞和含有外泌体的转染体系的用量比为1.8～2.2×106个：780～800μL。
作为优选，所述外泌体包装质粒为FRB-CD63-FRB载体质粒，所述FRB-CD63-FRB载体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
gtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcccagagcccaggcccggcagccatgatcctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgtttgtactttggggaaaggaacgtgaaaggcatgtttgaggtgctggagcccttgcatgctatgatggaacggggcccccagactctgaaggaaacatcctttaatcaggcctatggtcgagatttaatggaggcccaagagtggtgcaggaagtacatgaaatcagggaatgtcaaggacctcctccaagcctgggacctctattatcatgtgttccgacgaatctcaaagggcggtcacaactccggaggtggaggtggacagagcccaggcccggcagccatgccggtcaaaggaggcaccaagtgcatcaaatacctgctgttcggatttaacttcatcttctggcttgccgggattgctgtccttgccattggactatggctccgattcgactctcagaccaagagcatcttcgagcaagaaactaataataataattccagcttctacacaggagtctatattctgatcggagccggcgccctcatgatgctggtgggcttcctgggctgctgcggggctgtgcaggagtcccagtgcatgctgggactgttcttcggcttcctcttggtgatattcgccattgaaatagctgcggccatctggggatattcccacaaggatgaggtgattaaggaagtccaggagttttacaaggacacctacaacaagctgaaaaccaaggatgagccccagcgggaaacgctgaaagccatccactatgcgttgaactgctgtggtttggctgggggcgtggaacagtttatctcagacatctgccccaagaaggacgtactcgaaaccttcaccgtgaagtcctgtcctgatgccatcaaagaggtcttcgacaataaattccacatcatcggcgcagtgggcatcggcattgccgtggtcatgatatttggcatgatcttcagtatgatcttgtgctgtgctatccgcaggaaccgcgagatggtctccggtggaggtggatccatggcttctaactttactcagttcgttctcgtcgacaatggcggaactggcgacgtgatcctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgtttgtactttggggaaaggaacgtgaaaggcatgtttgaggtgctggagcccttgcatgctatgatggaacggggcccccagactctgaaggaaacatcctttaatcaggcctatggtcgagatttaatggaggcccaagagtggtgcaggaagtacatgaaatcagggaatgtcaaggacctcctccaagcctgggacctctattatcatgtgttccgacgaatctcaaagtagagatctgatccaccggatctagataactgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaacgcgtaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttgga
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cccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgg
gcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctac
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aatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatg。
作为优选，所述待包装质粒为目标蛋白-FKBP荧光报告质粒；
所述目标蛋白-FKBP荧光报告质粒的构建方法包括如下步骤：
a.pcDNA3-目标蛋白质粒为模板采用高保真PCR试剂盒进行扩增，得到目标蛋白GS；
b.以PM-FRB-mRFP-T2A-FKBP-5-ptase质粒为模板，采用高保真PCR试剂盒进行扩增，得到GS FKBP；
c.将目标蛋白GS和GS FKBP按照1：0.8～1.2的质量比混合，用高保真PCR试剂盒扩增，得到Kpn1目标蛋白FKBP EcoR1；
d.将Kpn1目标蛋白FKBP EcoR1、pcDNA 3.1质粒、Kpn1酶和EcoR1酶按照8～12μg：8～12μg：8～12μL：8～12μL的用量比混合，在35～39℃条件下酶切50～70min，得到酶切产物；
e.将酶切产物和T4连接酶在20～26℃条件下反应4～6min，得到连接产物；
f.将连接产物转化大肠杆菌感受态菌株，在含80～120μg/mL氨苄青霉素的LB平板上挑克隆，得到目标蛋白-FKBP荧光报告质粒。
作为优选，所述目标蛋白为GFP等荧光蛋白或基因编辑器Cas9，Cas12/Cas13。
作为优选，步骤(2)中所述洗涤时采用1×PBS，所述含有雷帕霉素的无血清培养基中雷帕霉素的含量为8～12ng/ml。
作为优选，步骤(4)中所述离心的条件为：2～6℃、1800～2200×g、离心13～17min，所述过滤时采用0.20～0.24μm滤膜，所述超速离心的条件为2～6℃、100000～140000×g、离心60～80min。
本发明还提供了一种外泌体主动包装蛋白。
本发明提供了一种雷帕霉素诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法和应用。本发明利用雷帕霉素诱导FKBP/FRB蛋白二聚体形成的原理，设计发明了一种化学分子诱导的类病毒装载系统。将目标蛋白与FKBP进行融合，同时将FRB蛋白结构域插入外泌体表面蛋白CD9的两端，这样可以在高浓度的化学分子雷帕霉素诱导下，外泌体可以主动包装目标蛋白。在外泌体侵染靶向细胞后，FKBP/FRB二聚体会自然解离，自由释放目标蛋白POI。目标蛋白可以是GFP等荧光蛋白，也可以是基因编辑器Cas9，Cas12/Cas13等任何蛋白编码序列，在靶向细胞当中行使相应的功能。
附图说明
图1为FRB-CD9-FRB介导的外泌体包装过程示意图。
图2为FRB-CD9-FRB介导的包装EGFP-FKBP的外泌体和侵染293T细胞进行Westernblot，抗体为anti-EGFP。
图3为FRB-CD9-FRB介导的包装EGFP-FKBP的外泌体，侵染293T细胞，然后进行共聚焦显微镜观察。
图4为质粒FRB-CD9-FRB图谱。
图5为质粒pcDNA-EGFP-FKBP图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1构建FRB-CD63-FRB载体质粒
(1)以p1xNLS-FRB-mCherry-hsp86-BSD(淼灵,编号p46117)质粒为模板，分别使用引物组合EcoRI-FRB-F1/linker1-FRB-R1和linker2-FRB-F3/XhoI-FRB-R3，用高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物。产物分别编号为FRB-1和FRB-3。
以pECMV-3×FLAG-CD9(淼灵,编号p5064)质粒为模板，使用引物组合linker1-CD9-F2/linker2-CD9-R2，用高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物。产物编号为CD9-2。
扩增FRB-1的上游引物EcoR1-FRB-F1：
cggaattcatgatcctctggcatgagatgtggcat(SEQ ID NO.2)；
扩增FRB-1的下游引物：linker1-FRB-R1：
ggctctgtccacctccacctccggagttgtgaccgccctttgagattcgtcggaacac(SEQ IDNO.3)；
扩增CD9-2的上游引物linker1-CD9-F2：
ggaggtggaggtggacagagcccaggcccggcagccatgccggtcaaaggaggcacca(SEQ IDNO.4)；
扩增CD9-2的下游引物linker2-CD9-R2：
acgagaacgaactgagtaaagttagaagccatggatccacctccaccggagaccatctcgcggttcctgc(SEQ ID NO.5)；
扩增FRB-3的上游引物linker2-FRB-F3：
ctaactttactcagttcgttctcgtcgacaatggcggaactggcgacgtgatcctctggcatgagatgtggcat(SEQ ID NO.6)；
扩增FRB-3的下游引物Xho1-FRB-R3：ccctcgagctactttgagattcgtcggaacac(SEQID NO.7)。
高保真PCR扩增反应体系如表1：
表1高保真扩增的反应体系
高保真PCR扩增反应程序如表2：
表2高保真扩增的反应程序
(2)将上述步骤获得的FRB-1、CD9-2和FRB-3片段各取20ng混合作为PCR模板，使用引物组合EcoR1-FRB-F1/Xho1-FRB-R3，用高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，将全部体系加入1.5％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外成像系统下割取1390bp条带所在胶块，然后用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化DNA。产物编号为FRB-CD9-FRB。高保真PCR扩增反应程序如表2，将循环内延伸时间设置为1min 30s。
(3)将上述步骤获得的片段FRB-CD9-FRB和pcDNA3.1(+)质粒各自略低于1μg，用1μL EcoRI和1μL XhoI酶在37℃双酶切1h。前者直接使用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)回收酶切产物；后者先用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，切下5.4kb的条带，再用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)溶胶回收线性骨架。
(4)将回收的DNA产物用1μLT4连接酶(Invitrogen)，按如下体系(表3)在23℃下反应5min，完成连接。
表3FRB-CD9-FRB和pcDNA3.1(+)的连接体系
将连接产物转化TreliefTM5α大肠杆菌感受态菌株(擎科，货号TSC-C01)，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上挑克隆，引物CMV-F测序鉴定得到插入克隆。
鉴定FRB-CD9-FRB插入的测序引物
CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg(SEQ ID NO.8)。
将确认构建成功的质粒pcDNA3.1(+)-FRB-CD9-FRB，取少量菌液扩大培养，提取无内毒素质粒，以备细胞实验使用。
实施例2构建EGFP-FKBP荧光报告质粒(本实施例以绿色荧光蛋白EGFP为例)
(1)以pcDNA3-EGFP质粒(Addgene,#13031)为模板，引物组kpn-Egfp-for/gs-Egfp-rev，用高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物。产物编号为EGFP GS。
上游引物kpn-Egfp-for：
ggggtaccatggtgagcaagggcgagga(SEQ ID NO.9)；
下游引物gs-Egfp-rev：
ctgcactccgcttcctcctcctccgcttccacctcctcccttgtacagctcgtccatgc(SEQ IDNO.10)；
(2)以PM-FRB-mRFP-T2A-FKBP-5-ptase质粒(Addgene,#40896)为模板，引物组gs-fkbp-for/ecor1-fkbp-rev，用高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物。产物编号为GS FKBP。
上游引物gs-fkbp-for：
gaggaggaagcggagtgcaggtggaaaccat(SEQ ID NO.11)；
下游引物ecor1-fkbp-rev：
cggaattctcattccagttttagaagctcca(SEQ ID NO.12)；
(3)混合回收片段EGFP GS和GS FKBP为模板，反应体系各加1ng，引物组kpn-Egfp-for/ecor1-fkbp-rev，用高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物。产物编号为Kpn1 EGFP FKBP EcoR1。
高保真PCR扩增反应体系如表4：
表4扩增反应体系
| 组成成分 | 用量 |
| 2×PhantaMaxBuffer | 25μL |
| dNTP(10mMeach) | 1μL |
| PrimerF(上游引物) | 2μL |
| PrimerR(下游引物) | 2μL |
| DNAtemplate(plasmid)(模板) | 1ng |
| PhantaMaxSuper-FidelityDANPolymerase | 1μL |
| ddH2O | 补足体系至50μL |
高保真PCR扩增反应程序如表5：
表5扩增反应程序
(4)将上述步骤获得的片段Kpn1 EGFP FKBP EcoR1和pcDNA 3.1质粒各自1μg，用1μL Kpn1酶和1μL EcoR1酶在37℃酶切1h。两者都直接使用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)回收酶切产物。
(5)将回收的DNA产物用1μLT4连接酶(Invitrogen)，按如下体系(表6)在23℃下反应5min，完成连接。
表6连接体系
| 组成成分 | 用量 |
| 5×T4LigaseBuffer | 2μL |
| Kpn1EGFPFKBPEcor1(插入DNA) | 90fmol |
| PcDNA3.1(载体酶切骨架DNA) | 30fmol |
| T4Ligase | 1μL |
| ddH2O | 补足体系至10μL |
(6)将连接产物转化TreliefTM5α大肠杆菌感受态菌株(擎科，货号TSC-C01)，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上挑克隆。
测序引物CMV-F：
cgcaaatgggcggtaggcgtg(SEQ ID NO.13)。
将确认构建成功的质粒pcDNA-EGFP-FKBP，取少量菌液扩大培养，提取无内毒素质粒，以备细胞实验使用。
实施例3雷帕霉素诱导外泌体EV的主动装载蛋白
使用含有10％胎牛血清(BioAgrio，货号S1350-500)、1×链青霉素(翌圣，货号60162ES76)的DMEM(Hakata，货号A19008)完全培养基，在37℃、5％CO2环境、10cm培养皿(Nest，货号704001)中培养293T细胞(ATCC，货号CRL-3216)，每2天更换一次完全培养基，至细胞融合度75％时进行质粒转染。
质粒转染试剂：Lipo8000(碧云天，货号C0533)，每个10cm板质粒转染体系如表7：
表7 10cm培养皿质粒转染体系
| 体系成分 | 用量 |
| 纯DMEM培养基 | 750μL |
| 待包装质粒(EGFP-FKBP) | 10μg |
| 外泌体包装质粒(FRB-CD9-FRB) | 2.5μg |
| 外膜糖蛋白表达质粒(pMD2.G) | 2.5μg |
| Lipo8000转染试剂 | 24μL |
其中，进行外泌体包装测试的组合如表8：
表8外泌体包装系统测试DNA组合
其中编号①的组别是用pcDNA3.1作为被动包装对照，编号②的组别是用FKBP/FRB介导的主动包装。
转染后培养至细胞融合度达90％时，使用倒置荧光显微镜观察转染后细胞荧光。将细胞培养基弃去，使用1×PBS(Servicebio，货号G4202)洗涤细胞2次，更换为无血清培养基培养细胞，在培养基中添加终浓度为10ng/ml的雷帕霉素(生工，货号A606203-0100)，诱导FRB与FKBP结合。
更换无血清培养基后48h收集细胞上清，更换新的加入10ng/ml雷帕霉素的无血清培养基，再过24h收集细胞上清。
在收集到的细胞上清至50mL离心管中，于水平转子离心机(Thermo Scientific,ST40R)4℃2000xg离心15min。用酒精浸润灭菌超速离心管和超离适配器，并在安全柜中风干。将低速离心后的培养上清用0.22μm滤膜过滤，滤液收集至超速离心管中。
使用无菌PBS严格配平超速离心机转子的各适配器，4℃、120000×g、70min条件下超速离心。结束后缓慢倾倒出上清，注管管口残留液体用移液枪吸除；使用200μL无菌PBS重悬超速离心管底部物质，肉眼不可见。取10μL EV悬液短期储存用于纳米颗粒计数，其余分装。EV悬液可在4℃下过夜放置，最多保存1周；若需较长期储存，可置于-80℃下，避免反复冻融。
使用Nanoparticle Tracking Analysis(Particle Metrix,ZetaView)对收集到的外泌体颗粒进行粒子数、粒径的粗定量：取10ml PBS溶液，稀释至1mL，使用仪器上机测试，NTA测试的参数如表9：
表9 NTA设置参数
使用纳米颗粒跟踪分析仪对EV悬液中的颗粒进行粒径分析和计数，按比例计算EV转染细胞的使用量。(以HEK293T细胞为例，EV/细胞个数比例为103-106的范围)。
实施例4通过Western blot证明外泌体装载效率
(1)EV侵染293T细胞
对293T细胞进行计数并铺板，待细胞贴壁后，吸弃培养上清并更换为无血清的DMEM培养基，向培养基中缓慢滴入对应体积的EV悬液，轻轻震荡混匀。
(2)细外泌体蛋白的提取：
EV侵染293T细胞24小时后，收集细胞。
外泌体蛋白提取使用T-PER蛋白提取试剂(Thermo Scientific，货号78510)，按每个24孔100μL加入，4℃摇床15min，待裂解充分后吸入离心管，在4℃12000rpm下离心10min，吸取上清，在紫外分光光度计使用UV法测定蛋白质浓度。取相同质量的蛋白调整至蛋白终浓度相等，加入6xSDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天，货号P0015F)。将蛋白样品在沸水中煮10min，冻存于-20℃待用。
(3)SDS-PAGE胶、电泳液、转膜液及TBST缓冲液的配置：
SDS-PAGE胶的配方如表10：
表10SDS-PAGE胶的配置10％分离胶
5％浓缩胶
先配置分离胶，加入胶板后保证平齐后使用ddH2O液封，等待30min，待分离胶凝固再配置浓缩胶，加入胶板后插入梳子，等待30min浓缩胶凝固。Western Blot电泳液配方如表11：
表11电泳液配方
Western Blot转膜液配方如表12：
表12转膜液配方
1x TBST缓冲液配方如表13：
表13 1x TBST缓冲液配方
| 成分 | 用量 |
| 1M Tris-HCL(pH＝7.5) | 50mL |
| Nacl(General Reagent，CAS号7647-14-5) | 8.8g |
| Tween-20(碧云天，货号ST825) | 400μL |
| ddH2O | 定容至1L |
(4)电泳：
将电泳液倒入电泳槽中。上样前将蛋白再煮沸5min，按相同量加入泳道。电泳分为两个阶段：第一阶段采用80V恒压电泳35min，使蛋白在浓缩胶中得到浓缩；第二阶段采用120V恒压电泳，电泳时间120min。
(5)转膜：
采用湿法转膜，膜为PVDF膜(Millipore，货号IPVH00010)，在转膜前置于甲醇甲醇(国药集团，CAS号67-56-1)中活化。将转膜液倒入电泳槽中，按顺序制作转膜“三明治”。转膜条件为300mA，恒流转印100min。因转膜时会大量产热，需要在转膜槽中内置冰袋并将转膜槽放置在冰水浴中进行。
(6)封闭：
转膜结束后，将PDVF膜使用1×TBST洗涤3次，每次10min。将膜转移至5％脱脂奶粉(生工，货号A600669-0250)中室温摇晃1小时。
(7)一抗、二抗孵育：
封闭结束后将膜用1x TBST洗涤3次，每次10min。按1：2000的比例配置兔源GFP一抗(Proteintech，货号50430-2-AP)，按1：2000的比例配置鼠源β-actin一抗(Trans，货号HC201-02)，抗体均用抗体稀释液(生工，货号C520011-0250)稀释。加入抗体后4℃摇床过夜。
一抗孵育完毕后，将膜用1x TBST洗涤3次，每次10min。按1：10000的比例配置抗鼠二抗(Proteintech，货号SA00001-1)，按1：10000的比例配置抗兔二抗(Proteintech，货号SA00001-1-2)，抗体均用抗体稀释液(生工，货号C520011-0250)稀释。加入抗体后室温摇床孵育1小时。
(8)ECL发光底物显影：
二抗孵育完毕后，将膜用1x TBST洗涤3次，每次10min。使用ECL发光试剂盒(圣尔生物，货号SB-WB012)，将膜置于配置好的显影液中1min后，使用Tanon 5200化学发光成像仪成像。预测EGFP-FKBP条带40KD，β-actin条带42KD。
在雷帕霉素诱导下，FRB-CD9-FRB能主动装载EGFP-FKBP的蛋白片段。WB检测结果如下图.用pcDNA3.1的空载体，分离的EV能被动装载部分EGFP蛋白，但EV侵染细胞24小时后，细胞当中表达的EGFP蛋白含量比较少。相对而言，用FRB-CD9-FRB，在雷帕霉素(100mM)诱导下，EV当中明显能提升主动装载EGFP的含量，侵染293T细胞后也能检测到一定水平的荧光蛋白。
实施例5通过细胞荧光观察证实外泌体递送靶向蛋白到细胞的能力
将收集到的外泌体颗粒根据NTA定量的结果，取相同的粒子数侵染下游293T细胞(及293T细胞的爬片)，侵染时使293T细胞融合度为80％，将293T细胞的培养基弃去，使用1xPBS洗涤细胞2次，更换为无血清培养基，并添加polybrene(翌圣，货号40804ES76，终浓度8μg/mL)促进类病毒侵染效率。
外泌体颗粒侵染后24h后，弃去培养基，1x PBS洗涤细胞2次，使用DAPI染料染细胞核，收集细胞爬片(卧宏生物，货号WHB-24-CS)。将爬片置于载玻片上，放于湿盒中备用。
使用Leica激光共聚焦显微镜系统对细胞爬片成像。不同荧光设置参数如表14：
表14共聚焦荧光参数设置
| 荧光蛋白 | 激发光波长 | 吸收光波长 |
| DAPI | 405nm | 410～474nm |
| GFP | 488nm | 505～572nm |
在雷帕霉素诱导下，FRB-CD9-FRB能主动装载EGFP-FKBP的蛋白，在细胞当中观察到绿色荧光。荧光显微镜观察结果如图3。
由以上实施例可知，本发明提供了一种雷帕霉素诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法和应用。本发明利用雷帕霉素诱导FKBP/FRB蛋白二聚体形成的原理，设计发明了一种化学分子诱导的类病毒装载系统。将目标蛋白与FKBP进行融合，同时将FRB蛋白结构域插入外泌体表面蛋白CD9的两端，这样可以在高浓度的化学分子雷帕霉素诱导下，外泌体可以主动包装目标蛋白。在外泌体侵染靶向细胞后，FKBP/FRB二聚体会自然解离，自由释放目标蛋白POI。目标蛋白可以是GFP等荧光蛋白，也可以是基因编辑器Cas9，Cas12/Cas13等任何蛋白编码序列，在靶向细胞当中行使相应的功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.雷帕霉素在诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白中的应用。
2.一种雷帕霉素诱导CD9蛋白介导的外泌体主动包装蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将细胞培养至细胞融和度为70～80％时利用含有外泌体的转染体系进行质粒转染；
(2)转染后继续培养至细胞融和度为88～92％，去除培养基，洗涤1～3次，更换为含有雷帕霉素的无血清培养基；
(3)更换培养基44～52h后收集细胞上清；
(4)将细胞上清离心后过滤上清液，将上清液超速离心，得到外泌体主动包装蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述的培养条件独立的为：35～39℃、4～6％CO2；培养时所用的培养基为含有8～12％胎牛血清、青霉素80～120U/ml、链霉素80～120μg/ml的DMEM完全培养基，所述培养时每2～3天更换一次培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述细胞的种类为293T细胞、鼠卵巢细胞CHO或人Hela细胞等细胞系，所述质粒转染时所用的含有外泌体的转染体系包括如下重量份的组分：DMEM培养基730～770份、待包装质粒8～12份、外泌体包装质粒2～3份、外膜糖蛋白表达质粒2～3份、转染试剂20～28份，所述外膜糖蛋白表达质粒为pMD2.G，所述转染试剂为Lipo8000，所述质粒转染时细胞和含有外泌体的转染体系的用量比为1.8～2.2×106个：780～800μL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述外泌体包装质粒为FRB-CD63-FRB载体质粒，所述FRB-CD63-FRB载体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待包装质粒为目标蛋白-FKBP荧光报告质粒；
所述目标蛋白-FKBP荧光报告质粒的构建方法包括如下步骤：
a.pcDNA3-目标蛋白质粒为模板采用高保真PCR试剂盒进行扩增，得到目标蛋白GS；
b.以PM-FRB-mRFP-T2A-FKBP-5-ptase质粒为模板，采用高保真PCR试剂盒进行扩增，得到GS FKBP；
c.将目标蛋白GS和GS FKBP按照1：0.8～1.2的质量比混合，用高保真PCR试剂盒扩增，得到Kpn1目标蛋白FKBP EcoR1；
d.将Kpn1目标蛋白FKBP EcoR1、pcDNA 3.1质粒、Kpn1酶和EcoR1酶按照8～12μg：8～12μg：8～12μL：8～12μL的用量比混合，在35～39℃条件下酶切50～70min，得到酶切产物；
e.将酶切产物和T4连接酶在20～26℃条件下反应4～6min，得到连接产物；
f.将连接产物转化大肠杆菌感受态菌株，在含80～120μg/mL氨苄青霉素的LB平板上挑克隆，得到目标蛋白-FKBP荧光报告质粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为GFP等荧光蛋白或基因编辑器Cas9，Cas12/Cas13。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述洗涤时采用1×PBS，所述含有雷帕霉素的无血清培养基中雷帕霉素的含量为8～12ng/ml。
9.根据权利要求2～8任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述离心的条件为：2～6℃、1800～2200×g、离心13～17min，所述过滤时采用0.20～0.24μm滤膜，所述超速离心的条件为2～6℃、100000～140000×g、离心60～80min。
10.一种权利要求2～9任意一项所述方法制备的外泌体主动包装蛋白。
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